CN112745388A - 一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法。将白色霞水母抗毒素经过胃蛋白酶切割去除重链恒定区Fc片段，然后利用凝胶过滤色谱技术除去Fc片段和胃蛋白酶，最终获得分子量约为90kDa的高纯度白色霞水母精制抗毒素。本发明具有快速、有效等特点，为研制白色霞水母毒素解毒药物提供重要方法指导。

Description

一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法。
背景技术
近年来，全球水母暴发现象逐年加重，水母蜇伤事件频繁发生，对游客、渔民、海军等涉海人员的健康和生命安全构成极大威胁。水母蜇伤轻者皮肤出现皮疹、红肿、瘙痒，令被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。我国是水母爆发重灾区，其中白色霞水母(拉丁名为Cyanea nozakii Kishinouye)是我国海域主要伤人水母之一，其伞径约40～60cm，触手可长达2米至数米，每年造成的众多水母蜇伤现象，水母蜇伤已成为严重的公共健康与安全问题。水母蜇伤是水母通过触手表面的刺丝囊细胞毒液注入到受害者体内从而导致蜇伤中毒症状，水母毒液中含有大量毒素(主要是一类蛋白类物质)，如溶血活性、肌肉毒性、肾脏毒性、心脏血管毒性、肝脏毒性和致死毒性等毒素；不但能够造成皮肤、脏器损伤，还可导致被蜇伤者死亡。但是，到目前为止我国尚无治疗水母蜇伤的专用药物，更无应对重症水母蜇伤的特效急救药。抗毒血清是目前世界治疗有毒动物咬伤或蜇伤的最有效的首选急救药物，如广泛应用的抗蛇毒血清等，及时注射抗毒血清可大大增加咬伤或蜇伤患者的生存几率，同时为后续抢救和治疗赢得宝贵时间。最早使用抗毒全血清中含有大量非中和抗体外的其它血清蛋白等成分，中和抗体虽能中和毒素毒性，而其它血清蛋白进入人体后作为新的抗原引起人体免疫反应，从而产生过敏等副反应症状，致使抗毒全血清的安全性较低；随着科技的发展，科学家可以有效将中和抗体从抗毒粗血清中提纯出来制备出第二代抗毒血清(即毒素抗体)，从而有效降低了血清中非中和抗体成分造成的毒副反应；毒素抗体主要是免疫球蛋白IgG,它是由2条重链和2条轻链通过二硫键链接成的Y型结构的免疫球蛋白，包括抗原结合区Fab和重链恒定区Fc；制备抗毒血清使用的动物通常为兔、马等，这些动物产生的抗体蛋白IgG相对于人体也属于外源蛋白质，尤其是非毒素蛋白结合区Fc片段可引起人体免疫反应造成一定的毒副作用。所以，去除IgG抗体的Fc片段的抗毒素既保留了毒素识别区Fab的中和部位，又切除了IgG抗体中可能引起人体免疫应答的Fc片段，既实现抗毒素的有效性。目前，有两类去除Fc片段的IgG抗体：Fab型和F(ab’)2型。但是并非所有类型抗毒素都具有很好有效性，由于单一Fab型抗毒素不能与抗原形成多价免疫复合物而不能被吞噬细胞清除，所以其有效性较差，进而制备获得F(ab’)2类型白色霞水母精制抗毒素，进一步提供一种有效性强、并保障其安全性的方式方法，将是具有重要科学意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法:
1)将白色霞水母抗毒素在预冷的缓冲液中透析过夜，2～6℃离心，收集上清液，待用；
2)将步骤1)所得上清液中加入胃蛋白酶，37℃下将Fc片段从抗毒素中切离，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
3)将步骤2)所得的酶解液浓缩后使用凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60，去除酶解液中的Fc片段和胃蛋白酶，最终得到高纯度的白色霞水母精制抗毒素。
所述步骤1)中缓冲液为pH＝2.0～3.0，浓度为20-50mM甘氨酸缓冲液，而后在2～6℃下10000～15000g离心10～20min，收集上清液待用。
所述步骤2)将所得上清液中加入胃蛋白酶，37℃下将Fc片段从抗毒素中切下，酶切完成后加入终止液使酶切反应停止，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；其中，胃蛋白酶与白色霞水母抗毒素的质量比为1:50～1:200，反应时间为20～40min。
所述酶切反应后向体现内加入终止液，终止液加入量为1/10的总酶切反应体积；其中，终止液为pH＝6.0～8.0,浓度为200～500mM PBS缓冲液。
所述步骤3)凝胶过滤条件为：20～50mM Tris-HCl,0.15M NaCl洗脱液洗脱，流速为0.8～1.2ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积为68-82ml)获得白色霞水母精制抗毒素。
本发明的优点：
1.本发明白色霞水母精制抗毒素的制备方法，为开发白色霞水母严重蜇伤的急救药物提供了重要指导；
2.采用本发明方法将白色霞水母抗毒素经过特定的胃蛋白酶，以及特定用量下，可准确并有效的切割去除重链恒定区Fc片段，然后利用凝胶过滤色谱技术除去Fc片段和胃蛋白酶，进而最终获得分子量约为90kDa的高纯度F(ab’)2型白色霞水母精制抗毒素，可见本发明具有快速、有效等特点。
3.本发明白色霞水母抗毒素的酶切和纯化方法具有效率高、分辨率高等特点，仅需一步纯化即可获得高纯度的白色霞水母精制抗毒素，既提高了产率又有效缩短制备时间，减少白色霞水母精制抗毒素在制备过程中的损失。
附图说明
图1为本发明实施例3提供的白色霞水母精制抗毒素纯化图谱。
图2为本发明实施例3提供的白色霞水母精制抗毒素SDS-PAGE纯度分析。
图3为白色霞水母不同酶用量比下的SDS-PAGE图。
图4为白色霞水母不同酶切时间下的SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1
1)白色霞水母抗毒素的酶切制备：
将10mg白色霞水母抗毒素在预冷的pH＝2.0，浓度为20mM甘氨酸缓冲液中透析过夜，而后在2℃下10000g离心10min，收集上清液待用；采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，分别测定白色霞水母抗毒素和胃蛋白酶的蛋白浓度，并且按照白色霞水母抗毒素：胃蛋白酶(w:w)＝1:50的比例混合，37℃下反应20min后加入200mM PBS缓冲液终止反应，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
2)白色霞水母精制抗毒素的分离与纯化：
①上样前样品的预处理：将得到白色霞水母抗毒素的酶解液使用截留分子量为10KDa的浓缩管进行浓缩，收集浓缩液；
②上样和洗脱：
将白色霞水母抗毒素酶解浓缩液利用蛋白质快速纯化系统AKTA pure配合凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60进行分离纯化，洗脱液为20mM Tris-HCl,0.15M NaCl，流速为0.8ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积约为68-82ml)，获得白色霞水母精制抗毒素。
3)SDS-PAGE纯度检测：将步骤2)凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60分离到的各个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。
4)白色霞水母精制抗毒素的体内中和作用检测：实验分为三组：空白对照组、毒素组和解毒组。每组使用10只(5雌5雄)16-18gSPF级KM小鼠，分别通过腹腔向空白对照小鼠注射0.7ml20mM Tris-HCl,0.15M NaCl缓冲液，向毒素组注射0.7ml白色霞水母毒素，向解毒组注射0.7ml等量白色霞水母毒素和上述步骤2)获得精制抗毒素的预混液，混合比例为5:3(质量比)，观察和记录小鼠4天内的生存状况。实验显示，白色霞水母精制抗毒素对白色霞水母毒素具有较好的中和作用。
实施例2
1)白色霞水母抗毒素的酶切制备：
将10mg白色霞水母抗毒素在预冷的pH＝2.5，浓度为30mM甘氨酸缓冲液中透析过夜，而后在4℃下12000g离心15min，收集上清液待用；采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，分别测定白色霞水母抗毒素和胃蛋白酶的蛋白浓度，并且按照白色霞水母抗毒素：胃蛋白酶(w:w)＝1:100的比例混合，37℃下反应30min后加入300mM PBS缓冲液终止反应，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
2)白色霞水母精制抗毒素的分离与纯化：
①上样前样品的预处理：将得到白色霞水母抗毒素的酶解液使用截留分子量为10KDa的浓缩管进行浓缩，收集浓缩液；
②上样和洗脱：
将白色霞水母抗毒素酶解浓缩液利用蛋白质快速纯化系统AKTA pure配合凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60进行分离纯化，洗脱液为30mM Tris-HCl,0.15M NaCl，流速为1ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积约为68-82ml)，获得白色霞水母精制抗毒素。
3)SDS-PAGE纯度检测：将步骤2)凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60分离到的各个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。
4)白色霞水母精制抗毒素的体内中和作用检测：实验分为三组：空白对照组、毒素组和解毒组。每组使用10只(5雌5雄)16-18g SPF级KM小鼠，分别通过腹腔向空白对照小鼠注射0.7ml 30mM Tris-HCl,0.15M NaCl缓冲液，向毒素组注射0.7ml白色霞水母毒素，向解毒组注射0.7ml等量白色霞水母毒素和上述步骤2)获得精制抗毒素的预混液，混合比例为5:3，观察和记录小鼠4天内的生存状况。实验显示，白色霞水母精制抗毒素对白色霞水母毒素具有较好的中和作用。
实施例3
1)白色霞水母抗毒素的酶切制备：
将10mg白色霞水母抗毒素在预冷的pH＝3，浓度为50mM甘氨酸缓冲液中透析过夜，而后在4℃下15000g离心20min，收集上清液待用；采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，分别测定白色霞水母抗毒素和胃蛋白酶的蛋白浓度，并且按照白色霞水母抗毒素：胃蛋白酶(w:w)＝1:200混合，37℃下反应40min后加入500mM PBS缓冲液终止反应，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
2)白色霞水母精制抗毒素的分离与纯化：
①上样前样品的预处理：将得到白色霞水母抗毒素的酶解液使用截留分子量为10KDa的浓缩管进行浓缩，收集浓缩液；
②上样和洗脱：
将白色霞水母抗毒素酶解浓缩液利用蛋白质快速纯化系统AKTA pure配合凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60进行分离纯化，洗脱液为50mM Tris-HCl,0.15M NaCl，流速为1ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积约为68-82ml)，获得白色霞水母精制抗毒素(参见图1)。
3)SDS-PAGE纯度检测：将步骤2)凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60分离到的各个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳检测其纯度(参见图2)。
6)白色霞水母精制抗毒素的体内中和作用检测：实验分为三组：空白对照组、毒素组和解毒组。每组使用10只(5雌5雄)16-18g SPF级KM小鼠，分别通过腹腔向空白对照小鼠注射0.7ml 50mM Tris-HCl,0.15M NaCl缓冲液，向毒素组注射0.7ml白色霞水母毒素，向解毒组注射0.7ml等量白色霞水母毒素和上述步骤2)获得精制抗毒素的预混液，混合比例为5:3，观察和记录小鼠4天内的生存状况。实验显示，白色霞水母精制抗毒素对白色霞水母毒素具有很好的中和作用(参见表1)。
由上述图表1-3可见，图1是白色霞水母抗毒素酶切后利用凝胶色谱柱Superdex200 16/60主要分成两个洗脱峰，第一个洗脱峰为白色霞水母精制抗毒素，第二个洗脱峰为切除的Fc部分，可以明显看出两部分实现显著的分离；图2的电泳图可以明显看出白色霞水母抗毒素分子量约在150kDa，酶切后白色霞水母抗毒素分为90kDa的精制抗毒素和Fc部分，经过Superdex200 16/60纯化后可以得到高纯度的白色霞水母精制抗毒素。表1显示了，白色霞水母毒素实验组小鼠在注射后1小时只有60％小鼠存活，而4小时仅有50％小鼠存活；使用本申请专利获得的白色霞水母精制抗毒素中和毒素注射后3小时并无小鼠死亡，注射4小时有90％小鼠可存活，明显延长小鼠存活数量和时间。
表1
Figure BDA0002779200970000051
实施例4
1)白色霞水母抗毒素的酶切制备：
将10mg白色霞水母抗毒素在预冷的pH＝3，浓度为50mM甘氨酸缓冲液中透析过夜，而后在4℃下15000g离心20min，收集上清液待用；采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，分别测定白色霞水母抗毒素和胃蛋白酶的蛋白浓度，并且将白色霞水母抗毒素与不同量的胃蛋白酶混合，即白色霞水母抗毒素：胃蛋白酶(w:w)＝1:50、1:100、1:200、1:500或1:1000，37℃下反应20min后加入500mM PBS缓冲液终止反应，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
2)白色霞水母精制抗毒素的分离与纯化：
①上样前样品的预处理：将得到白色霞水母抗毒素的酶解液使用截留分子量为10KDa的浓缩管进行浓缩，收集浓缩液；
②上样和洗脱：
将白色霞水母抗毒素酶解浓缩液利用蛋白质快速纯化系统AKTA pure配合凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60进行分离纯化，洗脱液为50mM Tris-HCl,0.15M NaCl，流速为1ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积约为68-82ml)，获得白色霞水母精制抗毒素(参见图1)。
3)SDS-PAGE纯度检测：将步骤2)凝胶过滤色谱柱Superdex200 16/60分离到的各个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳检测其纯度(参见图3)。
由图3在白色霞水母抗毒素与不同量的胃蛋白酶混合比例经酶切后可见，1:500或1:1000比例下并未切除白色霞水母抗毒素，由此只有在特定的胃蛋白酶，以及特定用量下，将其对白色霞水母抗毒素作用可准确并有效的切割去除重链恒定区Fc片段，然后利用凝胶过滤色谱技术除去Fc片段和胃蛋白酶，最终获得分子量约为90kDa的高纯度F(ab’)2型白色霞水母精制抗毒素。
实施例5
1)白色霞水母抗毒素的酶切制备：
将10mg白色霞水母抗毒素在预冷的pH＝3，浓度为50mM甘氨酸缓冲液中透析过夜，而后在4℃下15000g离心20min，收集上清液待用；采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，分别测定白色霞水母抗毒素和胃蛋白酶的蛋白浓度，并且按白色霞水母抗毒素：胃蛋白酶(w:w)＝1:100，37℃下不同时间下(5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min)进行酶切反应，后加入500mM PBS缓冲液终止反应，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
2)白色霞水母精制抗毒素的分离与纯化：
①上样前样品的预处理：将得到白色霞水母抗毒素的酶解液使用截留分子量为10KDa的浓缩管进行浓缩，收集浓缩液；
②上样和洗脱：
将白色霞水母抗毒素酶解浓缩液利用蛋白质快速纯化系统AKTA pure配合凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60进行分离纯化，洗脱液为50mM Tris-HCl,0.15M NaCl，流速为1ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积约为68-82ml)，获得白色霞水母精制抗毒素(参见图1)。
3)SDS-PAGE纯度检测：将步骤2)凝胶过滤色谱柱Superdex200 16/60分离到的各个洗脱峰进行SDS-PAGE电泳检测其纯度(参见图4)。
由图4在不同时间下经酶切后可见，只有在特定的胃蛋白酶，以及特定用量下，将其对白色霞水母抗毒素作用可准确并有效的切割去除重链恒定区Fc片段，然后利用凝胶过滤色谱技术除去Fc片段和胃蛋白酶，最终获得分子量约为90kDa的高纯度F(ab’)2型白色霞水母精制抗毒素。
综上可见本发明方法采用特定的胃蛋白酶、特定用量以及酶切时间下，将其对白色霞水母抗毒素作用可准确并有效的切割去除重链恒定区Fc片段，然后利用凝胶过滤色谱技术除去Fc片段和胃蛋白酶，最终获得分子量约为90kDa的高纯度F(ab’)2型白色霞水母精制抗毒素，既保留了该抗毒素的有效性，又降低了其潜在的副作用，使其得到精制，可见本发明具有快速、有效等特点，并为研制白色霞水母毒素解毒药物提供重要方法指导。

Claims (5)

1.一种白色霞水母精制抗毒素的制备方法，其特征在于：
1)将白色霞水母抗毒素在预冷的缓冲液中透析过夜，2～6℃离心，收集上清液，待用；
2)将步骤1)所得上清液中加入胃蛋白酶，37℃下将Fc片段从抗毒素中切离，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；
3)将步骤2)所得的酶解液浓缩后使用凝胶过滤色谱柱Superdex 200 16/60，去除酶解液中的Fc片段和胃蛋白酶，最终得到高纯度的白色霞水母精制抗毒素。
2.按权利要求1所述的白色霞水母精制抗毒素的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中缓冲液为pH＝2.0～3.0，浓度为20-50mM甘氨酸缓冲液，而后在2～6℃下10000～15000g离心10～20min，收集上清液待用。
3.按权利要求1所述的白色霞水母精制抗毒素的制备方法，其特征在于：所述步骤2)将所得上清液中加入胃蛋白酶，37℃下将Fc片段从抗毒素中切下，酶切完成后加入终止液使酶切反应停止，得到白色霞水母抗毒素的酶解液；其中，胃蛋白酶与白色霞水母抗毒素的质量比为1:50～1:200，反应时间为20～40min。
4.按权利要求3所述的白色霞水母精制抗毒素的制备方法，其特征在于：所述酶切反应后向体现内加入终止液，终止液加入量为1/10的总酶切反应体积；其中，终止液为pH＝6.0～8.0,浓度为200～500mM PBS缓冲液。
5.按权利要求1所述的白色霞水母精制抗毒素的制备方法，其特征在于：所述步骤3)凝胶过滤条件为：20～50mM Tris-HCl,0.15M NaCl洗脱液洗脱，流速为0.8～1.2ml/min,收集第一个洗脱峰(保留体积为68-82ml)获得白色霞水母精制抗毒素。
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