CN112730557B - 一种直接实时检测no的电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电化学传感器技术领域，具体公开了一种直接实时检测NO的电化学传感器及其制备方法。本发明的NO电化学传感器的制备方法包括：在玻碳电极表面滴加氧化石墨烯分散液，晾干后得到氧化石墨烯修饰玻碳电极；将氧化石墨烯修饰玻碳电极置于含有偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，采用电化学聚合法制得聚偶氮胭脂红B‑氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极；在聚偶氮胭脂红B‑氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极表面滴加Nafion溶液，自然晾干即得NO电化学传感器。本发明的NO电化学传感器，可实现液相中NO含量的直接快速检测，此外，还具有线性范围宽、灵敏度高、检出限低、响应时间短、抗干扰能力强等优点，有望在生物医学分析检测领域发挥重要作用。

Description

一种直接实时检测NO的电化学传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域，具体涉及一种直接实时检测NO的电化学传感器及其制备方法。
背景技术
NO(一氧化氮)在许多生理和病理过程中起着生物信号分子的作用。NO具有多种血管保护特性，比如说血管扩张、抑制内皮细胞凋亡、血小板聚集等。内源性NO的代谢氧化物为NO2 -和NO3 -，代谢氧化物在缺氧、缺血或者损伤的组织中又能产生NO。硝酸盐和亚硝酸盐衍生的NO又可以参与细胞的保护、限制缺血导致的细胞凋亡以及调节细胞信号。NO在生物体内扮演着如此重要的角色，因此NO的测定在缺氧、营养和治疗等生理过程中越来越重要。但NO是一种自由基小分子，化学反应活性高，半衰期很短，且容易被O2氧化形成NO2 -和NO3 -，这给NO的实时准确检测带来了很大困难。
目前已经建立了多种NO的检测方法，如电子自旋共振光谱法，化学发光法，重氮化反应法，荧光分光光度法，电化学传感法等，其中，化学发光法、重氮化反应法、荧光分光光度法大多是基于特定试剂与NO反应以后生成特定光学物质，然后再通过对光学物质的检测间接地实现对NO的定量分析，这些方法操作复杂、费时、且特异性不高；电子自旋共振光谱法是检测自由基最直接、最特异和最有效的方法，但灵敏度低、线性范围窄、仪器昂贵、技术要求高，而电化学传感法不仅可以实现对NO的直接实时检测，而且还具有操作简单、成本低等优点，为NO的实时检测和生物样品分析提供了一种既实用又简便的方法。
依据电化学传感的机理不同，电化学传感法可分为直接氧化法、电催化氧化法、直接还原法和电催化还原法，其中直接氧化法和还原法因工作电位过高或过低而造成传感器抗干扰能力较差，而且方法灵敏度低，因此已基本被淘汰；电催化还原法通常需要以一些蛋白分子作为NO电催化还原剂，这在一定程度上增加了传感器的成本，同时，电催化还原法也存在灵敏度低的缺点；电催化氧化法是以NO敏感功能材料作为电催化剂，催化NO的电化学氧化，以获得放大的电流信号，方法灵敏度高、选择性好，是目前NO电化学传感领域最受关注的方法。
NO敏感功能材料是NO电化学传感器的核心部件，对传感器的各项性能指标起着决定性作用。近年来，新型纳米材料尤其是新型碳纳米材料的出现，在很大程度上促进了NO电化学传感器的发展。作为新型碳纳米材料的其中一员，石墨烯是一种共价键合单层碳原子的二维薄片，具有非常好的强度、大的比表面积、好的热传导性能、良好的光学性能等物理特性，近年来在电化学传感领域应用广泛。将石墨烯应用于NO电化学传感器的研究工作也有报道，但仍存在制备过程复杂、线性范围窄以及响应时间长等问题，限制了传感器的应用范围。
基于此，本课题组在国家自然科学基金(61501526，21804146，22004134)，湖北省自然科学基金(2018CFC836，2020CFB313)，中央高校基本科研业务费(CZY20006，CZY19040,CZY18028,CZQ18014)的资助下，开发了一种可实现NO直接实时检测的电化学传感器，该传感器制备方法简单、性能优良，有望在生物医学分析检测领域发挥重要作用。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种直接实时检测NO的电化学传感器及其制备方法。
第一方面，本发明提供了一种直接实时检测NO的电化学传感器的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
S1、在玻碳电极(Φ＝3mm)表面滴加氧化石墨烯分散液，晾干后得到氧化石墨烯修饰玻碳电极：GO/GCE；
S2、将S1得到的氧化石墨烯修饰玻碳电极置于含有偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，采用电化学聚合法制备得到聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极：PACB/GO/GCE；
S3、在S2得到的聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极表面滴加Nafion溶液，自然晾干，得到复合电极Nafion/PACB/GO/GCE，即直接实时检测NO的电化学传感器，所述直接实时检测NO的电化学传感器能直接实时检测NO。
进一步，所述步骤S1中玻碳电极在滴加氧化石墨烯分散液之前，可对玻碳电极进行预处理，如对玻碳电极进行抛光及清洗。
进一步，所述步骤S1中滴加的氧化石墨烯分散液为单层氧化石墨烯水分散液：浓度为0.5～1.5mg/mL(优选浓度为1.0mg/mL)，体积为4～10μL(优选体积为8μL)；氧化石墨烯比表面积不小于2600m2/g。
进一步，所述步骤S2中采用电化学聚合法制备聚偶氮胭脂红B薄膜，具体包括：以100mV/s的扫描速率，在-0.2～1.6V的电位范围内，循环伏安扫描15～30圈(优选扫描30圈)。
进一步，所述步骤S2中支持电解质是惰性的支持电解质，可以是无机盐、无机酸或缓冲剂，在水溶液中使用的有KNO3、Na2SO4等。
进一步，所述步骤S2中含有偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，偶氮胭脂红B的浓度为1mg/mL～10mg/mL，支持电解质的浓度为0.1mol/L～1.0mol/L。
优选的，所述步骤S2中支持电解质是H2SO4，含有偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，偶氮胭脂红B的浓度为1mg/mL～10mg/mL(优选浓度为5mg/mL)，H2SO4的浓度为0.1mol/L～1.0mol/L(优选浓度为0.5mol/L)。
进一步，所述步骤S3中滴加的Nafion溶液：其浓度为0.2％～1.0％(优选浓度为0.5％)，体积为1～5μL(优选体积为2μL)。
第二方面，本发明还提供了一种直接实时检测NO的电化学传感器，采用上述制备方法制得。
第三方面，本发明还提供了上述直接实时检测NO的电化学传感器在检测NO浓度中的应用。
进一步，所述电化学传感器能实现液相中NO的直接实时检测，具体步骤为：(1)以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学传感器为工作电极，构建三电极系统；(2)将三电极系统置于0.1mol/L pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液中；(3)以0.85V作为工作电位，进行安培响应法测定；(4)向0.1mol/L pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液(底液)中加入样品，若样品中含有NO，则会有电流台阶出现，若样品中无NO，则看不到电流台阶，以此对NO进行定性分析；此外，电流台阶的大小与样品中所含NO的浓度成正比，借此可对样品中的NO进行定量分析。
将所制备的NO电化学传感器应用于NO的检测，其线性范围宽，为0.2～10.0μmol/L和10.0～500μmol/L。在0.2～10.0μmol/L浓度范围内，传感器的灵敏度为58.2nA/(nmol/L)，检出限为：6.2nmol/L；在10.0～500μmol/L浓度范围内，传感器的灵敏度为12nA/(nmol/L)，检出限为：30nmol/L。
与现有技术相比，本发明方法的优点和有益效果如下：
(1)本发明的直接实时检测NO的电化学传感器，是在玻碳电极表面覆盖Nafion-聚偶氮胭脂红B-石墨烯纳米复合膜，该复合膜是一种新型的传感膜，为首次制备，并用于NO电化学传感器；
(2)本发明的直接实时检测NO的电化学传感器制备方法，采用简单的滴涂法与电化学聚合法制备了Nafion/PACB/GO/GCE电化学传感器。扫描电镜表征说明，Nafion/PACB/GO/GCE的表面凹凸不平，电极的比表面积较大，电子传递速率增快，对NO在电极表面发生的反应有催化作用。同时实验表明，制备得到的电化学传感器具有线性范围宽(0.2～500μmol/L)、灵敏度高、检出限低、响应时间短(约为3s)和重现性良好等优点，且对抗坏血酸、多巴胺、尿酸、NO2 -等常见干扰生物分子具有良好的抗干扰能力。
附图说明
图1为本发明的直接实时检测NO的电化学传感器的制备方法的工艺流程图；
图2为不同氧化石墨烯分散液滴涂量制备的电化学传感器对NO氧化峰电流的影响曲线图；
图3为不同偶氮胭脂红B电聚合圈数制备的电化学传感器对NO氧化峰电流的影响曲线图；
图4为将制备得到的电化学传感器置于不同pH值磷酸盐缓冲溶液使用时，对NO氧化峰电流的影响曲线图；
图5为裸玻碳电极、对比例1中制备的Nafion-聚偶氮胭脂红B修饰玻碳电极(Nafion/PACB/GCE)以及实施例1中制备得到的Nafion-聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极(Nafion/PACB/GO/GCE)的表面电子扫描显微镜(SEM)表征图；
图6为不同扫描速率下2.25×10-5mol/L NO在实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学响应图；
图7为NO的氧化峰电流与扫描速率之间的关系曲线图；
图8为NO的氧化峰电位与扫描速率的自然对数之间的关系图；
图9为实施例1中制备得到的复合膜电极对不同浓度NO的时间-电流曲线图；
图10为NO的氧化峰电流与其浓度之间的线性关系图；
图11为实施例1中制备得到的复合电极重现性考察图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，玻碳电极购自天津艾利安电子科技有限公司DJ035(规格Φ＝3mm)。
实施例1
一种直接实时检测NO的电化学传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1、在玻碳电极表面滴加氧化石墨烯分散液，自然晾干后得到氧化石墨烯修饰玻碳电极(GO/GCE)；
S2、将S1得到的氧化石墨烯修饰玻碳电极置于含有偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，采用电化学聚合法制备得到聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极(PACB/GO/GCE)；
S3、在S2得到的聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极表面滴加Nafion溶液，自然晾干后制得Nafion/PACB/GO/GCE，即NO电化学传感器；其中Nafion溶液(DuPont，D520)购置时浓度为5％(指树脂固含量为5％)，用无水乙醇将其稀释10倍，至Nafion溶液浓度为0.5％后再进行使用。
需要说明的是，实施例1中S1具体包括：在玻碳电极(GCE)表面滴涂8μL1mg/mL氧化石墨烯分散液(GO)，自然晾干得到氧化石墨烯修饰玻碳电极(GO/GCE)。所使用的氧化石墨烯分散液为单层氧化石墨烯水分散液，购自苏州碳丰石墨烯科技有限公司，氧化石墨烯经改进Hummer法制备而得，表面含有丰富的羧基、羟基和环氧基等含氧官能团，比表面积为2630m2/g。氧化石墨烯大的比表面积，可有效增加电极表面的活性位点，从而增大NO在传感器表面的富集量，提高传感器的检测灵敏度；同时，石墨烯具有良好的导电性，其电阻率为0.02～0.03μΩ·m，可以加快NO与传感器之间的电子转移速率，从而缩短NO电化学传感器的响应时间。
实施例1中S2具体包括：将实施例中S1制得的GO/GCE置于含有5mg/mL偶氮胭脂红B和0.5mol/L H2SO4的支持电解质溶液中，以100mV/s的扫描速率，在-0.2～1.6V的电位范围内，循环伏安扫描30圈，进行电聚合，即得聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极(PACB/GO/GCE)。支持电解质溶液就是提高化学电池中溶液导电率的电解质，本身不参与电化学反应。惰性的支持电解质可以是无机盐、无机酸或缓冲溶剂。在水溶液中常用的支持电解质有KNO3、Na2SO4等。
实施例1中S3具体包括：将2μL 0.5％Nafion溶液滴涂于S2所得PACB/GO/GCE表面，在空气中自然晾干，制备得到复合电极Nafion/PACB/GO/GCE，即电化学传感器。该复合电极最外层是覆盖Nafion膜，Nafion膜是一种质子交换膜，也叫阳离子交换膜，可以交换钠离子、钾离子等阳离子，也可以抵挡阴离子对电极表面的干扰。Nafion具有良好的热稳定性和成膜性，在电化学传感器的构建中，用作电极修饰剂，以提高传感器的选择性，因为Nafion不仅可以消除NO2 -、抗坏血酸、尿酸等阴离子的干扰，而且还能防止生物样品中存在的蛋白质等生物材料的非特异性吸附对电极的污染。
需要说明的是，实施例1中S1中在玻碳电极表面滴涂氧化石墨烯分散液之前还包括：对玻碳电极进行预处理，具体为：先用抛光纸和0.05μm的氧化铝浆液将直径为3mm玻碳电极抛光至镜面，然后用体积比为1:1的硝酸溶液(用16mol/L的浓硝酸与超纯水按体积比为1:1进行混合配制而成)、无水乙醇和超纯水在超声波清洗机中依次对玻碳电极进行清洗，超声清洗后的电极在室温下晾干备用。
实施例1采用滴涂法将氧化石墨烯修饰在玻碳电极表面，然后采用电聚合法将偶氮胭脂红B修饰在GO/GCE修饰电极表面，最后在表面滴加上Nafion膜进行覆盖，制备出了一种新型NO电化学传感器，该NO电化学传感器具有线性范围广、抗干扰能力强、灵敏度高等性能。
对比例1
一种电极的制备方法，包括：按照实施例1S2的制备方法将裸玻碳电极(GCE)置于含有偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，采用电化学聚合法制备得到聚偶氮胭脂红B修饰玻碳电极(PACB/GCE)；按照实施例1S3的制备方法在聚偶氮胭脂红B修饰玻碳电极表面滴加Nafion溶液，自然晾干后制得Nafion-聚偶氮胭脂红B修饰玻碳电极(Nafion/PACB/GCE)。
性能检测
1、氧化石墨烯分散液的滴涂量、电聚合扫描圈数、磷酸盐缓冲溶液pH对NO氧化峰电流的影响
按照实施例1S1中的方法在玻碳电极表面分别滴涂1μL、2μL、3μL、4μL、6μL、7μL、8μL、9μL以及10μL的氧化石墨烯分散液，然后按照实施例1相同的方法制备得到复合电极Nafion/PACB/GO/GCE(即电化学传感器)，测试不同氧化石墨烯分散液滴涂量制备的电化学传感器对NO氧化峰电流的影响，结果如图2所示。从图2中可知，当氧化石墨烯分散液(GO)的滴涂量为8μL时，NO氧化峰电流达到最大值，因此氧化石墨烯溶液(GO)的最佳滴涂量为8μL。但当氧化石墨烯分散液(GO)的滴涂量在4μL至10μL变化时，NO的氧化峰电流变化很小，因此，在实际使用时，氧化石墨烯溶液(GO)的滴涂量选择4μL至10μL均可。
按照实施例1S2中的方法，将GO/GCE置于含有5mg/mL偶氮胭脂红B和0.5mol/LH2SO4的支持电解质溶液中，以100mV/s的扫描速率，在-0.2～1.6V的电位范围内，分别循环伏安扫描5圈、10圈、15圈、25圈、30圈、35圈和40圈，以不同聚合圈数制备Nafion/PACB/GO/GCE(即电化学传感器)，然后测试不同聚合圈数制备的电化学传感器对NO氧化峰电流的影响，结果如图3所示。聚偶氮胭脂红B膜的厚度也是NO测定的关键因素，可以通过电聚合扫描圈数方便地控制。从图3中可知，随着电聚合扫描圈数的增加，电极表面聚偶氮胭脂红B膜的厚度随之增加，NO的氧化峰电流先增加后减小，当聚合圈数为30圈时，NO的氧化峰电流达到最大，但当聚合圈数在15圈至30圈范围内时，NO的氧化峰电流变化不大，因此，在实际使用中，偶氮胭脂红B的聚合圈数在15圈至30圈范围内均可。
按照实施例1中的方法制备复合电极Nafion/PACB/GO/GCE(即电化学传感器)，将电化学传感器置于0.1mol/L含有Na2HPO4和NaH2PO4的磷酸盐缓冲溶液中，并调节磷酸盐缓冲溶液的pH分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，然后分别取8mL上述各溶液作为底液，向其中通入纯度为99.999％的高纯氮气除氧20min，接着使用微量进样器向其中加入100μLNO饱和水溶液(室温25℃下，NO饱和水溶液的浓度为1.8mmol/L，通过向无氧超纯水中通入纯度为99.999％的高纯NO气体30min制备而得)，使底液中含有2.25×10-5mol/LNO，接着对NO进行线性扫描检测，测试检测底液的pH值对NO氧化峰电流的影响，线性扫描结果如图4B所示。对图4B中的数据进行分析处理，以底液pH值为横坐标，NO氧化峰电流为纵坐标作图，结果如图4A所示，结果表明，当检测底液的pH值为4.0时，NO电化学传感器对NO的响应达到最佳，因此，将传感器置于0.1mol/LpH值为4.0的无氧磷酸盐缓冲溶液中对NO进行检测，可达到较理想的检测灵敏度。
2、不同电极表面的SEM表征
借助于SEM技术，分别对裸玻碳电极、对比例1中Nafion/PACB/GCE以及实施例1S3中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE的表面形貌进行了表征，结果如图5所示。
从图5中可知，裸玻碳电极表面光滑(图5中A所示)；Nafion/PACB/GCE表面明显可见一层褶皱样的薄膜结构(图5中B所示)；Nafion/PACB/GO/GCE表面褶皱增多，同时出现许多纤维条状结构，整个表面凹凸不平(图5中C所示)。众所周知，凹凸不平的表面比平滑表面拥有更大的表面积。因此，Nafion/PACB/GO/GCE凹凸不平的表面结构赋予了它明显大于裸GCE和Nafion/PACB/GCE的表面积，大的表面积使得Nafion/PACB/GO/GCE对NO具有更好的富集能力，从而增加了其对NO的传感敏感度。
3、NO在不同电极上的电化学响应
分别测试相同浓度的NO在裸GCE、实施例1S1中制备得到的GO/GCE以及实施例1S3制备的Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学响应，结果如表1所示。
表1
具体的测试方法为：以0.1mol/L pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液为底液，在0～1.4V的电位范围内，以100mV/s的扫描速率，采用循环伏安法(CV)考察了NO在裸GCE、GO/GCE、Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学响应。结果表明，裸GCE对NO的电化学响应很小，峰电位为Ep＝0.85V，峰电流为Ip＝0.30μA；在GO/GCE上，NO的氧化峰电流值比裸GCE增大了6倍，说明石墨烯对NO的电化学有促进作用。相较于前两者，NO在Nafion/PACB/GO/GCE上的峰电位为Ep＝0.77V，峰电流为Ip＝7.35μA，相比于裸GGE，NO在Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学响应得到了明显改善，峰电位降低了80mV，峰电流增大了7.05μA，约24倍。石墨烯大的比表面积和优良的导电性增加了传感器对NO有效富集并加快了NO与传感器之间的电子传递速率，同时，聚偶氮胭脂红B(PACB)的大环共轭体系加速了电极表面的电化学催化反应。在氧化石墨烯(GO)和聚偶氮胭脂红B(PACB)膜的协同作用下，使得Nafion/PACB/GO/GCE复合电极对NO有较好的电催化能力。
4、扫描速率影响
研究了不同扫描速率下2.25×10-5mol/L NO在实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学行为。扫描速率分别为50、75、100、125、150、175、200、225、250mV/s。结果如图6所示。并通过图6中数据得出NO的氧化峰电流与扫描速率之间的关系，结果如图7所示；通过图6中数据得出氧化峰电压与扫描速率的自然对数之间的关系图，结果如图8所示。
从图6～8中可知，NO的氧化峰电流与扫描速率之间呈线性关系(Ip＝8.65+0.034v)，R系数＝0.99，说明NO在电极表面发生的电化学反应是受吸附控制的过程，且该反应为完全不可逆反应。在本申请实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE，NO氧化峰电位与扫描速率的自然对数之间的关系可以描述为：Ep＝0.72+0.036lnv，R＝0.994。根据Laviron的理论可以计算出n＝1.4≈1，即NO在Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学氧化过程中，电子转移数为1。
5、不同工作电位下，NO在Nafion/PACB/GO/GCE上的电流响应。
为了研究工作电位对NO在实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE上的电化学氧化过程的影响，测试不同工作电位下，NO在Nafion/PACB/GO/GCE(即电化学传感器)上的电流响应，结果如表2所示。具体的，将Nafion/PACB/GO/GCE(即电化学传感器)置于0.1mol/L pH 4.0的磷酸盐缓冲溶液中，分别施加不同工作电位，测定电化学传感器对2.25×10- 5mol/LNO的电化学响应。
表2
由表2可知，当工作电位为0.85V时，电化学传感器对NO具有最短的响应时间，最大的电流响应。因此，测定传感器的线性范围、灵敏度、检出限以及抗干扰能力时，选定工作电位为0.85V。
6、NO电化学传感器的线性范围、灵敏度及检出限
采用安培响应法评估了实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE复合膜电极(即电化学传感器)对NO的定量分析能力，即实施例1中制备得到Nafion/PACB/GO/GCE复合膜电极(即电化学传感器)对不同浓度NO的时间-电流曲线，结果如图9所示。
具体的实验方法为：实验反应过程均在氮气保护下进行，在工作电位为0.85V时，将实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE复合膜电极(即电化学传感器)置于5mL0.1mol/L pH＝4.0的无氧磷酸盐缓冲溶液(向磷酸盐缓冲溶液中通入纯度为99.999％的高纯氮气除氧20min)中，从200s开始，使用微量进样器向底液中连续注入不同体积不同浓度的NO水溶液，具体的，200s至400s期间，每隔50s向底液中注入5μL浓度为18μmol/L的NO水溶液，浓度为18μmol/L的NO水溶液由NO饱和水溶液经除氧的纯水稀释而得；450s至850s时间段内，每隔50s向底液中注入25μL浓度为18μmol/L的NO水溶液；900s至1300s时间段内，每隔50s向底液中注入2.5μL浓度为1.8mmol/L的NO饱和水溶液；1350s至1550s时间段内，每隔50s向底液中注入50μL浓度为1.8mmol/L的NO饱和水溶液；1600s至2000s时间段内，每隔50s向底液中注入100μL浓度为1.8mmol/L的NO饱和水溶液，加样期间持续搅拌。如图9所示，电流梯度从450s开始出现，在反应进行到1950s时，电流梯度基本结束，此时底液中NO的浓度为500μmol/L。由图10可见，在0.2～10.0μmol/L(450s～1300s)和10.0～500μmol/L(1300s～1950s)浓度范围内，电流响应与NO浓度呈良好线性关系。在0.2～10.0μmol/L浓度范围内，Ip(μA)＝0.0546+0.0582c(μmol/L)，R＝0.99，此浓度范围内传感器的灵敏度为58.2nA/(nmol/L)(线性方程的斜率)，检出限为：6.2nmol/L，检出限依据公式D＝3N/S进行计算，其中D为检出限，N为噪音信号(120nA)，S为灵敏度(58.2nA/(nmol/L))。在10.0～500μmol/L浓度范围内，Ip(μA)＝1.05+0.012c(μmol/L)，R＝0.98，此浓度范围内传感器的灵敏度为12nA/(nmol/L)(线性方程的斜率)，检出限为：30nmol/L，检出限依据公式D＝3N/S进行计算，其中D为检出限，N为噪音信号(120nA)，S为灵敏度(12nA/(nmol/L))。此外，由图9可知，传感器对NO的响应迅速，响应时间约为3s。结果表明，所制备的NO电化学传感器具有线性范围宽、灵敏度高、检出限低、响应时间短等优点。
7、NO传感器的重现性以及抗干扰能力
重现性也是电化学传感器的重要参考性能，用同一根实施例1制备的Nafion/PACB/GO/GCE复合膜电极(即NO电化学传感器)在相同条件下平行检测2.25×10-5mol/LNO七次，其检测结果的相对标准偏差为2.8％(图11A)；用七根不同复合膜电极平行检测2.25×10-5mol/LNO，七根复合膜电极均按实施例1制备而得，其结果的相对标准偏差为3.5％(图11B)。这些结果表明，在分析应用中，Nafion/PACB/GO/GCE即NO电化学传感器对NO的测定具有良好的重现性。
在生物体内会存在很多影响检测NO的生物物质，因此通过加入多种干扰物，研究了实施例1中NO电化学传感器对NO的选择性和抗干扰能力。具体的，运用安培响应法研究了实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE复合电极(即NO电化学传感器)的抗干扰能力。将实施例1中制备得到的Nafion/PACB/GO/GCE复合电极(即NO电化学传感器)置于pH值为4.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液底液中，在200s时加入2.25×10-5mol/L NO水溶液，后续每隔50s，依次向底液中加入相同浓度(2.25×10-5mol/L)的DA(多巴胺)、UA(尿酸)、AA(抗坏血酸)、NO2 -，最后再加入2.25×10-5mol/L NO水溶液。实验结果如表3所示，可知，DA、UA、AA、NO2 -等生物样品中的常见干扰因子对NO的电流影响均小于5％，说明实施例1中制备得到的NO电化学传感器具有良好的抗干扰性。
表3
8、NO传感器的检测准确性
为了评估NO电化学传感器用于NO监测的准确性，首先用5mL 0.1mol/L pH值为4.0的无氧磷酸盐缓冲溶液配制6组NO标准溶液为底液，12.5μmol/L、22.5μmol/L和30.0μmol/L的标准溶液的制备方法是：使用微量进样器向5mL 0.1mol/LpH值为4.0的无氧磷酸盐缓冲溶液中分别加入35μL、62.5μL以及83μL浓度为1.8mmol/L的NO饱和水溶液，然后分别向底液中加入不同浓度的NO溶液，借助于安培响应法，采用标准加入法测定NO的检测回收率，测定结果如表4所示。从表中数据可见，6次测定的平均回收率为100.5％，此结果表明，该NO电化学传感器用于NO检测时，检测准确度高，具有潜在的生物医学应用前景。
表4
本申请实施例采用简单的滴涂法与电化学沉积法制备了Nafion/PACB/GO/GCE电化学传感器。扫描电镜表征说明，Nafion/PACB/GO/GCE电极表面凹凸不平，电极的比表面积较大，电子传递速率增快，对NO在电极表面发生的反应有催化作用。本申请优化了电化学传感器的制备及检测条件，如GO(氧化石墨烯)滴涂量、PACB(聚偶氮胭脂红B)膜的厚度、磷酸盐缓冲溶液pH等，结果表明，该NO电化学传感器具有线性范围宽、灵敏度高、检出限低、抗干扰能力强、稳定性好、检测准确度高等性能，对抗坏血酸、多巴胺、尿酸、NO2 -等常见干扰生物分子具有良好的抗干扰能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种直接实时检测NO的电化学传感器在液相中检测NO浓度中的应用，其特征在于，具体应用时，检测步骤为：
(1)以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，以直接实时检测NO的电化学传感器为工作电极，构建三电极系统；
(2)将三电极系统置于0.1mol/LpH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液中；
(3)以0.85V作为工作电位，进行安培响应法测定；
(4)向底液中加入样品，通过电流台阶来对样品中的NO进行定性和/或定量分析；
所述直接实时检测NO的电化学传感器的制备方法包括以下步骤：
S1、在玻碳电极表面滴涂8μL1mg/mL比表面积为2630m2/g的单层氧化石墨烯水分散液，自然晾干得到氧化石墨烯修饰玻碳电极：GO/GCE；
S2、将S1制得的GO/GCE置于含有0.5mol/LH2SO4和5mg/mL偶氮胭脂红B的支持电解质溶液中，以100mV/s的扫描速率，在-0.2～1.6V的电位范围内，循环伏安扫描30圈，进行电聚合，即得聚偶氮胭脂红B-氧化石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极：PACB/GO/GCE；
S3、将2μL0.5％Nafion溶液滴涂于S2所得PACB/GO/GCE表面，在空气中自然晾干，制备得到复合电极Nafion/PACB/GO/GCE。
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