CN112755021A - 褪黑素抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变的新用途 - Google Patents

褪黑素抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及褪黑素在制药领域中的新用途，即早期肺癌合并多发结节的射频消融治疗后，褪黑素在抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变中的新用途。在早期肺癌合并多发结节的射频消融治疗后使用褪黑素，可以促进射频消融诱发NK细胞的抗肿瘤免疫活性，显著降低非消融区结节的增大和恶变发生。

Description

褪黑素抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变的新 用途
技术领域
本发明涉及褪黑素的药物新用途，特别是涉及在早期肺癌射频消融治疗后用于抑制非消融区结节恶变的药物新用途。
背景技术
肺癌是当前世界范围内发病率和死亡率最高的癌症，早发现、早治疗是提高肺癌生存率的关键。近年来，随着计算机断层扫描筛查等医疗技术的飞速发展，早期肺癌的发现率大大提升，而早期肺癌患者往往合并多发肺结节。
外科手术是目前早期肺癌合并多发结节的标准治疗方法，但术后非治疗区域结节恶变是该疾病的重要难题。
目前针对早期肺癌合并多发结节的一线治疗标准方案为：1、主病灶直径≥8mm，考虑手术治疗切除主病灶，随访其余病灶；2、对主病灶直径＜8mm的多发结节随访观察。
这种一线治疗方法虽然可以有效去除主病灶，但同时也面临着极大的挑战：例如切除一个主病灶后，其余不在一侧或一叶的多发病灶往往会增大。这样就面临需要再次或多次手术的挑战，但患者的肺功能等条件又很难支持多次手术。早期肺癌合并多发结节患者的术后复发是目前一线治疗一直不能解决的难题。
国内外数据显示，肺癌合并多发肺结节术后复发率在14.7-23.9%。Fabian等(Fabian T, Bryant AS, Mouhlas AL, Federico JA, Cerfolio RJ. Survival afterresection of synchronous non–small cell lung cancer. The Journal of Thoracicand Cardiovascular Surgery. 2011; 142: 547-553.)研究纳入67例多原发肺癌患者，术后平均随访45.5月，16例复发，复发率为23.9%。北大人民医院(Zhang Z, Gao S, Mao Y etal. Surgical Outcomes of Synchronous Multiple Primary Non-Small Cell LungCancers. Sci Rep. 2016; 6: 23252.)报道285例多原发肺癌手术患者，中位随访27.6月，60例(21.1%)患者复发。复旦大学肿瘤医院(Zhang Y, Li G, Li Y et al. ImagingFeatures Suggestive of Multiple Primary Lung Adenocarcinomas. Annals ofsurgical oncology. 2020; 27: 2061-2070.)报道手术治疗442例多发肺结节患者，中位随访21个月，发现65例患者(14.7%)复发。
手术只能切除肿瘤，但是无法消除肿瘤发生的病因，更无法抑制远处结节的增大或恶变。临床上经常发现多发肺结节的患者经历多次胸部手术切除肿瘤，造成肺功能丧失、劳动力丢失和生存期缩短。因此，临床上急需一种创新的系统变革方案来解决这一难题。
根据美国国立综合癌症网络(NCCN)指南推荐，对早期肺癌合并多发结节可以考虑射频消融(RFA)治疗。RFA治疗损伤小，可以有效消灭局部癌细胞。
同时，RFA治疗还能够引发抗肿瘤免疫。多项针对不同类型肿瘤的实验均发现，RFA治疗后，患者外周血淋巴细胞中NK细胞绝对数量增加，抑制性受体水平降低，而功能性NK细胞活性增加，NK细胞的总体活力在短期内有大幅提升(Zerbini A, Pilli M, Laccabue Det al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinomastimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 2010; 138(5): 1931-42.，射频消融抑制小鼠乳腺癌肺转移[J]. 中华肿瘤杂志. 2015; 37: 497-500.)。
与手术治疗一样，虽然RFA治疗能够在较短时间内消灭肿瘤细胞，并引发抗肿瘤免疫，但这种较高水平的免疫监视与免疫防御功能并不能维持，在早期肺癌合并多发结节的治疗中，肿瘤复发依然是该治疗方案难以避免的问题。
因此，目前普遍认为，针对早期肺癌合并多发结节，最理想的治疗方案是局部治疗与系统治疗相结合。然而，系统治疗如化疗、靶向治疗或免疫治疗等都不适合早期肺癌合并多发结节手术后患者使用，急需有效的创新治疗方案。
发明内容
本发明的目的是提供褪黑素的一种药物新用途，即针对早期肺癌合并多发结节进行射频消融治疗后，褪黑素在抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变中的新用途。
事实上，本发明是提供了褪黑素在制备用于抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变的药物中的应用。
本发明还提供了褪黑素在制备用于促进射频消融诱发的NK细胞抗肿瘤免疫活性的药物中的应用。
进一步地，本发明优选的褪黑素使用剂量为3-10mg，更优选的使用剂量为5mg。
更进一步地，本发明中优选的药物褪黑素给药时间是在每晚给药一次。
优选地，本发明是将药物褪黑素通过经口的给药方式进行给药。
褪黑素(MLT)是一种调节昼夜节律和细胞氧化还原状态的内源性神经激素，其能调控线粒体功能，是重要的代谢调节剂和免疫调节分子。据报道，MLT能促进抗肿瘤免疫，并影响肿瘤细胞代谢，抑制肿瘤生长。
本发明研究发现，早期肺癌合并多发结节患者采用局部射频消融(RFA)治疗后，使用褪黑素(MLT)能够显著降低早期肺癌非射频治疗区域结节的恶变发生。
本发明研究中，在RFA治疗后使用MLT不仅可以微无创治愈早期肺癌合并多发结节主病灶，减少肺功能损伤及并发症发生，而且还可以大大降低非消融区肺结节的增大或恶变。
本发明同时在多发肺癌小鼠模型中重现了临床中观测到的现象，并且进一步揭示出RFA能够诱发抗肿瘤免疫，而MLT能特异性促进增强RFA诱发的NK细胞的抗肿瘤免疫活性。
通过对肿瘤的组学分析，本发明发现在RFA治疗后使用MLT，非消融区肿瘤组织内酸化和缺氧改善，线粒体有氧呼吸等功能得到增强，表明RFA治疗后使用MLT逆转了肿瘤标志性的糖酵解代谢。
同时本发明也发现，在RFA治疗后使用MLT，肿瘤中的MAPK、NFкB、Wnt和Hedgehog通路活性降低，激活p53通路，表明RFA治疗后使用MLT能够抑制肿瘤生长，降低肿瘤干性和恶性程度。
总体而言，本发明的系列临床及基础研究结果表明，MLT能显著促进RFA诱导的抗肿瘤免疫，在RFA治疗后使用MLT，能有效抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节的恶变发生，为此类疾病的临床治疗提供了一种新的解决方案。
附图说明
图1是各组小鼠肺癌模型非消融区瘤体变化情况。
A. 各组小鼠非消融区瘤体体积随时间变化趋势；B. 第21天时各组小鼠非消融区瘤体体积大小(**，p＜0.01；***，p＜0.005)。
图2是各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织增殖与凋亡免疫组化情况。
A. 非消融区肿瘤组织标本中HE、TUNEL、PCNA和CD133的表达；B. TUNEL表达的统计柱状图；C. PCNA表达的统计柱状图；D. CD133表达的统计柱状图。
图3是各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织内免疫细胞占比情况。
A、B、C、D分别是Control组、RFA组、MLT组和RFA+MLT组非消融区肿瘤组织的NK细胞流式细胞模式图；E、F、G、H、I分别是非消融区瘤体内NK细胞、巨噬细胞、 T细胞、B细胞和DC细胞占CD45+细胞的百分比(***，p＜0.001；**，p＜0.01；*，p＜0.05；ns，无统计学差异)。
图4是MLT促进NK细胞增殖和吞噬能力体外实验结果。
A. MLT促进NK细胞活力和增殖：不同浓度MLT(0mM，1mM，2mM)处理24h后NK92的细胞活力；B. MLT促进NK细胞吞噬能力(CCK8)：不同浓度MLT(0mM，1mM，2mM)e:t比值(1:1，2:1，5:1)下，NK92与K562细胞体外共培养；C. MLT促进NK细胞吞噬能力(荧光)：不同浓度MLT(0mM，1mM，2mM)e:t比值(1:1，2:1，5:1)下，NK92与K562细胞体外共培养的荧光图像和统计柱状图(*，p＜0.05；***，p＜0.005)。
图5是各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织转录及蛋白富集通路热图。
图6是各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织相关信号通路的蛋白印迹分析。
图7是各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织相关信号通路的RT-qPCR分析。
A. p53(Mdm4，Siva1，Fas，Igfbp3)，B. NFкB(Ptgs2，Cxcl1，Il1b)；C. MAPK(Hspa1b，Pgf，Fas，Angpt2，Cacna1g，Kit，Hspa1a，Map2k6，Dusp4)；D. Wnt(Sox17) (*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图8是各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织内线粒体相关基因与蛋白的多组学分析。
A. 各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织中线粒体电子传递链上各复合物的转录、蛋白组学分析；B. 各组小鼠肺癌模型非消融区肿瘤组织中溶酶体ATP酶亚基的转录、蛋白组学分析。
图9是早期肺癌合并多发结节病人临床治疗前后的CT图像。
A. RFA+MLT组入组病人特征CT：消融区术前(A1)，12个月后(A2)；非消融区术前(A3)及12个月后(A4)；B. 手术组入组病人特征CT：手术区术前(B1)，12个月后(B2)；非手术区0周(B3)及12个月后(B4)。
图10是早期肺癌合并多发结节病人临床治疗前后的结节大小、结节数目和肺功能变化统计结果。
A. RFA+MLT组和手术组结节平均大小术前及12个月后的变化(p＜0.05)；B. RFA+MLT组和手术组结节数目及12个月后的变化(p＜0.05)；C. RFA+MLT 组和手术组术前及12个月后肺功能的变化，包括FEV1、FEV1(% of predicted value)、MVV(*，p＜0.05)。
图11是RFA+MLT组及手术组的复发曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及到的实验方法、实验仪器及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规实验步骤并应用相应的仪器设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例中使用的各种试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
其中，下述实施例中射频消融缩写为RFA，褪黑素缩写为MLT。
临床研究中，在RFA治疗后使用MLT，用于治疗早期肺癌合并多发结节患者，经与手术治疗相比较，不仅疗效显著，而且并发症减少。RFA+MLT既可以极微创消融杀伤局部肺癌，同时抑制非消融区结节的增大与恶化，又可以减少肺功能损伤，减少并发症的发生。
临床研究随访两年发现，RFA+MLT无一例非消融区结节增大或恶变，而手术治疗有2例结节增大，2例结节恶变，RFA+MLT非消融区结节复发率显著低于手术治疗(0 vs 19%，p=0.0378)。因此，与现行的一线治疗方案手术相比，RFA+MLT治疗早期肺癌合并多发肺结节，可以明显减少非消融区肺结节的增大和恶变。
本发明进而设计动物模型验证临床结论，并进一步阐明可能的机制。
动物实验中发现，RFA联合MLT持续抑制非消融区肿瘤的生长，明显优于单一RFA或者MLT治疗组。同时，进一步探究非消融区肿瘤组织内免疫细胞的改变，发现RFA及RFA+MLT组NK细胞比例上升，且RFA+MLT组上升更明显，提示本研究中RFA联合MLT不仅可以物理消融降低手术处肿瘤负荷，还可以诱导NK细胞抗肿瘤免疫反应。本发明还通过体外实验验证了MLT能增强NK细胞的细胞活性及吞噬能力，表明MLT可以在RFA提升NK细胞数量的基础上，进一步增强NK抗肿瘤免疫，从而持续抑制非消融区瘤体生长。
为探讨RFA联合MLT抑制非消融区瘤体生长机制，本发明采用多组学进一步深入分析，发现在癌症相关通路中，RFA+MLT组p53通路上调，MAPK、NFкB、Wnt和Hedgehog通路下调。p53是抑癌基因，对肿瘤有监视作用，p53的缺失可使糖酵解增加，p53的上调标志着癌症增殖及恶性的下降。本发明发现非消融区肿瘤p53上调，有氧呼吸增强，提示RFA+MLT可以增强NK抗肿瘤免疫，降低非消融区肿瘤恶性程度，抑制肿瘤生长，这与临床和动物研究结论一致。
本发明RFA+MLT组NK抗肿瘤免疫活性提升可能与MLT提升线粒体功能有关。本发明研究发现，肿瘤组织线粒体复合物相关基因和活性蛋白上调，尤其是复合物V，RFA+MLT组的上调程度远高于单RFA组和MLT组，表明RFA+MLT组中MLT在RFA诱导下有效发挥逆转Warburg效应的作用，弥补了单用MLT时因瘤负荷较大仅能有限提升OXPHOS的弊端。本发明研究中还观察到RFA+MLT组非消融区溶酶体酶(v-ATP酶)相关基因和蛋白下调，提示v-ATP酶的表达抑制，改善肿瘤组织的酸性微环境。
以上研究数据均表明，RFA+MLT组非消融区瘤体中线粒体的代谢重编程及内环境等得到了改善，这些可能与非消融区NK细胞活性提升，瘤体生长得以抑制相关。肿瘤的发生是一个多信号网络相互调节的复杂过程，除能量代谢外，线粒体在生物合成、内环境稳态、信号转导调节等过程中的作用都与肿瘤发生发展密切相关。组学中看到脂质稳态、DNA修复、细胞周期质量控制等通路明显上调，这些功能的恢复也是肿瘤转向低恶性趋势的一个重要信号。
实施例1：小鼠多原发肺癌模型RFA+MLT有效消除消融区病灶并持续抑制非消融区肿瘤生长动物实验。
为模拟早期肺癌合并多发结节的临床治疗，并深入探究其机制，本实施例设计了系列动物实验，在C57BL/6小鼠的双侧背部外侧部位，皮下注射1×105小鼠Lewis肺癌细胞(LLC细胞)，待肿瘤生长至体积250mm3时，将种瘤后小鼠随机分为以下四组(每组n=8)：对照组(Control组)、射频消融组(RFA组)、褪黑素组(MLT组)和射频消融+褪黑素组(RFA+MLT组)。
其中，对RFA组和RFA+MLT组小鼠右侧肿瘤进行完全射频消融，保留左侧肿瘤不消融，作为非消融区肿瘤进行观察。
在RFA治疗后第二天，对MLT组和RFA+ MLT组给予MLT溶液腹腔注射(10mg/kg，0.1mL，每周2次)。
每7天测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。
待4周后处死小鼠，收集小鼠皮下成瘤瘤体，测量大小。留取新鲜组织和石蜡包埋组织，行转录组和代谢组检测，并测定瘤体组织的mPTP、ATP、NK细胞、DC细胞等。
通过观察4组小鼠非消融区瘤体大小的发展变化情况，模拟临床研究患者非消融区肺部结节的发展。
如图1中A所示，RFA+MLT组非消融区瘤体术后7天即明显小于Control组、RFA组及MLT组，在术后21天，其瘤体大小已缩小为初始瘤体的三分之一。从图1中B可以看出，RFA+MLT组非消融区瘤体发展速度显著低于其他三组，表明RFA+MLT可以持续有效抑制非消融区肿瘤生长。
小鼠非消融区肿瘤组织的免疫组化显示如图2所示，可以看出，与Control组、RFA组和MLT组比较，RFA+MLT组非消融区肿瘤组织的细胞增殖减少(PCNA)，细胞凋亡增加(TUNEL)。更重要的是，还检测到RFA+MLT组非消融区肿瘤组织中CD133的表达明显下降，这表明RFA+MLT组非消融区肿瘤组织中干细胞减少。
同时，实验过程中4组小鼠的体重并无明显变化，说明经过RFA处理后，小鼠的营养和生长状况无明显变化，可以排除应激反应对小鼠瘤体大小的影响。
实施例2：RFA+MLT显著增加小鼠非消融区肿瘤组织中NK细胞浸润，促进NK抗肿瘤免疫动物实验。
RFA+MLT处理能显著抑制小鼠非消融区肿瘤生长。
如图3所示，本实施例使用流式细胞术分析各组肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况，在小鼠非消融区肿瘤组织中发现RFA能显著促进M细胞、B细胞、DC细胞和NK细胞的浸润。进一步的分析表明，相较于RFA组，RFA+MLT组肿瘤组织内的NK细胞数量明显增高，因此推测MLT可能通过促进RFA诱发的NK抗肿瘤免疫，与RFA产生了协同抑瘤作用。
实施例3：MLT促进NK细胞活力和增殖，增强NK细胞吞噬能力体外实验。
实施例2证明了MLT能影响NK细胞活性。本实施例通过体外培养实验，进一步证明MLT可以显著提高NK细胞的活力，但对T细胞的活力没有影响。
收集生长状态良好的NK细胞，加入不同浓度的MLT，培养箱中培养24小时后，加入CCK8试剂孵育1-4小时，以酶标仪检测450nm处的OD值，计算细胞的增殖抑制率如图4A所示。
将K562细胞铺在12孔板中，每个孔中密度1.5×105，在指定的e:t比值下加入NK92细胞，加入不同浓度的MLT，培养箱中共培养24小时，将染色细胞在倒置NikonTi-s荧光显微镜下成像(图4C)，并利用CCK8试剂检测细胞的增殖情况。结果表明，随着浓度的增加，MLT可以有效促进NK细胞杀伤K562细胞(图4B、C)。
本实施例结果表明，MLT可以增强NK的活性，促进抗肿瘤免疫，进而与RFA协同抑制非消融区肿瘤生长。
实施例4：RFA+MLT降低小鼠非消融区肿瘤恶性程度并改善肿瘤微环境。
为进一步探究RFA+MLT针对早期肺癌合并多发结节的疗效和机制，本实施例对小鼠模型非消融区肿瘤进行转录和蛋白组学分析。
实验发现，各组小鼠非消融区瘤体出现一系列基因/蛋白变化，这些变化主要集中在27种通路。如图5所示，左侧为转录组学富集结果，右侧为蛋白组学富集结果，线粒体代谢显著增强，NFкB、Wnt、HIF和Hedgehog相关通路活性改变。表明RFA+MLT显著促进线粒体代谢等通路的上调，这些基因主要集中在Nduf基因家族、Cox基因家族、Uqcr基因家族，它们都是线粒体能量代谢中线粒体系列复合物、线粒体核糖体、呼吸链电子转移过程中的重要因子。
蛋白组数据也得到了类似结果。
因此，这些数据表明RFA+MLT治疗降低了肿瘤特异的Warburg能量代谢，促进了线粒体功能，这与前面实施例验证的RFA+MLT治疗后肿瘤生长速率下降的数据一致。
图5中，基于转录与蛋白组学分析结果，发现经RFA+MLT治疗后，与癌症增殖、凋亡(MAPK、p53)、肿瘤恶性及干性相关通路(NFкB、Wnt、Hif1和Hedgehog)有显著改变。
为此，本实施例分别对这些通路作了western Blotting或RT-qPCR分析验证。
如图6所示，RFA+MLT治疗可以下调以下信号通路相关蛋白，MAPK(P-erk，Foxo3，PKC，ERK2和STAT3)，NFкB(Rela，BTK和CSNK2A1)，Wnt(c-myc，β-catenin，p-β-catenin和CyclinD1)，Hedgehoge(β-arrestin1和Gli1)，并上调p53信号通路相关蛋白(Cleaved-BID和P53)，这些数据表明，RFA+MLT治疗可以抑制肿瘤生长，降低其恶性程度。
此外，RT-qPCR分析验证，本实施例还发现MAPK(HSPA1b、PGF、FAS、Angpt2等)中的相关基因（图7C），NFкB(Ptgs2、Cxcl1、Il1b和Sox17)（图7B）和Wnt(Sox17)（图7D）信号通路均符合下调趋势，p53通路相关基因(Siva1)上调(图7A)。
据报道，p53是抑癌基因，对肿瘤有监视作用；MAPK通路在细胞凋亡和细胞存活中起着至关重要的作用，NFкB可以通过细胞增殖、凋亡、肿瘤转移、代谢重编程等机制促进肿瘤进展，HIF-1α协同NFкB维持肿瘤的恶性表型；Wnt/β-catenin信号通路是与免疫逃避相关的最关键致癌途径，Hedgehog通路可以调节肿瘤干细胞的活力及更新，维持肿瘤恶性。
本实施例研究中，RFA+MLT治疗降低非消融区肿瘤中MAPK、NFкB、Wnt和Hedgehog通路的活性，并上调p53通路，抑制肿瘤生长，降低肿瘤恶性程度。这些数据均与多组学分析结果一致，表明RFA+MLT治疗具有抑制肿瘤生长、降低肿瘤恶性程度的作用。
图8的多组学综合分析为RFA+MLT治疗的潜在机制提供了一个全局观点。本实施例发现，如图8A所示，与电子转运链中起主导作用的各复合物，包括复合物I(NADH脱氢酶)、复合物II(琥珀酸脱氢酶)、复合物III(UQ-细胞色素C脱氢酶)和复合物IV(细胞色素c氧化酶)息息相关的基因均上调，如NDUF家族、SDHB、CYC1、UQCR家族、COX家族和PPA1基因；同时，复合物V(ATP合成酶)相关蛋白(ATP5PD)也明显上调。这些组学数据均表明，RFA+MLT治疗通过增强线粒体中复合物I、II、III、IV和V的活性，促进OXPHOS释放能量，逆转肿瘤代谢重编程。
如图8B所示，与溶酶体(v-ATP酶)密切相关的基因和蛋白质atp6v1b2、atp6v1a、atp6v1e1在RFA+MLT组表达明显降低，表明RFA+MLT治疗可能抑制非消融肿瘤组织中v-ATPase的表达。v-ATPase的表达抑制，减轻肿瘤微环境中的酸性，进而改善内环境，发挥抗肿瘤作用。
实施例5：在RFA治疗后使用MLT消除早期肺癌并有效预防合并多发结节增大的临床研究。
本研究纳入2018年1月至2018年6月经过经皮肺穿刺或外科手术病理明确为早期肺癌合并多发肺结节患者共42例。
将42例患者随机分为两组，21例患者接受RFA+MLT联合治疗(RFA+MLT组)，21例患者接受手术治疗(手术组)。两组患者根据性别、年龄、吸烟史、病理类型和主病灶大小1∶1匹配，观察两组患者非治疗区域结节的发展情况、肺功能变化和并发症发生率。
本研究获得了上海市第十人民医院伦理委员会的批准。
具体分组情况如表1所述，RFA+MLT组平均年龄58.48岁(38-82岁)，手术组平均年龄58.47岁(36-78岁)；RFA+MLT组和手术组中各有女性13例(61.9%)，各有吸烟患者3例(14.29%)。
对于早期肺癌合并多发肺结节患者，结节大小是影响治疗的关键因素。RFA+MLT组患者肺结节平均直径0.88cm(±0.22)，手术组患者平均直径0.89cm(±0.17)。肺结节形态方面，RFA+MLT组有pGGO 13例(61.90%)，mGGO 8例(38.10%)，手术组有pGGO 15例(71.43%)，mGGO 6例(28.57%)。两组患者病理类型基本匹配。RFA+MLT组和手术组均包含不典型腺瘤样增生(AAH)10例，原位癌(AIS)11例。
Figure 709373DEST_PATH_IMAGE001
RFA+MLT组通过RFA消融最大结节，术后一周给予MLT口服，5mg，每晚一次，口服1年。
手术组通过单孔胸腔镜对最大结节实施楔形切除，术后持续随访。
在射频消融或手术后的第1、3、6、9和12个月，低剂量薄层CT进行扫描，通过比较CT图像中治疗区域和非治疗区域结节的大小和几何形状来评估局部疗效。同时，射频消融或手术后1、3、6、9和12个月进行身体检查和实验室检查，包括肿瘤标志物检测和生化检查。射频消融或手术后3个月进行肺功能检查。
研究终点包括RFA+MLT组及手术组的不良事件和1年局部疗效、复发风险。使用美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准4.0版评估毒性，并记录1级以上不良事件，包括2至4级。
采用Wilcoxon秩和检验、卡方检验或Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)检验，比较不同治疗方法与变量之间的相关性。连续数据使用t检验比较。比较RFA+MLT组和手术组患者的1年复发率、不良反应、住院时间、肺功能变化。使用R软件包(版本3.4.1)和SAS软件(版本9.4；SAS Institute，Cary，NC)进行所有计算。p＜0.05定义为统计学差异。
本研究中，对21名RFA+MLT组患者和21名手术组患者12个月的随访结果如表2所示。
Figure 98897DEST_PATH_IMAGE002
RFA+MLT组中，RFA处理的结节18例(85.71%)形成纤维索，3例(14.29%)缩小，手术组手术处理病灶全部消失，典型病例CT如图9中A1、A2及B1、B2所示。
然而最重要的是，在1年的随访中，RFA+MLT组21例患者的非消融区结节均无明显增大，典型病例CT如图9中A3、A4所示。但在21例手术患者中，发现4例有新发或增大的结节，其中2例经再手术诊断为侵袭性腺癌(图9中B3、B4)。具体统计结果见图10中A和B。
两组患者治疗后12个月，非治疗区结节的总体变化为0/21对4/21，RFA+MLT组与手术组之间的复发率分别为0%对19%(p=0.0377)，两组间有显著性差异(图11)，本研究手术复发率与亚洲区其他中心的数据(21%)近似。
此外，通过术后的肺功能数据分析发现，RFA+MLT组患者的肺功能在消融术前后(12个月)无显著性下降，而手术组在手术前后(12个月)有显著性下降(图10C)。
入组的42个早期肺癌合并多发肺结节患者中，RFA+MLT组无严重并发症，而手术组并发症发生率较高，21例均伴随胸痛，其中7例(80.95%)有胸腔积液。另外，RFA+MLT组治疗患者的住院时间及治疗费用也明显低于手术组。
上述系列临床研究结果显示，采用局部RFA联合MLT治疗，可以显著抑制早期肺癌合并多发结节患者非消融区肺结节的增大或恶变，还可减少肺功能损伤及并发症发生。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.褪黑素在制备用于抑制早期肺癌合并多发结节非消融区结节恶变的药物中的应用。
2.褪黑素在制备用于促进射频消融诱发的NK细胞抗肿瘤免疫活性的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述褪黑素的使用剂量为3-10mg。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述褪黑素的使用剂量为5mg。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述褪黑素在每晚给药一次。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是所述褪黑素通过经口方式进行给药。
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