CN112714673A - 微流体装置和用于处理微粒的方法 - Google Patents

Abstract

旨在用于处理微粒、特别是细胞的微流体装置(1)包括：细长的处理室(2)，其包括至少一个细长段(21)；至少一个输入播种通道(33)和一个输出播种通道(43)，其被配置成在横向于段(21)的纵向方向(X)的方向(Y)上限定播种流；至少一个输入收获通道(53)和一个输出收获通道(63)，其被配置成在段(21)的纵向方向(X)上限定收获流，其中，对于段(21)，单个输入播种树(3)限定多个输入播种通道(33)，并且单个输出播种树(4)限定多个输出播种通道(43)，输入播种通道(33)和输出播种通道(43)与处理室(2)的接合部(31、41)沿着段(21)被分布在处理室的两侧上，其中，比率Rs_input，即

高于50、优选的高于75、优选高于100、优选高于150、优选高于200，其中S₂₁是段(21)的垂直于横向方向(Y)的截面，并且(∑_kV_k*S_k)/V_{TOTs_input}是输入播种通道(33)的体积与截面的乘积之和除以总体积V_{TOTs_input}，所述输入播种通道是指在最靠近输入播种树(3)的树根(30)的第一个节点(35)与段(21)之间的所有输入播种通道(33)，所述总体积是这些输入播种通道(33)的体积之和。

Description

微流体装置和用于处理微粒的方法

本发明涉及一种微流体装置和使用该装置处理微粒、特别是细胞的方法。本发明更具体地涉及一种微流体装置和使用该装置来实现对活细胞的各种类型的生物生产操作，例如过滤、播种、扩增、转导、分选、收获等的操作。

近年来，微流体“芯片”技术已经广泛应用于细胞悬浮处理。然而，在现有的细胞悬浮处理微流体装置中，输入悬浮分散限制了程序的功效和准确性。实际上，细胞是复杂系统，其对环境的许多参数是敏感的。结果，在执行生物生产协议中的较小变化可以具有较大的影响。类似地，生物生产步骤内的参数异质性(这意味着细胞个体地经历重要参数的不同值)能够导致非常异质的输出。异质性还意味着一些细胞经历的参数不同于最佳参数，这能够导致降低的效率和功效。异质性还阻止了有效地确定最优工艺参数，由于测量的输出代表参数的扩展分布，因此提供的关于目标参数组的相关性的信息有限。因此，参数的批间再现性和批内均匀性是在生物生产中获得可再现且均匀产出的关键。这又使得可以从方案参数筛选获得可靠的数据，以便确定提供了最大效率、功效和再现性的最佳工艺条件。

此外，少数微流体生物生产装置被配置成支持包括“培养步骤”的生物生产，例如扩增和分化步骤。支持这种一般生物处理步骤的现有微流体装置在提供足够的容量的同时，不能以合理的复杂性和成本提供细胞和反应物效率。

本发明旨在通过提出一种用于处理微粒、特别是细胞的微流体装置和方法来更具体地克服这些缺点，所述微流体装置和方法能够在微粒和反应物的数量方面实现便宜、有效、高效以及精确的生物处理技术。

为此目的，根据一个方面，本发明的主题是用于处理微粒、特别是细胞的微流体装置，其包括：

-细长的处理室，其包括至少一个细长段，

-至少一个输入播种通道和至少一个输出播种通道，其被配置成在横向于处理室的段的纵向方向的方向上限定播种流，

-至少一个输入收获通道和至少一个输出收获通道，其被配置成在处理室的段的纵向方向上限定收获流，

其中，对于处理室的每个段，微流体装置包括多个输入播种通道和多个输出播种通道，多个输入播种通道和多个输出播种通道与处理室的段的接合沿着段被分布在两侧上，多个输入播种通道由单个输入播种树限定，并且多个输出播种通道由单个输出播种树限定。

根据一个特征，比率Rs_input，即：

大于50、优选地大于75、优选地大于100、优选地大于150、优选地大于200，其中，S₂₁是段的垂直于横向方向的截面，并且(∑_kV_k*S_k)/V_{TOTs_input}是输入播种通道的体积和截面的乘积之和除以总体积V_{TOTs_input}，所述输入播种通道是指最接近输入播种树的树根的第一节点与段之间的所有输入播种通道，该总体积是这些输入播种通道的体积之和。

根据一个特征，比率Rh_input，即：

小于20、优选地小于15、优选地小于10、优选地小于5，其中，W是垂直于纵向方向的段的截面，而(∑_jV_j*S_j)/V_{TOTh_input}是输入收获通道的体积和截面的乘积之和除以总体积V_{TOTh_input}，所述输入收获通道是指最接近输入收获树的树根的第一节点与段之间的所有输入收获通道，该总体积是这些输入收获通道的体积之和。

由于具有上述特征，本发明具有以下优点：

-包括至少一个细长段的该细长的处理室在播种期间促进了在播种通道中和在室中的剪切速率的高差异，从而增加了所述播种的稳健性并促进了所处理的微粒的高产量；在本发明的含义内，当室或段的长度是其宽度的至少两倍、优选是其宽度的四倍时，室或段被认为是细长的；

-在播种流期间，播种比率Rs_input的值大于50、优选大于75、优选大于100、优选大于150、优选大于200、优选大于200，这导致了播种通道与处理室之间的剪切速率的较大的变化，因此通过促进在处理室中微粒的沉积来提高播种效率；

-在收获流期间，收获比率Rh_input的值小于20、优选小于15、优选小于10、优选小于5，这导致了收获通道与收获室之间的剪切速率的较小的变化，因此提高了收获效率。

根据一个特征，比率Rs_output，即：

大于50、优选大于75、优选大于100、优选大于150、优选大于200，其中，S₂₁是段的垂直于横向方向的截面，并且(∑_kV_k*S_k)/V_{TOTs_output}是指输出播种通道的体积和截面的乘积之和除以总体积V_{TOTs_output}，所述输出播种通道是指最接近输出播种树的树根的第一节点与段之间的所有输出播种通道，该总体积是这些输出播种通道的体积之和。

根据一个特征，比率Rh_output使得：

小于20、优选小于15、优选小于10、优选小于5，其中，W是垂直于纵向方向的段的截面，并且(∑_jV_j*S_j)/V_{TOTh_output}是收获输出通道的体积和截面的乘积之和除以总体积V_{TOTh_output}，所述输出收获通道是指最接近输出收获树的树根的第一节点与段之间的所有输出收获通道，该总体积是这些输出收获通道的体积之和。

输出播种树和输出收获树的配置使得Rs_output和Rh_output中的每个比率与对应比率Rs_input或Rh_input处于相同数量级，从而增强了微流体装置的对称性及其播种和收获的效率。

注意，在仅存在一个收获通道而没有实际的收获通道树的情况下，如本文所使用的表述“收获树”能够指代唯一的收获通道。在这种情况下，收获树的第一节点被认为是段与收获通道之间的几何过渡(如图1所示)。

根据一个实施例，对于处理室的每个段，输入播种树在从树根到与处理室的段的接合的每个可能的流动路径上具有至少一个位置，使得在该位置处的输入播种通道的播种剪切指标SSI与处理室的段的平均播种剪切指标SSI的比率高于10、优选高于20、更优选高于40，其中，通道或段的播种剪切指标由下式定义：

其中，T_Q是流经所考虑的通道或段的播种流的百分比，S是通道或段垂直于其用于播种流的纵向纤维所截取的截面表面积，并且h是通道或段在高度方向上所截取的高度。

注意，对于给定的微流体装置，由于流体特性(例如当流体是细长微粒的悬浮液或剪切稀化流体时，或者由于惯性效应，特别是由于在通道交叉处的惯性效应，例如在所谓的“特斯拉阀”中发生的惯性效应)，流的分布以及相应的T_Q值可以根据流速而变化。在整个该文档中，对于所有评估，通过忽略这种影响，特别是通过基于37℃和惯性效应可忽略的低流速的水流的数值模拟来估计流的分布，并因此估计T_Q值，特别地，0.1μL/s的总播种或收获流速将被用于这些估计。

由于根据本发明的播种剪切指标的特定选择，当通过输入播种通道和处理室施加流时，上游相对较高的剪切速率能够分离、再悬浮和朝向处理室移动微粒，而在处理室中，相对较低的剪切速率和速度允许悬浮微粒的沉降并防止沉降微粒的置换、分离和再悬浮。处理室中的播种剪切指标比输入播种通道中的播种剪切指标低得多，这确保了以有效地置换输入播种通道中的微粒的播种流速的播种流不会使先前在处理室中播种的微粒移动太多，并且优选根本不移动。特别地，在脉冲式播种流的情况下，在一个脉冲期间播种的微粒仍然被捕集并且在下一个播种脉冲期间不被排出。

这种配置与在相对侧上存在的灌注处理室的相同段的单个输入播种树和单个输出播种树相结合，使得可以提供具有分散补偿的播种功能，从而导致处理室的均匀播种和悬浮液浓缩，其优点是不需要任何过滤器或离心机就能获得，所述过滤器或离心机通常回导致附加成本、复杂性和性能的潜在损失或对微粒的不利影响。除了播种通道相对于处理室的段的特定布置之外，根据本发明的微流体装置提供了收获功能，所述收获功能具有独立于播种功能的有效且稳健的收获能力，以便能够在不需要太高的压力的情况下在处理室内引起相对高的剪切速率。

注意，在本发明中，最相关的剪切速率是发生在微流体装置的壁附近，特别是发生在微流体装置的底表面附近，因为正是这些壁附近的剪切速率值指示了定位在壁附近的微粒的剪切相关效应的量级，并且最值得注意的是，其根据微粒的性质、壁的性质和流体的性质指示了易于使微粒再悬浮的力。因此，在本发明中，除非另有说明，用以下公式计算剪切速率的估计值：

其中，Q是垂直于流动方向截取的穿过所考虑的截面的流速，S是所考虑的截面表面积，并且h是在高度方向上截取的横截面平均高度。

根据有利特征，对于处理室的每个段，在链接至段的输入播种树的通道体积的一半以上中，输入播种通道的播种剪切指标与处理室的段的平均播种剪切指标的比率高于10、优选高于20、更优选高于40。

根据一个实施例，在输入播种树中，输入播种通道的播种剪切指标基本上恒定。每个通道的这种配置导致输入播种通道中的大致恒定的剪切速率。这使得在没有将产生裂解风险的重要的局部峰值或没有将倾向于捕集微粒的局部最小值的情况下，可以选择在播种期间产生足够高的剪切速率的流速，以将微粒有效地移向处理室的。

实际上，在输入播种树中可能难以维持播种剪切指标恒定。在这种情况下，播种剪切指标的值优选覆盖小于3个数量级、优选小于2个数量级、更优选小于1个数量级。

根据一个实施例，微流体装置的每个播种树在水力阻力方面是对称的，即，对于相同温度下的相同流体，相同层级的节点之间的播种通道具有相同的水力阻力，这能够通过数字或分析来估计。这种水力阻力方面的对称性提高了播种流的均匀性。

根据一个实施例，在几何形状方面，微流体装置的每个播种树是对称的，即，相同层级的播种树的所有节点(包括与处理室的接合部)相对于树根处于相同的通道路径距离；并且在距树根给定的通道路径距离处的播种通道的截面对于所有通道是相同的。这种几何形状是获得在水力阻力方面对称的播种树的一种方式。

为了进一步简化微流体装置的设计，根据本发明，微流体装置的每个播种树可以另外被设计成至少部分地是二叉树。这意味着给定层级的播种树的所有节点具有两个新兴通道。为了达到优化的结果，于较高层级的节点(即更靠近于与处理室的接合部)相比，较低层级的节点(即更靠近树根的节点)被更优先二叉化。当每个播种树是完全二叉树时，设计是特别简化的。

根据一个实施例，微流体装置包括阻挡装置，该阻挡装置被配置成：

-当通过输入播种通道和输出播种通道将播种流施加至处理室时，阻挡装置选择性地阻挡输入收获通道和输出收获通道，以及

-当通过输入收获通道和输出收获通道将收获流施加至处理室时，阻挡装置选择性地阻挡输入播种通道和所述输出播种通道。

根据一个特征，对于处理室的每个段，播种通道与处理室的段的相邻接合部之间的间距沿着该段是相同的。在处理室的段的两侧上的这种恒定的间距有助于处理室的均匀的播种流和均匀的灌注。

根据另一个特征，在每个播种树中，播种通道的截面随着距树根的通道路径距离的增加而减小。更准确地说，考虑到在播种树的播种通道中分开的流速，调整播种通道与处理室的段的相邻接合部之间的间距以及在距树根给定通道路径距离处的各个播种通道的截面，进而导致在处理室中产生的大约“n倍”的剪切速率，其中，如上所述，n高于10、优选高于20、更优选高于40。在二叉播种树的情况下，调整二叉树的播种通道的数量，数量为二的幂，以达到期望的结果。

根据一个实施例，对于处理室的每个段，段的垂直于横向方向的截面与灌注该段的输入播种通道(即更靠近于与该段的接合)的截面的总和的比率高于5、优选高于10、更优选高于15。

根据一个实施例，通过估计播种流期间在窄截面(其在沿着处理室的中间纵向纤维L的连续位置处垂直于长度为dL的播种流)中的剪切速率来获得播种剪切速率曲线，其特征在于相对于标准的变化小于66％、优选小于33％、更优选小于10％，在dL是恒定的(等于小于处理室中间纤维的总长度L的1％)并且dL乘以这些截面的数目等于处理室中间纤维L的总长度的情况下来估计这种曲线，以改善播种性能和均匀性。

根据一个实施例，通过类似地沿着处理中间纤维L，在相同的连续截面上计算穿过该截面的播种流速与处理室局部宽度(其是通过该截面与在该截面两侧上与处理室最接近的播种树接合之间的距离之和来估计的)之间的比率来估计的播种体积分布，其特征在于相对于标准的变化小于66％、优选小于33％、更优小于10％，以便改善播种性能，并且特别地，降低播种脉冲期间损失的微粒量。

根据一个实施例，通过估计收获流期间在截面(其垂直于沿着处理室中间纤维L的收获流)中的剪切速率来获得收获物剪切速率曲线(其利用沿着由所考虑的收获流灌注的处理室分段的整个长度均匀分布的至少100个连续测量截面来获得)，其特征在于相对于标准的变化小于66％、优选小于33％、更优选小于10％，以便提高收获效率和均匀性。

根据一个实施例，播种树的总体积小于处理室的总体积、优选小于处理室的总体积的33％、更优选小于处理室的总体积的10％，以提高反应物的使用效率。

在本发明的有利实施例中，每个输入和输出播种通道与处理室的接合部在高度方向上位于处理室的上部。这种配置利用了播种期间的微粒惯性，以获得在处理室中更均匀的微粒分布，并且特别地，避免了在播种脉冲期间新播种的微粒在处理室的底表面附近行进。

根据本发明的一个特征，对于处理室的每个段，该段在横向方向上的宽度与该段在高度方向上的高度之比高于5、优选高于10、更优选高于20。这样，处理室的每个段都是较浅的段，其中，层流导致包含在该段中的大部分流体的对流置换。还能够增加拔模角度(即处理室的段的侧壁与垂直于该段的底表面的方向之间的角度)，并且在底部边缘处的圆角(即圆形底部边缘)也能够进一步促进包含在段中的流体的完全更新。

应注意，如果段的底表面与输入播种通道的底表面之间的距离大于段的宽度，则在施加播种流时，在段中能够出现代表处理室段体积的大部分的一个或更多个稳定涡流。这导致输入播种通道与涡流之间很少或没有对流交换，能够发现这增加了进行某些生物处理操作所需的反应物的体积。

为了使微流体装置的制造更容易并降低通道之间泄漏的风险，在平行通道之间具有最小距离是有利的。例如，平行通道之间的典型最小距离是1mm，而精确的制造方法可以允许将该最小距离减小到例如500μm或更小。能够发现，特别是为了实现较低的单位成本，通过聚合物材料的注塑成型或热压印来制造微流体装置的部件是有利的，所述聚合物材料例如聚苯乙烯、环烯烃聚合物或共聚物。在这种情况下，通过应用如上所述的最小拔模角，促进了脱模，并且所得到的精度被提高。

根据一个实施例，为了允许用诸如聚合物的材料的平坦片材来封闭微流体装置，微流体装置的处理室和通道都共用同一顶表面平面，这使得制造更加容易。在一个具体实施例中，微流体装置可以包括由聚合物材料制成的注塑成型或热压印的底部部分和由相同或不同的聚合物材料制成的顶部部分，例如平坦片材。

通过使微流体装置的通道弯曲的内边缘变圆，从而具有50μm或100μm量级的最小曲率半径，可以进一步促进模具制造。有利地，特别是为了使弯曲部中的流动规则化，通道弯曲部的外边缘也可以是具有最小曲率的圆形。

根据一个实施例，在化学残留物、灰尘和微粒、内毒素和其他生物污染物方面，微流体装置是极其清洁的，这可以通过调整制造方法和/或通过实施涉及例如超声处理、辐照、清洗、高压灭菌等的后处理步骤来实现。在优选的实施例中，微流体装置由医用级材料制成。在优选的实施例中，由聚合物制成的微流体装置的部件不含增塑剂。

根据一个实施例，在例如密封的聚合物袋之类的包装中，例如通过γ射线辐射对微流体装置进行灭菌。在使用微流体装置时，这降低了污染的风险。

根据一个实施例，微流体装置是一次性装置，以便减少连续处理之间的交叉污染和/或干扰。

根据一个实施例，微流体装置的外部连接器或连接端口能够将微流体装置与其他系统流体连接，该微流体装置的外部连接器或连接端口具有小于或等于2mm、优选小于或等于1mm的内径。这种配置减少了所谓的“死体积”并提高了生物生产效率。

为了避免损失微粒的同时与处理室的段对流交换，处理室的每个段有利地用播种流脉冲来播种，播种流脉冲表示的体积比段的体积低，并且播种流脉冲之间的播种暂停对应于不施加或施加非常有限的流，以使悬浮微粒沉淀。根据微流体装置的设计，播种脉冲期间的流速被选择为足够小，以使在处理室的部分中不产生剪切速率，该剪切速率将导致沉积微粒的再悬浮或大的位移，并且足够大以使在播种流脉冲期间输入微粒悬浮液不会沉积得太快，在这种情况下，微粒将朝向段的输入播种侧累积，并且还使得上游剪切速率足以使微粒朝向处理室的段有效地移动。

根据一个有利特征，对于处理室的每个段，播种通道的相邻接合部与处理室之间的间距小于处理室的段在横向方向上的宽度、优选小于处理室的段的宽度的1/2、更优选小于处理室的段的宽度的1/3。以此方式，在处理室的段内发生更均匀的播种流。

根据本发明的一个特征，每个输入和输出播种通道与处理室的接合部是倒角的。在播种通道与处理室之间的结合处的这种倒角使得处理室的段可以具有增加的长度，使得在不导致不均匀的播种流的情况下，微流体装置的容量更高。优选地，每个倒角在其与处理室的部分的结合处相对于播种通道的纵向方向具有小于45°的角度，以便提供均匀的播种流。

根据一个实施例，播种通道和收获通道被配置成使得在处理室中施加收获流时，每个播种通道中的绝对流速小于施加在每个输入收获通道与处理室的结合处的收获流的流速之和的10％、优选小于5％、更优选小于2.5％。这个百分比的降低能够被描述为收获流期间的分流，其有助于在收获期间降低在播种通道中的微粒损失的风险，这进而提高了收获的性能。

更一般地，根据本发明，在播种流期间，播种通道的特征在于与处理室相比较低的截面和较高的剪切速率，而在收获流期间，收获通道的特征在于与处理室相比相似的截面和剪切速率。

在一个有利的方式中，处理室在高度方向上的高度为50μm至300μm。该高度范围被发现是适应中等流动阻力的。应当注意，在大多数情况下，处理室的底表面代表微流体装置的生产能力，而处理室的高度代表每单位生产能力的流体体积。因此，发现该高度范围有利地最小化了相对于经处理的微粒的数量来进行生物生产操作所需的反应物的量。优选地，处理室的高度是恒定的。更一般地，处理室被设计为通过表现出较低的流体阻力、最小的尺寸和对于流动的障碍物的数量来降低对流动分布影响。

在一种有利的方式中，处理室的垂直于高度方向的表面大于0.25cm²、优选大于1cm²、更优选大于4cm²、更优选大于10cm²、更优选大于16cm²、更优选大于20cm²、更优选大于30cm²。这种高表面积确保了用于生物生产的足够的微粒处理能力。

根据本发明的一个特征，处理室的每个段的上壁和下壁中的至少之一在高度方向上对于用于穿过微流体装置的壁来成像的装置的成像波长是透明的。这允许横跨微流体装置的壁的清晰成像，从而能够执行过程监测。成像波长可以被包括在可见光、红外和/或紫外光谱中。根据一个实施例，为了便于聚焦和成像，处理室的段的上壁和/或下壁是平面的且平行的。应注意的是，表面的平面性不排除提供例如微粒粘附特征的微结构的存在。当存在这种微结构时，它们的尺寸优选比成像波长的尺寸低得多或高得多。

根据本发明的一个特征，处理室的底表面设置有微粒粘附涂层，例如粘附肽、ECM分子或片段、抗体、纳米抗体、细胞膜锚定分子。类似地，播种通道可以具有降低微粒粘附的涂层，例如基于白蛋白的亲水性涂层，所述白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(pHEMA)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)、羧基甜菜碱、琼脂、纤维素、壳聚糖或它们的聚合物或共聚物。替代地，出于类似目的，能够选择表面微结构和/或粗糙度，使得在处理室中，处理室的底表面附近的剪切速率捕集微粒，并且在播种通道中，使得播种通道的底表面附近的剪切速率通常足够强以补偿微粒粘附并提供微粒移动。

根据一个实施例，微流体装置包括处理室的通过流体连接器以蛇形形状连接的一组平行段。通过将处理室的段的数量选择为二的幂，能够在段的两侧上采用二叉播种树，以确保均匀的播种流。通过调节处理室的每个段的长度和段的数量，可以同时优化微流体装置的容量和尺寸。因为不需要第二通道层，因此这种配置具有很多个优点，包括相对简单的设计和相对简单的制造工艺。

因为在装置的生产能力方面，该体积通常是“死体积”，因此在这些实施例中，在表示最小体积的同时，流体连接器的截面优选适于对流产生中等的阻力。例如，每个流体连接器的截面的数量级能够是垂直于其纵轴的处理室的截面的数量级，或者是该截面的一半的数量级。

在超过微流体装置(或芯片)的某个尺寸，流体阻力变得太高而不能有效地执行播种或收获的情况下，可以考虑处理室的段的其他布置，诸如其中若干段和附接通道在同一平面中平行连接的配置，或其中若干段和附接通道垂直堆叠的配置。然而，与以蛇形形状连接平行段的配置相比，这些配置使流体连接的数量倍增，并且在堆叠配置的情况下，使得对处理室的内容物执行光学显微镜分析更加复杂。

根据一个实施例，微流体装置包括透气膜，该透气膜形成了处理室的顶表面和/或底表面的至少一部分。该膜的目的是提供气体交换(该膜也可以被称为气体交换膜)。为此，将含有给定浓度的气相气体或溶解在液体中的气体的交换介质放置在与处理室相对的透气膜的向外定向的一侧上。例如，对于处理对溶解气体浓度敏感的微粒或对于处理能够化学转化溶解气体的微粒(例如活体动物细胞)而言，该实施例是有意义的。

根据一个实施例，微流体装置包括聚合物部件，所述聚合物部件包括处理室和形成在其中的播种通道和收获通道，所述聚合物部件通过透气膜密封。聚合物部件可以由弹性或刚性聚合物例如环烯烃共聚物(COC)制成。在该实施例中，形成处理室的顶表面或底表面的透气膜也可形成微流体装置的播种和收获通道的顶表面或底表面。聚合物部件可以例如通过注塑成型或热压印制造。有利地，透气膜可以由透明材料例如过氧化物或铂固化的硅树脂制成，以便保持成像能力。聚合物部件和透气膜可以使用本领域已知的任何常规组装方法来组装。

根据一个特征，透气膜被设计成具有足以保持其形状并保持其高度上的压力差的厚度。然而，特别是因为气体交换的诱导限制和处理室中的膜由于其弹性变形而塌陷的风险，因此还应当避免透气膜的厚度过大，所述弹性变形是在例如向微流体装置外部施加压力以避免泄漏之后发生的。例如，气体交换膜(例如由硅树脂制成的气体交换膜)根据其气体扩散和机械性能，其厚度可以为50μm到2mm，优选为100μm到1mm。

当透气膜在处理室的底表面的至少一部分处形成时，在播种之后，微粒可以位于透气膜上，因此由于微粒与透气膜的外侧(其相对于处理室向外定向)之间的距离减小而允许了更好地控制溶解的气体浓度。通过使用已经被化学改性的透气膜，特别是例如使用能够用于将抗体或抗体部分结合到处理室的底表面的硅烷化学涂覆的透气膜，也可以获得用于处理室的底表面的特定生物化学性质，例如选择性粘附性质。

当透气膜在处理室的顶表面和/或底表面的至少一部分处形成时，可以有利的为微流体装置配备“气体晶片(Gas chip)”，该“气体晶片”被配置为控制在透气膜的外侧上的气体交换介质中的流动或扩散，并且还可选地在透气膜的外侧上提供机械支撑。气体晶片有利地由透明材料制成，以便保持装置的成像能力。因为气体碎片不与经处理的微粒直接接触，所以可以使用多种材料。气体晶片可以包括互连的通道或室，所述通道或室的底部或顶部表面由透气膜形成。

在一个优选实施例中，气体晶片包括腔室，其具有面对处理室定位的柱阵列或通道阵列，以便限制透气膜相对于处理室的向外的变形。在这种情况下，气体晶片的腔室和柱阵列或通道阵列优选地被布置成例如通过减小柱或通道的高度并增加它们的密度来最小地影响处理室的内容物的成像。这种布置使得可以保持微流体装置的几何形状，特别是当微流体装置中的压力高于气体交换介质中的压力时，即使在透气膜和装置的其他部分之间不存在强化学键的情况下。也是如此，特别是由于难以在塑料和硅树脂之间建立强化学键，这种情况是经常发生的。气体交换介质也能够被优化以便减少对成像的干扰。例如，气体交换介质能够是在选定的成像光谱例如可见光谱上基本透明的液体，并且在选定的成像光谱上具有与气体晶片材料的折射率匹配的折射率。

气体晶片还优选地包括用于更新气体交换介质的输入和输出通道，其可以连接到被配置为更新气体交换介质或调整其气体浓度的外部模块。气体晶片的输入和输出通道优选地被布置成例如通过遵循输入和输出收获通道的路径而避开面向微流体装置的输入和输出播种通道的区域。当微流体装置包括多个处理室时，气体晶片的附加通道可以被布置成面向微流体装置的流体连接器，该流体连接器连接用于收获流的处理室。这种布置允许更好地控制和更均匀的播种。可以使用本领域已知的任何常规组装方法例如共价结合、粘合剂、机械夹持、磁性夹持等来组装气体晶片和包括透气膜的微流体装置。

根据可以独立于上述特征，尤其是独立于涉及播种剪切速率指标(SSI)的值的标准来考虑的一个方面，本发明的主题是用于处理微粒，特别是细胞的微流体装置，该微流体装置包括：

-细长的处理室，其包括至少一个细长段，

-至少一个输入播种通道和至少一个输出播种通道，其被配置成在横向于处理室的段的纵向方向的方向上限定播种流，

-至少一个输入收获通道和至少一个输出收获通道，其被配置成在处理室的段的纵向方向上限定收获流，

其中，对于处理室的每个段，微流体装置包括多个输入播种通道和多个输出播种通道，多个输入播种通道和多个输出播种通道与处理室的段的接合沿着段被分布在两侧上，多个输入播种通道由单个输入播种树限定，并且多个输出播种通道由单个输出播种树限定，

其中，通过估计播种流期间在窄截面(其在沿着处理室的中间纵向纤维L的连续位置处垂直于长度为dL的播种流)中的剪切速率来获得播种剪切速率曲线，其特征在于相对于标准的变化小于66％、优选小于33％、更优选小于10％，在dL是恒定的(等于小于处理室中间纤维的总长度L的1％)并且dL乘以这些截面的数目等于处理室中间纤维L的总长度的情况下来估计这种曲线。

根据可独立于上述特征、特别是独立于涉及播种剪切速率指标(SSI)的值的标准考虑的另一方面，本发明的主题是一种用于处理微粒、特别是细胞的微流体装置，该微流体装置包括：

-细长的处理室，其包括至少一个细长段，

-至少一个输入播种通道和至少一个输出播种通道，其被配置成在横向于处理室的段的纵向方向的方向上限定播种流，

-至少一个输入收获通道和至少一个输出收获通道，其被配置成在处理室的段的纵向方向上限定收获流，

其中，对于处理室的每个段，微流体装置包括多个输入播种通道和多个输出播种通道，多个输入播种通道和多个输出播种通道与处理室的段的接合沿着段被分布在两侧上，多个输入播种通道由单个输入播种树限定，并且多个输出播种通道由单个输出播种树限定，

其中，播种树的总体积小于处理室的总体积、优选小于处理室的总体积的33％、更优选小于所述处理室的总体积的10％。

本发明的另一个主题是使用如上所述的微流体装置处理微粒、特别是细胞的方法，该方法包括：

-在输入和输出收获通道被阻挡的同时，通过经输入和输出播种通道向处理室施加播种流向处理室播种微粒的步骤，

-在输入和输出播种通道被阻挡的同时，通过经输入和输出收获通道向处理室施加收获流向处理室收集微粒的步骤。

在上述部分和文件的其余部分中，当一组通道被称为被阻挡时，这意味着，至少例如通过位于微流体装置中的或位于与其连接的流动管线上的一个或更多个阀来抑制该组通道与微流体装置或任何其他装置的外部之间的流动。当所考虑的通道组被阻挡时，在该通道组和与其连接的处理室的段之间可能发生一些流动。然而，在使用这种表达时，通常优选的是，抑制在这组通道内的任何流动。

在阻挡播种通道的同时，通过收获通道将收获流施加至处理室，在相对低的水力阻力下提供足够的剪切速率以从处理室中非常有效地再收集微粒。

根据一个实施例，在施加收获流之前，可以通过将阻挡材料诸如适当尺寸的珠子注入播种通道中来防止播种通道中的流动。在收获流期间播种通道中的流动高并且干扰收获的情况下，这被发现是特别有利的。

根据一个实施例，通过施加由静置时间所分隔的播种流的连续脉冲来执行对处理室播种的步骤。这样，在收获通道被阻挡的同时，悬浮液中的微粒通过从输入播种通道到输出播种通道的流动而被脉冲地注入，这导致悬浮微粒沿输入播种通道向下行进到处理室中，沉积并保持被捕集在处理室中。

根据一个实施例，通过在阻挡播种通道的同时施加连续不同的流速的收获流来执行从处理室收集微粒的步骤。不同流速的收获流有利地适于收集对处理室表面的具有不同大小的附着性的微粒，和/或受到的不同流动诱导力的微粒，和/或与其他微粒的不同聚集状态的微粒。

从下面对根据本发明的微流体装置和用于处理微粒的方法的实施例的描述中，本发明的特征和优点将变得显而易见，仅通过示例的方式并参考附图给出该描述，在附图中：

图1是根据本发明的第一实施例的微流体装置的俯视图，

图2是沿图1的线II-II的截面图，

图3是根据本发明的微流体装置的第二实施例的类似于图1的视图，

图4是根据本发明的微流体装置的第三实施例的类似于图1的视图，

图5是根据本发明的微流体装置的第四实施例的类似于图1的视图，

图6和图7是根据本发明的第五实施例的微流体装置的两个变型的截面图，

图8a、图8b、图8c是根据本发明的第六实施例的三种变型的配备有气体晶片的微流体装置的截面图，以及

图9A、图9B、图9C分别是在图7A、图7B、图7C的每个变型中的气体晶片的俯视图。

第一实施例

在图1和图2所示的第一实施例中，微流体装置1包括细长的处理室2，该细长的处理室包括沿纵轴线X延伸的单个段21。微流体装置1还包括限定多个输入播种通道33的单个输入播种树3和限定多个输出播种通道43的单个输出播种树4，输入播种通道33和输出播种通道43与处理室的段21的接合部31、41沿段21被分布在两侧上。

更具体地，在该特定实施例中，输入播种树3和输出播种树4是在段21的两侧上彼此面对设置的二叉树。输入播种通道33和输出播种通道43被配置成在横向于段21的纵向方向X的方向Y上限定播种流。每个播种二叉树3、4在水力阻力方面是对称的，这有利于确保均匀的播种流。

输入播种通道33与段21的相邻接合部31之间的间距P和输出播种通道43与段21的相邻连接部41之间的间距P沿段21是相同的，这也有助于处理室2的均匀播种流和均匀灌注。如图2所示，每个输入播种通道33和输出播种通道43与处理室2的接合部31、41在高度方向Z上位于处理室的上部。这种配置利用了在适当的播种流速下的惯性，以在播种脉冲之后将微粒更均匀地分布在处理室内。然后，能够使用播种暂停以允许微粒沉积在处理室的底表面22上。相反，在较低的流速下，在重力作用下，能够发现微粒会遵循较低的流线F，如图2所示，这在播种均匀性方面不太有利。

在有利的方式中，段21的底表面22设置有微粒粘附涂层，例如粘附肽、ECM分子或片段、抗体、纳米抗体、细胞膜锚定分子。相反，输入播种通道33和输出播种通道43有利地设置有减少微粒粘附的涂层，例如基于BSA、pHEMA、PLL、PEG、羧基甜菜碱、琼脂、纤维素、壳聚糖或其聚合物或共聚物的亲水性涂层。

在该实施例中，比率Rs_input以及比率Rs_output高于50，而比率Rh_input以及比率Rh_output小于20。

在该实施例中，处理室的段21的垂直于横向方向Y的截面S₂₁与输入播种通道33在与处理室2的接合部31处的截面S₃₁之和的比率大于15。另外，处理室的段21的沿横向方向Y截取的宽度W与段21的沿高度方向Z截取的高度H的比率大于20。这样，处理室的段21是浅的段，其中，层流导致了对包含在该段中的大部分流体的对流置换。与处理室的段21的侧壁所成的角度进一步促进了对包含在段21中的流体的完全更新。

微流体装置1还包括输入收获通道53和输出收获通道63，其被配置成在处理室的段21的纵向方向X上限定收获流。如图1所示，输入收获通道53和输出收获通道63与处理室2的接合51、61是倒角的，这有利于收获流的均匀性。播种和收获通道33、43、53、63被配置成使得在处理室的段21中施加收获流时，每个播种通道33、43中的绝对流速小于施加在输入收获通道53与处理室的段21的接合51处的收获流的流速的2.5％。

在该实施例中，输入播种树3在其通道体积的一半以上中的输入播种通道33的播种剪切速率指标SSI与处理室的段21的平均播种剪切速率指标SSI的比率高于20，其中，通道或段的播种剪切速率指标SSI由下式定义：

其中，T_Q是流经所考虑的通道或段的播种流的百分比，其等于所考虑的通道或段中的播种流速Q与总播种流速Q_tot的比率，S是通道或段垂直于其用于播种流的纵向纤维所截取的截面，而h是通道或段在高度方向Z上截取的高度。

在第一实施例的非限制性示例中：

-处理室的段21具有100μm的高度H和5mm的宽度W，

-播种通道33、43在与处理室2的接合部31、41处的截面S31为100μm宽乘50μm高，

-输入播种通道33的相邻接合部31之间的间距P和输出播种通道43的相邻接合部41之间的间距P是恒定的并且等于1.25mm，

-处理室2的垂直于高度方向Z的表面大于0.25cm²。

在该实施例中，在高度方向Z上，处理室2的上壁10和下壁12对可见波长、近IR波长和近UV波长是透明的，例如上壁10或底壁12由环烯烃共聚物(COC)制成。这样，能够通过穿过微流体装置1的壁的成像来监测生物过程。在该实施例中，处理室的段21的上壁10和下壁12是平面的且平行的，以便于聚焦和成像。

第二实施例

在图3所示的第二实施例中，与第一实施例的元件相似的元件具有相同的附图标记。第二实施例与第一实施例的微流体装置1的不同之处在于，单个输入收获通道53和单个输出收获通道63被输入收获二叉树5和输出收获二叉树6代替，其具有与处理室2的段21的倒角接合51、61的。与第一实施例相比，收获树5和6提供更均匀的收获流。注意，在该第二实施例中，收获树5、6和播种树3、4是不可互换的。实际上，在给定流速下，收获流在处理室内提供的剪切速率比使用相同流速来灌注微流体装置的播种流的剪切速率高得多。

在该实施例中，比率Rs_input以及比率Rs_output高于50，而比率Rh_input以及比率Rh_output小于20。

第三实施例

在图4所示的第三实施例中，与第一实施例的元件相似的元件具有相同的附图标记。第三实施例与第二实施例的微流体装置1的不同之处在于，处理室2包括通过流体连接器24以蛇形形状连接的四个段21。在该第三实施例中，微流体装置1包括用于所有段21的单个输入播种树3和单个输出播种树4，这对于微流体装置的相容性和整个处理室2中的播种流的均匀性二者都是有利的。因为不需要第二通道层，因此蛇形配置使得可以利用相对简单的设计和相对简单的制造工艺来优化微流体装置1的容量及其尺寸。

在该实施例中，比率Rs_input以及比率Rs_output高于50，而比率Rh_input以及比率Rh_output小于20。

第四实施例

在图5所示的第四实施例中，与第一实施例的元件相似的元件具有相同的附图标记。第四实施例与第三实施例的微流体装置1的不同之处在于，对于接合处理室的两个段21的每个流体连接器24，连接器24通过与段具有倒角接合的二叉树连接到两个段21中的每一个。这种配置进一步提高了微流体装置1内的收获流的均匀性。

在第四实施例的非限制性示例中，输入播种二叉树3从树的根部到末端的通道的连续截面可以如下选择：

-从根部开始的第一输入播种通道具有200μm的宽度和200μm的高度，

-从根部开始的第二层级的播种通道具有159μm的宽度和159μm的高度，

-从根部开始的第三层级的播种通道具有126μm的宽度和126μm的高度，

-从根部开始的第四层级的播种通道具有100μm的宽度和100μm的高度，

-从根部开始的第五层级的播种通道具有100μm的宽度和70.7μm的高度，

-从根部开始的第六层级的播种通道具有100μm的宽度和50μm的高度，所述播种通道连接至处理室2。

在该实施例中，比率Rs_input以及比率Rs_output高于50，而比率Rh_input以及比率Rh_output小于20。

第五实施例

在图6和图7所示的第五实施例中，与第四实施例的元件相似的元件具有相同的附图标记。第五实施例与第四实施例的微流体装置1的不同之处在于，装置的所有通道和室共享公共底表面，其由硅树脂制成的透气膜8所形成并且具有50μm至2mm恒定厚度。作为变型，透气膜8可以由与生物医学用途相容的任何其他材料制成，并且优选是透明的。微流体装置的其余部分由聚合物部件形成，例如由聚苯乙烯(PS)或环烯烃共聚物(COC)制成。

图6示出了透气膜8形成了微流体装置1的上部的配置，而图7示出了透气膜8覆盖有附加刚性板80的配置。附加刚性板80使得可以在流动操作期间限制透气膜8的变形。有利地，在流动操作期间，刚性板80被定位在透气膜8上方，并且使用任何合适的装置，特别是机械装置来将等于或大于灌注压力的平均压力施加在刚性板80上。为了使气体在流动操作之外能够穿过透气膜8进行交换，优选地在流动操作之后将刚性板80移除。

第六实施例

在图8a、图8b、图8c和图9a、图9b、图9c所示的第六实施例中，与第五实施例的元件相似的元件具有相同的附图标记。第六实施例与第五实施例的微流体装置1的不同之处在于，它还包括在透气膜8外侧上的气体晶片9，该气体晶片相对于处理室的段21向外定向，其被配置成控制气体的流动或扩散。气体晶片9优选由刚性且透明的聚合物材料制成，例如聚苯乙烯(PS)或环烯烃共聚物(COC)。气体晶片9由透气膜8封闭，并且包括面向处理室设置的腔室910，该腔室具有如图8A、图9A和图8B、图9B的示例中所示的通道92的阵列，或者具有如图8C、图9C的示例中所示的柱911的阵列，通道92或柱911的阵列与透气膜8接触。

调节通道92或柱911的高度和间隔，以便在处理室中的压力大于气体交换介质中的压力时，例如相差1bar时，使气体晶片中的透气膜8的塌陷的风险最小化。支撑透气膜8的通道92或柱911优选地具有小于100μm、优选地小于50μm高度；接近1、优选地小于1的长宽比；以及它们宽度的量级、例如它们宽度的两倍的间隔。在使用密集布置的通道92的情况下，通道92被布置成通过扩散和对流来提供对气体晶片中存在的气体交换介质中的气体浓度的有效控制。如图所示，可以沿着处理室的段21的纵向轴线将低液压阻力通道添加至气体晶片，以允许以较低压力来更新气体交换介质。

当为输入播种二叉树3选择上述截面时，可以为输出播种二叉树4选择相同的截面，此外，当为输入播种二叉树3选择上述截面时，在其与处理室的接合部处灌注处理室2的段21的相邻播种通道33之间的距离p可以被选择为1mm，处理室2的高度H可以被选择为100μm，处理室2的宽度W可以被选择为5mm。

方法

使用微流体装置1的以上实施例中的任何一个来处理细胞的方法包括如下所述的步骤。

在处理室中播种

通过微流体装置1的播种步骤被配置成导致细胞在处理室2内的均匀分布。注意，播种应当相对快速地进行，特别是在粘附细胞的情况下，以避免预先播种条件对细胞的影响，例如失巢凋亡、装置上游细胞的不期望的粘附、聚集。

使用如上所述的微流体装置1，通过播种流脉冲(其也被称为播种脉冲)来播种细胞，该播种流脉冲表示的体积通常为处理室2的体积的数量级，其体积通常为处理室的体积的R＝40％至R＝200％。然后，如果待播种的细胞悬浮在表示处理室2的体积的x倍的体积中，则需要x/R播种流脉冲的量级来播种它们。为了播种尤其是由于沉降和分散而保持在上游的细胞，还使用“无细胞”介质输入进行被称为二次播种脉冲的附加播种脉冲。

对于每个连续的播种脉冲对，脉冲由静止时间或播种暂停分开，以允许最近播种的细胞沉降在处理室2中。为了加速沉降，并因此加速播种过程，有利的是将细胞播种在低至中等粘度的介质中，例如在37℃下运动粘度不超过水的运动粘度的五倍并且可忽略的弹性的介质，例如交联的水凝胶不被优选作为播种介质。例如，对于100μm高、5mm宽、640mm总长度的处理室：处理室的体积为320μL，能够特别地取决于细胞沉降速度将播种流速选择为1μL/s与100μL/s。在进一步优化前，推荐30μL/s作为首选的典型值，根据细胞沉降速度，能够使用5s至1200s的播种暂停。在进一步优化之前，推荐首选的典型值为100s至300s。假设在播种脉冲期间播种细胞的位置分布广泛，则能够选择190μL(约60％的处理室体积)的播种脉冲作为第一值。根据播种脉冲期间播种细胞的实际位置分布来调节该值。在这种情况下，推荐使用一个并且优选地二至十个二次播种脉冲来确保非常低的上游细胞丢失率。二次播种脉冲的数量应被调节到播种流中的处理室2上游的总体积，包括潜在管道和用于灌注微流体装置1的其他附件。

为了避免长的播种时间，优选将待播种的细胞悬浮在x/R小于20的介质体积中。因为输入细胞悬浮液的分散可能强烈影响沿着处理室宽度的播种的均匀性，因此太低的值(例如x/R＝1)也不是优选的。推荐x/R的值为3至10。利用这样的参数和300s的播种暂停，在大约30分钟内(这是可接受的持续时间)执行初始播种脉冲。由于包括沉降和分散在内的各种原因，在上游行进较慢的少量细胞会经历更长的播种过程持续时间，这不会危害本发明的优点。注意，该方法提供了细胞悬浮液的浓缩。这是本发明的另一个优点，因为细胞悬浮液浓缩在生物生产中常常是必需的。通过将浓缩功能集成在生物处理装置内，这减少了对细胞浓缩专用模块的需要，从而简化了生物生产方案的实施。

可选的在处理室中的进一步播种

当需要执行两个播种步骤时，例如在同一处理室中连续播种两个不同的细胞群体，可以在第一个播种步骤之后进行如上所述的第二个播种步骤。当在两次播种之间不需要有延迟时，可以使用第二次播种初始脉冲作为第一次播种的二次播种脉冲。通过这样做，本发明有利地允许同时混合和浓缩两个不同的细胞群。

处理室的三个或更多个播种步骤可以顺序地执行，并且与上述的二次播种类似。然后，再次，下一个播种初始脉冲可以用作前一播种的二次播种脉冲。

介质更新

许多生物生产的普通操作包括在不收获细胞的情况下部分或大量更换介质，它们在下文中被称为介质更新步骤。

介质更新步骤通常用于例如细胞扩增、分化、病毒转导(或其他遗传编辑方法)、标记、加标签、染色、过滤、解冻、冷冻等方案。

在生物生产中，通常必须在体积方面精确地进行介质更新，以在处理室中产生均匀的介质，避免细胞的下游损失，避免暴露于机械应力或其他干扰。

通过播种通道的介质更新

为此，利用根据本发明的微流体装置1，使用播种流模式以在在细胞上具有最小的应力以及最小的细胞损失风险的情况下在处理室2中均匀地分配流体。为了部分地替换介质，将增加的体积注入处理室2中，然后用来回流动或用环路流动或用两者的组合来均质化。

在这种介质更新操作期间，选择流速以避免过大的压力(过高的流速)或过慢的操作(过低的流速)。还根据细胞来选择流速，以便导致较低风险的不期望的细胞损失。这些介质更新操作的允许流速取决于处理室2的潜在涂层以及细胞类型。另外，优选在细胞损失可忽略的范围内选择高流速，以允许更快操作和更有效地处理某些化合物，例如非细胞囊泡、细胞碎片、垂死或死亡细胞。

在某些实施例中，流动回路能够部分或全部由气体可渗透(或半渗透或选择性渗透)材料制成，以提供气体交换，特别是CO2和O2的交换。当处理室2的透气性较低时，为了避免介质的过于频繁的更换，这种类型的布置是特别有意义的。

在某些实施例中，能够发现频繁地更换一小部分介质而不是较不频繁地更换一大部分介质对于减少介质参数(如营养物浓度)的波动是有利的。实际上，较小和较频繁的变化导致较小的处理参数的突然变化，能够发现这导致了较稳健和可再现的过程。

在某些实施例中，能够发现通过用较少量的浓缩溶液而不是较大量的较低浓缩溶液替换介质来增加一种或几种介质的浓度是有利的。实际上，替换较少量的体积能够避免不必要地去除介质成分，该介质成分的浓度比需要较频繁添加的介质成分衰减得慢。另外，这种类型的操作导致对由细胞分泌的化合物的稀释度降低，能够发现所述化合物对维持或进化细胞表型，例如干细胞维持和分化具有重要作用。

通过收获通道的介质更新

在某些和较不频繁的实施例中，特别是当发现细胞对处理室具有相对较高的粘附时，能够发现在收获流模式下的介质更新是有利的。在以下情况下尤其如此：

-需要较高的剪切速率以消除主体，如垂死细胞、死细胞、非细胞囊泡、细胞碎片、血小板、红细胞，

-需要较高剪切速率来触发机械转导，

在某些实施例中，仅以线性流执行这些操作，在其他实施例中，仅以环路流执行这些操作，在又一些其他实施例中以线性流与环路流的组合来执行这些操作。

通过两种类型的通道的介质更新

当需要完全清洗装置以消除化合物，如化学品、酶、病毒时，可以同时或顺序地并最终重复地执行使用播种和/或收获通道的介质更新。

这些操作包含至少一些线性流，但它们有时也包括一些环流。

使用穿过封闭处理室的透气膜的扩散交换来维持气体浓度

处理室中的气体浓度有利地通过穿过透气膜的扩散交换获得，从而允许减少介质消耗以补偿例如活细胞情况下的氧消耗。为了提供这种扩散交换，气体交换介质，例如具有期望成分的气体混合物，或者具有经调节的溶解气体浓度的液体被设置在与处理室相对的透气膜的外侧上。为了提供稳定的处理条件，或者为了改变处理室中的气体浓度方面的处理条件，在与处理室相对的气体交换介质的一侧，以适于处理室中的气体浓度变化的期望速度或者适于补偿处理室中的气体浓度变化的速率来更新具有经调节的气体浓度的气体交换介质，该气体浓度变化可能是由于例如代谢活动引起的。

在包括气体晶片的实施例中，使用诸如泵、气体源或交换器的常规装置使气体交换介质从气体晶片的输入流到气体晶片的输出。气体晶片可以很好地控制处理室中的气体浓度更新，并减小气体交换介质的所需体积。当要扩散到处理室中的气体来自于诸如是包含高分子纯度气体的高压容器的源时，这是特别有意义的。

收获

收获可以包括以下步骤，以下指出的顺序仅是非限制性示例。能够执行或不执行以下步骤、能够以任何顺序和以任何种类的实现方式将以下步骤执行任何次数：

-根据介质更新方法之一清洗处理室2或整个微流体装置1，

-通过将细胞分离反应物(例如酶)注入处理室2中来更新介质。能够根据任何介质更新方法来执行该步骤，但优选地，执行仅使用播种通道33、43的方法，

-额外的物理处理，例如温度、振动、电场、磁场、利用可见或不可见光例如紫外光或其组合的照射，以有利于细胞分离，

-清洗处理室2。该步骤能够根据任何介质更新方法来执行，但更优选地执行仅使用播种通道33、43的方法，

-仅使用收获通道53、63来再收集细胞，同时播种通道33、43在其末端处被尽可能刚性地阻断，收获溶液(如介质或缓冲液)的流被施加到微流体装置1，并且在输出中被收获细胞。考虑到微流体装置1及其附件的机械完整性的限制，相对于所产生的压力和细胞机械灵敏度的限制，将该操作的代表性剪切速率选择为最高可允许值。典型剪切速率允许了有效再收集对处理室壁具有低残留粘附的细胞，该剪切速率为100至10000s^-1；然而，在特定情况下，例如细胞对剪切非常敏感，或者相反地，细胞对处理室壁具有高残留粘附时，可以使用该范围之外的值，

-能够可选地执行微流体装置1的成像，特别是处理室2的成像，以便评估收获的功效，特别是在使用比通常更低的剪切速率时。

在细胞的再收集期间冲过微流体装置1的体积至少等于处理室2各段21、中间和下游流动路径体积到回收体积之和。优选地，使用两倍于该最小量的或更大的体积。作为在进一步优化之前使用的第一值，推荐的体积是上述最小体积的三倍。

在某些实施例中，在细胞的再收集期间使用的流速连续地或不连续地增加。然而，除非特定情况表明这样做是有用的，否则不推荐这样做。可以表明的一种在细胞的再收集期间与增加的流速相关的元素可以是例如是处理室2内的非常高的细胞密度。在这种情况下，细胞密度能够增加流速阻力，因此，在细胞的再收集期间增加流速能够逐渐减少装置中的细胞数量，从而避免过大的压力。在这种情况下，能够有利地监测上游压力以调节流速并避免过大的压力和泄漏的风险。

细胞分选

因为在处理室2中细胞对涂覆或未涂覆的处理室或其他细胞可能具有不同类型的粘附，并且因为它们也可能具有不同的形状和大小，所以可以在微流体装置1内利用这些差异来选择性地收获某些细胞和/或选择性地保留某些细胞，以实现细胞分选。

在一些实施例中，处理室2预先涂覆有一种或更多种化合物(结合锚)，例如抗体、纳米抗体、ECM分子、ECM分子的片段、与分子特异性结合的肽(结合靶)，这些化合物在彼此待分离的两组细胞中的一组细胞的表面上比在第二组细胞的表面上更频繁地出现。

在一些实施例中，根据上述方法之一将细胞播种在处理室2中。在一些实施例中，在播种步骤之后，将小且强烈的来回脉冲施加至处理室2以降低叠加细胞的频率。这种脉冲应表示小于处理室体积的25％的体积，并且至少与播种流脉冲一样强。

在一些实施例中，在播种通道33、43在其末端处被阻断的同时，通过施加通过收获通道53、63的流来执行第一再收集。在这样的实施例中，对处理室表面、涂层或对相当强粘附的其他细胞具有较低粘附的细胞被优先地再收集，导致在输出流中富集这样的细胞，并且耗尽了处理室2内的这些细胞。在一些这样的实施例中，流速被连续或不连续地增加至略小于危害目的细胞的活力或危害装置机械完整性的那些值。在一些这样的实施例中，根据所施加的流速的范围来分离在该流动期间从处理室2获得的体积。在一些这样的实施例中，在该操作期间，例如使用位于收获通道63的输出处的成像传感器来监测每单位时间的再收集的细胞的数目。在一些这样的实施例中，每单位时间的再收集的细胞的数目的测量被用于调节流速。在一些这样的实施例中，流速被自动增加直到特定速率下的最大值，同时每单位时间的再收集的细胞数量的测量值小于先前定义的阈值。

在一些实施例中，在施加第一分选流以对处理室2中剩余的一些、可能全部细胞进行再收集之后，执行根据上述收获方法之一的收获(第二再收集)。

在一些实施例中，在第一或第二再收集期间收集的分选的部分之一再次被播种在处理室2中或类似微流体装置的处理室中，以进行另外的分选。可以执行任何次数的这种分选重复以获得期望的细胞群体的组成和纯度。

从前面的实施例能够看出，根据本发明的微流体装置提供了一种新颖的几何形状，其中高容量的处理室与对应于两种不同流动模式的两组通道相连，所述两种不同流动模式即播种流模式和收获流模式。播种流模式使得可以获得处理室的均匀且有效的播种、具有低风险的上游和下游微粒沉积，并且使得微流体装置能够浓缩和清洗微粒悬浮液，而收获流模式提供了快速、有效且高效的收获。通过将这些功能集成到一个微流体装置中，本发明特别适于实施自动化和/或小型化生物生产，其具有许多技术优点，例如由于转移步骤的数量减少而在微粒和反应物效率方面获得增益。这种独特的配置具有另外的优点，即，在仅有一个通道层而没有过滤膜的情况下是可用的，因此大大降低了制造复杂性和成本。

本发明并不限于所描述和所示出的示例。

特别地，在上述示例性实施例中，微流体装置包括用于处理室的所有段的单个输入播种树和单个输出播种树。作为变型，微流体装置可以包括若干输入播种树和若干输出播种树，只要处理室的每个段都具有单个输入播种树和单个输出播种树。

此外，在上述示例中，处理室的连续段被彼此相邻地布置，彼此平行，并且通过横向于处理室的段的流体连接器连接。作为变型或除了这种平行布置之外，处理室还可以包括首尾相连布置的几个段和/或彼此横向布置的几个段。特别地，在图4和图5的实施例中，流体连接器24可以由处理室的段21代替。

此外，在图中所示的实例中，微流体装置在输入和输出播种通道与处理室的接合部是不包括倒角的。然而，这种倒角的存在是有利的并且在本发明的范围内。还能够发现，在处理室附近并朝向处理室的播种通道截面交替的逐渐增加(例如圆角)是有利于改善播种流的。

另外，在上述实施例中，处理室的每个段具有矩形几何形状的播种通道和几何形状对称的二叉树的播种通道。然而，在本发明的其他实施例中，处理室和播种通道的树状结构可以具有不同的形状和布置。在本发明的一些实施例中，也可以堆叠根据本发明的几个微流体装置，然后可以通过液压歧管连接所堆叠的装置。根据另一变型，处理室可以包含接合其顶表面和底表面的柱，以降低与处理室的平坦度相关的塌陷的风险。在处理室的宽度远大于其高度的实施例中，这种附加的柱可能是特别有利的。

Claims (20)

1.一种用于处理微粒、特别是细胞的微流体装置(1)，包括：

-细长的处理室(2)，其包括至少一个细长段(21)，

-至少一个输入播种通道(33)和至少一个输出播种通道(43)，所述至少一个输入播种通道和至少一个输出播种通道被配置成在横向于所述处理室的段(21)的纵向方向(X)的方向(Y)上限定播种流，

-至少一个输入收获通道(53)和至少一个输出收获通道(63)，所述至少一个输入收获通道和至少一个输出收获通道被配置成在所述处理室的段(21)的纵向方向(X)上限定收获流，

其中，对于所述处理室(2)的每个段(21)，所述微流体装置(1)包括多个输入播种通道(33)和多个输出播种通道(43)，所述多个输入播种通道和所述多个输出播种通道与所述处理室的段(21)的接合部(31、41)沿着所述段被分布在两侧上，所述多个输入播种通道(33)由单个输入播种树(3)限定，并且所述多个输出播种通道(43)由单个输出播种树(4)限定，

其中，比率Rs_input，即：

大于50、优选地大于75、优选地大于100、优选地大于150、优选地大于200，其中，S₂₁是所述段(21)的垂直于所述横向方向(Y)的截面，并且(∑_kV_k*S_k)/V_{TOTs_input}是所述输入播种通道(33)的体积和截面的乘积之和除以总体积V_{TOTs_input}，所述输入播种通道是指最接近所述输入播种树(3)的树根(30)的第一节点(35)与所述段(21)之间的所有输入播种通道(33)，所述总体积是指这些输入播种通道(33)的体积之和。

2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述比率Rh_input，即：

小于20、优选小于15、优选小于10、优选小于5，其中，W是垂直于纵向方向(X)的段(21)的截面，而(Σ_jV_j*S_j)/V_{TOTh_input}是所述输入收获通道(53)的体积和截面的乘积之和除以总体积V_{TOTh_input}，所述输入收获通道是指在最接近所述输入收获树(5)的树根(50)的第一节点(55)与所述段(21)之间的所有输入收获通道(53)，所述总体积是这些输入收获通道(53)的体积之和。

3.根据权利要求1或2所述的微流体装置，其中，对于所述处理室(2)的每个段(21)，在链接至所述段(21)的所述输入播种树(3)的通道体积的一半以上中，所述输入播种通道(33)的播种剪切速率指标(SSI)与所述段(21)的平均播种剪切速率指标(SSI)的比率高于10、优选高于20、更优选高于40，其中，通道或段的播种剪切速率指标(SSI)由下式定义：

其中，T_Q是流经所述所考虑的通道或段的播种流的百分比，S是所述通道或段垂直于其用于播种流的纵向纤维所截取的截面，并且h是所述通道或段在高度方向(Z)上所截取的高度。

4.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，包括阻挡装置，所述阻挡装置被配置成：

-当通过所述输入播种通道和所述输出播种通道(33、43)将播种流施加至所述处理室(2)时，所述阻挡装置选择性地阻挡所述输入收获通道和输出收获通道(53、63)，以及

-当通过所述输入收获通道和所述输出收获通道(53、63)将收获流施加到所述处理室(2)时，所述阻挡装置选择性地阻挡所述输入播种通道和所述输出播种通道(33、43)。

5.如前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，在垂直于所述高度方向(Z)的方向上的所述处理室(2)的表面大于4cm²、优选大于10cm²，更优选大于16cm²、更优选大于20cm²、更优选大于30cm²。

6.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，对于所述处理室(2)的每个段(21)，在所述播种通道(33、43)与所述处理室(2)的段(21)的相邻接合部(31、41)之间的间距(P)沿着所述段(21)是相同的。

7.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，在每个播种树(3、4)中，所述播种通道(33、43)的截面随着距所述树的根部(30、40)的通道路径距离的增加而减小。

8.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，对于所述处理室(2)的每个段(21)，所述段(21)的垂直于所述横向方向(Y)的截面(S₂₁)与灌注所述段(21)的所述输入播种通道(33)的平均截面(S₃₁)的总和的比率高于5、优选高于10、更优选高于15。

9.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述播种树(3、4)的总体积小于所述处理室(2)的总体积，优选小于所述处理室(2)的总体积的33％、更优选小于所述处理室(2)的总体积的10％。

10.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，每个输入播种通道和输出播种通道(33、43)与所述处理室(2)的接合部(31、41)在所述高度方向(Z)上位于所述处理室的上部。

11.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，对于所述处理室(2)的每个段(21)，所述段(21)的沿所述横向方向(Y)截取的宽度(W)与所述段(21)的沿所述高度方向(Z)截取的高度(H)的比率高于5、优选高于10、更优选高于20。

12.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，每个输入播种通道和输出播种通道(33、43)与所述处理室(2)的接合部(31、41)是倒角的。

13.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述播种通道和收获通道(33、43、53、63)被配置成使得在所述处理室(2)中施加收获流时，每个播种通道(33、43)中的绝对流速小于施加在每个输入收获通道(53)与所述处理室(2)的接合(51)处的收获流的流速之和的10％、优选小于5％、更优选小于2.5％。

14.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述处理室(2)的沿所述高度方向(Z)截取的高度(H)为50μm至300μm。

15.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其包括所述处理室(2)的一组平行段(21)，所述处理室的一组平行段通过流体连接器(24)以蛇形形状进行连接。

16.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其包括透气膜(8)，所述透气膜形成了所述处理室(2)的段(21)的顶部表面和/或底表面的至少一部分。

17.根据权利要求16所述的微流体装置，其包括在与所述处理室(2)相对的所述透气膜(8)的外侧上的气体晶片(9)，所述气体晶片(9)具有由所述透气膜(8)封闭的通道(92)或腔室。

18.一种用于使用根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置(1)处理微粒、特别是细胞的方法，所述方法包括：

-在所述输入收获通道和所述输出收获通道(53、63)被阻挡的同时，通过经所述输入播种通道和所述输出播种通道(33、43)向所述处理室(2)施加播种流来向所述处理室(2)播种微粒的步骤，

-在所述输入播种通道和所述输出播种通道(33、43)被阻挡的同时，通过经所述输入收获通道和所述输出收获通道(53、63)向所述处理室(2)施加收获流来从所述处理室(2)收集微粒的步骤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，通过施加由静置时间所间隔的播种流的连续脉冲来执行对所述处理室(2)播种的步骤。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，通过施加连续的不同流速的收获流来执行从所述处理室(2)收集微粒的步骤。

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