CN112680464A

CN112680464A - 一种单甲基砷和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN112680464A
Application number: CN202011439763.8A
Authority: CN
Inventors: 张隽; 赵方杰; 吴亦飞; 王子萍; 李小龙
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN112680464B

Abstract

本发明公开了一种单甲基砷氧化酶和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白质。该单甲基砷氧化酶和三价锑氧化酶基因arsV具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明的MAs(III)氧化酶基因arsV在砷敏感大肠杆菌AW3110中表达时，可显著提高大肠杆菌对MAs(III)的抗性。其编码产物单甲基砷氧化酶ArsV纯化后的酶在体外也具有氧化MAs(III)和三价锑(Sb(III))的活性。

Description

一种单甲基砷和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域和农业领域，涉及三价单甲基砷和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用。

背景技术

砷(As)是一种类金属元素。它是一种在环境中广泛存在的有毒、致癌性物质，可通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体，对人类健康有严重的危害。在美国环境署的有毒物质中名录中，砷是有害污染物清单的第1位。目前人类已知的砷化合物有二十余种，可分为无机砷和有机砷，常见的有机砷是甲基类砷，包括一甲基砷酸盐[MAs(V)]、二甲基砷酸盐[DMAs(V)]和三甲基砷氧化物[TMAs(V)O]，这三种形态的砷都有还原态，且还原态毒性更大。砷的毒性与其形态有着紧密的关系，As(III)毒性比As(V)高很多，因为As(III)可以与体内的巯基化合物及蛋白质等形成稳定的复合物，进而抑制其活性，导致中毒。

重金属生物修复是利用生物材料进行重金属治理的技术，而重金属抗性基因是生物修复的重要资源。基于基因改造的生物材料可以突破自然生物材料的性状限制，获得生物量、生长速度和修复效率的优化组合，来自微生物的重金属抗性基因已经在生物修复方面取得了重要的研究进展。研究人员将砷甲基化基因arsM在水稻，拟南芥中高效表达，转基因植物表现了高效修复砷污染土壤的潜力。虽然MAs(III)的毒性很强，严重威胁人类的生命健康，但一些微生物却对环境中MAs(III)表现出极强的抗性，并在砷的地球化学循环中扮演着重要的角色。因此了解微生物的重金属抗性机制，研究MAs(III)抗性相关的功能基因有助于我们从基因的水平上了解微生物对重金属的解毒机制，并发明新型的重金属污染修复方法。为环境中砷污染的生物修复提供理论基础和技术支持。

发明内容

发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种单甲基砷(MAs(III))和三价锑(Sb(III))氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种单甲基砷氧化酶基因arsV，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述的单甲基砷氧化酶基因arsV编码的单甲基砷氧化酶ArsV，其具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

用于扩增权利要求1所述单甲基砷氧化酶基因arsV的引物，它包括正向引物：5’-TCTGGCATATGATGGACCACACCCCCGATC-3’和反向引物5’-TCTGGCTCGAGTCCAATCGTTTCCAGTTCTTTTGG-3’。

含有上述的单甲基砷氧化酶基因arsV的生物材料也属于本发明保护的范围。所述的生物材料为表达盒、表达载体、细胞系或宿主菌。

上述的生物材料在氧化三价单甲基砷中的应用。

上述的单甲基砷氧化酶基因arsV在提高菌种对三价单甲基砷抗性中的应用。

上述的单甲基砷氧化酶ArsV在体外氧化三价单甲基砷中的应用。

申请人前期工作是以分离自汕头砷污染稻田土壤的砷氧化细菌粘着剑菌Ensiferadhaerens ST2(参见：Zhang,J.,Chai,C.-W.,ThomasArrigo,L.K.,Zhao,S.-C.,Kretzschmar,R.,Zhao,F.-J.,2020.Nitrite accumulation is required for microbialanaerobic iron oxidation,but not for arsenite oxidation,in two heterotrophicdenitrifiers.Environmental Science&Technology 54,4036-4045)为研究对象，通过基因组草图测序，以及砷代谢功能基因簇的比较基因组学研究。因此推测ArsV可能为粘着剑菌ST2中的三价单甲基砷氧化酶，并通过基因异源表达、生长氧化实验以及酶学实验等方法鉴定其MAs(III)和Sb(III)氧化的功能。

砷氧化细菌粘着剑菌Ensifer adhaerens ST2的生物材料保藏信息：分类命名为粘着剑菌ST2 Ensifer adhaerens ST2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间2019年12月31号，保藏编号CCTCC NO：M20191138。

本发明的有益效果：

本发明公开了一种单甲基砷氧化酶基因arsV及其编码的蛋白质。申请人前期研究发现，粘着剑菌ST2可以在好氧条件下氧化三价单甲基砷，氧化速率可以达到100％。粘着剑菌ST2体内的单甲基砷氧化酶基因arsV全长为1416bp，序列如SEQ ID NO.1所示，在砷敏感大肠杆菌AW3110中表达arsV时，可显著提高大肠杆菌AW3110对MA(III)的抗性。其编码产物单甲基砷氧化酶ArsV含471个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2，纯化后的酶在体外也具有氧化Sb(III)的活性，在氧化三价单甲基砷和三价锑中效果显著。

附图说明

图1为菌株ST2对3μM MAs(III)的氧化。

图2为arsV基因在不同菌株的砷抗性基因簇中的分布情况。

图3为arsV的异源表达提高了大肠杆菌对MAs(III)的抗性。

图4为AW3110(pET29a-arsV)对MAs(III)氧化特性研究。

图5为ArsV蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图6为ArsV对5μM MAs(III)的生物转化。

图7为ArsV对10μM Sb(III)的生物转化。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1好氧条件下菌株ST2三价单甲基砷氧化特性的研究

20*ST培养基组成为(g/L)：10g蛋白胨，1g酵母膏，2g的葡萄糖。培养基于110℃灭菌20分钟。向20*ST培养基中添加3μM MAs(III)。同时接种菌株ST2细菌悬浮液，于30℃，180rpm振荡培养，同时设置不加菌的对照，每组实验三个重复。于不同时间取培养液离心过滤，利用HPLC-ICP-MS测定溶液中砷的形态。实验结果表明菌株ST2在6小时内可以将3μMMAs(III)完全转化为MAs(V)(图1)。

实施例2三价单甲基砷氧化酶基因arsV的克隆及功能验证

2.1细菌基因组总DNA的提取和分析

2.1.1细菌基因组总DNA的提取

菌株ST2基因组总DNA采用高盐法进行提取，基因组总DNA溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于-20℃保藏。

2.1.2基因组草图测序及结果分析

细菌基因组测序要求样品OD值在1.8-2.0之间，浓度不低于30ng/μl。将准备好的足量的DNA样品于干冰保温下寄送至上海凌恩生物科技有限公司测序。

样品检测采用：1.浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；2.OD260:280和OD260:230检测方法：NanoDrop。

2.1.3基因组草图测序结果分析

基因组测序结果：在基因组预测分析结果中，检索砷抗性基因簇，找到1个注释为FAD依赖型的氧化还原酶的基因，在NCBI上比较分析该基因在不同来源的菌株的分布情况(图2)。

2.2三价单甲基砷氧化酶基因arsV的扩增及表达菌的构建

2.2.1三价单甲基砷氧化酶基因arsV的PCR扩增

以正向引物：5’-TCTGGCATATGATGGACCACACCCCCGATC-3’和反向引物5’-TCTGGCTC GAGTCCAATCGTTTCCAGTTCTTTTGG-3’为引物，用PCR从菌株ST2总DNA中扩增出单甲基砷氧化酶基因序列。

扩增体系：

PCR扩增程序：

a.95℃变性3min；

b.95℃变性1.5min，57℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

c.72℃延伸10min，冷却到室温。

2.2.2 arsV片段和pET29a(+)用Nde I和Xho I双酶切。

酶切体系：

在37℃水浴中，反应3h以上。酶切产物进行的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。将2.2.2的两个片段进行酶连，酶连产物转化砷敏感大肠杆菌AW3110和表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞获得ArsV重组表达菌株AW3110和表达宿主菌BL21(DE3)获得AW3110(pET29a-arsV)和BL21(pET29a-arsV)的表达菌株。

2.3 arsV赋予E coli AW3110三价单甲基砷的抗性和氧化功能

2.3.1 ars提高大肠杆菌对单甲基砷抗性的提高

将表达菌株AW3110(pET29a-arsV)按OD_600nm值0.05转接到20*ST培养基(含0.2％的葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中，同时添加0.3mM IPTG，以及不同浓度的MAs(III)(0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM和15μM)于30℃培养，同时设置含AW3110(pET29a)的对照，每组实验设置三个重复。培养6小时用紫外分光光度计在600nm处检测菌体的生长情况。实验结果表明，在砷敏感大肠杆菌中表达arsV时，可显著提高大肠杆菌对单甲基砷的抗性(图3)。

2.3.2 AW3110(pET29a-arsV)对三价单甲基砷的转化

将表达菌株AW3110(pET29a-arsV)在LB培养基(含50mg/L卡那霉素)中培养后，按OD_600nm值0.5转接到20*ST培养基(50mg/L卡那霉素)中，同时添加0.3mM IPTG和3μM MAs(III)于30℃培养，同时设置不加菌的对照，每组实验设置三个重复。指定时间取培养液过滤，通过HPLC-ICP-MS测定溶液中砷的形态。实验结果表明，菌株在90分钟内可以将MAs(III)完全转化为MAs(V)(图4)。

2.4三价单甲基砷氧化酶ArsV的表达、纯化和功能验证

BL21(pET29a-arsV)在LB培养基中培养至OD_600nm为0.6到0.8之间，加IPTG至浓度0.3mM，16℃过夜培养。离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎10分钟，离心，收集上清，用镍离子亲和层析柱对ArsV进行纯化，SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化效果，条带大小与理论预测的大小(50.8kDa)相一致(图5)。

2.5 ArsV的体外活性研究

酶活反应体系：25mM 1,3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷缓冲液(pH值7.0)，0.2μMNADPH，25μM FMN/FAD，0.6μM ArsV和5μM MAs(III)或者5μM Sb(III)，37℃反应并在指定取培养液过滤，通过HPLC-ICP-MS测定溶液中砷的形态。结果表明，纯化蛋白ArsV在30分钟内可以将MAs(III)完全转化为MAs(V)(图6)，氧化大约50％的Sb(III)(图7)。

SEQ ID NO.1

ATGGACCACACCCCCGATCTACCAGTCGCCGTCATTGGCGCGGGTCCGGTTGGACTTGCCGCAGCCGCCCACCTCCTGCAGCGCGGTCTGCAGCCCGTGGTATTCGAGCGTGGTGAGGGACCCGGTTCCTCACTGATCGAATGGGGACATGTTCGTGTCTTCTCGCCCTGGCAATACGTGTTGGACAAGGCGGCCCAGGCGCTGCTCGAAGACAGCGGCTGGATCCAGCCTGATCCCGATGCGCTCCCGACGGGAGCGGAGATCGTCGAACACTATCTTGCTCCCCTCGCCCGCCTCCCCAACGTCGCGCGGCACATCAAATACAATGCCTCCGTCAATTCCATCACCCGGCTGGGACTGGACAAGGTCGCCAGCGAAGGGCGTGACGACACTCCCTTCGTTGTTCGCTACACGGTCGACGGGGTCGAGCGAAAACTGACGGCACGCGCAGTTCTCGATGCTTCCGGGACCTGGCTGCGGCCGAACCCGATTGGCATCGACGGGCTTCCCGTTGCCGGAGAAAAGACGGAATCCGATAGCATCCGCTACGGCATCCCGGATGTGAGCGGCCGGGAAAAGAAGGACTACGCGGGCAGACGTGTTCTCGTGATCGGAGGCGGGCATTCGGCGATCAATGTCGTGCTTGCCTTGCTCGACCTACAGAAGGAAAGCAGAGGCACATCGATCATCTGGGCGTTGCGGCGCAACAAGATCGCCAAGCTGCTCGGGGGCGGCCTGAACGATCAGTTGCCGGCCCGAGGTGCGCTTGGCCTTGCCGCCAAGGACGCGATTGAAAGCGGCCGCTTGAAGCTGCTTGCCCCAATTTCGGTGGAATCGATAGAGCCCGAAGCGGATGCTTTGCGCGTCAACGCCGACGTCGCCGGTTCCCTGGAAGTCCTTGATGTCGACCGTATCATCGTCGCGACAGGCTTCCGCCCCGACCTTACGATCTTGAGTGAGCTGCGCATCGATGTCGACGCCGCGGTCGAATCTCCGCGCCAGCTTGCCCCGATGATCGATCCGAACCTCCACTCCTGTGGCACCGTCCCCCCGCATGGCGTTGACGAGCTTTCGCACAGCGAGCGCGACTTCTACATCGTCGGATCTAAGTCCTATGGCCGAGCGCCCACCTTCCTCATGGCAACCGGTTACGAGCAGGTGCGGTCCGTCGTCGCCGAACTCGCTGGCGACCCTGTCGCCGCGCGGCAAGTCCAACTCGTGCTTCCCGAGACCGGTGTTTGCAACGTGACGCTGCCTGGTGACACAGATGATGCAGAAACGGGTTGTTGCGGCGGCCCCGCCCCCGTCGCGGCGGACGCCTGCTGTGTCGCGGACGCCGCGGCGAAGTCCGAGGGTAAAACGGGATGCGGTTGCGGGACGCCAACTCAGCCAAAAGAACTGGAAACGATTGGATGA

SEQ ID NO.2

MDHTPDLPVAVIGAGPVGLAAAAHLLQRGLQPVVFERGEGPGSSLIEWGHVRVFSPWQYVLDKAAQALLEDSGWIQPDPDALPTGAEIVEHYLAPLARLPNVARHIKYNASVNSITRLGLDKVASEGRDDTPFVVRYTVDGVERKLTARAVLDASGTWLRPNPIGIDGLPVAGEKTESDSIRYGIPDVSGREKKDYAGRRVLVIGGGHSAINVVLALLDLQKESRGTSIIWALRRNKIAKLLGGGLNDQLPARGALGLAAKDAIESGRLKLLAPISVESIEPEADALRVNADVAGSLEVLDVDRIIVATGFRPDLTILSELRIDVDAAVESPRQLAPMIDPNLHSCGTVPPHGVDELSHSERDFYIVGSKSYGRAPTFLMATGYEQVRSVVAELAGDPVAARQVQLVLPETGVCNVTLPGDTDDAETGCCGGPAPVAADACCVADAAAKSEGKTGCGCGTPTQPKELETIG

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种单甲基砷和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 粘着剑菌( Ensifer adhaerens)

<400> 1

atggaccaca cccccgatct accagtcgcc gtcattggcg cgggtccggt tggacttgcc 60

gcagccgccc acctcctgca gcgcggtctg cagcccgtgg tattcgagcg tggtgaggga 120

cccggttcct cactgatcga atggggacat gttcgtgtct tctcgccctg gcaatacgtg 180

ttggacaagg cggcccaggc gctgctcgaa gacagcggct ggatccagcc tgatcccgat 240

gcgctcccga cgggagcgga gatcgtcgaa cactatcttg ctcccctcgc ccgcctcccc 300

aacgtcgcgc ggcacatcaa atacaatgcc tccgtcaatt ccatcacccg gctgggactg 360

gacaaggtcg ccagcgaagg gcgtgacgac actcccttcg ttgttcgcta cacggtcgac 420

ggggtcgagc gaaaactgac ggcacgcgca gttctcgatg cttccgggac ctggctgcgg 480

ccgaacccga ttggcatcga cgggcttccc gttgccggag aaaagacgga atccgatagc 540

atccgctacg gcatcccgga tgtgagcggc cgggaaaaga aggactacgc gggcagacgt 600

gttctcgtga tcggaggcgg gcattcggcg atcaatgtcg tgcttgcctt gctcgaccta 660

cagaaggaaa gcagaggcac atcgatcatc tgggcgttgc ggcgcaacaa gatcgccaag 720

ctgctcgggg gcggcctgaa cgatcagttg ccggcccgag gtgcgcttgg ccttgccgcc 780

aaggacgcga ttgaaagcgg ccgcttgaag ctgcttgccc caatttcggt ggaatcgata 840

gagcccgaag cggatgcttt gcgcgtcaac gccgacgtcg ccggttccct ggaagtcctt 900

gatgtcgacc gtatcatcgt cgcgacaggc ttccgccccg accttacgat cttgagtgag 960

ctgcgcatcg atgtcgacgc cgcggtcgaa tctccgcgcc agcttgcccc gatgatcgat 1020

ccgaacctcc actcctgtgg caccgtcccc ccgcatggcg ttgacgagct ttcgcacagc 1080

gagcgcgact tctacatcgt cggatctaag tcctatggcc gagcgcccac cttcctcatg 1140

gcaaccggtt acgagcaggt gcggtccgtc gtcgccgaac tcgctggcga ccctgtcgcc 1200

gcgcggcaag tccaactcgt gcttcccgag accggtgttt gcaacgtgac gctgcctggt 1260

gacacagatg atgcagaaac gggttgttgc ggcggccccg cccccgtcgc ggcggacgcc 1320

tgctgtgtcg cggacgccgc ggcgaagtcc gagggtaaaa cgggatgcgg ttgcgggacg 1380

ccaactcagc caaaagaact ggaaacgatt ggatga 1416

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 粘着剑菌( Ensifer adhaerens)

<400> 2

Met Asp His Thr Pro Asp Leu Pro Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Pro

1 5 10 15

Val Gly Leu Ala Ala Ala Ala His Leu Leu Gln Arg Gly Leu Gln Pro

20 25 30

Val Val Phe Glu Arg Gly Glu Gly Pro Gly Ser Ser Leu Ile Glu Trp

35 40 45

Gly His Val Arg Val Phe Ser Pro Trp Gln Tyr Val Leu Asp Lys Ala

50 55 60

Ala Gln Ala Leu Leu Glu Asp Ser Gly Trp Ile Gln Pro Asp Pro Asp

65 70 75 80

Ala Leu Pro Thr Gly Ala Glu Ile Val Glu His Tyr Leu Ala Pro Leu

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Asn Val Ala Arg His Ile Lys Tyr Asn Ala Ser Val

100 105 110

Asn Ser Ile Thr Arg Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Ser Glu Gly Arg

115 120 125

Asp Asp Thr Pro Phe Val Val Arg Tyr Thr Val Asp Gly Val Glu Arg

130 135 140

Lys Leu Thr Ala Arg Ala Val Leu Asp Ala Ser Gly Thr Trp Leu Arg

145 150 155 160

Pro Asn Pro Ile Gly Ile Asp Gly Leu Pro Val Ala Gly Glu Lys Thr

165 170 175

Glu Ser Asp Ser Ile Arg Tyr Gly Ile Pro Asp Val Ser Gly Arg Glu

180 185 190

Lys Lys Asp Tyr Ala Gly Arg Arg Val Leu Val Ile Gly Gly Gly His

195 200 205

Ser Ala Ile Asn Val Val Leu Ala Leu Leu Asp Leu Gln Lys Glu Ser

210 215 220

Arg Gly Thr Ser Ile Ile Trp Ala Leu Arg Arg Asn Lys Ile Ala Lys

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Gly Leu Asn Asp Gln Leu Pro Ala Arg Gly Ala Leu

245 250 255

Gly Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ile Glu Ser Gly Arg Leu Lys Leu Leu

260 265 270

Ala Pro Ile Ser Val Glu Ser Ile Glu Pro Glu Ala Asp Ala Leu Arg

275 280 285

Val Asn Ala Asp Val Ala Gly Ser Leu Glu Val Leu Asp Val Asp Arg

290 295 300

Ile Ile Val Ala Thr Gly Phe Arg Pro Asp Leu Thr Ile Leu Ser Glu

305 310 315 320

Leu Arg Ile Asp Val Asp Ala Ala Val Glu Ser Pro Arg Gln Leu Ala

325 330 335

Pro Met Ile Asp Pro Asn Leu His Ser Cys Gly Thr Val Pro Pro His

340 345 350

Gly Val Asp Glu Leu Ser His Ser Glu Arg Asp Phe Tyr Ile Val Gly

355 360 365

Ser Lys Ser Tyr Gly Arg Ala Pro Thr Phe Leu Met Ala Thr Gly Tyr

370 375 380

Glu Gln Val Arg Ser Val Val Ala Glu Leu Ala Gly Asp Pro Val Ala

385 390 395 400

Ala Arg Gln Val Gln Leu Val Leu Pro Glu Thr Gly Val Cys Asn Val

405 410 415

Thr Leu Pro Gly Asp Thr Asp Asp Ala Glu Thr Gly Cys Cys Gly Gly

420 425 430

Pro Ala Pro Val Ala Ala Asp Ala Cys Cys Val Ala Asp Ala Ala Ala

435 440 445

Lys Ser Glu Gly Lys Thr Gly Cys Gly Cys Gly Thr Pro Thr Gln Pro

450 455 460

Lys Glu Leu Glu Thr Ile Gly

465 470

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctggcatat gatggaccac acccccgatc 30

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctggctcga gtccaatcgt ttccagttct tttgg 35

Claims

1.一种单甲基砷氧化酶基因arsV，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的单甲基砷氧化酶基因arsV编码的单甲基砷氧化酶ArsV，其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.用于扩增权利要求1所述单甲基砷氧化酶基因arsV的引物，其特征在于，它包括正向引物：5’-TCTGGCATATGATGGACCACACCCCCGATC-3’和反向引物5’-TCTGGCTCGAGTCCAATCGTTTCCAGTTCTTTTGG-3’。

4.含有权利要求1所述的单甲基砷氧化酶基因arsV的生物材料。

5.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述的生物材料为表达载体、细胞系或宿主菌。

6.权利要求1所述的单甲基砷氧化酶基因arsV在提高菌种对三价单甲基砷抗性中的应用。

7.权利要求2所述的单甲基砷氧化酶ArsV在体外氧化三价单甲基砷中的应用。

8.权利要求3所述的生物材料在氧化三价单甲基砷中的应用。