CN112689515A - 用于增加或增强基因治疗载体的转化以及用于去除或减少免疫球蛋白的组合物和方法 - Google Patents

用于增加或增强基因治疗载体的转化以及用于去除或减少免疫球蛋白的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了通过施用切割存在于免疫球蛋白中的肽键的蛋白酶或通过施用切割存在于免疫球蛋白中的碳水化合物残基的糖苷酶或其他类似的酶促切割体内免疫球蛋白的方法来治疗可能发展或已经具有预先存在的基因治疗中和抗体的患者的方法。还公开了利用IdeS和其他免疫球蛋白G降解酶多肽进行基因疗法治疗有需要的患者的疾病的方法。

Description

用于增加或增强基因治疗载体的转化以及用于去除或减少免 疫球蛋白的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2018年7月17日提交的欧洲专利申请号EP18305971.6和2018年11月16日提交的美国临时专利申请号62/768,731的优先权。上述申请的全部内容通过引用合并于本文，包括所有的文本、表格、序列表和附图。
背景技术
适应性免疫系统可以靶向腺相关病毒(AAV)和其他病毒载体以及基于脂质、聚合物和蛋白质的纳米颗粒基因治疗途径，导致功效减弱和患者对治疗干预变得完全难治的可能性。适应性免疫系统依赖于抗原特异性免疫球蛋白(例如IgG)抗体的开发，其导致靶分子的抑制或清除。由于人自然暴露于野生型AAV，因此预先存在的抗AAV抗体可阻碍AAV基因治疗。此外，在AAV基因转移后开发抗AAV抗体可防止再给药相同或交叉反应性载体。
出生后暴露于野生型AAV会在生命的前两年内诱导针对病毒衣壳的抗体(Calcedoet al.(2011)Clin Vaccine Immunol.18,1586-8；Erles et al.(1999)J Med Virol.59,406-11；Li et al.(2012)Gene Ther.19,288-94)。取决于AAV血清型和个体年龄，抗AAV抗体呈阳性的受试者比例可达60％。即使当以相对较低的滴度存在，一些抗AAV抗体靶向对细胞进入至关重要的病毒表位并中和病毒感染性。重要的是，抗AAV抗体与不同的AAV血清型具有高度的交叉反应性(Boutin et al.(2010)Hum Gene Ther.21,704-12)。如若干临床前和临床研究所证实，这种中和抗体极大降低转导效率，尤其当载体被直接递送入血液中时(Manno et al.(2006)Nat Med.12,342-7；Masat et al.(2013)Discov Med.15,379-89；Arruda et al.(2010)Blood.115,4678-88；Haurigot et al.(2010)Mol Ther.18,1318-29；Jiang et al.(2006)Blood.108,3321-8；Scallan et al.(2006)Blood.107,1810-7)。
中和性抗AAV抗体的高患病率使某些受试者无法参与AAV载体的基因转移试验，并将使某些患者无法接受批准的AAV基因治疗，使得某些患者无法获得可能挽救生命的疗法。此外，在AAV基因转移后中和性抗AAV抗体被诱导，这在再给药相同个体的情况下会阻碍转导效率。例如，血友病B是由凝血因子IX(FIX)缺乏或功能障碍引起的罕见的X连锁出血性疾病，并且当其严重时(循环FIX水平低于正常的1％)会导致频繁的出血发作、关节病发展和早期死亡的风险(Mannucci et al.(2001)N Engl J Med.344,1773-9)。用于预防或治疗出血的外源FIX施用的当前治疗不理想。分子的半衰期短意味着频繁的静脉注射，这与高成本和产生抑制性抗体的风险有关。血友病B的单基因性质使基因疗法成为恢复连续内源性FIX表达并规避当前疗法局限性的有吸引力的选择。在这方面，尽管AAV介导的基因转移在长期纠正重症患者的血友病B方面显示出巨大希望(Nathwani et al.(2014)N Engl JMed.371,1994-2004；Nathwani et al.(2011)N Engl J Med.365,2357-65；George et al.(2017)N Engl J Med.377,2215-2227)，但是预先存在的抗AAV抗体的存在为使用AAV介导的基因疗法治疗某些血友病B患者带来了障碍。类似地，尽管AAV介导的基因转移已显示出治疗血友病A、脊髓性肌萎缩(Mendell et al.,2017,N.Engl.J.Med.,377:1713-1722)以及许多其他疾病的巨大希望，但是预先存在的抗AAV抗体的存在同样为治疗某些患有这些疾病和障碍的患者带来了障碍。
免疫球蛋白的蛋白水解是病原体用来规避宿主防御系统的常见机制(Travis etal.(2000)Biochim Biophys Acta.1477,35-50；Travis et al.(1995)TrendsMicrobiol.3,405-7)。例如，IdeS是由病原性化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)表达的天然存在的35kDa半胱氨酸蛋白酶(特别是内肽酶)，除了几种其他物种外，其对人IgG中发现的靶序列具有特异性。IdeS能够在铰链区下方切割IgG(von Pawel-Rammingen etal.(2003)Curr Opin Microbiol.6,50-5)，导致产生F(ab')2和Fc/2片段(Ryan et al.(2008)Mol Immunol.45,1837-46)。
作为进一步的实例，EndoS是来自化脓性链球菌的天然存在的糖苷酶(特别是内切糖苷酶)，其特异性地水解来自人IgG的聚糖并改变抗体效应子功能，包括Fc受体结合。
本文特别描述了通过施用切割存在于免疫球蛋白中的肽键的蛋白酶或通过施用切割存在于免疫球蛋白上的碳水化合物残基或体内免疫球蛋白的其他类似酶促切割的糖苷酶来治疗可能发展或已经具有预先存在的针对基因治疗载体的中和抗体的患者的方法。本文还特别描述了通过施用切割存在于免疫球蛋白中的肽键的蛋白酶或通过施用切割存在于免疫球蛋白上的碳水化合物残基或体内免疫球蛋白的其他类似酶促切割的糖苷酶来治疗可能发展或已经具有预先存在的结合异源多核苷酸或由基因治疗载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的患者的方法。
发明概述
本文公开了利用蛋白酶(如IdeS)降低人血浆中抗体(例如IgG)水平的方法。根据本发明的方法尤其可以用于治疗具有预先存在的针对基因治疗载体的中和抗体的患者，以及再给药之前用基因治疗载体治疗的患者。
在某些实施方案中，治疗需要治疗由蛋白质功能或活性丧失引起的疾病的受试者的方法包括：(a)向受试者施用重组病毒载体，其包含编码提供或补充蛋白质功能或活性的蛋白质或肽的异源多核苷酸；和(b)向受试者施用一定量的蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少结合所述重组病毒载体的抗体和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的效应子功能。
在某些实施方案中，治疗需要治疗由蛋白质功能活性或表达增加引起的疾病的受试者的方法包括：(a)向受试者施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体，所述异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少所述蛋白质功能、活性或表达的增加的核酸；和(b)向受试者施用蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少结合所述重组病毒载体的抗体的效应子功能。
在某些实施方案中，治疗需要治疗由蛋白质功能或活性丧失引起的疾病的受试者的方法包括：(a)向受试者施用蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少病毒载体结合抗体的效应子功能；和(b)向受试者施用重组病毒载体，其包含编码提供或补充蛋白质功能或活性的蛋白质或肽的异源多核苷酸。
在某些实施方案中，治疗需要治疗由蛋白质功能活性或表达增加引起的疾病的受试者的方法包括：(a)向受试者施用蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少病毒载体结合抗体的效应子功能；和(b)向受试者施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体，所述异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少所述蛋白质功能、活性或表达的增加的核酸。
在某些实施方案中，在治疗受试者的方法中，步骤(b)在进行步骤(a)之后约90天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约60天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约45天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约30天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约21天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约14天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约7天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约72小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约48小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约24小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约12小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之前或之后约6小时内进行。
在某些实施方案中，蛋白酶包含半胱氨酸蛋白酶或硫醇蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶包含来自化脓性链球菌、马链球菌(Streptococcus equi)或犬支原体(Mycoplasma canis)的蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶包含SEQ ID NO：3-18、23或48中任一所示的IdeS或其修饰的变体。
在某些实施方案中，糖苷酶包括内切糖苷酶。在某些实施方案中，内切糖苷酶包含SEQ ID NO：44-47中任一所示的序列。
在某些实施方案中，蛋白酶或糖苷酶降解或消化和/或抑制或减少人抗体的效应子功能。
在某些实施方案中，病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。
在某些实施方案中，慢病毒载体包含抗体结合的包膜蛋白。
在某些实施方案中，AAV载体包括抗体结合的衣壳蛋白。
在某些实施方案中，AAV载体包含抗体结合的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在某些实施方案中，AAV载体包含与选自下组的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有60％或更高序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在某些实施方案中，AAV载体包含与选自下组的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有100％序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在某些实施方案中，受试者具有结合所述病毒载体的抗体。
在某些实施方案中，受试者不存在结合病毒载体的抗体。
在某些实施方案中，受试者具有结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。
在某些实施方案中，抗体包含IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE。
在某些实施方案中，方法包括在进行步骤(a)之前、进行步骤(a)之后但进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后确定存在于所述受试者中的病毒载体结合抗体的存在、定量其量或效应子功能。
在某些实施方案中，方法包括在进行步骤(a)之前、进行步骤(a)之后但进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后分析来自所述受试者的生物样品中存在于所述样品中的病毒载体结合抗体的存在、量或效应子功能。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品是血液制品。在某些实施方案中，血液制品包含血浆或血清。
在某些实施方案中，方法导致所述病毒载体结合抗体减少20-50％、50-75％、75-90％、90-95％或95％或更多。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1：100,000，其中在100,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:50,000，其中在50,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:10,000，其中在10,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:1,000，其中在1,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:100，其中在100份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:10，其中在10份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:5，其中在5份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:4，其中在4份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:3，其中在3份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:2，其中在2份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自受试者的生物样品或血液制品中存在的病毒载体结合抗体小于约1:1，其中在1份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
在某些实施方案中，方法包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后确定结合由异源多核苷酸编码的多肽或肽的抗体的存在或定量其量。
在某些实施方案中，方法包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后确定结合核酸的抗体的存在或定量其量。
在某些实施方案中，受试者患有肺部疾病(例如，囊性纤维化)、出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)、地中海贫血、血液疾病(例如，贫血)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、癫痫、溶酶体贮积病(例如天冬氨酰葡糖尿症、巴滕病、晚期婴儿神经元类脂褐质病2型(CLN2)、胱氨酸病、法布里病、高歇氏病I型、II型和III型、糖原贮积病II(庞贝病)、I型GM2-神经节病(Tay Sachs病)、II型GM2-神经节病(Sandhoff病)、粘膜脂溢性病I型(I和II型唾液酸病)、II型(I细胞病)、III型(假性Hurler病)和IV型、粘多糖贮积病(Hurler病和变种、Hunter、A、B、C、D型沙费利波、A和B型Morquio、Maroteaux-Lamy和Sly病)、A/B、C1和C2型Niemann-Pick病、以及I和II型Schindler病)、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁蓄积性疾病(例如，威尔逊氏病或Menkes病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或感染性病毒(例如乙肝和丙肝、HIV等)、细菌或真菌疾病。在某些实施方案中，受试者患有凝血障碍。在某些实施方案中，受试者患有血友病A、具有抑制性抗体的血友病A、血友病B、具有抑制性抗体的血友病B、任何凝血因子的缺乏症：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、von Willebrand因子、或组合的FV/FVIII缺乏症、地中海贫血、维生素K环氧还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。
在某些实施方案中，受试者患有贫血；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓形成剂(即FXa抑制剂)或血小板病(如Bernard Soulier综合征、Glanzmann血小板无力症或储存池缺乏症)相关的过度抗凝作用。
在某些实施方案中，受试者患有影响或起源于中枢神经系统(CNS)的疾病。在某些实施方案中，该疾病是神经退行性疾病。在某些实施方案中，CNS或神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪病、聚谷氨酰胺重复病或帕金森氏病。在某些实施方案中，CNS或神经退行性疾病是聚谷氨酰胺重复病。在某些实施方案中，聚谷氨酰胺重复病是脊髓小脑共济失调(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17)。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生成抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素、聚集蛋白、netrin-1和netrin-2、肝细胞生长因子(HGF)、ephrins、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：血小板生成素(TPO)、白介素(IL1至IL-36)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、血凝固(凝血)因子(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能性凝血因子的增加、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积病(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子、胰岛素样生长因子1或2、血小板源生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性生长因子、转化生长因子α和β、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、耐药蛋白、抑癌蛋白(例如p53、Rb、Wt-1、NF1、Von Hippel-Lindau(VHL)、腺瘤性息肉病(APC))、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性的肽或蛋白Tregitope或hCDR1、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护送蛋白1(Choroideremia)、LCA 5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(Gyrate Atrophy)、视黄酸松弛素1(X连锁性视网膜分裂症)、USH1C(Usher综合征1C)、X连锁性视网膜色素变性GTPase(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：视网膜色素变性)、DFNB1(联接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白、一种或多种用于基因组编辑的锌指核酸酶以及一种或多种用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码抑制性核酸。在某些实施方案中，抑制性核酸选自下组：siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核酶和shRNA。在某些实施方案中，抑制性核酸结合与多核苷酸重复疾病相关的基因、基因的转录物或基因的转录物，所述基因选自下组：亨廷顿蛋白(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩相关的基因(atrophin 1、ATN1)，在脊髓球肌萎缩症的X染色体上的雄激素受体、人Ataxin-1、-2、-3和-7、Cav2.1 P/Q电压依赖性钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8反向链(ATXN8OS)、脊髓小脑共济失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55 kDa调节亚基Bβ亚型、脆性X综合征的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性X相关性震颤/共济失调综合征的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性XE智力低下的FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2家庭成员2；肌强直性营养不良中的肌钙蛋白激酶(MT-PK)；弗雷德赖希共济失调中的Frataxin；肌萎缩性侧索硬化症中的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；与帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病发病机理相关的基因；载脂蛋白B(APOB)和原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中人类免疫缺陷病毒转录基因反式激活因子；HIV TAR、HIV TAR，HIV感染中人类免疫缺陷病毒反式激活因子响应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙肝病毒感染中的肝特异性microRNA(miR-122)；p53，急性肾损伤或移植物功能延迟肾移植或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为蛋白酶体亚基β9型(PSMB9)，转移性黑色素瘤；LMP7，也称为蛋白酶体亚基β8型(PSMB8)，转移性黑色素瘤；MECL1也称为蛋白酶体亚基β10型(PSMB10)，转移性黑色素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的驱动蛋白纺锤体蛋白、慢性粒细胞白血病中的凋亡抑制性B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的polo样激酶1(PLK1)、丙肝感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素能受体，青光眼；RTP801/Redd1，在糖尿病性黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中也称为DNA损伤诱导转录物4蛋白；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新血管形成中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性甲亢的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的甲型流感病毒基因组/基因序列；SARS感染中的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉病毒病毒基因组/基因序列；乙肝和丙肝感染中的乙肝和丙肝病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒
(HSV)基因组/基因序列；柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；基因的致病性等位基因沉默(等位基因特异性沉默)，如原发性肌张力障碍中的躯干蛋白A(TOR1A)、移植中特异的pan I类和HLA等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
在某些实施方案中，由异源多核苷酸编码的蛋白质包含基因编辑核酸酶。在某些实施方案中，基因编辑核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)或转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。在某些实施方案中，基因编辑核酸酶包含功能性II型CRISPR-Cas9。
在某些实施方案中，根据本发明的方法的步骤(a)和/或步骤(b)进行两次或更多次。
在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。
本文还公开了组合物，例如但不限于工具包和试剂盒，其具有可用于实施根据本发明的方法的组分。
在某些实施方案中，工具包或试剂盒中设置有：(a)包含编码蛋白质或肽的异源多核苷酸的重组病毒载体；(b)降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；和(c)具有用于进行本文公开的方法的说明的标签。在某些实施方案中，(a)和(b)在分开的或相同的容器中。
在某些实施方案中，工具包或试剂盒中设置有：(a)重组病毒载体，其包含被转录成抑制、降低或减少蛋白质表达的核酸的异源多核苷酸；(b)降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；和(c)具有用于进行本文公开的方法的说明的标签。在某些实施方案中，(a)和(b)在分开的或相同的容器中。
在某些实施方案中，治疗通过基因疗法使用载体治疗的疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的免疫球蛋白G降解酶多肽。
附图说明
图1是显示用IVIg重构的小鼠中人IgG的水解的图。将野生型C57BL/6小鼠用人IgG(IVIg，9mg/小鼠)重构，并在30分钟后注射IdeS(250IU/小鼠，3只小鼠)或PBS(2只小鼠)。在注射IdeS之前和注射后1、6和10小时收集血液。通过ELISA在小鼠血清中测量完整的人IgG，并使用IVIg为标准表示为μg/mL。
图2是用于体内中和抗AAV IgG的实验方案的示意图。将野生型C57BL/6小鼠(每组6只小鼠)或血友病B(HB)小鼠(每组4只小鼠)用人IgG(IVIg，9mg/小鼠，第(D)天减去1(D-1))重构，并在30分钟(min,mn)后注射IdeS(250、500或1250IU/小鼠，D-1+30分钟)。30小时(hr，h)后(D0)，将小鼠注射AAV8载体(2×1010vg/小鼠)。注射IVIg后15分钟，注射IdeS后24小时以及在D-7、D7、D14和D28收集血液。在安乐死(D28)时，收集肝脏进行载体基因组拷贝数(VGCN)评估。对照小鼠仅在注射AAV载体之前接受单独的IVIg、单独的Ides或PBS。
图3A、3B、3C、3D、3E和3F是显示在被动免疫小鼠中，IdeS分别对人抗AAV8 IgG、抗AAV8中和抗体(NAb)、抗AAV2 IgG、抗AAV2 Nab、抗AAV9 IgG和抗AAV9 Nab的影响的图。在D-1+15分钟和D-1+24时从注射了IVIg和IdeS(IVIg/IdeS)或单独的IVIg(IVIg/PBS)的小鼠(6只小鼠/组)收集血液(参见图2中的示意图)。在图3A、图3B、图3C和图3D中，IdeS的剂量为250IU/小鼠，以及在图3E和3F中，IdeS的剂量为500IU/小鼠。通过ELISA测量抗AAV IgG的水平，并且通过中和测定法测量AAV NAb的水平。图3A、3C和3E中抗AAV8、抗AAV2和抗AAV9 IgG的水平分别以μg/mL表示。图3B、3D和3F中抗AAV8、抗AAV2和抗AAV9 NAb的水平分别以滴度(1/x)表示。数据表示为平均值±SD。使用非参数两面Mann-Whitney检验评估统计学差异(ns：不显著)。
图4A、4B、4C和4D是显示在被动免疫小鼠中，IdeS处理用AAV8载体救济转基因表达的图。将用IVIg或PBS被动免疫并注射IdeS(250IU/小鼠(图4A和4B)或1250IU/小鼠(图4C和4D))或PBS的小鼠(6只小鼠/组)用编码人因子IX(hFIX)(图4A和4B)或高斯荧光素酶(GLuc)(图4C和4D)的2x1010vg/小鼠AAV8载体处理。图4A：使用特异性抗hFIX ELISA测量hFIX血浆水平。hFIX水平使用纯化的hFIX为标准表示为μg/mL。图4C：使用发光测定法测量血浆中的高斯荧光素酶活性。GLuc活性表示为RLU(相对光单位)。图4B和4D：处死时通过qPCR在小鼠肝脏中每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数。数据表示为平均值±SD。统计分析以Dunnett检验通过双向ANOVA用进行。
图5A和5B是显示通过IdeS体外消化人和非人灵长类抗AAV8IgG的测定的图。将IVIg(200μg)、来自AAV8血清反应阳性人的血清和来自AAV8血清反应阳性猴的血清与IdeS(100IU)或PBS在37℃孵育22小时。图5A描绘了通过ELISA测量的抗AAV8 IgG的水平。图5B描绘了AAV中和测定的结果(左Y轴)和在稀释时观察到的中和活性％(右Y轴，黑星)。数据表示为平均值±SD。
图6A和6B是显示IdeS处理允许在被动免疫血友病B(HB)小鼠中用AAV8载体进行有效基因治疗的图。将HB小鼠(每组4只小鼠)用人IgG(IVIg，9mg/小鼠，D-1)重构，并在30分钟后注射IdeS(1250IU/小鼠，D-1+30分钟)。24小时后(D0)，将小鼠注射携带hFIX转基因的AAV8载体(2×1010vg/小鼠)。注射IdeS后24小时以及在D7和D14收集血液。使用专用的ELISA测量血浆中hFIX的水平(图6A)。在D21，使用尾夹出血测定评估HB小鼠中基因治疗的功效，其中估计了超过20分钟的失血(图6B)。数据表示为平均值±SD。对于hFIX ELISA，统计分析以Dunnett检验通过双向ANOVA进行，对于尾夹测定，统计分析以Dunnett检验通过单向ANOVA进行(*：p<0.05；***：p<0.001)。
图7是NHP中实验方案的示意图。将两只对AAV8呈血清反应阳性(NAb滴度为1:17.2)的雄性食蟹猴输注2x1012vg/kg的AAV8-hFIX载体(D0)。在注射载体之前，NHP2在第D-2天和D-1天(NHP处理)接受IdeS(500μg/kg)的两次注射(i.v.)。NHP1未接受在先处理(对照NHP)。在注射IdeS之前和之后以及在D0、D1、D4、D7、D13、D21、D28、D35和D50收集血液样品。在安乐死(D50)时，从4个肝叶收集肝活检进行VGCN评估。
图8A、8B和8C是显示IdeS处理对AAV8血清反应阳性猴中IgG的影响的图。图8A：使用纯化的猴IgG作为标准，通过ELISA测量血清中的完整IgG水平并表示为mg/mL。图8B：通过ELISA的IdeS处理之前和之后测量血清中的抗AAV8 IgG水平。在经处理的猴子(NHP2)中，注射IdeS后抗AAV8 IgG的水平降低了2.7倍(从2.86降至1.05μg/mL)。图8C：使用中和测定法的Ides处理之前和之后测量抗AAV8 NAb水平。在经处理的猴子(NHP2)中，抗AAV8 NAb滴度降低了3倍(滴度从17.2降至5.4)。数据表示为平均值±SD。统计分析以Tukey检验通过双向ANOVA进行(ns：不显著；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001)。
图9A和9B是显示用IdeS处理对AAV8血清反应阳性猴中更高的转基因表达的图。图9A：使用特异性抗hFIX ELISA测量hFIX血浆水平。hFIX水平使用纯化的hFIX为标准表示为ng/mL。图9B：在处死时通过qPCR在肝脏中每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数(VGCN)。VGCN评估在4个楔形活检中进行，所述活检取自4个肝叶的不同部位(右、左、尾状(caud)和正方形(quad))。数据表示为平均值±SD。统计分析以Sidak多重比较检验通过双向SNOVA进行(***：p<0.001；****：p<0.0001)。与对照猴子(NHP1)相比，接受IdeS处理的猴子(NHP2)血浆中的hFIX水平更高，并且AAV肝转导效率更高。
图10A和10B是分别显示在用IdeS处理的AAV8血清反应阳性的猴中抗AAV8 IgG和抗AAV8 NAb水平的图。抗AAV8 IgG的水平通过ELISA测量并以μg/mL表示(图10A)。在中和测定中测量抗AAV8 NAb，并以滴度(1:x)表示(图10B)。数据表示为平均值±SD。统计分析以Tukey多重比较检验通过双向ANOVA进行(****：p<0.0001)。
图11是用于NHP中AAV8再施用的实验方案的示意图。将两只对AAV8呈血清反应阳性的雄性食蟹猴(Nab滴度1:31.6)输注5x1012vg/kg的AAV8-hFIX载体(D0)。在注射载体之前，NHP4在D-1天(NHP处理)接受IdeS的单次静脉内(IV)注射(500μg/kg)。NHP3未接受在先处理(对照NHP)。随后，两只猴子在第80天和第81天接受了两次IV注射IdeS(500μg/kg)，并在第82天接受了5x1012vg/kg的AAV8-hFIX载体注射。在实验期间的不同时间点收集血样。在安乐死(D105)时，从4个肝叶收集肝活检进行VGCN评估。
图12A和图12B是显示IdeS处理允许在AAV8血清反应阳性的猴子中有效地再给药AAV载体，从而导致转基因表达增加的图。图12A：使用特异性抗hFIX ELISA测量hFIX血浆水平。hFIX水平使用纯化的hFIX为标准表示为ng/mL。图12B：在处死时通过qPCR确定肝脏中每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数(VGCN)。VGCN评估在4个楔形活检中进行，所述活检取自4个肝叶的不同部位(左、右、尾状(caud)和正方形(quad))。数据表示为平均值±SD。统计分析以Sidak多重比较检验通过双向ANOVA进行(*：p<0.05；**：p<0.01；****：p<0.0001)。
图13A和13B是分别显示在再施用AAV8载体后，用IdeS处理的AAV8血清反应阳性的猴中抗AAV8 IgG和抗AAV8 NAb的水平的图。图13A：通过ELISA测量抗AAV8 IgG水平。图13B：使用中和测定法测量抗AAV8 Nab滴度。数据表示为平均值±SD。
图14A、14B和14C显示与增加量的IdeS一起孵育的人患者血清(图14A)、非人灵长类(恒河猴)血浆(图14B)和仓鼠血浆(图14C)中通过IdeS切割IgG的SDS-PAGE分析。将样品在不存在IdeS或存在浓度升高的IdeS的情况下于37℃孵育1小时。通过添加样品缓冲液终止反应。通过非还原性SDS-PAGE和考马斯染色分析样品。
图15是显示在用不同量的IVIg(所述IVIg用或不用IdeZ进行预处理)免疫的动物中，在输注AAV-Spk1-GAA载体后，鼠血浆中GAA活性水平的图。IVIg免疫后一天输注AAV-Spk1-GAA载体。在载体施用后2周通过GAA活性测定评估转基因活性。以nmol/hr/mL为单位绘制每组中每只小鼠的GAA活性。在不存在IVIg的情况下仅向对照小鼠施用载体。
图16显示在IdeS输注之前和之后，鼠血浆中抗Spk1中和抗体(NAb)的滴度水平。该研究中的相对NAb滴度水平指定为低滴度(<1:1,1:1-1:2.5)(粗体)、中等范围(1:2.5-1:5)(粗斜体)和高(>1:5-1:10)(斜体)。
图17显示在IdeS输注之前和之后，鼠血浆中抗Spk1 IgG NAb的水平(ng/mL)。阴性对照动物未用IVIg或IdeS处理。研究中使用的IdeS低是指0.4mg/kg IdeS，且IdeS高是指4mg/kg IdeS。
图18显示在用IVIg免疫然后用IdeS处理的动物中输注AAV-Spk1-GAA载体后，鼠血浆中GAA活性水平(nmol/hr/mL)。所有动物接受2x1012vg/kg AAV-Spk1-GAA载体。在用IVIg免疫的小鼠的血浆样品中测量转基因活性，然后用或不用IdeS处理，最后施用载体。在载体施用后1周通过GAA活性测定评估转基因活性。以nmol/hr/mL为单位绘制每组中每只小鼠的GAA活性。
图19显示在之前输注IVIg(0、300、800或1600mg/kg)并用IdeS(0、0.4、1.0或2.0mg/kg)处理的动物中输注AAV-Spk1-GAA载体(2x 1012vg/kg)两周后的GAA活性水平(nmol/hr/mL)。绘制每组中每只小鼠的GAA活性。排除未产生相应的抗Spk1 Nab滴度(即，在IdeS治疗前Nab滴度<1:1或为1:1-1:2.5)的IVIg施用组中的小鼠。
图20显示C57BL/6小鼠血浆中的抗Spk1 Nab滴度水平，其具有人抗衣壳中和IgG的人工滴度，其在用不同的IdeS制剂(批次#1和批次#2)输注之前和之后测量。
图21是显示来自C57BL/6小鼠的血浆中人因子VIII水平的图，该血浆具有人抗衣壳中和IgG的人工滴度，在给药前和给药AAV-Spk1-hFVIII后1和2周测量。
图22是显示在IdeS输注之前和之后的小鼠血浆中抗Spk1衣壳IgG水平(ng/mL)的图。向C57BL/6小鼠提供IVIg以诱导人抗衣壳中和IgG的人工滴度。阴性对照动物未用IVIg或IdeS处理。研究中使用的低IVIg是指300mg/kg IVIg，中等IVIg是指800mg/kg，并且高IVIg是指1600mg/kg。在每个IVIg组中，用递增剂量的IdeS(0、0.4、1.0、2.0mg/kg IdeS)处理动物。从图中排除用IVIg处理但未显示抗衣壳IgG响应的动物。
发明详述
本文提供改进基因治疗的益处或有效性的方法，包括施用降解或消化抗体和/或抑制或减少抗体的效应子功能的试剂。本文还提供降解或消化结合病毒载体(例如重组病毒载体)的抗体和/或降解或消化结合核酸或由重组病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体和/或抑制或减少结合重组病毒载体的抗体的效应子功能的方法，和/或核酸或由重组病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽。本文还提供向之前施用基因治疗载体的受试者再给药或再施用基因治疗载体的方法，并且其中所述受试者已经产生结合和/或中和所述基因治疗载体的抗体。
在某些实施方案中，方法包括向受试者施用一定量的有效降解或消化抗体的蛋白酶或有效抑制或减少结合重组病毒载体、和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的效应子功能的糖苷酶。在某些实施方案中，方法包括向受试者施用一定量的有效降解或消化抗体的内肽酶或有效抑制或减少结合重组病毒载体、和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的效应子功能的内切糖苷酶。
在某些实施方案中，方法包括向受试者施用一定量的有效减少结合重组病毒载体、和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的Fc受体结合的糖苷酶。在某些实施方案中，方法包括向受试者施用一定量的有效减少结合重组病毒载体、和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的Fc受体结合的内切糖苷酶。
在某些实施方案中，本发明涉及免疫球蛋白G降解酶肽，其用于在有需要的患者中通过使用载体的基因疗法治疗疾病。
在某些实施方案中，本发明涉及i)免疫球蛋白G降解酶多肽，和ii)载体作为组合制剂，其用于同时、分别或顺次地在有需要的患者中治疗通过使用所述载体的基因疗法来治疗的疾病。
在某些实施方案中，本发明涉及免疫球蛋白G降解酶多肽和载体的联合，其用于在有需要的患者中通过使用载体的基因疗法治疗疾病。
在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶多肽在所述载体之前、同时(伴随)或之后施用。
如本文所用，术语“通过使用载体的基因疗法治疗的疾病”表示其中将多核苷酸(编码至少一种多肽或抑制性核酸)作为药物递送至患者细胞以治疗所述疾病(基因疗法)的疾病。
在某些实施方案中，载体编码至少一种可用于治疗疾病的特异性多肽或抑制性核酸。在某些实施方案中，载体编码/包含适合于治疗疾病的治疗性多核苷酸。
在某些实施方案中，载体编码/包含适合于使用基因疗法治疗疾病的治疗性多核苷酸。
在某些实施方案中，患者是载体血清反应阳性患者。
在某些实施方案中，患者是载体血清反应阴性患者。
如本文所用，术语“免疫球蛋白G降解酶多肽”表示作为降解免疫球蛋白G的蛋白酶的多肽。在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽是化脓性链球菌，或来自其他细菌或微生物的变体，或其工程化形式的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或免疫球蛋白G降解酶多肽。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白G降解酶多肽特异性降解免疫球蛋白G。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白G降解酶多肽包含选自SEQ ID NO：3-43或48中的任一序列。
如本文所用，术语“患者”和“受试者”可互换地指动物，典型地是哺乳动物，例如啮齿动物、猫科、犬科和灵长类动物。特别地，根据本发明的受试者或患者是人。
如本文所用，术语“治疗”是指预防性或预防性治疗，例如基因治疗以及治愈性或疾病改变性治疗，包括治疗处于患病风险或疑似已患病的受试者以及生病或被诊断为患有疾病或医学病症的受试者，并且包括抑制临床复发。可以向患有医学病症或最终可能患有病症的受试者施用治疗，以预防、治愈、延迟病症或复发性病症的发作，降低严重程度或减轻一种或多种症状，或为了将受试者的生存期延长至超过在没有这种治疗的情况下所期望的生存期。
本文进一步提供例如以工具包或试剂盒的形式提供的组合物，其具有(a)包含编码蛋白质或肽的异源多核苷酸的重组病毒载体；(b)降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；和(c)具有用于进行本文公开的方法的说明的标签，其中(a)和(b)在分开的或相同的容器中。在某些实施方案中，可用于本发明的病毒载体包括，例如但不限于，腺相关病毒(AAV)载体。在某些实施方案中，可用于本发明的病毒载体包括，例如但不限于，逆转录病毒、腺病毒、辅助依赖的腺病毒、杂交腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、痘苗病毒和人巨细胞病毒载体，包括其重组形式。
如本文所用但不受限地，作为病毒载体(例如重组AAV(rAAV)载体)的修饰语以及序列(例如重组多核苷酸和多肽)的修饰语的术语“重组”是指已经以自然界中通常不会发生的方式操纵(即工程化)组合物。重组AAV载体的特定实例是将通常不存在于野生型AAV基因组中的核酸(异源多核苷酸)插入病毒基因组中。其实例是将编码治疗性蛋白质或多核苷酸序列的核酸(例如基因)克隆到载体中，该载体具有或不具有该基因通常与AAV基因组相关的5'，3'和/或内含子区域。尽管本文中并非总是针对AAV载体以及序列(如多核苷酸)使用术语“重组”，但是尽管有任何此类省略，仍明确包括包含AAV载体、多核苷酸等的重组形式。
例如，“rAAV载体”通过使用分子方法去除野生型AAV基因组的全部或部分并用非天然(异源)核酸(例如编码治疗性蛋白质或多核苷酸序列的核酸)替代而衍生自AAV的野生型基因组。典型地，对于rAAV载体，保留AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列。rAAV不同于AAV基因组，因为相对于AAV基因组核酸，AAV基因组的全部或部分已经被非天然序列所替代，例如被编码治疗性蛋白质或多核苷酸序列的异源核酸所替代。因此，非天然(异源)序列的掺入将AAV定义为“重组”AAV载体，其可以称为“rAAV载体”。
重组AAV载体序列可以被包装-在本文中称为“颗粒”，用于随后在离体、体外或体内感染(转导)细胞。当重组载体序列被衣壳化或包装成AAV颗粒时，该颗粒也可称为“rAAV”、“rAAV颗粒”和/或“rAAV病毒体”。此类rAAV、rAAV颗粒和rAAV病毒体包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白质。在AAV的情况下，具体实例包括衣壳蛋白。
可缩写为“vg”的“载体基因组”是指最终被包装或衣壳化以形成rAAV颗粒的重组质粒序列的部分。在重组质粒用于构建或制备重组AAV载体的情况下，AAV载体基因组不包括不对应于重组质粒的载体基因组序列的“质粒”的部分。重组质粒的该非载体基因组部分称为“质粒骨架”，其对于克隆和扩增质粒(繁殖和重组AAV载体生产所必需的过程)非常重要，但其本身并没有被包装或衣壳化成rAAV颗粒。因此，“载体基因组”是指被rAAV包装或衣壳化的核酸。
如本文所用，关于AAV载体的术语“血清型”是指在血清学上不同于其他AAV血清型的衣壳。根据针对一种AAV相比另一种AAV的抗体之间缺乏交叉反应性来确定血清学独特性。交叉反应性差异通常归因于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。由于衣壳蛋白序列的同源性，针对一种AAV的抗体可与一种或多种其他AAV血清型交叉反应。
在传统定义下，血清型是指针对所有现有和特征性血清型的血清测试了目标病毒的中和活性，并且未发现中和目标病毒的抗体。随着发现更多天然存在的病毒分离物和/或产生衣壳突变体，与任何当前存在的血清型可存在血清学差异或不存在血清学差异。因此，在新病毒(例如，AAV)不具有血清学差异的情况下，该新病毒(例如，AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试，以根据传统的血清型定义确定它们是否属于另一种血清型。因此，为了方便起见并避免重复，术语“血清型”广义上是指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及血清学上不同的可在给定血清型的亚组或变体之内的病毒(例如AAV)。
rAAV载体包括任何病毒株或血清型。例如但不限于，rAAV载体基因组或颗粒(衣壳，例如VP1、VP2和/或VP3)可以基于任何AAV血清型，例如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-rh74、-rh10或AAV-2i8。该载体可以基于相同的菌株或血清型(或亚组或变体)，或彼此不同。例如但不限于，基于一种血清型基因组的rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可以与包装该载体的一种或多种衣壳蛋白相同。另外，rAAV质粒或载体基因组可以基于不同于包装载体基因组的一种或多种衣壳蛋白的AAV血清型基因组，在这种情况下，这三种衣壳蛋白中的至少一种可以是不同的AAV血清型，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、SPK1(SEQ IDNO：1)、SPK2(SEQ ID NO：2)或其变体。更具体地，rAAV2载体基因组可以包含AAV2 ITR，但是来自不同血清型的衣壳，例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO：1)、SPK2(SEQ ID NO：2)或其变体。因此，rAAV载体包括对于特定血清型以及“混合”血清型(其也可称为“假型”)而言特征性的基因/蛋白质序列相同的基因/蛋白质序列。
在某些实施方案中，载体是AAV载体、慢病毒载体或腺病毒载体。
在某些实施方案中，术语载体还包括重组载体，其在首次施用后诱导中和免疫球蛋白G。
在某些实施方案中，载体是AAV载体。在某些实施方案中，载体是编码人FIX(包含编码人FIX的治疗性多核苷酸)的AAV8载体。在某些实施方案中，载体是编码人FIX的AAV8载体，可用于治疗血友病。
在某些实施方案中，rAAV质粒或载体基因组或颗粒基于爬行动物或无脊椎动物AAV变体，如蛇和蜥蜴细小病毒(Pénzes et al.,2015,J.Gen.Virol.,96:2769–2779)或昆虫和虾细小病毒(Roekring et al.,2002,Virus Res.,87:79–87)。
在某些实施方案中，重组质粒或载体基因组或颗粒基于博卡病毒变体。例如，人博卡病毒变体描述于Guido et al.,2016,World J.Gastroenterol.,22:8684–8697。
在某些实施方案中，rAAV载体包含或由与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO：1)、SPK2(SEQ ID NO：2)衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3序列)中的一个或多个具有至少70％或更高(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同一性的衣壳蛋白组成。在某些实施方案中，rAAV载体包含或由与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10或AAV-2i8、ITR中的一个或多个具有至少70％或更高(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同一性的序列组成。
在某些实施方案中，rAAV载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和其AAV-2i8变体(例如，ITR和衣壳变体，如氨基酸插入、添加、取代和缺失)，例如，如WO 2013/158879(国际申请PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313(国际申请PCT/US2014/047670)和US2013/0059732(美国专利申请号13/594,773)所述。
rAAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO：1)、SPK2(SEQ ID NO：2)及其变体、杂合和嵌合序列可以使用技术人员已知的重组技术来构建，以包括侧接一个或多个功能性AAVITR序列的一个或多个异源多核苷酸序列(转基因)。该AAV载体典型地保留至少一个功能性的侧翼ITR序列，这对于将重组载体救济、复制和包装成rAAV载体颗粒是必需的。因此，rAAV载体基因组将包括顺式复制和包装所需的序列(例如功能性ITR序列)。在某些实施方案中，本发明中使用的慢病毒可以是人免疫缺陷-1(HIV-1)、人免疫缺陷-2(HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana疾病病毒(JDV)、马感染性贫血病毒(EIAV)或山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。慢病毒载体能够在体外和体内将异源多核苷酸序列有效地递送、整合和长期表达到非分裂细胞中。多种慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:11382-11388(1996)；Science,272:263-267(1996)),Zufferey et al.,(Nat.Biotechnol.,15:871-875,1997),Dull etal.,(J Virol.1998Nov；72(11):8463-71,1998),美国专利号6,013,516和5,994,136，其中的任一个可以是用于本发明的合适的病毒载体。可以在暴露于野生型病毒的受试者中针对野生型病毒发展免疫应答，例如体液免疫。这样的暴露可导致受试者中预先存在的抗体与基于野生型病毒的病毒载体结合，甚至在采用病毒载体的基因治疗方法进行治疗之前。
如本文所用，术语“AAV载体”具有其本领域的一般含义，并且表示衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、变体AAV2、AAV3、变体AAV3、AAV3B、变体AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、变体AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10(如AAVcy10和AAVrh10)、AAVrh74、AAVDJ、AAV-Anc80；AAV-LK03、AAV2i8和猪AAV(如AAVpo4和AAVpo6衣壳)，或带有嵌合衣壳或可以感染人、猴子或其他物种的任何其他天然存在的AAV血清型以及通过改组、肽插入、易错PCR、合理设计或使用机器学习和其他技术工程化的所有其他血清型，如AAVLK03、AAVDJ、Anc80、AAV2i8、AAV-PHP-B。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一个或多个AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼的反向末端重复序列(ITR)序列。功能性ITR序列对于AAV病毒体的救济、复制和包装是必需的。因此，本文将AAV载体定义为包括至少顺式复制和包装病毒所需的那些序列(例如功能性ITR)。ITR不必是野生型核苷酸序列，并且可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变，只要序列提供功能性救济、复制和包装。使用已知技术构建AAV表达载体，以至少提供在转录方向上的可操作地连接的组分、控制元件(包括转录起始区)、本发明的核酸分子和转录终止区。选择控制元件以在哺乳动物细胞中起作用。包含可操作地连接的组分的所得构建体与功能性AAV ITR序列结合(5'和3')。
“腺相关病毒反向末端重复序列”或“AAV ITR”是指在AAV基因组的每个末端发现的本领域公认的区域，其以顺式一起起作用，作为DNA复制的起点和病毒的包装信号。AAVITR与AAV rep编码区一起，提供从两个侧翼ITR之间插入的核苷酸序列进行有效切除和救济，并将其整合到哺乳动物细胞基因组中。AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。例如对于AAV-2序列，参见Kotin,1994；Berns,KI"Parvoviridae and their Replication"inFundamental Virology,2nd Edition,(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)。如本文所用，“AAV ITR”不一定包含野生型核苷酸序列，而是可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变。另外，AAV ITR可以衍生自几种AAV血清型中的任何一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6等。此外，在AAV载体中位于选定核苷酸序列侧翼的5'和3'ITR不一定相同或衍生自相同的AAV血清型或分离株，只要它们能按预期发挥功能，即允许从宿主细胞基因组或载体中切除和救济目标序列，以及当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许将异源序列整合到受体细胞基因组中。在某些实施方案中，本发明的AAV载体选自在哺乳动物中枢和周围神经系统的细胞，特别是神经元、神经元祖细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经胶质细胞中具有向性和高转导效率的AAV血清型的载体。在某些实施方案中，所述AAV载体是已被描述为很好地转导脑细胞(尤其是神经元)的AAV4、AAV9或AAVrh10。在某些实施方案中，本发明的AAV载体是双链的自互补AAV(scAAV)载体。作为使用单链AAV载体的替代方法，可以使用自互补载体。由于表达前需要将单链DNA(ssDNA)基因组转化为双链DNA(dsDNA)，就转导所需的含基因组颗粒数量而言的AAV载体的功效受到阻碍。可以通过使用包装反向重复序列基因组的自互补载体来规避此步骤，该基因组可以折叠成dsDNA，而无需在多个载体基因组之间进行DNA合成或碱基配对。所得自互补AAV(scAAV)载体增加了转基因的所得表达。有关AAV生物学、ITR功能和scAAV构建体的综述，参见McCarty D M.Self-complementary AAV vectors；advances and applications.Mol.Ther.2008October；16(10):第1648-51页，第一段全文，AAV和scAAV构建体、ITR功能以及scAAV构建体中的ΔTRSITR的作用的公开通过引用并入本文。包含ΔTRS ITR的rAAV载体在复制周期中无法被正确切割(nick)，因此产生自互补的双链AAV(scAAV)基因组，其可被有效包装成感染性AAV颗粒。各种rAAV、ssAAV和scAAV载体，以及针对特定应用的每一类载体的优点和缺点以及在基因转移应用中使用此类载体的方法是本领域技术人员众所周知的(例如参见Choi et al.,2005,J.Virol.,79(11):6801-7；McCarty et al.,2004,Annu Rev Genet.,38:819-45；McCarty et al.,2001,Gene Ther.,8(16):1248-54；和McCarty 2008,Mol.Ther.,16(10):1648-56；所有引用的文献的AAV、rAAV和scAAV载体的公开通过引用并入本文)。
本发明的AAV载体可以通过将选择的序列直接插入已经从其切除了主要AAV开放阅读框(“ORF”)的AAV基因组中来构建。AAV基因组的其他部分也可以删除，只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能。可以使用本领域众所周知的技术来设计这样的构建体。例如参见美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO 92/01070和WO 93/03769。或者，可以使用标准连接技术从病毒基因组或从包含存在于另一载体中的所选核酸构建体的相同和融合的5'和3'的AAV载体中切除AAV ITR。包含ITR的AAV载体已描述于例如美国专利号5,139,941。特别地，其中描述了几种AAV载体，其可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)以登录号53222、53223、53224、53225和53226获得。另外，可以合成地产生嵌合基因以包括排列在一个或多个所选核酸序列的5'和3'的AAV ITR序列。可以使用在哺乳动物CNS和PNS细胞中表达嵌合基因序列的优选密码子。完整的嵌合序列由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装而成。为了产生AAV病毒体，使用已知技术(例如通过转染)将AAV表达载体引入合适的宿主细胞。许多转染技术是本领域公知的。例如，参见Graham et al.,1973；Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratories,New York,Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,and Chu et al.,1981。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham etal.,1973)、直接显微注射到培养细胞(Capecchi,1980)、电穿孔(Shigekawa et al.,1988)、脂质体介导的基因转移(Mannino et al.,1988)、脂质介导的转导(Felgner etal.,1987)和使用高速微粒的核酸递送(Klein et al.,1987)。
典型地，本发明的载体包含表达盒。如本文所用，术语“表达盒”是指包含足以表达本发明核酸分子的核酸元件的核酸构建体。典型地，表达盒包含可操作地连接至启动子序列的本发明的核酸分子。术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或多个核酸片段的缔合，使得一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时(例如，该编码序列在该启动子的转录控制下)，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。在某些实施方案中，启动子是异源启动子。如本文所用，术语“异源启动子”是指未发现与自然界中的给定编码序列可操作地连接的启动子。在某些实施方案中，表达盒可包含其他元件，例如内含子、增强子、聚腺苷酸化位点、土拨鼠响应元件(WRE)和/或已知影响编码序列表达水平的其他元件。如本文所用，术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。通常，本发明的核酸分子位于启动子序列的3’。在某些实施方案中，启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，并且可以包含增强子元件。“增强子”是可刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。在某些实施方案中，启动子以其整体衍生自天然基因。在某些实施方案中，启动子由衍生自不同天然存在的启动子的不同元件组成。在某些实施方案中，启动子包含合成核苷酸序列。本领域技术人员将理解，不同的启动子将指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件或存在或不存在药物或转录辅助因子的表达。遍在的、细胞类型特异性的、组织特异性的、发育阶段特异性的和条件性启动子，例如药物响应性启动子(例如四环素响应性启动子)是本领域技术人员众所周知的。启动子的实例包括但不限于磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子；CAG(CMV增强子、鸡β肌动蛋白启动子(CBA)和兔β珠蛋白内含子的复合物)；NSE(神经元特异性烯醇化酶)；突触蛋白或NeuN启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV)立即早期启动子区域(CMVIE)；SFFV启动子；劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子；合成启动子；杂合启动子等。其他启动子可以是人来源或来自其他物种，包括小鼠。常见的启动子包括例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子、磷酸甘油酸激酶启动子、人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、运甲状腺素蛋白启动子、TBG启动子和其他肝脏特异性启动子、结蛋白启动子和类似的肌肉特异性启动子、EF1-α启动子、CAG启动子和其他组成型启动子、具有多个组织特异性的杂合启动子、对神经元具有特异性的启动子(如突触蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子)，所有这些启动子都是本领域技术人员众所周知的并且容易获得的启动子，其可用于获得编码目标序列的高水平表达。另外，衍生自非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)的序列也可在本文中使用。例如，该启动子序列可从Stratagene(San Diego,CA)商购。
在某些实施方案中，表达盒包含合适的分泌信号序列，其将允许分泌由本发明的核酸分子编码的多肽。如本文所用，术语“分泌信号序列”或其变体是指与天然多肽所见的分泌水平相比，具有增强(如上定义的)从细胞分泌可操作地连接的多肽的功能的氨基酸序列。如上文所定义，“增强的”分泌是指由细胞分泌的细胞合成的多肽的相对比例增加；分泌蛋白质的绝对量不一定也增加。在某些实施方案中，基本上所有(即，至少95％、97％、98％、99％或更多)多肽被分泌。但是，只要与天然多肽相比分泌水平提高，就不一定分泌基本上全部或甚至大部分多肽。通常，分泌信号序列在内质网内被切割，并且在某些实施方案中，分泌信号序列在分泌前被切割。但是，只要增强多肽从细胞的分泌并且多肽具有功能，就不一定切割分泌信号序列。因此，在某些实施方案中，分泌信号序列被部分或完全保留。分泌信号序列可以全部或部分来源于分泌的多肽的分泌信号(即，来自前体)和/或可以全部或部分合成。分泌信号序列的长度不是关键的；通常，已知的分泌信号序列的长度为约10-15至50-60个氨基酸。此外，可以改变或修饰来自分泌的多肽的已知分泌信号(例如，通过氨基酸的取代、缺失、截短或插入)，只要所得的分泌信号序列起到增强可操作地连接的多肽的分泌的作用。本发明的分泌信号序列可以包含、基本上由天然存在的分泌信号序列或其修饰物组成或由其组成(如上所述)。指导从细胞分泌的众多分泌蛋白和序列是本领域已知的。本发明的分泌信号序列可以进一步是全部或部分合成的或人工的。合成的或人工的分泌信号肽是本领域已知的，例如参见Barash et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.294:835-42(2002)。
在某些实施方案中，本发明包括通过使用载体的基因疗法治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的免疫球蛋白G降解酶多肽。
核酸、载体、重组宿主细胞及其用途
在某些实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列，其用于在有需要的患者中通过使用载体的基因治疗来治疗疾病。
在某些实施方案中，本发明包括：i)编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列，和ii)载体作为组合制剂，其用于同时、分别或顺次地在有需要的患者中治疗通过使用所述载体的基因疗法来治疗的疾病。
在某些实施方案中，本发明包括编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列和载体的联合，其用于在有需要的患者中治疗通过使用所述载体的基因疗法来治疗的疾病。
在某些实施方案中，本发明包括编码如本文所述的SEQ ID NO：4的IdeS多肽或其功能保守变体的核酸序列。
在某些实施方案中，编码SEQ ID NO：4的IdeS多肽的核酸序列包含SEQ ID NO：52或由其组成。
在某些实施方案中，核酸序列与SEQ ID NO：52的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。
在某些实施方案中，可以使用本发明核酸的mRNA。
本发明的核酸可以通过本领域本身已知的任何技术来生产，例如但不限于单独的或组合的任何化学、生物学、遗传或酶促技术。
在某些实施方案中，本发明包括包含编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列的表达载体，其用于在有需要的患者中治疗通过使用载体的基因疗法来治疗的疾病。
在某些实施方案中，该表达载体包含编码如上所述的包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列或其功能保守变体的核酸序列。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO：52或其功能保守变体的载体不是AAV载体。
可用于本发明的表达载体可包含至少一个与核酸序列可操作地连接的表达控制元件。将表达控制元件插入载体中以控制和调节核酸序列的表达。表达控制元件的实例包括但不限于lac系统、噬菌体λ的操纵子和启动子区、酵母启动子和衍生自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或SV40的启动子。其他优选或所需的操作元件包括但不限于前导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号和宿主系统中核酸序列的适当转录和随后翻译所必需或优选的任何其他序列。本领域技术人员将理解，所需的或优选的表达控制元件的正确联合将取决于所选择的宿主系统。还将理解，表达载体应包含在宿主系统中转移和随后复制含有核酸序列的表达载体所必需的其他元件。该元件的实例包括但不限于复制起点和可选择标记。本领域技术人员将进一步理解，使用常规方法或商购可容易地构建此类载体。
在某些实施方案中，本发明包括包含如上所述的表达载体的宿主细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞可以是例如但不限于，真核生物细胞，如动物、植物、昆虫和酵母细胞，以及原核生物细胞，如大肠杆菌。可以将携带基因的载体引入细胞的手段包括但不限于显微注射、电穿孔、转导或使用DEAE-葡聚糖的转染、脂质转染、磷酸钙或本领域技术人员已知的其他方法。
在某些实施方案中，使用在真核细胞中起作用的真核表达载体。该载体的实例包括但不限于病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒；慢病毒、细菌表达载体、质粒(如pcDNA3)或杆状病毒转移载体。优选的真核细胞系包括但不限于COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、NIH/3T3细胞、293细胞(ATCC#CRL1573)、T2细胞、树突细胞或单核细胞。
还可以针对重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽产生免疫应答，例如体液免疫，导致在施用病毒载体的受试者中抑制或减少病毒载体细胞的转导，异源多核苷酸的表达或功能或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的功能或活性。
可被称为“中和”抗体的结合本发明中使用的病毒载体(如重组病毒载体)的抗体可以减少或抑制可用于基因治疗的病毒载体的细胞转导。结果，尽管不受理论的束缚，但细胞转导被减少或抑制，从而减少病毒包装的异源多核苷酸向细胞中引入以及随后的表达，以及在适当时，随后翻译为蛋白质或肽。另外，结合异源多核苷酸或由病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体可抑制异源多核苷酸的表达、异源多核苷酸的功能或活性或由异源多核苷酸编码的蛋白或肽的功能或活性。
因此，在受试者中可以存在结合重组病毒载体(例如，AAV)的抗体和/或可以存在结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。另外，可以存在结合由重组病毒载体衣壳化的异源多核苷酸的抗体。
结合重组病毒载体(例如，AAV)或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体(如果产生的话)可以被本文所述的蛋白酶降解或消化。结合重组病毒载体(例如，AAV)或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体(如果产生的话)也可以使其效应子功能减少或抑制，如本文所述。
如本文所用，关于抗体的“效应子功能”是指抗体的正常功能属性。例如，抗体功能属性的非限制性实例包括结合抗原；激活补体级联反应(称为补体依赖性细胞毒性)；结合效应细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞)上的Fc受体，从而引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；以及作为通过免疫细胞(如吞噬细胞和树突状细胞)摄入结合的抗原/病原体的信号。因此，抗体效应子功能的降低或抑制可以指任何一种或多种前述非限制性功能属性。效应子功能测定是本领域已知的以及例如WO2016012285所述。
“Fc受体”是指任何Fc受体。Fc受体的特定非限制性实例包括存在于细胞上的Fcγ免疫球蛋白受体(FcγR)。在人中，FcγR是指包含FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)的Fc受体家族中的一种、一些或全部。FcγR包括FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)的天然存在的多态性。
在某些实施方案中，通过蛋白酶方式减少或抑制结合病毒载体的抗体。
在某些实施方案中，通过糖苷酶方式减少或抑制结合效应细胞(如巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞或嗜酸性粒细胞)上的Fc受体的抗体。在某些实施方案中，内切糖苷酶水解抗体的Fc相互作用结构域上的聚糖结构。在某些实施方案中，内切糖苷酶水解IgG的Fc相互作用结构域上的聚糖结构，例如位置Asn-297(Kabat编号)处的N-联双触角聚糖。
在某些实施方案中，通过蛋白酶方式减少或抑制补体级联的抗体活化。
在某些实施方案中，通过蛋白酶或糖苷酶方式减少或抑制免疫细胞(例如吞噬细胞或树突状细胞)对抗体的刺激或摄取减少。
在某些实施方案中，在施用重组病毒(例如，AAV)载体之前，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。在某些实施方案中，在施用重组病毒(例如，AAV)载体之后，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。在某些实施方案中，重组病毒(例如，AAV)载体和蛋白酶和/或糖苷酶基本上同时或大约同时施用。
抗体包含IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE中的任何一种。因此，本发明涉及消化、降解或减少或抑制这五类抗体的任何一种、这五类抗体的任何两种、这五类抗体的任何三种、这五类抗体的任何四种或这五类抗体中的全部五种的效应子功能。
可以在施用重组病毒载体之前和/或之后分析、测量或确定受试者中抗体的水平。还可以在施用蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后分析、测量或确定受试者中抗体的水平。还可以在施用重组病毒载体之前和/或之后以及在施用蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后多次分析或测量受试者中抗体的水平。
可以在施用重组病毒载体之前和/或之后分析、测量或确定受试者中抗体的效应子功能。还可以在施用蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后分析、测量或确定受试者中抗体的效应子功能。还可以在施用重组病毒载体之前和/或之后以及在施用蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后多次分析或测量受试者中抗体的效应子功能。
平衡结合常数的增加对应于IgG与Fc受体之间的结合的减少。因此，由于糖苷酶活性而导致的抗体的Fc受体结合减少可导致IgG:FcR相互作用的平衡结合常数的增加。抗体的Fc受体结合减少可导致IgG:FcR相互作用的平衡结合常数增加至少1倍、至少2倍、至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少7倍、或至少8倍。
在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体之前，通过施用一定量的有效降解或消化结合基于野生型病毒的重组病毒载体的抗体的蛋白酶和/或糖苷酶来治疗由暴露于野生型病毒引起的受试者的免疫应答(例如，体液免疫应答)。
在某些实施方案中，通过施用一定量的有效降解或消化结合重组病毒载体的抗体或结合异源多核苷酸或由病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的蛋白酶和/或糖苷酶来治疗由施用重组病毒载体(例如AAV)引起的免疫应答(例如，体液免疫应答)。
在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体之前，先施用蛋白酶和/或糖苷酶以抑制或阻止针对重组病毒载体或结合异源多核苷酸或由病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的免疫应答(例如体液免疫应答)。
在某些实施方案中，在免疫应答(例如，体液免疫应答)之前，例如在产生中和抗体或产生结合异源多核苷酸或由病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体之前，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。
蛋白酶是降解或消化蛋白质的酶。如本文所用，蛋白酶也称为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。
可将可用于本发明的蛋白酶根据其底物特异性分为两大类。蛋白酶可以是水解位于N末端或C末端的肽键的外切型(外切蛋白酶或外切肽酶)。例如，外切蛋白酶或外切肽酶的非限制性实例包括来自猪胰腺的黄素酶(Novozymes)、ProteaAX(Amano)和胰酶。
可以在本发明中使用的蛋白酶可以是在多肽链内部水解肽键的内切型(内切蛋白酶或内切肽酶)。例如，内切蛋白酶的实例包括IdeS、IdeZ、IgdE、IdeMC、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。
可用于本发明的蛋白酶的实例包括，例如但不限于，来自化脓性链球菌、马链球菌、犬支原体、无乳链球菌、假猪链球菌或假单胞菌的半胱氨酸蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶包括如SEQ ID NO：3-18中任一所示的来自化脓性链球菌的内切肽酶IdeS或其修饰的变体。在某些实施方案中，蛋白酶包括SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示的蛋白酶或其修饰的变体。在某些实施方案中，蛋白酶包括SEQ ID NO：21-43中任一所示的来自马链球菌的内切肽酶IdeZ或其修饰的变体。
可用于本发明的其他蛋白酶包括例如但不限于WO 2017/134274中所述的来自猪链球菌(S.suis)、猪链球菌(S.porcinus)、马链球菌的IgdE酶。可用于本发明的其他蛋白酶包括例如但不限于WO 2018/093868中描述的IdeMC和同源物。可用于本发明的其他内切肽酶包括例如但不限于WO 2016/128559中所述的具有和不具有N末端甲硫氨酸和信号肽的IdeZ以及IdeS/IdeZ杂合蛋白。可用于本发明的其他蛋白酶包括但不限于例如描述于Jordan et al.(N Engl.J Med.377；5,2017),Lannergard and Guss(FEMS MicrobiolLett.,262(2006)；230-235)和Hulting et al.,(FEMS Microbiol Lett.,298(2009),44-50)的蛋白酶。
糖苷酶是水解复合糖中糖苷键的酶。通常有两大类，即糖苷外切酶和糖苷内切酶。糖苷酶切割并因此从糖蛋白(例如抗体)中释放聚糖/寡糖。
可用于本发明的糖苷外切酶包括，例如但不限于，N-乙酰氨基葡糖苷酶、岩藻糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、神经氨酸酶和木糖苷酶。可用于本发明的糖苷内切酶包括，例如但不限于，EndoS、Endo D、糖苷内切酶-H、Endo F1、Endo F2和Endo F3。
因此，在某些实施方案中，糖苷酶包含内切糖苷酶。在某些实施方案中，糖苷酶包括外切糖苷酶。
内切糖苷酶的实例包括，例如但不限于，EndoS。在某些实施方案中，内切糖苷酶包含SEQ ID NO：44-47中任一所示的序列或其修饰的变体。
在某些实施方案中，EndoS多肽包括EndoS多肽、EndoS多肽的片段、EndoS多肽的变体或EndoS多肽的片段的变体，条件是所述多肽、片段、变体或片段的变体具有免疫球蛋白(Ig)糖苷内切酶活性。
在某些实施方案中，EndoS多肽是化脓性链球菌EndoS。EndoS多肽的变体可以是来自另一种生物(例如另一种细菌)的EndoS多肽。在某些实施方案中，细菌是链球菌，例如马链球菌、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)或化脓性链球菌。或者，变体可以来自假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，例如CP40蛋白；例如，CP40蛋白；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，例如EndoE蛋白；或脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethingia meningoseptica)(以前称为脑膜炎败血黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum))，例如EndoF2蛋白。
EndoS多肽可以包含或由以下组成：(a)SEQ ID NO：44-47中的任一氨基酸序列；(b)(a)的片段，其具有Ig内切糖苷酶活性；或(c)(a)的变体，其与SEQ ID NO：44-47中的任一氨基酸序列具有至少50％的同一性并且具有Ig内切糖苷酶活性；或(d)(b)的变体，其与SEQ ID NO：44-47中的任一氨基酸序列的相应部分具有至少50％的同一性并且具有Ig内切糖苷酶活性。
在某些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO：44-47中的任一氨基酸序列或其具有Ig内切糖苷酶活性的片段具有至少约60％或更高的同一性(例如60-70％、70-80％或80-90％的同一性)。在某些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO：44-47中的任一氨基酸序列或其具有Ig内切糖苷酶活性的片段具有90-100％的同一性。
蛋白酶可包含或由以下组成：(a)SEQ ID NO：3-43或48中的任一氨基酸序列；(b)(a)的片段，其具有蛋白酶活性；或(c)(a)的变体，其与SEQ ID NO：3-43或48中的任一氨基酸序列具有至少50％的同一性并具有蛋白酶活性；或(d)(b)的变体，其与SEQ ID NO：3-43或48中的任一氨基酸序列的相应部分具有至少50％的同一性并且具有蛋白酶活性。在某些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO：3-43或48中的任一氨基酸序列或其具有蛋白酶活性的片段具有至少约60％或更高的同一性(例如60-70％、70-80％或80-90％的同一性)。在某些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO：3-43或48中的任一氨基酸序列或其具有蛋白酶活性的片段具有90-100％的同一性。
在某些实施方案中，蛋白酶或糖苷酶缺乏其天然信号序列，并且具有另外的N末端甲硫氨酸，例如SEQ ID NO：48，其是化脓性链球菌的IdeS的成熟形式(没有信号序列，但具有添加的N末端甲硫氨酸)。用于本发明方法的任何蛋白酶或糖苷酶可包括添加的N末端甲硫氨酸来代替天然信号序列。
在某些实施方案中，蛋白酶或糖苷酶具有非天然的N末端信号或前导肽序列来代替其天然信号序列。用于本发明方法的任何蛋白酶或糖苷酶可包括非天然N末端信号序列来代替天然信号序列。在某些实施方案中，非天然N末端信号序列选自SEQ ID NO：49-51或其功能保守变体。
在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶多肽能够降解患者中存在的腺病毒中和抗体。
在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶多肽能够降解患者中存在的AAV中和抗体。
在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶多肽是化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽。
在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶多肽是化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽，其被施用以降解患者中存在的腺病毒中和抗体。
在某些实施方案中，免疫球蛋白G降解酶多肽是化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽，其被施用以降解患者中存在的AAV中和抗体。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽在治疗通过向有需要的患者施用基因治疗载体来治疗的疾病中的用途。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽在治疗通过向有需要的患者施用基因治疗载体来治疗的疾病中的用途，其中向患者施用IdeS以降解患者中存在的中和性抗AAV抗体。
在某些实施方案中，患者是载体血清反应阳性患者，并且本发明涉及化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽，其用于治疗AAV血清反应阳性患者。
在某些实施方案中，患者是载体血清反应阴性患者，并且本发明涉及化脓性链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)多肽，其用于治疗AAV血清反应阴性患者。
在某些实施方案中，根据本发明的IdeS多肽是化脓链球菌IdeS，或保持半胱氨酸蛋白酶活性的化脓链球菌IdeS的变体或片段。变体可以是来自另一种生物(例如另一种细菌)的IdeS多肽。细菌优选是链球菌。链球菌优选是A组链球菌、C组链球菌或G组链球菌。特别地，变体可以是来自C组链球菌(例如马链球菌或兽疫链球菌)的IdeS多肽。或者，变体可以来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或来自其他细菌菌株的重组变体。在某些实施方案中，根据本发明的IdeS多肽包含SEQ ID NO：3-43或48中的任一序列。
在某些实施方案中，多肽的半胱氨酸蛋白酶活性具有在IgG重链的下部铰链区中的甘氨酸残基237处切割所有四种人IgG亚类，而不切割IgA、IgM、IgD和IgE同种型的能力。
在某些实施方案中，IdeS多肽包含SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一氨基酸序列或其功能保守变体或由其组成。
在某些实施方案中，根据本发明的多肽可以与SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列相差1、2、3、4或5个氨基酸。
在某些实施方案中，本发明包括作为SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一的多肽的功能保守变体的多肽。
在某些实施方案中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO：3-18、23或48任一序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％的同一性，并且仍然能够在IgG重链的下部铰链区中的甘氨酸残基237处切割所有四种人IgG亚类，而不切割IgA、IgM、IgD和IgE同种型。
在某些实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：3-18、23或48任一所示的氨基酸序列或其变体组成，所述变体包含与SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性，并且仍然能够在IgG重链的下部铰链区中的甘氨酸残基237处切割所有四种人IgG亚类，而不切割IgA、IgM、IgD和IgE同种型。
在某些实施方案中，本发明的多肽是SEQ ID NO：3-18、23或48任一的多肽的片段，其仍然能够在IgG重链的下部铰链区中的甘氨酸残基237处切割所有四种人IgG亚类，而不切割IgA、IgM、IgD和IgE同种型。
在某些实施方案中，本发明的多肽包含对应于SEQ ID NO：3-18、23或48任一的氨基酸残基的残基Lys-55和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257。在某些实施方案中，本发明的多肽包含对应于SEQ ID NO:4的Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255和Asp-257的每个残基。在某些实施方案中，本发明的多肽包含对应于SEQ ID NO:4的Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255和Asp-257的至少一个、至少两个、至少三个、至少4个或全部5个残基。
为了验证本发明的多肽或片段是否仍然能够切割IgG的四种人亚类，可以对每个多肽或片段进行测试。例如，在将测试的多肽或片段与人IgG一起孵育后，将通过蛋白质印迹法对消化片段进行研究。没有检测到完整IgG和检测到人IgG消化片段将表明所测试的多肽或片段具有切割所有四种人IgG亚类的能力。
如本文所用，术语“功能保守变体”是指其中蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已经被改变(插入、缺失或取代)，而不改变肽的总体构象和功能的那些。该变体包括具有氨基酸改变(例如缺失、插入和/或取代)的蛋白质。“缺失”是指蛋白质中不存在一个或多个氨基酸。“插入”是指在蛋白质中添加一个或多个氨基酸。“取代”是指蛋白质中一个或多个氨基酸被另一个氨基酸残基替代。典型地，给定的氨基酸被具有相似性质(例如极性、氢键势、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸替代。该给定的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。除了表示为保守的那些以外，蛋白质中的氨基酸可不同，使得具有相似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可不同，例如，根据比对方案(例如通过聚类方法测定，其中相似性基于MEGALIGN算法)，可为70％-99％，。“功能保守变体”还包括具有通过BLAST或FASTA算法测定的至少60％氨基酸同一性的多肽，优选至少75％，更优选至少85％，还优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且其具有与其比较的天然或亲本蛋白质相同或基本上相似的性质或功能。当大于80％，优选大于85％，优选大于90％的氨基酸相同，或大于约90％，优选大于95％在较短序列的整个长度上相似(功能相同)时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，使用例如GCG(Genetics ComputerGroup,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)的比对程序或任何序列比较算法(例如BLAST，FASTA等)通过比对来鉴定相似或同源序列。
在某些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：48的序列，其中一个或多个残基已被功能相似的残基保守取代，并其显示出如本文所述的SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：48的多肽的功能方面。
在某些实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列，其中一个或多个残基已经被功能相似的残基保守取代，并且其显示出如本文所述的SEQ IDNO：3-18、23或48的多肽的功能方面。
保守取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸被)另一个取代；一个极性(亲水性)残基被另一个取代，例如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天冬酰胺之间，甘氨酸和丝氨酸之间；一个碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被另一个取代，或一个酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)被另一个取代。
术语“保守取代”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生残基。“化学衍生物”是指具有一个或多个通过官能性侧基的反应化学衍生的残基的主题肽。该衍生分子的实例包括，例如，其中游离氨基已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、碳苯甲酰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。可将游离羧基衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。可将游离羟基衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。可将组氨酸的咪唑氮衍生化以形成N-im-苄基组氨酸。化学衍生物还包括含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然氨基酸衍生物的肽。例如：4-羟基脯氨酸可以代替脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以代替赖氨酸；3-甲基组氨酸可以代替组氨酸；高丝氨酸可以代替丝氨酸；和鸟氨酸可以代替赖氨酸。术语“保守取代”也包括使用旨在控制和稳定肽或蛋白质二级结构的非天然氨基酸。这些非天然氨基酸是化学修饰的氨基酸，例如如下文所述的脯氨酸、β-氨基酸、N-甲基氨基酸、环丙基氨基酸、α,α-取代的氨基酸。这些非天然氨基酸还可包括氟化、氯化、溴化或碘化修饰的氨基酸。
在某些实施方案中，本发明的多肽与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列的区别在于至少1、2、5、10、20、30、50或更多个突变(其可以是氨基酸的取代、缺失或插入)。例如，可以进行1至50、2至30、3至20或5至10个氨基酸取代、缺失或插入。修饰的多肽通常保留作为IgG特异性半胱氨酸蛋白酶的活性。在具体实施方案中，氨基酸取代是保守取代。
在某些实施方案中，本发明的多肽可以另外包括信号序列。
在某些实施方案中，信号序列包含氨基酸序列SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50或SEQID NO：51或其功能保守变体或由其组成。
在某些实施方案中，本发明的多肽可以包含标签。标签是可用于纯化肽的包含标签的序列。它通过多种技术(如亲和色谱法)连接，用于使用免疫标记技术在细胞或组织样品内定位所述肽或多肽、通过免疫印迹检测所述肽或多肽等。本领域通常使用的标签的实例是GST(谷胱甘肽-S-转移酶)标签、FLAGTM-标签、Strep-标签TM、V5标签、myc标签、His标签等。
在某些实施方案中，本发明的多肽可以用荧光染料标记。染料标记的荧光肽是细胞研究中的重要工具。可以在N端侧或C端侧标记肽。
使用胺反应性荧光染料的N末端肽标记：胺反应性荧光探针广泛用于修饰N末端或赖氨酸残基处的肽。已经开发了许多荧光氨基反应性染料来标记各种肽，并且所得的缀合物广泛用于生物学应用。当前使用三类主要的胺反应性荧光试剂来标记肽：琥珀酰亚胺酯(SE)、异硫氰酸酯和磺酰氯。
使用含胺的荧光染料的C末端标记：含胺的染料用于使用水溶性碳二亚胺(例如EDC)修饰肽，以将肽的羧基转化为酰胺基。NHS或NHSS均可用于改进EDC介导的蛋白质-羧酸偶联的缀合效率。
在某些实施方案中，可以修饰用于根据本发明的治疗方法的多肽，以改进其治疗功效。治疗化合物的这种修饰可用于降低毒性、增加循环时间、改变生物分布或降低免疫原性。例如，通过与改变生物分布的多种药物载体结合可以显著降低潜在重要治疗化合物的毒性。
改进药物可行性的策略是利用水溶性聚合物。已显示各种水溶性聚合物可改变生物分布、改进细胞摄取方式、通过生理屏障改变通透性；并改变机体清除率。为了达到靶向或持续释放的效果，已经合成水溶性聚合物，其包含药物部分作为末端基团、作为骨架的一部分或作为聚合物链上的侧基。
鉴于其高度的生物相容性和易于修饰，聚乙二醇(PEG)已被广泛用作药物载体。附接各种药物、蛋白质和脂质体已表明可改进停留时间并降低毒性。PEG可以通过链末端处的羟基和其他化学方法与活性剂偶联；但是，PEG本身每个分子局限于最多两种活性剂。以不同途径，将PEG和氨基酸的共聚物探索为新型生物材料，其将保留PEG的生物相容性，但具有每个分子众多连接点(提供更大的载药量)的附加优点，并且可以合成设计为适合各种应用。
本领域技术人员知道用于药物有效修饰的聚乙二醇化技术。例如，VectraMed(Plainsboro,N.J.)已使用由PEG和三官能单体(例如赖氨酸)的交替聚合物组成的药物递送聚合物。PEG链(典型地为2000道尔顿或更小)通过稳定的氨基甲酸酯键与赖氨酸的a-和e-氨基连接。该共聚物保留PEG的所需性能，同时沿聚合物链以严格控制的预定间隔提供反应性侧基(赖氨酸的羧酸基)。反应性侧基可用于衍生、交联或与其他分子缀合。通过改变聚合物的分子量、PEG链段的分子量以及药物和聚合物之间的可切割键，这些聚合物可用于生产稳定的长循环前药。PEG片段的分子量影响药物/连接基复合物的间隔以及每分子量缀合物的药物量(越小的PEG片段提供越大的载药量)。通常，增加嵌段共聚物缀合物的总分子量将增加缀合物的循环半衰期。然而，缀合物必须是易于降解的或分子量低于限制肾小球滤过的阈值(例如，小于45kDa)。
另外，由于聚合物主链对于维持循环半衰期和生物分布很重要，可以使用接头将治疗剂保持为前药形式，直到通过特定的触发物(典型地是靶组织中的酶活性)从主链聚合物中释放出来。例如，这种类型的组织活化的药物递送在需要递送到生物分布的特定位点并且治疗剂在病理位点处或附近释放的情况下特别有用。用于活化药物递送的连接基团库是本领域技术人员已知的，并且可以基于酶动力学、活性酶的普遍性以及所选疾病特异性酶的切割特异性(例如，参见technologies of established by VectraMed,Plainsboro,N.J.)。此接头可用于修饰本文所述的衍生肽以用于治疗性递送。
根据本发明，可以通过常规的自动化肽合成方法或通过重组表达来生产多肽。设计和制备蛋白质的一般原理是本领域技术人员众所周知的。
本发明的多肽可以根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成器是可商购的，并且可以根据描述于Stewart and Young；Tam et al.,1983；Merrifield,1986 and Barany and Merrifield,Gross and Meienhofer,1979的已知方案来使用。本发明的肽也可以通过固相技术合成，其采用示例性的肽合成仪，例如Applied BiosystemsInc.的433A型。可以使用反相HPLC分析测定通过自动肽合成或重组方法产生的蛋白质。每种肽的化学真实性可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法来建立。
作为自动化肽合成的替代方法，可以采用重组DNA技术，其中将编码选择蛋白的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于以如下所述表达的条件下培养。为了生产更长的多肽，重组方法是尤其优选的。
多种表达载体/宿主系统可用于包含和表达肽或蛋白质编码序列。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体转化的细菌，质粒或粘粒DNA表达载体；用酵母表达载体转化的酵母(Giga-Hama et al.,1999)；用病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如杆状病毒，参见Ghosh et al.,2002)；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒；例如参见Babe et al.,2000)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。本领域技术人员知道用于优化哺乳动物蛋白表达的各种技术，例如参见，Kaufman,2000；Colosimo et al.,2000。可用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。用于在细菌、酵母和其他无脊椎动物中重组表达肽底物或融合多肽的示例性方案是本领域技术人员已知的，并且在下文中简要描述。美国专利号6,569,645；美国专利号6,043,344；美国专利号6,074,849；和美国专利号6,579,520提供了重组生产肽的具体实例，这些专利的这些教导通过引用明确并入本文。用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员众所周知的。可以选择宿主细胞菌株以具有处理表达的蛋白质或产生某些可用于提供蛋白质活性的翻译后修饰的特定能力。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“prepro”形式蛋白质的翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能也可能是重要的。不同的宿主细胞(如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等)具有特定的细胞机制和特征机制以进行此类翻译后活性，并且可以选择这些宿主细胞以确保正确修饰和加工引入的外源蛋白质。
在本发明的衍生的多肽的重组生产中，将有必要采用包含多核苷酸分子的载体来编码衍生的肽。制备此类载体以及产生用此类载体转化的宿主细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。可以将用于这种企图的多核苷酸分子与载体结合，该载体通常包括可选择标记和复制起点，以在宿主中繁殖。表达构建体的这些元件是本领域技术人员众所周知的。通常，表达载体包括编码给定蛋白质的DNA，该蛋白质可操作地连接至合适的转录或翻译调控序列，例如衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的那些。调节序列的实例包括转录启动子、操纵子或增强子、mRNA核糖体结合位点以及控制转录和翻译的合适序列。
术语“表达载体”、“表达构建体”或“表达盒”可互换地贯穿该说明书，并且意在包括任何类型的遗传构建体，其包含编码基因产物的核酸，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。
用于表达本发明的肽或多肽的合适表达载体的选择当然取决于所用的特定宿主细胞，并且在普通技术人员的技术范围内。哺乳动物表达载体的构建方法描述于例如Okayama et al.,1983；Cosman et al.,1986；Cosman et al.,1984；EP-A-0367566；和WO91/18982。生产表达载体的其他考虑在例如Makrides et al.,1999；Kost et al.,1999.Wurm et al.,1999中有详细描述，其作为教导因素并入本文，以考虑在哺乳动物细胞中大规模瞬时表达用于重组蛋白的生产。
表达需要在载体中提供适当的信号，例如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，其可用于驱动宿主细胞中目标核酸的表达。通常，表达的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”包括被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。当调节序列在功能上与编码目标肽的DNA(即4N1K、变体等)有关时，核苷酸序列可操作地连接。因此，如果启动子核苷酸序列指导序列的转录，则启动子核苷酸序列可操作地连接至给定的DNA序列。
类似地，短语“在转录控制下”是指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和方向，以控制基因的RNA聚合酶的起始和表达。可以使用将驱动核酸表达的任何启动子。用于控制目标核酸序列表达的特定启动子并不重要，只要它能够指导靶细胞中核酸的表达。因此，在靶向人细胞的情况下，优选将核酸编码区域与能够在人细胞中表达的启动子相邻并在所述启动子的控制之下。一般来说，这种启动子可以包括人或病毒启动子。常见的启动子包括例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子、磷酸甘油激酶启动子、人α-1抗胰蛋白酶启动子、运甲状腺素蛋白启动子、TBG启动子和其他肝特异性启动子、结蛋白启动子和类似的肌肉特异性启动子、EF1-α启动子、CAG启动子和其他组成型启动子、具有多种组织特异性的杂合启动子、对神经元具有特异性的启动子(如突触蛋白)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，所有这些启动子都是本领域技术人员众所周知的并且容易获得的启动子，可用于获得编码目标序列的高水平表达。还考虑使用本领域熟知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现目标编码序列的表达，条件是表达水平足以产生可回收产量的目标蛋白。通过采用具有众所周知性能的启动子，可以优化转染或转化后目标蛋白表达的水平和模式。也可以使用诱导型启动子。
用于蛋白质表达的另一种调节元件是增强子。这些是遗传元件，其增加位于同一DNA分子远处位置的启动子的转录。当表达构建体采用cDNA插入物时，典型地将需要包括聚腺苷酸化信号序列以实现基因转录物的适当聚腺苷酸化。通过选定的转基因动物物种的细胞识别的任何聚腺苷酸化信号序列都适用于本发明，例如人或牛生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。
如上所述，使用免疫球蛋白G降解酶多肽(如Ides)可适用于治疗通过使用AAV载体的基因疗法治疗的疾病。
治疗组合物
在某些实施方案中，本发明涉及一种治疗组合物，其包含免疫球蛋白G降解酶多肽或编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸或包含编码根据本发明的免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸的表达载体，其用于在有需要的患者中治疗通过使用载体的基因治疗来治疗的疾病。
本发明的任何治疗剂可以与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质(例如生物可降解的聚合物)组合以形成治疗组合物。
“药学上”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于哺乳动物，特别是人时，不会产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的药物组合物可以配制用于局部、口服、鼻内、肠胃外、眼内、静脉内、肌内或皮下施用等。
本发明的药物组合物可以包含对于能够被注射的制剂而言是药学上可接受的介质。这些可以特别是等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)，或干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，根据情况，其在添加无菌水或生理盐水后允许构成注射溶液。用于施用的剂量可以根据各种参数，特别是根据所使用的施用方式、相关病理学或期望的治疗持续时间来调节。
另外，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其他固体；定时释放胶囊；和目前可以使用的任何其他形式。
本发明的药物组合物可以包含其他治疗活性剂。
可以任何合适的剂量向受试者施用蛋白酶或糖苷酶。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg-约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg-约4mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，以约0.01mg/kg-约10mg/kg受试者体重的剂量施用IdeZ。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg-约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg-约4mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，以约0.01mg/kg-约10mg/kg受试者体重的剂量施用IdeS。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg-约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg-约4mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，以约0.01mg/kg-约10mg/kg受试者体重的剂量施用EndoS。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg-约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg-约4mg/kg受试者体重。
除非本文另外指出，否则可以以任何合适的顺序进行根据本发明的方法。在某些实施方案中，方法可包括首先(a)向受试者施用有效降解或消化中和抗体的蛋白酶和/或糖苷酶；然后(b)向受试者施用重组病毒载体。在某些实施方案中，(b)向受试者施用重组病毒载体在(a)向受试者施用有效降解或消化中和抗体的蛋白酶和/或糖苷酶后约1分钟-约90天之间进行。在某些实施方案中，(a)向受试者施用有效降解或消化中和抗体的蛋白酶和/或糖苷酶，和(b)向受试者施用重组病毒载体大约在同一时间进行。
在某些实施方案中，方法可包括首先(a)向受试者施用携带异源多核苷酸的重组病毒载体，然后(b)向受试者施用一定量的蛋白酶和/或糖苷酶，其有效降解或消化结合重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。在某些实施方案中，(b)向受试者施用一定量的蛋白酶和/或糖苷酶(其有效降解或消化结合重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体)在(a)向受试者施用携带异源多核苷酸的重组病毒载体后约1分钟-约90天之间进行。在某些实施方案中，(a)向受试者施用携带异源多核苷酸的重组病毒载体，和(b)向受试者施用一定量的蛋白酶和/或糖苷酶(其有效降解或消化结合重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体)大约在同一时间进行。
抗体，例如中和抗体，可预先存在并且甚至可以在施用病毒载体之前以抑制或减少重组病毒载体细胞转导的水平存在于受试者中。或者，在暴露于重组病毒载体所基于的病毒后，抗体可在受试者中产生。更进一步，抗体，例如中和抗体，或结合异源多核苷酸或由病毒载体衣壳化的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体，可在施用重组病毒载体后在受试者中产生。
因此，本文的方法适用于具有预先存在的抗体的受试者和没有预先存在的抗体的受试者。如本文所述，这样的受试者包括已经暴露于野生型病毒并基于该野生型病毒产生针对病毒载体的预先存在的抗体的受试者，以及已经接受病毒载体基因治疗并且已经产生抗体和随后可以用一种或多种其他剂量的相同病毒载体基因疗法来治疗(称为再给药)，或使用相同病毒载体以递送基因疗法治疗以不同基因疗法(例如，不同的异源多核苷酸)治疗的受试者。
可以在施用病毒载体之前和/或在施用蛋白酶糖苷酶之前测试受试者的抗体。待测试的抗体的非限制性实例包括中和抗体、结合如本文所述的蛋白酶或糖苷酶的抗体、结合异源多核苷酸的抗体和结合异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。因此，在施用重组病毒载体和/或在施用蛋白酶糖苷酶之前，可以筛选受试者的中和抗体、结合如本文所述的蛋白酶或糖苷酶的抗体、结合异源多核苷酸的抗体或结合异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。
具有结合如本文所述的蛋白酶或糖苷酶的预先存在的抗体(例如，IgG)的受试者可以任选地通过根据本发明的方法从初始治疗中排除。然而，并非所有具有或产生结合蛋白酶或糖苷酶的抗体的受试者都需要从本发明的治疗方法中排除。例如，仍可以使用根据本发明的方法治疗具有滴度小于15mg/升的可检测的抗IdeS IgG的受试者。
在施用重组病毒载体后，还可以筛选受试者的中和抗体、结合异源多核苷酸的抗体或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。可以在施用重组病毒载体后任选地在一段时间内监测此类受试者，以确定在没有检测到预先存在的抗体的受试者中是否产生这种抗体或阻止产生这种抗体，或者在具有预先存在的抗体的受试者的情况下，蛋白酶和/或糖苷酶是否减少或消除这种预先存在的抗体。
在某些实施方案中，在测试中和抗体、结合如本文所述的蛋白酶或糖苷酶的抗体、结合异源多核苷酸的抗体或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的存在呈阳性之后，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。在某些实施方案中，在测试中和抗体、结合如本文所述的蛋白酶或糖苷酶的抗体、结合异源多核苷酸的抗体或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的存在呈阳性之前，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。
在某些实施方案中，在施用蛋白酶和/或糖苷酶之前或之后，不测试受试者的抗体。因此，在施用蛋白酶和/或糖苷酶之后，测试中和抗体、结合如本文所述的蛋白酶或糖苷酶的抗体、结合异源多核苷酸的抗体或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体，或者在本发明的治疗方法中，施用重组病毒载体是任选的。
可向受试者施用任何次数的蛋白酶或糖苷酶。例如，可以向受试者施用2至5次、2至10次、2至15次蛋白酶和/或糖苷酶。
可以以规则的基础(例如连续几天或交替几天)或不规则的基础，以任何持续时间向受试者施用蛋白酶或糖苷酶。在某些实施方案中，在施用重组病毒载体后，施用蛋白酶和/或糖苷酶约1至12周，或约1至10周，或约1至8周，或约1至6周，或约1至4周，或约1到2周，或约2周。
在某些实施方案中，在向受试者施用蛋白酶或糖苷酶之前或之后施用重组病毒载体。在某些实施方案中，在向受试者施用蛋白酶或糖苷酶后例如1-12、12-24或24-48小时或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超过50天向受试者施用重组病毒载体。在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体后例如1-12、12-24或24-48小时或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超过50天向受试者施用蛋白酶或糖苷酶。
可以单独或组合施用重组病毒载体、蛋白酶和/或糖苷酶。在某些实施方案中，向受试者分开施用重组病毒载体与蛋白酶和/或糖苷酶。在某些实施方案中，向受试者联合施用重组病毒载体与蛋白酶和/或糖苷酶。
在某些实施方案中，将蛋白酶和糖苷酶的混合物向受试者施用一次或多次。在某些实施方案中，将两种或更多种蛋白酶或糖苷酶向受试者施用一次或多次。
在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体、蛋白酶或糖苷酶之前、基本上同时或之后，向受试者施用至少一种免疫抑制剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂，例如类固醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂是泼尼松、环孢素(例如环孢素A)、霉酚酸酯、利妥昔单抗、雷帕霉素或其衍生物。
降低体液免疫力的其他策略包括去除、耗尽、捕获和/或失活抗体的方法，通常称为单采血液分离术，更特别是涉及血液制品的血浆除去法。单采血液分离术或血浆除去法是一种其中人受试者的血浆通过设备进行离体(体外)循环的过程，该设备通过在血浆返回患者之前添加、去除和/或替换成分来修饰血浆。血浆除去法可以用于从血液制品(例如血浆)去除人免疫球蛋白(例如IgG、IgE、IgA、IgD)。该程序耗尽、捕获、失活、减少或去除结合重组病毒载体、结合异源多核苷酸、结合异源多核苷酸编码的蛋白质或肽、结合蛋白酶和/或结合糖苷酶的免疫球蛋白(抗体)，从而降低治疗的受试者中抗体的滴度，这可有助于例如病毒载体的中和。实例是由AAV衣壳亲和基质柱组成的设备。使血液制品(例如血浆)通过这样的AAV衣壳亲和基质将仅导致AAV抗体和所有同种型(包括IgG、IgM等)的结合。免疫吸附(美国专利申请公开US 2018/0169273 A1)也可以用于耗尽免疫球蛋白，更特别是抗AAV抗体。亲和配体(国际专利申请公开WO/2018/158397)也可用于耗尽免疫球蛋白，更特别是抗AAV抗体。在向受试者施用重组病毒载体、蛋白酶或糖苷酶之前、基本上同时或之后，可以使用任何上述策略。
在系统性基因转移中减少(克服)或避免对AAV的体液免疫的其他策略包括使用AAV空衣壳颗粒和/或衣壳蛋白作为诱饵来吸附抗AAV抗体。其他策略描述于Mingozzi etal.,2013,Blood,122:23-36。
根据本发明，可以将蛋白酶和/或糖苷酶与脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微胶囊、胶束或胞外囊泡包封或复合。
根据本发明，可以将病毒颗粒与脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微胶囊、胶束或胞外囊泡包封或复合。
在某些实施方案中，脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微胶囊、胶束或胞外囊泡可用于本发明中以非病毒递送基因治疗核酸。
“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指基于脂质的囊泡，其用于递送重组病毒载体和/或蛋白酶和/或糖苷酶，并且具有纳米级的尺寸，即约10nm至约1000nm，或约50至约500nm，或约75至约127nm。不受理论的束缚，LNP被认为提供了部分或完全屏蔽免疫系统的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体。屏蔽允许将蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体递送至组织或细胞，同时避免在体内诱导针对蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体的实质性免疫应答。屏蔽还可以允许重复施用而不会在体内(例如，在受试者(如人)中)诱导针对蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体的实质性免疫应答。屏蔽还可以改进或增加体内的递送效率、治疗效果的持续时间和/或治疗功效。
AAV的pI(等电点)在约6至约6.5的范围内。因此，AAV表面携带轻微的负电荷。因此，LNP包含阳离子脂质(例如氨基脂质)可能是有益的。示例性的氨基脂质已描述于美国专利号：9,352,042,9,220,683,9,186,325,9,139,554,9,126,966 9,018,187,8,999,351,8,722,082,8,642,076,8,569,256,8,466,122和7,745,651以及美国专利公开号2016/0213785,2016/0199485,2015/0265708,2014/0288146,2013/0123338,2013/0116307,2013/0064894,2012/0172411和2010/0117125中。
术语“阳离子脂质”和“氨基脂质”在本文可互换使用，以包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定氨基(例如，烷基氨基或二烷基氨基)的脂质和其盐。阳离子脂质典型地在低于阳离子脂质的pKa的pH下被质子化(即带正电)，并且在高于pKa的pH下基本上是中性的。阳离子脂质也可以是可滴定的阳离子脂质。在某些实施方案中，阳离子脂质包含：可质子化的叔胺(例如pH可滴定的)基团；C18烷基链，其中每个烷基链独立具有0-3个(例如0、1、2或3)个双键；以及头基和烷基链之间的醚、酯或缩酮键。
阳离子脂质可以包括但不限于1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA，也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、二亚油基-3-三甲基氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA，也称为MC2)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA，也称为MC3)、其盐及其混合物。其他阳离子脂质还包括但不限于1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C4-DMA)、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA和(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)。
进一步的阳离子脂质可以包括但不限于2,2-二亚油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二恶烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基哌嗪基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-MPZ)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚麻基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚麻基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙烷(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-羧酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙三氟乙酸酯(DOSPA)、二十八烷基氨基缩水甘油基精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁烷-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(胆甾5-烯-3-β-氧基)-3'-草五氧基]-3-二甲基-1-(顺,顺9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、地塞米松-亚精胺(DS)和二取代的精胺(D2S)或它们的混合物。
可以使用许多阳离子脂质的商业制剂，例如
Figure BDA0002903837500000551
(包括可从GIBCO/BRL获得的DOTMA和DOPE)和
Figure BDA0002903837500000552
(包括可从GIBCO/BRL获得的DOSPA和DOPE)。
在某些实施方案中，阳离子脂质可以以LNP的约10重量％至脂质纳米颗粒的约85重量％，或LNP的约50重量％至LNP的约75重量％的量存在。
甾醇可以赋予LNP流动性。如本文所用，“甾醇”是指植物(植物甾醇)或动物(动物固醇)来源的任何天然存在的甾醇以及非天然存在的合成甾醇，所有这些都以在甾醇A环的3-位上存在羟基为特征。甾醇可以是脂质体、脂质囊泡或脂质颗粒制剂领域中常规使用的任何甾醇，最通常为胆固醇。植物甾醇可包括菜油甾醇、谷甾醇和豆甾醇。甾醇还包括甾醇修饰的脂质，例如在美国专利申请公开2011/0177156中描述的那些。在某些实施方案中，甾醇可以以LNP的约5重量％至脂质纳米颗粒的约50重量％或LNP的约10重量％至LNP的约25重量％的量存在。
LNP可以包含中性脂质。中性脂质可以包括在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的任何脂质种类。此类脂质包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷。中性脂质的选择通常通过尤其考虑粒径和必要的稳定性来指导。在某些实施方案中，中性脂质组分可以是具有两个酰基的脂质(例如，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。
具有各种不同的链长和饱和度的酰基链基的脂质是可获得的，或者可以通过众所周知的技术分离或合成。在某些实施方案中，可以使用包含具有碳链长度为C14-C22范围内的饱和脂肪酸的脂质。在某些实施方案中，使用具有碳链长度为C14-C22范围内的单或二不饱和脂肪酸的脂质。另外，可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。示例性中性脂质包括但不限于1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或任何相关的磷脂酰胆碱。中性脂质也可以由鞘磷脂、二氢鞘磷脂或具有其他头部基团(如丝氨酸和肌醇)的磷脂组成。
在某些实施方案中，中性脂质可以以脂质纳米颗粒的约0.1重量％至LNP的约75重量％，或LNP的约重量5％至LNP的约15重量％的量存在。
LNP包封的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体可以掺入药物组合物，例如药学上可接受的载体或赋形剂。这样的药物组合物尤其可用于体内或离体向受试者施用和递送LNP包封的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体。
LNP的制剂可以与另外的组分组合，所述另外的组分可以包括例如但不限于聚乙二醇(PEG)和甾醇。
术语“PEG”是指聚乙二醇，一种具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的线性水溶性聚合物。PEG按其分子量分类；例如，PEG 2000的平均分子量为约2,000道尔顿，而PEG5000的平均分子量为约5,000道尔顿。PEG可从Sigma Chemical Co.和其他公司商购，并且包括例如以下功能性PEG：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三苯甲酸酯(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
在某些实施方案中，PEG可以是平均分子量为约550至约10,000道尔顿的聚乙二醇，并且任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，PEG可以在末端羟基位置被甲基取代。在某些实施方案中，PEG可具有约750至约5,000道尔顿，或约1,000至约5,000道尔顿，或约1,500至约3,000道尔顿，或约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。PEG可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，末端羟基可以被甲氧基或甲基取代。
PEG-修饰的脂质包括在美国专利号8,936,942和7,803,397中描述的PEG-二烷氧基丙基缀合物(PEG-DAA)。有用的PEG-修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)可具有多种“锚定”脂质部分，以将PEG部分固定至脂质囊泡的表面。合适的PEG修饰的脂质的实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、美国专利号5,820,873中描述的PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺和PEG-修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。在某些实施方案中，PEG修饰的脂质可以是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在某些实施方案中，PEG的量可为LNP的约0.5重量％至LNP的约20重量％，或LNP的约5重量％至LNP的约15重量％。
此外，LNP可以是PEG修饰的和甾醇修饰的LNP。与其他组分组合的LNP可以是相同或分开的LNP。换言之，相同的LNP可以是PEG修饰的且甾醇修饰的，或者，第一LNP可以是PEG修饰的并且第二LNP可以是甾醇修饰的。任选地，可以将第一和第二修饰的LNP组合。
在某些实施例中，在包封之前，LNP的尺寸可以为约10nm至500nm，或约50nm至约200nm，或75nm至约125nm。在某些实施方案中，LNP包封的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体的尺寸可为约10nm至500nm。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用，是指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、microRNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反拼接RNA或反义RNA)。
核酸包括天然存在的、合成的以及有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以是单、双或三重，线性或环状，并且可以是任何长度。在讨论核酸时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述特定多核苷酸的序列或结构。
“异源”核酸序列是指出于载体介导的将多核苷酸转移/递送至细胞中的目的而插入质粒或载体中的多核苷酸。异源核酸序列不同于病毒核酸，即，相对于病毒核酸而言是非天然的。一旦被转移/递送到细胞中，载体中所含的异源核酸序列就可以被表达(例如，如果合适的话，转录和翻译)。或者，载体中所含的细胞中转移/递送的异源多核苷酸不必被表达。尽管本文中并不总是使用术语“异源”来指核酸序列和多核苷酸，但是即使不存在修饰语“异源”，提到核酸序列或多核苷酸旨在包括异源核酸序列和多核苷酸，不管有无遗漏。
本文使用的“转基因”方便地是指旨在或已经引入细胞或生物体的核酸。转基因包括任何核酸，例如异源多核苷酸序列或编码蛋白质或肽的异源核酸。术语转基因和异源核酸/多核苷酸序列在本文可互换使用。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：治疗庞贝病的GAA(酸性α-葡糖苷酶)；治疗威尔逊氏病的ATP7B(铜转运ATPase2)；治疗法布里氏病的α半乳糖苷酶；治疗1型瓜氨酸血症的ASS1(精氨酸琥珀酸合酶)；治疗1型戈谢病的β-葡萄糖脑苷脂酶；治疗泰萨克斯疾病的β-己糖胺酶A；治疗遗传性血管性水肿(HAE，也称为I型和II型C1抑制剂缺乏症)的SERPING1(C1蛋白酶抑制剂或C1酯酶抑制剂)；和治疗糖原性贮积病I型(GSDI)的葡萄糖-6-磷酸酶。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生成抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素、聚集蛋白、netrin-1和netrin-2、肝细胞生长因子(HGF)、ephrins、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码酸性α-葡糖苷酶(GAA)。向患有庞贝病或另一种糖原贮积病的受试者施用包含编码GAA的异源多核苷酸的重组病毒载体可以导致GAA蛋白的表达。患者中GAA蛋白的表达可用于阻止、抑制或减少糖原的积聚、阻止糖原的积聚或降解糖原，进而可以反过来减少或降低庞贝病或另一种糖原贮积病的一种或多种不良反应。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：血小板生成素(TPO)、白介素(IL1至IL-36等)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、血凝固(凝血)因子(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能性凝血因子的增加、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积病(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子、胰岛素样生长因子1或2、血小板源生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性生长因子、转化生长因子α和β、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、耐药蛋白、抑癌蛋白(例如p53、Rb、Wt-1、NF1、Von Hippel-Lindau(VHL)、腺瘤性息肉病(APC))、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性的肽或蛋白Tregitope或hCDR1、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护送蛋白1(Choroideremia)、LCA 5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(Gyrate Atrophy)、视黄酸松弛素1(X连锁性视网膜分裂症)、USH1C(Usher综合征1C)、X连锁性视网膜色素变性GTPase(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：视网膜色素变性)、DFNB1(联接蛋白26耳聋)、ACHM2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白、一种或多种用于基因组编辑的锌指核酸酶以及一种或多种用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码用于治疗贫血的促红细胞生成素(EPO)；用于治疗各种免疫疾病、病毒感染和癌症的干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ；用于治疗各种炎症性疾病或免疫缺陷的白介素(IL)，包括IL-1至IL-36中的任一种，以及相应受体；用于治疗免疫疾病的趋化因子，包括趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)；用于治疗免疫性疾病(如克罗恩氏病)的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；用于治疗各种人炎症性疾病的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；用于治疗各种人炎症性疾病的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；用于治疗上皮组织损伤的角质形成细胞生长因子(KGF)；用于治疗复发性流产、HIV相关并发症和胰岛素抵抗的趋化因子(如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1))；用于治疗各种免疫疾病的肿瘤坏死因子(TNF)和受体；用于治疗肺气肿或慢性阻塞性肺疾病(COPD)的α1-抗胰蛋白酶；用于治疗粘多糖贮积症I(MPS I)的α-L-艾杜糖醛酸酶；用于治疗OTC缺乏症的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的苯丙氨酸羟化酶(PAH)或苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)；用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症的脂蛋白脂酶；用于治疗载脂蛋白(Apo)A-I缺乏症的载脂蛋白；用于治疗家族性高胆固醇血症(FH)的低密度脂蛋白受体(LDL-R)；用于治疗低白蛋白血症的白蛋白；卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)；氨基甲酰基合成酶I；精氨琥珀酸合成酶；精氨琥珀酸裂合酶；精氨酸酶；富马酸乙酰乙酸酯水解酶；胆色素原脱氨酶；用于治疗高半胱氨酸尿症的胱硫醚β合酶；支链酮酸脱羧酶；异戊酰-CoA脱氢酶；丙酰CoA羧化酶；甲基丙二酰-CoA突变酶；戊二酰CoA脱氢酶；胰岛素；丙酮酸羧化酶；肝磷酸化酶；磷酸化酶激酶；甘氨酸脱羧酶；H蛋白；T蛋白；囊性纤维化跨膜调节剂(CFTR)；用于治疗Stargardt病的ATP结合盒，亚家族A(ABC1)，成员4(ABCA4)；或肌营养不良蛋白。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文可互换使用。由“多核苷酸序列”编码的“多肽”、“蛋白质”和“肽”包括全长天然序列和天然存在的蛋白质、以及功能性亚序列、修饰形式或序列变体，只要该亚序列、修饰形式或变体保留天然全长蛋白质的某种程度的功能。在本发明中，由多核苷酸序列编码的这些多肽、蛋白质和肽可以但不必须与在治疗的哺乳动物中缺乏，或其表达不足或缺乏的内源蛋白质相同。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自下组：siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核酶和shRNA的抑制性核酸。
在某些实施方案中，抑制性核酸结合基因、基因的转录物或与多核苷酸重复疾病相关的基因，所述基因选自下组：亨廷顿蛋白(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩相关的基因(atrophin 1、ATN1)，在脊髓球肌萎缩症的X染色体上的雄激素受体、人Ataxin-1、-2、-3和-7、Cav2.1 P/Q电压依赖性钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8反向链(ATXN8OS)、脊髓小脑共济失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55 kDa调节亚基Bβ亚型、脆性X综合征的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性X相关性震颤/共济失调综合征的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性XE智力低下的FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2家庭成员2；肌强直性营养不良中的肌钙蛋白激酶(MT-PK)；弗雷德赖希共济失调中的Frataxin；肌萎缩性侧索硬化症中的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；与帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病发病机理相关的基因；载脂蛋白B(APOB)和原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中人类免疫缺陷病毒转录基因反式激活因子；HIV TAR、HIV TAR，HIV感染中人类免疫缺陷病毒反式激活因子响应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙肝病毒感染中的肝特异性microRNA(miR-122)；p53，急性肾损伤或移植物功能延迟肾移植或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为蛋白酶体亚基β9型(PSMB 9)，转移性黑色素瘤；LMP7，也称为蛋白酶体亚基β8型(PSMB 8)，转移性黑色素瘤；MECL1也称为蛋白酶体亚基β10型(PSMB 10)，转移性黑色素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的驱动蛋白纺锤体蛋白、慢性粒细胞白血病中的凋亡抑制性B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的polo样激酶1(PLK1)、丙肝感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素能受体，青光眼；RTP801/Redd1，在糖尿病性黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中也称为DNA损伤诱导转录物4蛋白；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新血管形成中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性甲亢的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的甲型流感病毒基因组/基因序列；SARS感染中的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉病毒病毒基因组/基因序列；乙肝和丙肝感染中的乙肝和丙肝病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列；柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；基因的致病性等位基因沉默(等位基因特异性沉默)，如原发性肌张力障碍中的躯干蛋白A(TOR1A)、移植中特异的pan I类和HLA等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
可以任何合适的剂量施用重组病毒载体剂量。通常，剂量为至少1×108或更高，例如1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014或更高的载体基因组/每公斤重量的受试者(vg/kg)，以达到治疗效果。小鼠中AAV的剂量范围为1×1010-1×1011vg/kg以及狗中为1×1012-1×1013vg/kg是有效的。更特别地，剂量为约1x1011vg/kg-约5x1014vg/kg(包括端点)，或约5x1011vg/kg-约1x1014vg/kg(包括端点)，或约5x1011vg/kg-约5x1013vg/kg(包括端点)，或约5x1011vg/kg-约1x1013vg/kg(包括端点)，或约5x1011vg/kg-约5x1012vg/kg(包括端点)，或约5x1011vg/kg-约1x1012vg/kg(包括端点)。剂量可以是例如约5×1014vg/kg，或小于约5×1014vg/kg，例如约2x1011-约2x1014vg/kg的剂量(包括端点)，特别是例如约2x1012vg/kg，约6x1012vg/kg，或约2x1013vg/kg。
在某些实施方案中，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶降低了包含有效治疗受试者所需的异源多核苷酸的重组病毒载体的剂量。在某些实施方案中，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶允许施用增加剂量的包含异源多核苷酸的重组病毒载体。
剂量可以变化并且取决于受试者的治疗所针对疾病的类型、发作、进展、严重程度、频率、持续时间或可能性、期望的临床终点、之前或同时治疗、总体健康、年龄、性别、种族或免疫能力以及本领域技术人员应理解的其他因素。剂量、数量、频率或持续时间可按比例增加或减少，如治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其他危险因素以及受试者的状况所表明。技术人员将理解可以影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
获得治疗效果的剂量，例如载体基因组中的剂量/每千克体重(vg/kg)，将基于几个因素而变化，这些因素包括但不限于：施用途径、实现治疗效果所需的异源多核苷酸表达、所治疗的特定疾病、对重组病毒载体的任何宿主免疫应答、对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质或肽)的宿主免疫应答以及所表达的蛋白质或肽的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的重组病毒载体基因组的剂量范围。
“有效量”或“足够量”是指以单剂量或多剂量单独或组合提供与一种或多种其他组合物、治疗、方案或治疗方案试剂、任何持续时间(长期或短期)的可检测响应、任何可测量或可检测的程度或在任何持续时间(例如分钟、小时、天、月、年、或治愈)对受试者的预期或期望结果或对受试者的益处的量。用于治疗(例如，改善或提供治疗益处或改进)的“有效量”或“足够量”的剂量通常有效地对疾病的一种、多种或全部不良症状、后果或并发症，例如，由疾病引起或与之相关的一种或多种不良症状、病症、疾病、病理或并发症提供可测量的范围的响应，尽管降低、减少、抑制、阻止、限制或控制疾病的进展或恶化是令人满意的结果。
有效量或足够的量可以但不必在单次施用中提供，可以需要多次施用，并且可以但不必单独施用或与另一种组合物(例如试剂)、治疗、方案或治疗方案组合施用。例如，量可以如受试者的需要、待治疗疾病的类型、状态和严重性或治疗副作用(如果有的话)所指示地成比例地增加。另外，如果以单剂量或多剂量提供而没有第二组合物(例如另一种药物或试剂)、治疗、方案或治疗方案，则有效量或足够量就不一定有效或不足，因为可以包括另外的剂量、高于或超过这样的剂量的量或持续时间，或另外的组合物(例如，药物或试剂)、治疗、方案或治疗方案，以便被认为在给定受试者中有效或足够。认为有效的量还包括导致减少使用另一种治疗、治疗方案或方案的量，例如施用重组GAA以治疗溶酶体贮积病(例如庞贝病)或施用重组凝血因子蛋白(例如FVIII或FIX)以治疗凝血障碍(例如，血友病A(HemA)或血友病B(HemB))。
对于庞贝氏病，有效量将是抑制或减少糖原产生或积聚、增强或增加糖原降解或去除、减少受试者机体组织中的溶酶体改变或例如改进受试者的肌张力和/或肌肉强度和/或呼吸功能的GAA的量。例如，有效量可以通过确定成肌细胞从血浆中摄取GAA的动力学来测定。成肌细胞GAA摄取率(K摄取)为约141-147nM似乎是有效的(参见例如Maga et al.,J.Biol.Chem.2012)。在动物模型中，已经观察到血浆中GAA活性水平大于约1,000nmol/hr/mL，例如约1,000-约2,000nmol/hr/mL是治疗有效的。
对于HemA和HemB，一般而言，据信为了达到治疗效果，需要比正常个体中发现的凝血因子浓度大1％的凝血因子浓度以将严重的疾病表型改变为中度疾病表型。严重的表型以关节损伤和威胁生命的出血为特征。为了将中度疾病表型转化为轻度疾病表型，据信需要大于正常值的5％的凝血因子浓度。
正常人中的FVIII和FIX水平为约150-200ng/mL血浆，但可能更低(例如，约100-150ng/mL范围)或更高(例如，约200-300ng/mL范围)，由于例如通过活化的部分凝血活酶时间(aPTT)一阶段凝血测定法测定的功能性凝血而仍被认为是正常的。因此，可以实现治疗效果，使得受试者/人中FVIII或FIX的总量大于正常受试者/人中存在的FVIII或FIX的1％，例如100-300ng/mL的1％。
所述组合物可以作为联合组合物向受试者施用，或单独施用，如同时或连续或顺次(之前或之后)递送或施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体。本发明提供了联合，其中本发明的方法或用途与本文所述或本领域技术人员已知的任何化合物、试剂、药物、治疗政策、治疗方案、方法、疗法或组合物联合。可以在向受试者施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体之前、基本上同时或之后施用或进行化合物、试剂、药物、治疗政策、治疗方案、方法、疗法或组合物。
因此，本发明尤其包括导致对另一种化合物、试剂、药物、治疗政策、治疗方案、方法或疗法的需要或使用减少的方法和用途。例如，对于凝血疾病，如果在给定的受试者中施用较低频率或减少剂量或消除重组凝结因子蛋白以补充受试者中缺陷或缺乏(异常或突变)的内源性凝血因子，则本发明的治疗方法具有治疗益处。在另一个实例中，对于溶酶体贮积病(如庞贝氏病)，即使之前已经施用较低频率或减少剂量的包含GAA的重组病毒载体，或继续向受试者施用，则本发明的治疗方法仍具有治疗益处。因此，在本发明中包括减少对另一种治疗或疗法的需要或使用。
有效量或足够量不需要在给定组或群体中的每个治疗的受试者中有效，也不需要在大多数治疗的受试者中有效。有效量或足够量是指在特定受试者而非组或一般群体中有效或足够。如此类方法的典型情况，一些受试者对给定的治疗方法或用途表现出更大的响应，或更少的响应或没有响应。
术语“改善”是指受试者的疾病或其症状或潜在的细胞反应的可检测或可测量的改进。可检测或可测量的改进包括主观或客观上降低、减少、抑制、阻止、限制或控制疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间、或由疾病引起或与之相关的并发症、或改善疾病的症状、根本原因或后果、或疾病的逆转。例如，对于庞贝，有效量将是抑制或减少糖原产生或积聚、增强或增加糖原降解或去除、改进肌张力和/或肌肉强度和/或呼吸功能的量。例如，对于HemA或HemB，有效量将是减少受试者中急性出血发作的频率或严重性的量，或例如减少通过凝血测定法测量的凝血时间的量。
因此，本发明的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现预期的治疗目的的组合物。使用本领域已知的技术和指导并使用本文提供的教导来确定治疗有效剂量完全在熟练的医学从业者的能力之内。
治疗剂量将取决于受试者的年龄和一般状况、异常表型的严重程度以及调节表达水平的控制序列的强度等因素。因此，人中的治疗有效量将落入较宽的范围内，该范围可由医师基于单个患者对基于载体的治疗的响应来确定。改剂量可以是单独的或与免疫抑制剂或药物联合。
可以将组合物(如药物组合物)递送至受试者，以允许转基因表达并任选地产生编码的蛋白质。在某些实施方案中，药物组合物包含足以使受试者能够产生治疗有效量的凝血因子以改进受试者的止血的遗传物质。在某些实施方案中，药物组合物包含足以使受试者能够产生治疗有效量的GAA的异源多核苷酸。
在某些实施方案中，在受试者中的治疗作用持续一段时间，例如2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25，25-30或30-50天或更长，例如50-75、75-100、100-150、150-200天或更长。因此，在某些实施方案中，重组病毒载体提供治疗效果。
在某些实施方案中，重组病毒载体在没有免疫抑制剂的情况下提供治疗效果。在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体之前、基本上同时或之后向受试者施用至少一种免疫抑制剂。
某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是甾醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂是泼尼松、环孢素(例如环孢素A)、霉酚酸酯、利妥昔单抗、雷帕霉素或其衍生物。其他特定试剂包括稳定化合物。可用于根据本发明的方法的其他免疫抑制剂包括，例如但不限于，B细胞靶向抗体，例如利妥昔单抗；蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米；哺乳动物靶标的雷帕霉素(mTOR)抑制剂，例如雷帕霉素；酪氨酸激酶抑制剂，例如依鲁替尼；B细胞活化因子(BAFF)抑制剂；和增殖诱导配体(APRIL)的抑制剂。
组合物可以在任何无菌的生物相容的药物载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。所述组合物可以向患者单独施用或与影响剂量、施用频率和/或治疗功效的其他试剂组合施用。
本发明的方法和用途包括系统地、区域性地或局部地递送和施用，或通过任何途径，例如通过注射或输注。药物组合物在体内的递送通常可以通过使用常规注射器经由注射来完成，尽管预期其他递送方法，例如对流增强递送(参见例如，美国专利号5,720,720)。例如，可以皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹膜内、静脉内、胸膜内、动脉内、口服、肝内(经由门静脉)或肌内递送组合物。其他施用方式包括口服和肺部施用、栓剂和透皮施加。专门治疗凝血功能障碍患者的临床医生可以根据许多标准，包括但不限于：患者的病症和治疗目的(例如，增加的GAA、增强的凝血等)，来确定使用腺病毒相关载体的最佳途径。
根据本发明的治疗方法包括联合疗法，其包括附加使用具有期望的治疗、有益、加成、协同或互补活性或效果的任何化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗政策或方案。示例性的联合组合物和治疗包括第二活性物质，如生物制剂(蛋白质)、试剂(例如免疫抑制剂)和药物。可以在根据本发明的任何其他治疗方法之前、基本同时或之后施用或进行此类生物制剂(蛋白质)、试剂、药物、治疗和疗法，例如，治疗受试者的溶酶体贮积病(如庞贝)的治疗方法，或治疗受试者的凝血疾病(如HemA或HemB)的治疗方法。
化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗政策或方案可作为联合组合物施用，或分开施用，例如同时或连续或顺次(之前或之后)递送或施用核酸、载体、重组载体(例如重组病毒载体)或重组病毒颗粒。因此，本发明提供了联合，其中根据本发明的方法或用途与本文所述或本领域技术人员已知的任何化合物、试剂、药物、治疗政策、治疗方案、方法、疗法或组合物联合。根据本发明，可以在向受试者施用核酸、载体、重组载体(例如重组病毒载体)或重组病毒颗粒之前、基本上同时或之后施用或进行化合物、试剂、药物、治疗政策、治疗方案、方法、疗法或组合物。
在某些实施方案中，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶可以导致阻止中和抗体、结合异源多核苷酸的抗体和/或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的形成。如本文所述，向该受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶可以在向受试者施用病毒载体之前、在施用病毒载体的基本上同时、或在施用病毒载体之后进行。
在某些实施方案中，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶与预先存在的抗体导致中和抗体、结合异源多核苷酸的抗体和/或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的减少。在施用蛋白酶和/或糖苷酶之后，然后可以根据本文的方法向这些受试者施用重组病毒载体。施用重组病毒载体后，可以任选地评估此类受试者是否存在剩余的预先存在的抗体。或者，可以在蛋白酶和/或糖苷酶减少或消除受试者中任何此类预先存在的抗体的预定量的时间后，向这类受试者施用重组病毒载体。
在某些实施方案中，向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶可导致至少20％-50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的中和抗体、结合异源多核苷酸的抗体和/或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体的降解或消化，如通过测量从施用重组病毒载体的受试者获得的生物样品中的此类抗体所反映。在某些实施方案中，根据本发明的方法降解或消化至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的中和抗体和/或结合异源多核苷酸的抗体和/或结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。
来自受试者的可被分析的生物样品的非限制性实例包括全血、血清、血浆等，及其组合。生物样品可以不含细胞，或者可以包括细胞(例如红细胞、血小板和/或淋巴细胞)。
在某些实施方案中，受试者的生物样品中存在的中和抗体可以被降解或消化至小于约1:25，其中在25份缓冲液中稀释的1份生物样品导致50％的重组病毒载体中和。在某些实施方案中，受试者的生物样品中存在的中和抗体可以被降解或消化至小于约1:20，小于约1:15，小于约1:10，小于约1:5，小于约1:4，小于约1:3，小于约1:2或小于约1:1，其中分别在20、15、10、5、4、3、2或1份缓冲液中稀释的1份生物样品导致50％的重组病毒载体中和。
生物样品中的AAV中和抗体的示例性分析和测量在本文中公开，并且还描述于美国专利申请公开2016/0123990中。可以通过测定平衡结合常数来测量抗体与Fc受体的结合。抗体的Fc受体结合的减少由IgG:FcR相互作用的平衡结合常数的增加来测定。
根据本发明的方法适用于功能丧失和增加以及功能遗传缺陷。如本文所用，涉及遗传缺陷的术语“功能丧失”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白(即突变蛋白)显示出部分或全部通常与野生型蛋白有关的功能丧失。如本文所用，涉及遗传缺陷的术语“功能增加”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白(即突变蛋白)获得通常与该蛋白(即，野生型蛋白)不相关的功能以引起或促成疾病或病症。功能增加型突变可以是基因中一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代，这会引起编码蛋白功能的改变。在某些实施方案中，功能增加型突变改变突变蛋白的功能或引起与其他蛋白的相互作用。在某些实施方案中，例如，通过改变的突变蛋白与所述正常野生型蛋白的相互作用，功能增加型突变引起正常野生型蛋白的减少或去除。
可以通过根据本发明的方法治疗的疾病和病症包括，例如但不限于，肺部疾病(例如，囊性纤维化)、出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)、地中海贫血、血液疾病(例如，贫血)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、癫痫、溶酶体贮积病(例如天冬氨酰葡糖尿症、巴滕病、晚期婴儿神经元类脂褐质病2型(CLN2)、胱氨酸病、法布里病、高歇氏病I型、II型和III型、糖原贮积病II(庞贝病)、I型GM2-神经节病(Tay Sachs病)、II型GM2-神经节病(Sandhoff病)、粘膜脂溢性病I型(I和II型唾液酸病)、II型(I细胞病)、III型(假性Hurler病)和IV型、粘多糖贮积病(Hurler病和变种、Hunter、A、B、C、D型沙费利波、A和B型Morquio、Maroteaux-Lamy和Sly病)、A/B、C1和C2型Niemann-Pick病、以及I和II型Schindler病)、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁蓄积性疾病(例如，威尔逊氏病或Menkes病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或感染性病毒(例如乙肝和丙肝、HIV等)、细菌或真菌疾病。
II型糖原贮积病，也称为庞贝病，可以通过根据本发明的方法治疗。庞贝病是一种常染色体隐性遗传疾病，其由催化糖原降解的溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的编码基因中的突变引起。由此产生的酶缺乏导致机体所有组织中糖原的病理性积聚和溶酶体改变，从而导致心脏、呼吸和骨骼肌功能障碍(van der Ploeg&Reuser,2008)。
可以通过根据本发明的方法治疗的凝血障碍包括，例如但不限于，血友病A、具有抑制性抗体的血友病A、血友病B，具有抑制性抗体的血友病B、任何凝血因子的缺乏症：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、von Willebrand因子或组合的FV/FVIII缺乏症、地中海贫血、维生素K环氧还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。
可以通过根据本发明的方法治疗的其他疾病和病症包括，例如但不限于，贫血；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓形成剂(即FXa抑制剂)或血小板病(如Bernard Soulier综合征、Glanzmann血小板无力症或储存池缺乏症)相关的过度抗凝作用。
可以通过根据本发明的方法治疗的其他疾病和病症包括，例如但不限于，增生性疾病(癌症、肿瘤、发育不良等)、Crigler-Najjar和代谢性疾病，例如肝脏的代谢性疾病、腓特烈共济失调、感染性疾病、病毒性疾病(例如，由乙肝或丙肝病毒、HIV、疱疹、逆转录病毒等引起)、遗传性疾病(囊性纤维化、营养不良性糖病、肌病，如杜氏肌病或肌营养不良症、肌小管肌病、镰状细胞贫血、镰状细胞病、范科尼贫血、糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、肌微管素肌病、运动神经元疾病，如脊髓性肌萎缩症(SMA)、脊髓小球肌萎缩症或Charcot-Marie-Tooth病、关节炎、严重的合并免疫缺陷(如RS-SCID、ADA-SCID或X-SCID)、Wiskott-Aldrich综合征、X连锁性血小板减少、X连锁先天性中性粒细胞减少症、慢性肉芽肿疾病等)、凝血因子缺乏症、心血管疾病(再狭窄、局部缺血、血脂异常、纯合子家族性高胆固醇血症等)、眼科疾病，如色素性视网膜炎、Leber先天性黑眼症、Leber遗传性视神经病变和Stargardt疾病；溶酶体贮积病，如圣菲利波综合症；高胆红素血症(例如I型或II型CN或吉尔伯特综合征)、糖原贮积病(例如GSDI、GSDII(庞贝病)、GSDIII、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII或致命的先天性心脏糖原贮积病。
在某些实施方案中，受试者患有影响或起源于中枢神经系统(CNS)的疾病。在某些实施方案中，疾病是神经退行性疾病。CNS或神经退行性疾病的非限制性实例包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪病、聚谷氨酰胺重复病或帕金森氏病。在某些实施方案中，该疾病是精神病、成瘾(例如，烟草、酒精或毒品)、癫痫、Canavan病或肾上腺脑白质营养不良。在某些实施方案中，CNS或神经退行性疾病是聚谷氨酰胺重复病，例如且不受限制地是脊髓小脑共济失调(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17)。
本发明可以用于人类和兽医医学应用。因此，合适的受试者包括哺乳动物如人，以及非人哺乳动物。术语“受试者”是指动物，典型地是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家养动物(狗和猫)、农场动物(家禽(如鸡和鸭)、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、少年和成人受试者。受试者还包括动物疾病模型，例如，蛋白质/酶缺乏症(例如庞贝病(GAA缺失)、糖原贮积病(GSD))和本领域技术人员已知的其他疾病的小鼠和其他动物模型。
本发明提供了组合物，例如试剂盒，其在其中包括包装材料和一种或多种组分。试剂盒典型地包括标签或包装插入物，该标签或包装插入物包括组分的描述或其中的组分在体外、体内或离体使用的说明。试剂盒可包含此类组分的集合，例如核酸、重组载体、病毒(例如，AAV、慢病毒)载体或病毒颗粒以及降解或消化抗体的蛋白酶和/或糖苷酶。
试剂盒是指容纳试剂盒的一个或多个组件的物理结构。包装材料可以无菌地保持组件，并且可以由通常用于这种目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
标签或插入物可包括其中一种或多种组分的识别信息、有效成分的剂量、临床药理，包括作用机理、药代动力学和药效学。标签或插入物可以包含鉴定制造商、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插入物可包含鉴定制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插入物可包含可使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插入物可包括针对临床医生或受试者在方法、用途或治疗方案或治疗政策中使用一种或多种试剂盒组分的说明。说明可以包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所述的任何方法、用途、治疗方案或预防或治疗政策的说明。
标签或插入物可包括组分可提供的任何益处的信息，例如预防或治疗益处。标签或插入物可以包括潜在的不良副作用、并发症或反应的信息，例如向受试者或临床医生提供关于将不适合使用特定组合物的情况的警告。当受试者已经、将要或正在服用一种或多种可能与组合物不相容的其他药物时，或者受试者已经、将要或正在经历将与组合物不相容的另一种治疗方案或治疗政策时，也可能发生不良副作用或并发症，因此，说明中可包含有关此类不相容的信息。
标签或插入物包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独或附着于组分、试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附着于包含试剂盒组分的安瓿、管或小瓶。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在以任何方式说明而非限制所要求保护的本发明的范围。
具体实施方式
实施例1
材料和方法
AVV载体
如之前所述(Ayuso et al.(2010)Gene Ther.17,503-10)制备AAV载体。按照三步转染方案，使用氯化铯梯度纯化，在滚瓶中生产含基因组的载体(Ayuso et al.(2010))。AAV载体滴定通过在ABI PRISM7900HT序列检测器中使用Absolute ROX混合物(Taqman,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)进行实时PCR(qPCR)来进行，除了空衣壳先用SDS-PAGE滴定，然后用银染色并通过光密度法对用作标准品的AAV衣壳进行定量。对于体外中和测定，如之前所述(Miao et al.(2006)Blood.108,19-27)，将编码荧光素酶的AAV8载体(AAV8-Luc)用作报告基因。在体内实验中使用的AAV载体在肝脏特异性启动子的控制下表达人FIX或高斯荧光素酶(Manno et al.(2006)；Mingozzi et al.(2013)Gene Ther.20,417-24)。
IdeS内切肽酶的设计和生产
将IdeS编码序列(CDS)克隆入pEX-N-His标签的克隆载体(OriGeneTechnologies,Inc.,Rockville MD)，遵循制造商的说明将其转化为BL21感受态大肠杆菌(NEB,Ipswich,MA)。通过向细菌培养物中添加0.5mM IPTG，在37℃下诱导蛋白表达4hr。分别使用抗FabRICATOR抗体A3-AF1-010(Genovis)和镍亲和柱(GE Healthcare)进行蛋白质的检测和纯化。使用聚(ε-赖氨酸)树脂离心柱(Thermo Scientific，Waltham，MA)进行内毒素去除，并根据制造商的说明使用Endosafe Cartridge Technology(Charles RiverLaboratories)通过LAL试验评估残留的内毒素浓度。在由50mM磷酸钠、150mM NaCl、0.25％人白蛋白，pH 6.6组成的可注射溶液缓冲液中稀释IdeS内切肽酶。
细胞培养
在补充有10％FBS、2mM GlutaMAX(Invitrogen Life Technology，Carlsbad，CA)的Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM)中，将2V6.11细胞(ATCC CRL-2784)维持在37℃、5％CO2的条件下，并用于AAV中和测定。
通过IdeS体外消化IgG
将来自AAV8血清反应阳性的人(NAb滴度：1:31.6)和猴(NAb滴度：1:100)或IVIg(NAb滴度：1:316)的血清在PBS中稀释至4-4.5mg/mL IgG。将五十微升稀释的IgG(200μg)与IdeS(100IU，50IU/μL)或PBS在37℃下孵育22小时。通过ELISA和中和测定法测量抗AAV8IgG。在猴IgG的情况下，使用对与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的猴IgG的γ链特异性的抗体(Fitzgerald，Acton，MA USA)。
抗人IgG ELISA
ELISA板用山羊抗人κ抗体(PBS中2.5μg/mL)包被，并用PBS-1％牛血清白蛋白(BSA)封闭。使用市售IVIg制剂为标准，将IgG样品以1/10稀释液孵育。然后，使用第二HRP缀合的小鼠抗人IgG-Fc抗体和邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物显示完整的IgG。
AAV抗体测定
如之前所描述(Mingozzi et al.(2013)Sci Transl Med.5,194ra92)进行抗AAVIgG捕获测定。简言之，将重组AAV空衣壳在包被缓冲液(35mM碳酸氢盐、13mM碳酸盐，pH>9.2)中稀释至每mL 2x1010个载体颗粒的终浓度。在96孔Nunc Maxisorp免疫板(Thermofisher,Waltham,USA)中向每个孔添加50微升。将纯化的人IgG(Tégéline,LFB,France)制成的标准曲线直接添加到板中。将板在4℃下包被过夜。第二天，将板用洗涤缓冲液(PBS,0.05％Tween-20)洗涤3次，然后在室温下用封闭缓冲液(PBS，6％脱脂牛奶)封闭2小时。将板再次用洗涤缓冲液(PBS,0.05％Tween-20)洗涤3次，然后与在封闭缓冲液中稀释的血清一起在37℃下孵育1小时。洗涤3次后，将对缀合HRP的人IgG重链具有特异性的抗体(Southern Biotech，Birmingham，USA)在37℃下孵育1小时。孵育后，将板用洗涤缓冲液洗涤3次，并用OPD底物(Sigma，Saint Louis，USA)显示。用3M H2SO4溶液终止反应，并使用酶标仪(ENSPIRETM,Perkin Elmer,Waltham,USA)在492nm下进行光密度(OD)测量。使用4参数回归针对特定标准曲线确定抗AAV IgG浓度，结果以IgG的μg/mL表示。在NHP研究中，使用针对标准曲线纯化的猴IgG和对用辣根过氧化物酶(HRP)(Fitzgerald,Acton,MA USA)缀合的猴IgG的γ链具有特异性的抗体进行显示。
AAV中和测定
如之前所描述(Meliani et al.(2015)Hum Gene Ther Methods.26,45-53)进行NAb测定。简言之，在第1天，在百日青蜕皮酮A(Life Technologies,Carlsbad,USA)存在下，将96孔板以2x104的2V6.11细胞/孔接种24小时。将重组AAV8-CMV-荧光素酶在无血清DMEM(Life Technologies,Carlsbad,USA)中稀释，并与血清样品的半对数系列稀释液一起孵育，然后在37℃下孵育1小时。随后，将血清-载体混合物添加到细胞中。每个稀释液以一式两份或一式三份测试。24小时后，裂解细胞，并在发光计(ENSPIRETM,Perkin Elmer,Waltham,USA)上测量荧光素酶活性。转换效率以每秒的相对光单位(RLU)测量。据报道中和滴度是最高血清稀释度，与无血清对照相比(100％转导)，其抑制AAV转导≥50％。
小鼠研究
小鼠研究根据法国和欧洲有关动物护理和实验的法规(2010/63/EU和CE12-037)进行，并得到当地机构伦理委员会的批准(协议号2017-014-B)。
使用6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠或雄性和雌性IX因子(FIX)缺陷的血友病B(HB)小鼠。在所有实验中，通过静脉注射最终体积为100μL的9mg IVIg(PRIVIGEN，CSL Behring，US-PA)将动物被动免疫。30分钟后，小鼠通过眼眶后注射接受250UI、500UI或1250UI的IdeS(Promega，Madison，US-WI)。第二天，在注射IdeS后30小时，通过尾静脉途径向所有小鼠注射剂量为1x1012vg/kg(2x1010vg/小鼠)的AAV8载体。从肝素包被的毛细管(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)中的眼眶后丛收集血液样品(D-7、D+7、D+14和D+28)，或从下颌方式收集样品D-1+15mn和D0。在安乐死时，收集全肝并速冻以用于随后的载体基因组拷贝数评估。
NHP研究
所有使用NHP的程序均得到机构动物护理和使用委员会的批准(协议号2018120409565637，APAFIS 18092)，并在南特兽医学校(Oniris,Nantes,France)进行。根据其抗AAV8中和抗体滴度(1:10至1:31.6)选择两只猕猴(Macaca facscicularis，2-3岁)。在第-2天，一只动物(NHP2)接受静脉缓慢输注IdeS(500μg/kg)。24小时后(D-1)，按照相同的方案重复第二次注射IdeS。第二天，在第二次IdeS注射后24小时，以2x1012vg/kg的剂量向2只猴子(NHP1，对照动物；NHP2经处理动物)输注AAV8-hFIX载体。在(D-2)之前、处理期间和AAV施用之前(D0)，在D-7、D-2、D-2+10h、D-1、D-1+10h、D0采集血液样品以评估IdeS处理对IgG抗体降解的功效。为了追踪抗AAV8的体液响应和在D4，D7，D13，D21，D28，D35，D50天的转基因表达，收集其他血液样品。在安乐死(D50)处，收集了4个从肝的4个裂片中取出的楔形活检样本，并进行了速冻，以用于随后的载体基因组拷贝数研究。
为了再施用研究，向2只AAV8血清反应阳性的猴子输注5x1012vg/k的AAV8-hFIX载体(D0)。在注射载体之前，一只猴子在D-1天接受单次注射IdeS(500μg/kg)。随后，两只猴子在第80天和第81天接受两次注射IdeS(500μg/kg)，并且在第82天接受5x1012vg/kg的AAV8-hFIX载体注射。在实验期间的不同时间点收集血液样品。在安乐死(D105)时，从4个肝叶收集肝活检进行VGCN评估。
抗猴IgG ELISA
通过夹心酶联免疫法(ELISA)测量猴IgG水平。简言之，我们分别使用山羊抗人IgGF(ab')2(Thermo Scientific)和山羊抗猴IgG-HRP(Fitzgerald)作为捕获和检测抗体。OPD过氧化物酶底物系统(SIGMAFASTTM-OPD,Sigma)用于显示。
人FIX ELISA
按照制造商的说明测量小鼠血浆中的人FIX(hFIX)蛋白水平。用于ELISA测定的捕获HRP和二级HRP抗体购自Affinity Biological(Ancaster,Canada)。在NHP样品中，抗hFIX抗体(MAI-43012,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)和抗hFIX-HRP抗体(CL20040APHP,Tebu-bio,France)分别用于包被和检测。通过按照制造商的说明添加SIGMAFASTTM OPD底物(Sigma-Aldrich)并在492nm的吸光度下测量OD来测定hFIX抗原水平。
载体基因组拷贝数(VGCN)
使用qPCR测定法，用对肝启动子和小鼠Titin或eGlobin基因具有特异性的引物和探针测定肝载体基因组拷贝数。启动子特异性引物和探针由Thermo Scientific(Waltham,MA,USA)合成。小鼠Titin和eGlobin分别用作小鼠和NHP研究中的归范基因，由ThermoScientific(Waltham,MA,USA)合成。使用FastPrep机器(MP Biomedicals)和GentraPuregen Blood Kit(Qiagen,ref 158467)将全器官(小鼠)或活检(NHP)匀浆后，从组织提取DNA。每个样品以一式三份测试，并根据线性化质粒的标准曲线测定每个二倍体基因组的基因组拷贝数。
高斯荧光素酶测定
将50μL在PBS(1:50)中稀释的血浆样品加载到白色96孔微板(OptiPlate-96Perkin Elmer,Waltham,USA)上。在光度计(ENSPIRETM,Perkin Elmer,Waltham,USA)上测量高斯荧光素酶活性。在自动注射50μL底物溶液(Coelenterazine,Sigma Aldrich)后的1秒内进行测量。从每个值中减去信号背景。高斯荧光素酶活性表示为RLU/sec，并且值是来自重复测定的重复样品的平均值+/-SD。
尾夹出血测定
用腹腔注射(IP)递送氯胺酮和赛拉嗪的混合物的麻醉动物，并置于俯卧位。用手术刀切除尾巴的3mm远端部分。将尾巴立即浸入包含预热至37℃的等渗盐水的50mL Falcon管中。尾巴的位置是垂直的，其中尖端位于机体地平线下方约2cm处。即使出血停止，也要监测每只动物20分钟，以检测是否有再次出血。使用停止时钟测定出血时间。如果出现出血开/关循环，则使用20分钟内的出血时间总和。在实验结束时，通过颈脱位法处死动物。
实施例2
AAV8的结果
我们首先研究了野生型小鼠的被动免疫后，即在存在内源性小鼠IgG的情况下，IdeS是否在体内水解人IgG。野生型小鼠注射人IgG(IVIg)，并且30分钟后注射IdeS。然后在1、6和24小时后在收集的血清中测试完整的人IgG(图1)。在未经处理的小鼠中，人IgG的水平随时间逐渐下降，从0小时的9.9±1.2mg/mL(平均值±SD)降至24小时的3.7±0.6mg/mL，与小鼠中人IgG的半衰期一致(Roopenian et al.(2003)J Immunol.170,3528-33)。相反，经IdeS处理的小鼠中的人IgG表明从0小时的11.1±1.0mg/mL快速消除到24小时的0.7±0.03mg/mL。因此，用IdeS处理导致注射后6小时和24小时的人IgG浓度降低5倍。
为了研究IdeS在体内降低抗AAV8 IgG水平的能力，我们使用了之前描述的被动免疫模型(Scallan et al.(2006))。向野生型C57BL/6小鼠注射9mg IVIg。30分钟后，向小鼠注射IdeS(250UI)或作为未处理的对照组的PBS。注射IdeS后30小时，以1x1012vg/kg的剂量向小鼠注射编码人FIX转基因的AAV8载体(图2)。如处理组的下表所示，将小鼠分为4组(n＝6只小鼠/组)：
组 IVIg IdeS AAV8-hFIX
1 + + +
2 + - +
3 - + +
4 - - +
在载体递送后追踪动物四周，并在第-7、7、14、28天收集血浆，以测量FIX转基因表达水平(图2)。在用人IgG重构后(D-1+15min)和注射IdeS或PBS(D0)后，从收集的血液测量血清中的抗AAV8 IgG和NAb。如之前所公布(Scallan et al.(2006))，IVIg含有高水平功能相关的抗AAV8 IgG，如通过ELISA(图3A，对于第1组和第2组，分别为2.56±0.21μg/mL和2.83±0.22μg/mL,平均值±SD)和中和测定(图3B，1:22.6[范围：1:10至31.6]滴度和1:19[范围：1:10至31.6])检测。注射IdeS导致抗AAV8 IgG循环水平急剧下降。24小时后，抗AAV8IgG(对于第1组和第2组，分别为0.39±0.10μg/mL和1.67±0.42μg/mL)和AAV8 NAb的降低分别为4.3倍和10倍。在PBS处理的小鼠(第2组)中，抗AAV8 IgG超时含量的降低表示小鼠中人IgG的天然消除。
然后，向用IdeS或PBS处理的用IVIg或PBS重构的野生型小鼠注射编码hFIX的AAV8载体，并在7、14和28天后测量hFIX血浆水平。如所预料的，缺乏抗AAV8 IgG的未重构小鼠在4周内表现出血液中hFIX的恒定产生和积聚(图4A)。这伴随着小鼠肝脏中大量的基因拷贝数(图4B)。相反，用含有抗AAV8中和IgG的人IgG重构的小鼠(图3A)未能产生hFIX。有趣的是，使用IdeS处理人IgG重构小鼠能够在基因治疗后恢复hFIX的产生。如通过测量曲线下面积所评估，在IdeS处理的小鼠中产生的hFIX水平代表对照非重构小鼠中产生水平的50.31％(图4A)。因此，在经人IgG重构的IdeS处理的小鼠的肝脏中，基因拷贝数为2.016±0.620vg/二倍体细胞(图4B)，而在未接受IdeS的经人IgG重构的小鼠中，基因拷贝数为0.005±0.002vg/二倍体细胞(P＝0.002)。
IdeS水解来自不同物种的IgG，包括非人灵长类动物。因此，我们调查了IdeS与AAV8血清反应阳性的人和非人灵长类动物(NHP，猴)血清样品的孵育是否水解中和性抗AAV8 IgG。如图5A所示，IdeS确实水解人血清和猴血清中的抗AAV8 IgG，其中在孵育22小时内猴血清中的抗AAV8 IgG水平降低15倍(用IdeS或PBS处理时分别为0.42±0.01μg/mL和6.29±0.10μg/mL)。在与IdeS孵育的人血清中，抗AAV8 NAb滴度也降低了(图5B)。在猴血清与IdeS孵育后，未观察到抗AAV8 NAb滴度降低，但在IdeS孵育后，这些抗体的中和能力从76％降低至64％(图5B)。缺乏降低的抗AAV NAb滴度的原因可能是由于高亲和力猴抗AAV8IgG的功能性F(ab’)2片段保留在孵育混合物中。
实施例3
AAV2和AAV9的结果
在从用9mg人IgG重构野生型小鼠(D-1+15min)和注射IdeS(250IU或500IU，分别对于AAV2或AAV9)或PBS(D0)后收集的血液中制备的血清中测量抗AAV2和抗AAV9 IgG和NAb(图2)。如ELISA(对于第1组和第2组，分别为：图3C,抗-AAV2 IgG 9.05±1.20μg/mL和8.92±0.63μg/mL,平均值±SD；图3E,抗-AAV9 IgG5.51±0.492μg/mL和5.145±0.691μg/mL)和中和测定(对于第1组和第2组，分别为：图3D，1:886和1:772[范围：1:316至1000]抗AAV2NAb滴度；图3F，1:15.4和1:24.4[范围：1:10至31.6]抗AAV9 NAb滴度)所检测，IVIg包含高水平的功能相关的抗AAV2和抗AAV9IgG。注射IdeS导致抗AAV2和AAV9 IgG循环水平急剧下降。24小时后，抗AAV2 IgG降低了6倍(对于第1组和第2组，分别为1.51±0.31μg/mL和4.58±0.45μg/mL)，并且抗AAV2 NAb降低了28倍。24小时后，抗AAV9 IgG降低了36倍(对于第1组和第2组，分别为0.153±0.074μg/mL和2.92±0.50μg/mL)，并且抗AAV9 NAb降低了20倍。PBS处理的小鼠(第2组)中抗AAV2和AAV9 IgG的水平随时间降低，代表小鼠中人IgG的自然消除。
实施例4
高斯荧光素酶的结果
用合并的人IgG被动免疫的野生型小鼠接受IdeS(1250UI/小鼠)或PBS，然后注射编码GLuc的AAV8。在7、14和28天后在小鼠血浆中测量GLuc的表达。缺乏抗AAV8 IgG的未重构小鼠在4周内表现出血液中GLuc的恒定产生和积聚(图4C)。这伴随着小鼠肝脏中大量的基因拷贝数(图4D)。相反，用包含抗AAV8中和性IgG的人IgG重构的小鼠未能产生GLuc(图4C)。有趣的是，在GLuc的情况下，用IdeS处理被动免疫的小鼠恢复了几乎完全的基因治疗效率(图4C)。
因此，在经人IgG重构的IdeS处理的小鼠肝脏中，基因拷贝数为0.759±0.148vg/二倍体细胞(图4D)，而在未接受IdeS的经人IgG重构的小鼠中，基因拷贝数为0.0006±0.0004vg/二倍体细胞(P<0.0001)。
实施例5
HB小鼠研究
将用IVIg或PBS重构的缺乏因子IX的血友病B(HB)小鼠用IdeS(1250UI/小鼠)或PBS处理，并注射编码hFIX的AAV8载体，并在7和14天后测量hFIX血浆水平。缺乏抗AAV8 IgG的未重构HB小鼠在2周内显示出血液中hFIX的产生和积聚(图6A)。相反，用含有抗AAV8中和性IgG的人IgG重构的小鼠未能产生hFIX(图6A)。有趣的是，用IdeS处理的被动免疫小鼠恢复了完全的基因治疗效率，并达到了与对照非重构小鼠中所观察到的相同的循环hFIX水平(图6A)。组合的IdeS/AAV8处理后达到的内源产生的hFIX水平保护小鼠免于尾夹测定的急性出血。实际上，与经AAV8处理的未免疫小鼠和野生型C57BL/6小鼠相比，失血量不是统计学显著的(虚线)。相反，未接受IdeS的被动免疫小鼠比其他组的小鼠损失明显更多的血液。
实施例6
NHP研究
我们研究了IdeS处理在非人类灵长类动物中的功效。将一只食蟹猴(NHP2)用两次IV注射的IdeS(500μg/kg)处理，如图7所示的实验方案所示。通过ELISA测量血清中的完整IgG，并使用纯化猴IgG作为标准，以mg/mL表示(图8A)。数据显示，即使在第二次注射IdeS(D-1+10h,D0)之后，总NHP2 IgG的消除，其中保留了一些完整的IgG。处理后D4开始恢复IgG，总恢复21天。在IdeS处理之前和之后测量抗AAV8 IgG。通过ELISA测量，第二次注射IdeS后，经处理猴子(NHP2)中的抗AAV8 IgG水平降低了2.7倍(从2.86降低至1.05μg/mL)(图8B)。类似地，在中和测定中测量的抗AAV8NAb滴度降低了3倍(滴度从17.2至5.4)(图8C)。
NHP2和未用IdeS处理的对照猴子(NHP1)接受编码hFIX的AAV8(2x1012vg/kg)，并且在50天内测量血浆中hFIX随时间的水平。与对照猴子(NHP1)相比，接受IdeS处理(NHP2)的猴子随时间直至死亡都具有明显更高的hFIX表达水平(图9A)。该结果与肝VGCN的评估一致。实际上，经处理猴子(NHP2)显示出比未处理的对照猴子(NHP1)更有效的肝转导(图9B，10.1±1.6vs.1.6±0.2)。我们还追踪了AAV8介导的基因治疗后NHP1和NHP2猴子血液中中和抗AAV8 IgG的水平。在IdeS处理的猴子(NHP2)中，抗AAV8 IgG体液应答与未处理的猴子(NHP1)相比降低了11倍(图10A，75.4±0.3vs.816.7±122)。用抗AAV8 NAb观察到体液应答也有类似的降低(图10B：NHP2,1:316vs.NHP1,1:3160)。
然后，我们开发了再施用IdeS和AAV8的方案(图11)。为此，对两只具有相似的抗AAV8 IgG初始水平的猴子用编码hFIX的AAV8处理，使用(NHP4)或不使用(NHP3)之前的IdeS处理。如所预期的，在第一次AAV8注射后，在IdeS/AAV8处理的猴子(NHP4)中，hFIX的内源性水平高于未接受IdeS(NHP3)的经AAV8处理的对照猴子(图12A)。然后，两只猴子都接受两次Ides注射并再给药编码hFIX的AAV8。NHP3未能产生内源性hFIX，其与中和抗AAV8IgG的水平升高、肝转导效率差以及抗hFIX抗体的产生有关(数据未显示)。相反，在用IdeS/AAV8进行第二次处理后，NHP4的hFIX产量增加，这与抗AAV8 IgG和NAb的低含量一致。有趣的是，载体再施用后，hFIX水平比首次注射载体后更稳定。这些结果与肝VGCN的评估一致(图12B)。我们追踪了105天内猴子血液的中和抗AAV8 IgG水平。在经IdeS处理的猴子(NHP4)中，在实验结束时几乎无法检测到抗AAV8 IgG体液应答(图13A，NHP4为2.25±0.071μg/mL，而NHP3为1552.5±337.9μg/mL)。用抗AAV8 NAb观察到体液应答也有类似的降低(图13B，NHP4为1:17.2，而NHP3为1:10000)。
结论
数据表明，在血友病B背景下，使用编码因子IX的AAV8载体，Ides治疗可有效减少抑制基因治疗的中和抗体(参见实施例1、4和5)。该数据支持使用IdeS处理对其他AAV血清型进行基因治疗(参见实施例2)。
实施例7
方法
通过内切肽酶体外切割免疫球蛋白G(IgG)：将具有或不具有针对Spk2衣壳的中和抗体(NAb)的人血清或非人灵长类动物(NHP)血浆样品与来自化脓性链球菌的递增剂量的免疫球蛋白降解酶(IdeS；Promega)在37℃下一起孵育1小时。根据Promega的指示，一个单位定义为在37℃下30分钟内切割≥95％的1μg重组单克隆IgG。用PBS调节反应体积。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估总IgG的切割。
切割的IgG的SDS-PAGE分析：制备切割的样品，用
Figure BDA0002903837500000851
LDS样品缓冲液(4X)(ThermoFisher Scientific)进行非还原SDS-PAGE，并加热到70℃持续10分钟。然后，使用MOPS SDS Running缓冲液通过
Figure BDA0002903837500000852
Novex 4-12％Bis-Tris凝胶分析样品。凝胶用考马斯蓝染色。
抗AAV衣壳中和抗体(NAb)滴度：使用基于细胞的体外测定法和分别包封海肾荧光素酶转基因的报告载体的AAV-Spk1或AAV-Spk2定量针对AAV-Spk1或AAV-Spk2衣壳的中和抗体。简言之，将早期传代(传代次数少于#26)293E4细胞解冻，并以2x104个细胞/200μL/孔铺板在平底白色96孔板中。向每个孔中添加终浓度为1μg/mL的百日青蜕皮酮A(Invitrogen；cat.#H101-01)以诱导辅助病毒蛋白人腺病毒E4的表达。然后，将细胞在37℃/5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，将样品在56℃下热灭活30分钟，然后使用FBS作为稀释剂制备4点稀释液(从1:1到1:5)。以3.16倍(半对数)系列稀释液制备因子测定对照血浆(FACT；King George Bio-Medical,Inc.)以评估测定性能。将AAV荧光素酶载体在DMEM中稀释至7.5x107vg/mL，然后添加到FACT对照和样品中。将载体和对照/样品在37℃下孵育60分钟。将“中和”的对照/样品的每孔7.5μL的体积转移到接种有细胞的板的每个孔中，然后将细胞返回培养箱中培养过夜。第二天，将细胞在PBS中洗涤一次，在Renilla测定裂解缓冲液中裂解，并用海肾萤光素酶测定系统(Promega)测量萤光素酶活性，并在SpectraMax L酶标仪上读数。
使用IVIg的人工免疫小鼠模型：为了在雄性C57BL/6小鼠中产生人工NAb滴度，静脉(IV)施用载体前一天，腹膜内注射静脉免疫球蛋白(IVIg；Gamunex)，其含有从人血纯化的10％免疫球蛋白G(IgG)。为了确定通过IdeS或IdeZ(一种来自马链球菌的类似内切肽酶，其与IdeS相比针对小鼠IgG2a和IgG3的活性增加)体外切割IgG是否能救济体内的转导效率，在37℃下用125个单位的IdeZ处理IVIg过夜，然后IP给药。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估总IgG的切割。IVIg给药后一天，以2x1012vg/kg施用载体(AAV-Spk1-GAA)。每周收集小鼠血浆样品，并分析样品的转基因(GAA酶)活性。为了确定通过IdeS体内切割IgG是否可以救济体内的转导效率，通过IP给药输注300mg/kg IVIg。24小时后，通过IV给药输注0.4或4mg/kg IdeS。然后，在输注IdeS后24小时，以2x1012vg/kg施用载体(AAV-Spk1-GAA)。
GAA活性测定：通过在pH 4下测量底物4-甲基-伞形基-α-D-葡萄糖苷的切割来评估GAA活性(Galjaard et al.,Clin Chim Acta 1973；49(3):361-75)。简言之，通过向在MilliQ水中以1:250稀释的10μL血浆样品中添加20μL底物来引发反应。将反应混合物在37℃下孵育1小时，然后随后通过pH 10.5的碳酸盐缓冲液终止。此后，将标准曲线铺板4-甲基伞形酮(一种从4-甲基-伞形基-α-D-葡萄糖苷释放的蓝色荧光染料，当在370nm处激发时在440nm处产生荧光)。
抗AAV衣壳IgG抗体：抗AAV衣壳总IgG的形成用捕获测定法测量。将ELISA平板孔用50μL含有1μg/mL AAV-Spk1衣壳颗粒的溶液包被。稀释总的人IgG(Southern Biotech,0150-01)以生成10,000ng/mL至0.5ng/mL的10点标准曲线，并将其添加到板中。反向计算后，测定的定量限为460ng/mL。制备三个水平的质量控制样品，并将其包括在每个板上以评估测定性能。将衣壳颗粒、标准品和质量控制(QC)在4℃下孵育过夜。洗涤后，在室温下用2％BSA,0.05％Tween-20的PBS溶液封闭孔2小时。然后，将样品在封闭缓冲液中的系列稀释液加载到板上，并在室温下孵育2小时。在封闭缓冲液中以1:5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的绵羊抗人IgG抗体(GE Healthcare,cat.#NA933V)用作检测抗体，并在室温下在板上孵育1小时。洗涤后，在室温下与3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(TMB)孵育10分钟后，显示过氧化物酶活性。用1M硫酸终止反应，然后通过吸光度板读数器读取该板的450nm处的光密度(OD)。针对由纯化的人总IgG的系列稀释液制备的标准曲线测定IgG浓度。
实施例8
IdeS在体外从人、NHP和仓鼠样品切割IgG
来自化脓性链球菌的免疫球蛋白G(IgG)降解酶(IdeS)是半胱氨酸蛋白酶，其以高特异性切割所有四种人IgG亚类。IdeS在IgG重链下部铰链区的Gly236处水解人IgG。
为了分析IdeS切割血清中IgG的能力，将增加剂量的IdeS(0-100单位；Promega)添加至人血清和具有或不具有抗Spk2 NAb滴度的NHP(恒河猴)血浆样品。在初始(<1:1)或相对中范围(1:5-1:10)或相对高(1:20-1:40)NAb滴度的人样品中，最低剂量的IdeS切割了全部IgG(～150kD)以释放Fc片段(～25kD)(图14A)。在NHP样品中，IgG在所有NAb滴度组中均被类似切割(<1:1,1:50-1:100,>1:100,图14B)。
预期仓鼠将提供比小鼠更好的模型，用于检查针对AAV再给药的IdeS处理。通过将增加量的IdeS(0-50个单位；Promega)与合并的仓鼠血浆(合并的人血浆作为阳性对照)一起孵育测试了IdeS切割仓鼠IgG的能力。通过非还原SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析样品。IdeS在体外有效切割合并的仓鼠血浆和合并的人血浆中的IgG(图14C)。
这些结果证明，IdeS是人IgG、恒河猴IgG和仓鼠IgG的高效且特异性的蛋白酶。
实施例9
通过IdeS切割IgG降低体外NAb滴度
为了分析通过IdeS切割IgG是否足以减少中和，在体外测定了AAV载体的转导效率。在该测定中，可以通过将编码海肾荧光素酶的AAV载体与血浆或血清一起预孵育，用这些混合物转导培养物中的人细胞，随后评估荧光素酶活性水平来评估各种物种的血清或血浆样品中是否存在针对AAV衣壳的中和抗体。
将初始(<1:1)或具有抗-Spk2 NAb高滴度(1:10-1:20)的人患者血清样品用或不用过量的IdeS(50单位)预处理，然后评估Nab滴度。有趣的是，在一个研究中，用IdeS预处理的之前报告的NAb效价为1:10-1:20的患者样品显示至少两倍的降低，至1:5-1:10的Nab滴度(表1)。这些结果表明，当IgG抗体被IdeS切割时，AAV载体转导增加。
表1–与过量IdeS孵育的人血清的抗Spk2 NAb滴度分析。
研究1
Figure BDA0002903837500000881
研究2
样品# Spark ID IdeS 载体 之前滴度 滴度范围
S1 FBS 否 Spk2 NA <1:1
S2 FBS 是 Spk2 NA <1:1
S3 BRH1450399 否 Spk2 1:2.5 1:2.5
S4 BRH1450399 是 Spk2 1:2.5 1:1
S5 BRH1450436 否 Spk2 ～1:5 1:5
S6 BRH1450436 是 Spk2 ～1:5 1:1
S7 BRH1450427 否 Spk2 1:10 1:10
S8 BRH1450427 是 Spk2 1:10 1:10
用IdeS内切肽酶处理后的抗Spk2 NAb滴度分析。用和不用IdeS预处理人患者样品(由Spark ID指定)。随后，通过体外载体转导测定评估Nab滴度。
实施例10
IdeZ体外降解IVIg增加载体的体内转导效率
IgG抗体的效应子功能(如细胞毒性和补体固定)由Fc部分介导。中和依赖于重链和轻链的可变区对抗原的特异性。尽管F(ab’)2片段仍包含完整的抗原结合区，但数据表明通过IdeS或IdeZ(马链球菌中的类似内切肽酶，其具有针对小鼠IgG2a和IgG3的改进的活性)释放的F(ab’)2片段导致没有Fc部分的稳定性降低，因此与完整的IgG相比，F(ab’)2片段从循环中更快清除。该测定法测试了在体内环境中施用通过IdeS或IdeZ预切割的中和抗体是否应导致对AAV的中和活性的降低。
小鼠用IVIg免疫，IVIg是包括用或不用0.1mg/kg IdeZ预处理的抗AAV衣壳中和抗体的人IgG混合物。然后，向小鼠施用2x1012vg/kg AAV-Spk1-GAA。与对照组小鼠(33,551±13,635nmol/hr/mL)相比，用1.0mg或5.0mg IVIg处理的小鼠导致血浆中GAA活性水平降低(10,951±1,554nmol/hr/mL和1,041±553nmol/hr/mL)，表明IVIg对载体的中和是剂量依赖性的(图15)。
用IdeZ预处理40mg/kg IVIg救济转导效率，产生与对照相当的GAA活性水平(37,707±11,449nmol/hr/mL)。200mg/kg IVIg的IdeZ预处理部分减轻了载体中和(13,440nmol/hr/mL±15,543)，其中一只动物完全恢复活性(41,025nmol/hr/mL)。注意到，IdeZ本身不干扰AAV载体转导效率。通过考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析IVIg给药保留物以确认IgG的切割。这些结果表明，通过IdeS/IdeZ体外切割针对AAV衣壳的中和抗体可以救济体内AAV载体转导和转基因表达。
实施例11
通过IdeS体内降解IVIg增加载体的体内转导效率
为了分析体内切割IgG是否会影响血浆中的载体转导和转基因表达/活性，首先向小鼠输注完整的IVIg以产生人抗衣壳中和IgG的人工滴度。24小时后，向小鼠输注两种浓度(0.4mg/kg或4mg/kg)的IdeS，然后在IdeS输注后24小时，向所有小鼠施用2x1012vg/kg AAV-Spk1-GAA。在IdeS输注前和IdeS输注后(紧接在载体施用之前)分析抗Spk1 NAb滴度和IgG水平。
IdeS输注诱导NAb(图16)和IgG水平的剂量依赖性降低(图17)。最高剂量的IdeS(4mg/kg)能够将至少1:40的NAb滴度降低至<1:1。
当在载体输注后一周测量GAA活性时，仅施用载体的对照小鼠表现出为49,387±7,345nmol/hr/mL的GAA活性水平(图18)。注射300mg/kg IVIg的小鼠表现出与几乎完全抑制转导一致的血浆中的GAA转基因活性水平(1,702±336nmol/hr/mL)。IdeS显示出转基因活性水平的剂量依赖性救济；0.4mg/kg IdeS导致救济70％的GAA活性(34,408±10,562nmol/hr/mL)，而4mg/kg救济99％的GAA活性(48,948±5,322nmol/hr/mL)。这些结果证明，体内IdeS处理降低中和抗体滴度，并允许在难治性动物中给药和转导AAV载体。
实施例12
通过IdeS体内降解IVIg增加载体的体内转导效率
评价了IdeS体内切割更高滴度的抗衣壳IgG和在更高程度的AAV载体中和的情况下救济AAV转导的能力。向小鼠(雄性C57BL/6)中输注不同剂量的完整人IVIg(300mg/kg(低)、800mg/kg(中)或1600mg/kg(高))以产生人抗-衣壳中和IgG的人工滴度。24小时后，以三种浓度(0.4mg/kg(低)、1mg/kg(中)或2mg/kg(高))向小鼠输注IdeS。在IdeS输注后24小时，以2x1012vg/kg向小鼠施用AAV-Spk1-GAA。使用实施例1中所述的抗AAV衣壳NAb滴度测定法，在IdeS输注前和IdeS输注后(紧接在载体施用之前)测定抗Spk1 Nab滴度。如实施例1所述，在载体施用后两周，通过使用GAA活性测定法测量血浆中的转基因产物(GAA)活性来评估AAV转导。
对于所有剂量的IVIg，用IdeS预处理导致AAV Nab滴度的剂量依赖性降低(表2)。表2列出每组中每只动物在IdeS输注之前和之后的中和抗Spk1抗体(NAb)滴度。AAV NAb滴度被指定为低(<1:1,1:1–1:2.5)、低至中范围(1:2.5–1:5)、中至高范围(1:5–1:10)和高(>1:10–1:20)。最高剂量的IdeS(2mg/kg)能够将>1:160的NAb滴度(用1600mg/kg IVIg生成)降低至1:1-1:2.5。
表2–IdeS输注前后鼠血浆中的抗NAb滴度。
Figure BDA0002903837500000901
Figure BDA0002903837500000911
Figure BDA0002903837500000921
载体输注后两周测量的GAA活性结果示于图19。阴性对照小鼠(仅施用载体)的血浆显示GAA活性水平为26,689±12,420nmol/hr/mL。注射300mg/kg(或更高)IVIg且未接受IdeS的小鼠的血浆GAA活性水平仅为436±41nmol/hr/mL，与NAb对AAV载体转导的抑制一致。与之前实施例中的结果一致，如血浆中GAA活性水平所测量，IdeS预处理导致剂量依赖性救济AAV载体转导：0.4mg/kg IdeS导致GAA活性水平为7,702±4,710nmol/hr/mL，1mg/kgIdeS导致GAA活性水平为15,444±4,226nmol/hr/mL，2mg/kg IdeS导致GAA活性水平为14,375±2,572nmol/hr/mL。
接受较高剂量的IVIg(800或1600mg/kg IVIg)的组显示出随着IdeS增加，GAA活性水平的剂量依赖性增加的相似趋势。对于800mg/kg IVIg，0.4mg/kg IdeS导致GAA活性水平为4,188±2,549nmol/hr/mL，1mg/kg IdeS导致GAA活性水平为17,813±11,283nmol/hr/mL，并且2mg/kg IdeS导致GAA活性水平为26,846±7,354nmol/hr/mL。对于1600mg/kgIVIg，0.4mg/kg IdeS导致GAA活性水平为580±217nmol/hr/mL，1mg/kg IdeS导致GAA活性水平为12,511±1,602nmol/hr/mL，并且2mg/kg kg IdeS导致GAA活性水平为11,573±1,313nmol/hr/mL。在IVIg最高剂量(1600mg/kg)下，最低IdeS剂量(0.4mg/kg)未能救济载体转导。但是，在1600mg/kg的IVIg剂量下，循环中存在总IgG的超生理水平，这可能会由于其底物数量的增加而降低在0.4mg/kg剂量下IdeS的有效性。
这些结果表明，体内IdeS处理降低中和抗体滴度，并允许对病毒载体基因治疗方法难治的动物进行病毒载体的给药和转导。
实施例13
这种共疗法的应用范围广泛。例如，通过IdeS将NAb克服为AAV衣壳或其他基因递送方式，有潜力使得能够治疗具有预先存在的中和抗体滴度的患者，以及向之前已被施用基因治疗产品的患者(其中由于时间或其他混淆问题而未达到有效水平或已丧失有效水平)再给药。另外，本文的方法能够使肝基因转移到儿科群体，由于肝细胞的扩增和发育过程中转基因表达的潜在丧失，这已被认为针对基因治疗是难治性的。这些结果表明，IdeS施用将导致减少或清除针对AAV衣壳的中和抗体，并使得可以治疗之前认为不适合进行基因治疗或在AAV基因治疗后产生AAV抗体的患者。
实施例14
再给药AAV的仓鼠模型
向仓鼠输注携带目标转基因的rAAV载体颗粒，在产生抗AAV NAb后(例如4周)给药IdeS，并输注携带另一种转基因的另外的rAAV颗粒。该模型允许分析不同阶段的转导效率，包括在IdeS处理之前和之后以及在用rAAV再给药之前和之后。
为了评估Ides降解或降低针对AAV衣壳的中和抗体的作用的能力，在叙利亚金仓鼠(其IgG被内切肽酶IdeS有效切割的物种)中进行了研究。首先向仓鼠输注2x1012vg/kgSpk1-FVIII、Spk1-FIX或其他Spk1衣壳化的载体。除了通过抗Spk1 IgG ELISA或基于细胞的中和抗体测定来测量Nab形成Spk1衣壳以外，还监测动物血浆中转基因产物(即FVIII、FIX等)的表达。产生NAb滴度后，在载体输注的3-5周内，通过静脉内、皮下、腹膜内或其他途径向动物输注单次或多次递增剂量的IdeS：0、0.5、1和2mg/kg(以及更高剂量)。施用IdeS后，通过测量抗Spk1衣壳IgG和/或针对Spk1的Nab来追踪动物。当动物表现出NAb水平充分降低时，向它们输注2x1012vg/kg Spk1-GAA。转导后，通过GAA活性测定和/或GAA抗原水平测量来测量血浆中GAA表达，以确定达到的转导水平。
这些研究示出了IdeS是否能将体内AAV衣壳特异性NAb降低至足以再给药的低水平。抗FVIII IgG(如果在体内产生)的测量提供了有关IdeS在减少靶向转基因产物的NAb中的有效性以及在丧失有效性之前允许的IdeS再给药轮数的信息。
实施例15
AAV再给药的食蟹猴模型
为了在大型动物模型中评估IdeS降解或降低Nab针对AAV衣壳的影响的能力，在食蟹猴(猕猴)中进行了研究。首先筛选猴子的针对Spk1衣壳的预先存在的NAb。NAb阳性动物可能由于在野外或集体饲养场中暴露于天然存在的AAV而引起。根据阴性或阳性Nab滴度，以及如果阳性的话，预先存在的Nab滴度多高，将动物分组。
在研究的再给药组中，向动物给药2x1012vg/kg Spk1-FIX或其他Spk1衣壳化的载体。除了通过抗-Spk1 IgG ELISA或基于细胞的NAb测定法测量Nab形成Spk1衣壳外，还监测动物血浆中转基因产物(即FIX或其他)的表达。在产生NAb滴度后，在载体输注的3-5周内，通过静脉内、皮下、腹膜内或其他施用途径以0或0.5、1和2mg/kg和更高剂量的IdeS剂量向动物输注。施用IdeS后，通过测量抗Spk1衣壳IgG和/或针对Spk1的Nab来追踪动物。当动物表现出NAb水平充分降低时，向它们输注2x1012vg/kg Spk1-GAA。转导后，通过GAA活性测定和/或GAA抗原水平测量来测量血浆中GAA表达，以确定达到的转导水平。
该研究的另一分支评估了IdeS克服预先存在的Nab滴度的能力。将显示不同NAb滴度水平的动物根据滴度分组，并通过静脉内、皮下、腹膜内或其他施用途径输注单次或多次递增剂量的IdeS：0、0.5、1和2mg/kg(及更高剂量)。施用IdeS后，通过测量抗Spk1衣壳IgG和/或针对Spk1的Nab来追踪动物，并且当动物表现出NAb水平充分降低时，向它们输注2x1012vg/kg Spk1-GAA。转导后，通过GAA活性测定和/或GAA抗原水平测量来测量血浆中GAA表达，以确定达到的转导水平。
这些研究示出了IdeS是否能将体内AAV衣壳特异性NAb降低至足以在食蟹猴(人AAV施用的优良模型的物种)中再给药的低水平。这些研究还显示，通过IdeS施用可以克服最大的预先存在的Nab滴度。抗FVIII IgG(如果在体内产生)的测量提供了有关IdeS在减少靶向转基因产物的NAb中的有效性以及在丧失有效性之前允许的IdeS再给药轮数的信息。
实施例16
使用IdeS和AAV-Spk1-hFVIII的小鼠研究
在具有人工滴度的人抗衣壳中和IgG的小鼠中测试两种不同的IdeS制剂(批次1和批次2)。在第-2天向C57BL/6小鼠注射300mg/kg IVIg，然后在第-1天注射1mg/kg IdeS(用AAV预先给药)，最后在第0天(给药后)注射编码人因子VIII(AAV-Spk1-hFVIII)的AAV-Spk1载体的5x1010个载体基因组。阴性对照动物未接受IVIg或IdeS处理，“无IdeS”组仅接受IVIg和AAV-Spk1-hFVIII载体。使用类似于实施例7中所描述的抗AAV衣壳中和测定法，对样品进行8点滴度(1:1至1:160)，在IdeS施用前后测定血浆中的抗体滴度，并且在
Figure BDA0002903837500000961
Discover Microplate Reader(Promega)上读取发光。将滴度测定为最高的稀释度或范围，其中发光被抑制>50％。IdeS处理之前和之后的NAb滴度表明，两种批次的IdeS均有效降低小鼠的NAb滴度(图20)。
通过ELISA在载体输注前以及在载体输注后一和两周测量人FVIII抗原水平(图21)。两种批次的IdeS体内处理均降低中和抗体滴度，并允许与AAV载体一起给药和转基因表达。
实施例17
抗AAV-Spk1 IgG的小鼠研究
向C57BL/6小鼠提供IVIg以诱导人抗衣壳中和IgG的人工滴度。使用三种浓度的IVIg(300mg/kg(低)、800mg/kg(中)和1600mg/kg(高))，并且在每个IVIg组中，用增加剂量的IdeS(0、0.4、1.0、2.0mg/kg)处理动物。通过ELISA评估抗Spk1衣壳IgG水平。简言之，将96孔板用Spk1空衣壳包被，然后用BSA封闭，洗涤，并与血浆一起孵育，以1:100稀释，保持2小时。孵育后，将板洗涤，并与缀合有HRP的第二抗体一起孵育1小时。随后，再次将板洗涤，并使用TMB底物显影。在吸光度板读数器上于450nm处读取板的光密度(OD)。将发光与人IgG的标准曲线比较以测定抗体浓度。所有三种浓度的IdeS(0.4、1.0、2.0mg/kg)消除或显著降低了抗Spk1衣壳IgG针对所有三种浓度(低、中和高)的IVIg的血清水平(图22)。
实施例18
Spk1(SEQ ID NO:1):
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Spk2(SEQ ID NO:2):
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
IdeS序列，其包括N端甲硫氨酸和信号序列(SEQ ID NO:3,NCBI参考序列号WP_010922160.1):
MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
成熟IdeS序列，其缺少N端甲硫氨酸和信号序列(GenBank登录号ADF13949.1).(SEQ ID NO:4):
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NOs:5-18是来自WO 2016/128558的表C的示例性IdeS多肽的序列。
SEQ ID NO:5:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:6:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKRGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:7:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:8:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLREHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELDEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:9:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELEEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:10:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEKNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN
SEQ ID NO:11:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKSELENGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:12:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLKEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELEEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:13:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN
SEQ ID NO:14:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSW
SEQ ID NO:15:
SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:16:
SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:17:
SVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTN
SEQ ID NO:18:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTNGGGHHHHHH
无乳链球菌的IgdE对人IgG1具有特异性(WO2017134274)(SEQ ID NO:19):
NQNNIQETNLVEKNSEDKFIQELNRYKTEIPNFKGFNVWILGDKGYYKNLINLEEIKNIQATLKKERNEEYVFVKLNGKIAHDTTVFLMNKKHKLLKNIEEFKTITQKRLTERGKFPYDTVHSTFEIKDENFIMERLKSSGLSMGKPVDYMGVNGIPIYTKTLSIDNKFAFENNSKDSSYSSNINISEDKIKENDQKILDLIVKSGANNQNLTDEEKVIAFTKYIGEITNYDNEAYRARNVDTEYYRASDLFSVTERKLAMCVGYSVTAARAFNIMGIPSYVVSGKSPQGISHAAVRAYYNRSWHIIDITASTYWKNGNYKTTYSDFIKEYCIDGYDVYDPAKTNNRFKVKYMESNEAFENWIHNNGSKSMLFINESAALKDKKPKDDFVPVTEKEKNELIDKYKKLLSQIPENTQNPGEKNIRDYLKNEYEEILKKDNLFEHEHAEFKESLNLNESFYLQLKKEEKKPSDNLKKEEKPRENSVKERETPAENNDFVSVTEKNNLIDKYKELLSKIPENTQNPGEKNIRNYLEKEYEELLQKDKLFKHEYTEFTKSLNLNETFYSQLKEGEMKLSENPEKGETNTN
假猪链球菌的IgdE降解人IgG1和猪IgG(WO2017134274)(SEQ ID NO:20):
RENENVRQLQSENKQMKAVNLQEFSEKLKGEIAENQQFHIFKLGLNNYYIGGVRINELSDLAKNHDFIMIDNRATHNKYGVPHIIIMNKDDVIVHNQEDYNKEMAELTFAGDKPIQSDSYLPQKKRIHALFEIGLDSNRRQLLNAAGLKTPENSVIELDTFKIYSHGLAVDNKYYDEYSHFNNNTNVNITKQRFTENDNLIHNLITTSTAKDQPTDRDKVKTFVMYVANHTIYDWNAANNAVSNISDVNYYLGSDLFSITERKKAMCVGFSTTAARAFNMLGIPAYVVEGKNAQGVDHATARVYYNGKWHTIDGTGFINGNRTRSTLYTESHFRSVGEDSYQLVGLNEDIPFDRNYMKIDKVYEEWAPKQKTADLLLVNKDKSLVGLDRVAYVEPVYVDKNRQDALTQIYKKLKETMESSSKKNPSSGGFSSLLGSASSDIAKLEGSSQLTQEEYDKIHRSMTSILTFFAQLDKDAAEAFEKGNDYKNYLATTKHAQ
IdeZ的完整序列可作为NCBI参考序列号WP 014622780.1(SEQ ID NO:21)获得。该序列包括个N端甲硫氨酸，随后是33个氨基酸的分泌信号序列。典型地除去N末端甲硫氨酸和信号序列(在N末端总共34个氨基酸)以形成成熟的IdeZ蛋白:
MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
没有来自完整序列N端的34个氨基酸的IdeZ序列(SEQ ID NO:22):
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
基于IdeZ的具有N末端部分的IdeS/Z杂合序列，没有N末端甲硫氨酸和信号序列(在N末端总共34个氨基酸)(SEQ ID NO:23):
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGDNMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPGLSARRIGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVSINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS
SEQ ID NOs:24-43对应于具有相对于SEQ ID NO:22的IdeZ的修饰的肽。
SEQ ID NO:24:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKEAIRTKDSQTNSQLFEYFRDKAFPYLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVKRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKEELTKGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLN
SEQ ID NO:25:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKTFNGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNEELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFKEKAFPNLSTRQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDFKEKGLKDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQQLS
SEQ ID NO:26:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:27:
SVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:28:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:29:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:30:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:31:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIINNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:32:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:33:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIIRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:34:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKEAIRTKDSQTNSQLFEYFRDKAFPYLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVKRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKEELTKGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLN
SEQ ID NO:35:
SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:36:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGADNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:37:
SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGADNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:38:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:39:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGENMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPYLSAKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS
SEQ ID NO:40:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGENMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSAKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKSELTNGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLN
SEQ ID NO:41:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKQELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAAGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTS
SEQ ID NO:42:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:43:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPGLSARRIGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVSINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS
来自化脓性链球菌的内切糖苷酶EndoS49的蛋白质序列显示于美国专利9,493,752中(SEQ ID NO:44):
MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQTGKTDQQVGAKLVQEIREGKRGPLYAGYFRTWHDRASTGIDGKQQHPENTMAEVPKEVDILFVFHDHTASDSPFWSELKDSYVHKLHQQGTALVQTIGVNELNGRTGLSKDYPDTPEGNKALAAAIVKAFVTDRGVDGLDIDIEHEFTNKRTPEEDARALNVFKEIAQLIGKNGSDKSKLLIMDTTLSVENNPIFKGIAEDLDYLLRQYYGSQGGEAEVDTINSDWNQYQNYIDASQFMIGFSFFEESASKGNLWFDVNEYDPNNPEKGKDIEGTRAKKYAEWQPSTGGLKAGIFSYAIDRDGVAHVPSTYKNRTSTNLQRHEVDNISHTDYTVSRKLKTLMTEDKRYDVIDQKDIPDPALREQIIQQVGQYKGDLERYNKTLVLTGDKIQNLKGLEKLSKLQKLELRQLSNVKEITPELLPESMKKDAELVMVGMTGLEKLNLSGLNRQTLDGIDVNSITHLTSFDISHNSLDLSEKSEDRKLLMTLMEQVSNHQKITVKNTAFENQKPKGYYPQTYDTKEGHYDVDNAEHDILTDFVFGTVTKRNTFIGDEEAFAIYKEGAVDGRQYVSKDYTYEAFRKDYKGYKVHLTASNLGETVTSKVTATTDETYLVDVSDGEKVVHHMKLNIGSGAIMMENLAKGAKVIGTSGDFEQAKKIFDGEKSDRFFTWGQTNWIAFDLGEINLAKEWRLFNAETNTEIKTDSSLNVAKGRLQILKDTTIDLEKMDIKNRKEYLSNDENWTDVAQMDDAKAIFNSKLSNVLSRYWRFCVDGGASSYYPQYTELQILGQRLSNDVANTLKD
来自化脓性链球菌的成熟内切糖苷酶S(EndoS)的蛋白质序列显示于美国专利8,889,128和9,707,279中(SEQ ID NO:45):
EEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK
包括来自化脓性链球菌的内切糖苷酶EndoS分泌信号的全序列(GenBank登录号AAK00850.1).(SEQ ID NO:46):
MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK
分离自化脓性链球菌AP1分离的EndoS的蛋白质序列，包括信号序列，描述于美国专利8,889,128和9,707,279中(SEQ ID NO:47):
MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK
具有增加的N末端甲硫氨酸的成熟IdeS序列(SEQ ID NO:48):
MDSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NOs:49-51是可以在本文公开的任何蛋白酶或糖苷酶的N-末端融合的信号序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49:
MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIA
SEQ ID NO:50
MRKRCYSTSAAVLAAVTLFALSVDRGVIA
SEQ ID NO:51
MRKRCYSTSAVVLAAVTLFALSVDRGVIA
编码SEQ ID NO:4,成熟IdeS的多核苷酸序列(SEQ ID NO:52):
gat agt ttt tct gct aat caa gag att aga tat tcg gaa gta aca cct tatcac gtt act tcc gtt tgg acc aaa gga gtt act cct cca gca aac ttc act caa ggtgaa gat gtt ttt cac gct cct tat gtt gct aac caa gga tgg tat gat att acc aaaaca ttc aat gga aaa gac gat ctt ctt tgc ggg gct gcc aca gca ggg aat atg cttcac tgg tgg ttc gat caa aac aaa gac caa att aaa cgt tat ttg gaa gag cat ccagaa aag caa aaa ata aac ttc aat ggc gaa cag atg ttt gac gta aaa gaa gct atcgac act aaa aac cac cag cta gat agt aaa tta ttt gaa tat ttt aaa gaa aaa gctttc cct tat cta tct act aaa cac cta gga gtt ttc cct gat cat gta att gat atgttc att aac ggc tac cgc ctt agt cta act aac cac ggt cca acg cca gta aaa gaaggt agt aaa gat ccc cga ggt ggt att ttt gac gcc gta ttt aca aga ggt gat caaagt aag cta ttg aca agt cgt cat gat ttt aaa gaa aaa aat ctc aaa gaa atc agtgat ctc att aag aaa gag tta acc gaa ggc aag gct cta ggc cta tca cac acc tacgct aac gta cgc atc aac cat gtt ata aac ctg tgg gga gct gac ttt gat tct aacggg aac ctt aaa gct att tat gta aca gac tct gat agt aat gca tct att ggt atgaag aaa tac ttt gtt ggt gtt aat tcc gct gga aaa gta gct att tct gct aaa gaaata aaa gaa gat aat att ggt gct caa gta cta ggg tta ttt aca ctt tca aca gggcaa gat agt tgg aat cag acc aat taa
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其他参考文献、GenBank引用和ATCC引用均通过引用整体并入本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的特征是一类等同或相似特征的实例。
如本文所用，单数形式的“一个”、“和”和“该”包括复数参照对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种核酸”包括多种这样的核酸，提及“一种载体”包括多种这样的载体，并且提及“一种病毒”或“颗粒”包括多种这样的病毒/颗粒。
如本文所用，术语“约”是指在基础参数的10％以内的值(即，正负10％)。例如，“约1:10”表示1.1:10.1或0.9:9.9，而约5小时表示4.5小时或5.5小时，依此类推。在一串值开头的术语“约”通过10％修改每个值。
除非上下文另外明确指出，否则所有数值或数值范围包括这种范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及减少95％或更多包括95％、96％、97％、98％、99％、100％等，以及95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％等，96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％等，依此类推。因此，为了进一步说明，提及数值范围如“1-4”包括2、3以及1.1、1.2、1.3、1.4等，依此类推。例如，“1-4周”包括7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。
此外，提及数值范围如“0.01-10”包括0.011、0.012、0.013等，以及9.5、9.6、9.7、9.8、9.9等。例如，约“0.01mg/kg-约10mg/kg”受试者体重的剂量包括0.011mg/kg、0.012mg/kg、0.013mg/kg、0.014mg/kg、0.015mg/kg等，以及9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg等，依此类推。
提及具有大于(高于)或小于的整数分别包括大于或小于参考数字的任何数字。因此，例如，提及大于2包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等，依此类推。例如，“两次或多次”施用重组病毒载体、蛋白酶和/或糖苷酶包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。
此外，数值范围如“1-90”包括1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，以及81、82、83、84、85等，依此类推。例如，“约1分钟-约90天”包括1.1分钟、1.2分钟、1.3分钟、1.4分钟、1.5分钟等，以及1天、2天、3天、4天、5天……81天、82天、83天、84天、85天等，依此类推。
通常，本文使用肯定性语言来描述本发明的众多实施方案，以公开本发明。本发明还具体包括其中全部或部分排除特定主题的实施方案，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。例如，在本发明的某些实施方案中，排除材料和/或方法步骤。因此，即使本发明对于在本发明不包括的方面通常未在本文中进行表达，但是本发明未明确排除的方面仍公开于本文中。
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Claims (77)

1.一种治疗需要治疗由蛋白质功能或活性丧失引起的疾病的受试者的方法，包括：(a)向所述受试者施用重组病毒载体，其包含编码提供或补充蛋白质功能或活性的蛋白质或肽的异源多核苷酸；和(b)向所述受试者施用一定量的蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少结合所述重组病毒载体的抗体和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的效应子功能。
2.一种治疗需要治疗由蛋白质功能活性或表达增加引起的疾病的受试者的方法，包括：(a)向所述受试者施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体，所述异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少所述蛋白质功能、活性或表达的增加的核酸；和(b)向所述受试者施用蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少结合所述重组病毒载体的抗体的效应子功能。
3.一种治疗需要治疗由蛋白质功能或活性丧失引起的疾病的受试者的方法，包括：(a)向所述受试者施用蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少病毒载体结合抗体的效应子功能；和(b)向所述受试者施用重组病毒载体，其包含编码提供或补充所述蛋白质功能或活性的蛋白质或肽的异源多核苷酸。
4.一种治疗需要治疗由蛋白质功能活性或表达增加引起的疾病的受试者的方法，包括：(a)向所述受试者施用蛋白酶或糖苷酶，其有效降解或消化和/或抑制或减少病毒载体结合抗体的效应子功能；和(b)向所述受试者施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体，所述异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少所述蛋白质功能、活性或表达的增加的核酸。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)在进行步骤(a)之后约90天内进行。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包含半胱氨酸蛋白酶或硫醇蛋白酶。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包含来自化脓性链球菌、马链球菌或犬支原体的蛋白酶。
8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包含SEQ ID NO：3-18、23或48中任一所示的IdeS或其修饰的变体。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述糖苷酶包括内切糖苷酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述内切糖苷酶包含SEQ ID NO：44-47中任一所示的序列。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶降解或消化和/或抑制或减少人抗体的效应子功能。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述慢病毒载体包含抗体结合的包膜蛋白。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述AAV载体包含抗体结合的衣壳蛋白。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述AAV载体包含抗体结合的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
16.根据权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与选自下组的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有60％或更高序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
17.根据权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与选自下组的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有100％序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
18.根据权利要求1、3和5-17任一项所述的方法，其中所述受试者具有结合所述病毒载体的抗体。
19.根据权利要求1、3和5-17任一项所述的方法，其中所述受试者不存在结合病毒载体的抗体。
20.根据权利要求1、3和5-19任一项所述的方法，其中所述受试者具有结合由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的抗体。
21.根据权利要求1-20任一项所述的方法，其中所述抗体包含IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE。
22.根据权利要求1-21任一项所述的方法，进一步包括在进行步骤(a)之前、进行步骤(a)之后但进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后确定存在于所述受试者中的病毒载体结合抗体的存在、定量其量或效应子功能。
23.根据权利要求1-21任一项所述的方法，进一步包括在进行步骤(a)之前、进行步骤(a)之后但进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后分析来自所述受试者的生物样品中存在于所述样品中的病毒载体结合抗体的存在、量或效应子功能。
24.根据权利要求23所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品是血液制品。
25.根据权利要求1-24任一项所述的方法，其中所述方法导致所述病毒载体结合抗体减少20-50％、50-75％、75-90％、90-95％或95％或更多。
26.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1：100,000，其中在100,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
27.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:50,000，其中在50,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
28.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:10,000，其中在10,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
29.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:1,000，其中在1,000份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
30.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:100，其中在100份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
31.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:10，其中在10份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
32.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:5，其中在5份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
33.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:4，其中在4份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
34.根据权利要求23或24所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:3，其中在3份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
35.根据权利要求1-24任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:2，其中在2份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
36.根据权利要求1-24任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液制品中存在的所述病毒载体结合抗体小于约1:1，其中在1份缓冲液中稀释的1份所述生物样品或血液制品导致50％病毒载体中和。
37.根据权利要求1、3和5-36任一项所述的方法，进一步包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后确定结合由所述异源多核苷酸编码的所述多肽或肽的抗体的存在或定量其量。
38.根据权利要求2和4-36任一项所述的方法，进一步包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在进行步骤(a)和(b)之后确定结合所述核酸的抗体的存在或定量其量。
39.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约60天内进行。
40.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约45天内进行。
41.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约30天内进行。
42.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约21天内进行。
43.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约14天内进行。
44.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约7天内进行。
45.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约72小时内进行。
46.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约48小时内进行。
47.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约24小时内进行。
48.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约12小时内进行。
49.根据权利要求1-38任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约6小时内进行。
50.根据权利要求1-49任一项所述的方法，其中所述受试者患有肺部疾病(例如，囊性纤维化)、出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)、地中海贫血、血液疾病(例如，贫血)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、癫痫、溶酶体贮积病(例如天冬氨酰葡糖尿症、巴滕病、晚期婴儿神经元类脂褐质病2型(CLN2)、胱氨酸病、法布里病、高歇氏病I型、II型和III型、糖原贮积病II(庞贝病)、I型GM2-神经节病(Tay Sachs病)、II型GM2-神经节病(Sandhoff病)、粘膜脂溢性病I型(I和II型唾液酸病)、II型(I细胞病)、III型(假性Hurler病)和IV型、粘多糖贮积病(Hurler病和变种、Hunter、A、B、C、D型沙费利波、A和B型Morquio、Maroteaux-Lamy和Sly病)、A/B、C1和C2型Niemann-Pick病、以及I和II型Schindler病)、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁蓄积性疾病(例如，威尔逊氏病或Menkes病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或感染性病毒(例如乙肝和丙肝、HIV等)、细菌或真菌疾病。
51.根据权利要求1-49任一项所述的方法，其中所述受试者患有凝血障碍。
52.根据权利要求1-49任一项所述的方法，其中所述受试者患有血友病A、具有抑制性抗体的血友病A、血友病B、具有抑制性抗体的血友病B、任何凝血因子的缺乏症：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、von Willebrand因子、或组合的FV/FVIII缺乏症、地中海贫血、维生素K环氧还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。
53.根据权利要求1-49任一项所述的方法，其中所述疾病是贫血；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓形成剂(即FXa抑制剂)或血小板病(如Bernard Soulier综合征、Glanzmann血小板无力症或储存池缺乏症)相关的过度抗凝作用。
54.根据权利要求1或3-53任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生成抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素、聚集蛋白、netrin-1和netrin-2、肝细胞生长因子(HGF)、ephrins、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
55.根据权利要求1或3-53任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码选自下组的蛋白质：血小板生成素(TPO)、白介素(IL1至IL-36)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
56.根据权利要求1或3-53任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、血凝固(凝血)因子(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能性凝血因子的增加、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积病(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子、胰岛素样生长因子1或2、血小板源生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性生长因子、转化生长因子α和β、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、耐药蛋白、抑癌蛋白(例如p53、Rb、Wt-1、NF1、Von Hippel-Lindau(VHL)、腺瘤性息肉病(APC))、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性的肽或蛋白Tregitope或hCDR1、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护送蛋白1(Choroideremia)、LCA 5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(Gyrate Atrophy)、视黄酸松弛素1(X连锁性视网膜分裂症)、USH1C(Usher综合征1C)、X连锁性视网膜色素变性GTPase(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：视网膜色素变性)、DFNB1(联接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白、一种或多种用于基因组编辑的锌指核酸酶以及一种或多种用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
57.根据权利要求2、4-49任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码抑制性核酸。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述抑制性核酸选自下组：siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核酶和shRNA。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述抑制性核酸结合与多核苷酸重复疾病相关的基因、基因的转录物或基因的转录物，所述基因选自下组：亨廷顿蛋白(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩相关的基因(atrophin 1、ATN1)，在脊髓球肌萎缩症的X染色体上的雄激素受体、人Ataxin-1、-2、-3和-7、Cav2.1 P/Q电压依赖性钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8反向链(ATXN8OS)、脊髓小脑共济失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55 kDa调节亚基Bβ亚型、脆性X综合征的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性X相关性震颤/共济失调综合征的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性XE智力低下的FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2家庭成员2；肌强直性营养不良中的肌钙蛋白激酶(MT-PK)；弗雷德赖希共济失调中的Frataxin；肌萎缩性侧索硬化症中的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；与帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病发病机理相关的基因；载脂蛋白B(APOB)和原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中人类免疫缺陷病毒转录基因反式激活因子；HIV TAR、HIV TAR，HIV感染中人类免疫缺陷病毒反式激活因子响应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙肝病毒感染中的肝特异性microRNA(miR-122)；p53，急性肾损伤或移植物功能延迟肾移植或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为蛋白酶体亚基β9型(PSMB9)，转移性黑色素瘤；LMP7，也称为蛋白酶体亚基β8型(PSMB 8)，转移性黑色素瘤；MECL1也称为蛋白酶体亚基β10型(PSMB10)，转移性黑色素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的驱动蛋白纺锤体蛋白、慢性粒细胞白血病中的凋亡抑制性B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的polo样激酶1(PLK1)、丙肝感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素能受体，青光眼；RTP801/Redd1，在糖尿病性黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中也称为DNA损伤诱导转录物4蛋白；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新血管形成中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性甲亢的角蛋白6AN17K突变蛋白；流感感染中的甲型流感病毒基因组/基因序列；SARS感染中的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉病毒病毒基因组/基因序列；乙肝和丙肝感染中的乙肝和丙肝病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列；柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；基因的致病性等位基因沉默(等位基因特异性沉默)，如原发性肌张力障碍中的躯干蛋白A(TOR1A)、移植中特异的panI类和HLA等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
60.根据权利要求1、3或5-59任一项所述的方法，其中所述由异源多核苷酸编码的蛋白质包含基因编辑核酸酶。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述基因编辑核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)或转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述基因编辑核酸酶包含功能性II型CRISPR-Cas9。
63.根据权利要求1-62任一项所述的方法，其中所述步骤(a)和/或步骤(b)进行两次或更多次。
64.根据权利要求1-63任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
65.一种工具包，其中设置有：
(a)包含编码蛋白质或肽的异源多核苷酸的重组病毒载体；
(b)降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；和
(c)具有用于进行根据权利要求1-64任一项所述的方法的说明的标签，其中(a)和(b)在分开的或相同的容器中。
66.一种工具包，其中设置有：
(a)重组病毒载体，其包含被转录成抑制、降低或减少蛋白质表达的核酸的异源多核苷酸；
(b)降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；和
(c)具有用于进行根据权利要求1-64任一项所述的方法的说明的标签，其中(a)和(b)在分开的或相同的容器中。
67.免疫球蛋白G降解酶多肽，其用于在有需要的患者中治疗通过基因疗法载体治疗的疾病。
68.用于根据权利要求67所述的用途的免疫球蛋白G降解酶多肽，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或腺病毒载体。
69.用于根据权利要求68所述的用途的免疫球蛋白G降解酶多肽，其中所述载体是AAV载体，其包含选自下组的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV3、AAV3变体、AAV3B、AAV3B变体、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6变体、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVcy10、AAVrh10、AAVrh74、AAVdj、AAV-Anc80、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或AAV2i8。
70.用于根据权利要求67-69所述的用途的免疫球蛋白G降解酶多肽，其中所述免疫球蛋白G降解酶多肽包含SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列。
71.用于根据权利要求70所述的用途的免疫球蛋白G降解酶多肽，其中所述免疫球蛋白G降解酶多肽进一步包含SEQ ID NO：49-51中的任一非天然信号序列。
72.用于根据权利要求67-71所述的用途的免疫球蛋白G降解酶多肽，其中所述通过基因疗法载体治疗的疾病选自下组：增生性疾病(癌症、肿瘤、发育不良等)、Crigler-Najjar和代谢性疾病，例如肝脏的代谢性疾病、腓特烈共济失调、感染性疾病、成瘾(例如，烟草、酒精或毒品)、癫痫、Canavan病、肾上腺脑白质营养不良、病毒性疾病(例如，由乙肝或丙肝病毒、HIV、疱疹、逆转录病毒等引起)、遗传性疾病(囊性纤维化、营养不良性糖病、肌病，如杜氏肌病或肌营养不良症、肌小管肌病、血友病A、血友病B、镰状细胞贫血、镰状细胞病、范科尼贫血、糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、肌微管素肌病、运动神经元疾病，如脊髓性肌萎缩症(SMA)、脊髓小球肌萎缩症或Charcot-Marie-Tooth病、关节炎、严重的合并免疫缺陷(如RS-SCID、ADA-SCID或X-SCID)、Wiskott-Aldrich综合征、X连锁性血小板减少、X连锁先天性中性粒细胞减少症、慢性肉芽肿疾病等)、凝血因子缺乏症、心血管疾病(再狭窄、局部缺血、血脂异常、纯合子家族性高胆固醇血症等)、眼科疾病，如色素性视网膜炎、Leber先天性黑眼症、Leber遗传性视神经病变和Stargardt疾病；溶酶体贮积病，如圣菲利波综合症；高胆红素血症(例如I型或II型CN或吉尔伯特综合征)、Fabry病、糖原贮积病(例如GSDI、GSDII(庞贝病)、GSDIII、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和致命的先天性心脏糖原贮积病。
73.用于根据权利要求67-72所述的用途的免疫球蛋白G降解酶多肽，其中所述载体包含适于治疗权利要求72所述的疾病的治疗性多核苷酸。
74.编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列，其用于在有需要的患者中治疗通过基因疗法载体治疗的疾病中的用途。
75.包含编码免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列的表达载体，其用于在有需要的患者中治疗通过基因疗法载体治疗的疾病。
76.治疗组合物，其用于在有需要的患者中治疗通过基因疗法载体治疗的疾病，所述治疗组合物包含含有SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列的免疫球蛋白G降解酶多肽，或编码包含SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列的免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列，或包含编码包含SEQ ID NO：3-18、23或48中的任一序列的免疫球蛋白G降解酶多肽的核酸序列的表达载体。
77.一种治疗通过基因疗法载体治疗的疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的免疫球蛋白G降解酶多肽。
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