CN112680314A - 核酸分析装置及核酸定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸分析装置，用以定量样品试剂中的核酸片段的数量。核酸分析装置包括电路板、感测芯片、微孔阵列、温度控制元件以及微流体元件。感测芯片配置于电路板上且包括多个图像传感器。微孔阵列配置于感测芯片上且包括多个微孔。各微孔对应于一个或多个图像传感器。温度控制元件配置于电路板上。微流体元件配置于微孔阵列上且包括微流道。微流道与各微孔相连通。微流体元件与感测芯片分别位于微孔阵列的相对两侧。另外，提供一种使用核酸分析装置的核酸定量方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析装置及定量方法，尤其涉及一种核酸分析装置及核酸定量方法。
背景技术
在目前的核酸定量的技术中，相较于使用即时定量聚合酶连锁反应(real-timequantitative polymerase chain reaction)的相对定量的方法，数字聚合酶链锁反应(digital polymerase chain reaction)则可提供较近似绝对定量的方式。
然而，由于数字聚合酶链锁反应的定量方法仍需利用泊松分布(Poissondistribution)原理来推测出核酸的数量，因此，数字聚合酶链锁反应的定量方法还不能算是绝对定量。此外，数字聚合酶链锁反应的定量方法还有其缺点，例如：通常需进行32次或32次以上的聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction，PCR)并耗时约2.5～4小时。
发明内容
本发明提供一种核酸分析装置及核酸定量方法，可具有较高的灵敏度、较少的检测时间以及绝对定量的效果。
本发明的核酸分析装置可用以定量样品试剂中的核酸片段的数量。核酸分析装置包括电路板、感测芯片、微孔阵列、温度控制元件以及微流体元件。感测芯片配置于电路板上且包括多个图像传感器。微孔阵列配置于感测芯片上且包括多个微孔。各微孔对应于一个或多个图像传感器。温度控制元件配置于电路板上。微流体元件配置于微孔阵列上且包括微流道。微流道与各微孔相连通。微流体元件与感测芯片分别位于微孔阵列的相对两侧。
在本发明的一实施例中，上述的核酸分析装置还包括滤波器以及导线。滤波器配置于感测芯片上且位于微孔阵列与感测芯片之间。导线配置于电路板上。导线可用以电性连接感测芯片与电路板。
在本发明的一实施例中，上述的温度控制元件包括多个加热元件。加热元件围绕微孔阵列的各微孔，以调控各微孔的温度。
在本发明的一实施例中，上述的微孔的数量大于样品试剂中的核酸片段的数量。
在本发明的一实施例中，上述的各微孔内的核酸片段的数量为0至N个，且N为整数。
在本发明的一实施例中，上述的各微孔与对应的图像传感器之间的距离小于等于10微米。
本发明的核酸定量方法可用以定量样品试剂中的核酸片段的数量。核酸定量方法包括以下步骤。首先，提供上述的核酸分析装置。接着，将样品试剂及反应试剂分装至微孔阵列的各微孔内，且反应试剂包括荧光标记。而后，对样品试剂进行预定次数的聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction，PCR)，以使荧光标记黏合至核酸片段并释放出荧光物质。然后，检测各微孔内的荧光物质的荧光信号强度。然后，根据检测到的荧光信号强度，判断各微孔内的核酸片段的数量。最后，加总各微孔内的核酸片段的数量，以得到样品试剂中的核酸片段的数量。
在本发明的一实施例中，上述的微流体元件更包括连通微流道的开口。将样品试剂及反应试剂分装至微孔阵列的各微孔内的步骤包括以下步骤。分别将样品试剂及反应试剂注入至开口内。样品试剂及反应试剂沿着微流体元件的微流道流入至微孔阵列的各微孔内。
在本发明的一实施例中，上述对样品试剂进行预定次数的聚合酶链锁反应的步骤包括以下步骤。利用温度控制元件来调控微孔的温度，以使微孔的温度在45℃至95℃之间循环或使微孔的温度维持在固定温度，以进行聚合酶链锁反应。
在本发明的一实施例中，上述检测各微孔内的荧光物质的荧光信号强度的步骤包括以下步骤。利用各微孔对应的一个或多个图像传感器，独立地读取微孔内的荧光物质的荧光信号强度。
在本发明的一实施例中，上述根据检测到的荧光信号强度判断各微孔内的核酸片段的数量的步骤包括以下步骤。首先，将检测到的荧光信号强度由低到高排序。接着，将荧光信号强度最低的微孔内的核酸片段的数量表示为1个，且随着排序越高，依序使对应的微孔内的核酸片段的数量增加1个。最后，将检测不到荧光信号强度的微孔内的核酸片段的数量表示为0个。
基于上述，在本实施例的核酸分析装置及核酸定量方法中，核酸分析装置包括感测芯片、微孔阵列、温度控制元件以及微流体元件。通过微流体元件的配置，可使样品试剂平均地分装于微孔阵列的各微孔内。通过感测芯片的配置，可提高样品检测的灵敏度，进而可减少检测时间。此外，由于可根据检测到的荧光信号强度来判断各微孔内的核酸片段的数量，因而使得本实施例提供的核酸定量方法具有可绝对定量的效果。
附图说明
图1A示出为本发明一实施例的核酸分析装置的上视示意图；
图1B示出为图1A的核酸分析装置沿剖面线A-A’的剖面示意图；
图2示出为本发明另一实施例的核酸分析装置的剖面示意图；
图3示出为本发明一实施例的核酸定量方法的流程图；
图4示出为本发明一实验例中，核酸片段于微孔阵列中的分布情形。
附图标号说明：
10，10a：核酸分析装置
110：电路板
112：接合垫
120：感测芯片
122：图像传感器
124：接合垫
130，130a：微孔阵列
132，132a：微孔
140：温度控制元件
142：加热元件
150：微流体元件
152：微流道
154：第一开口
156：第二开口
158：封盖
159：封装胶体
160：样品试剂
162：核酸片段
164：反应试剂
166：荧光标记
170：滤波器
172：吸收型滤光片
174：干涉型滤光片
180：导线
D：距离
S210、S220、S230、S240、S250、S260：步骤
具体实施方式
图1A示出为本发明一实施例的核酸分析装置的立体示意图。为了附图清楚及方便说明，图1A省略示出了若干元件，例如微流体元件150等。图1B示出为图1A的核酸分析装置沿剖面线A-A’的剖面示意图。请同时参照图1A与图1B，本实施例的核酸分析装置10包括电路板110、感测芯片120、微孔阵列130、温度控制元件140以及微流体元件150。在本实施例中，电路板110可包括接合垫112。接合垫112可与外部的电子元件电性连接，并将核酸分析装置10所检测得到的信号输出至外部的电子元件(未示出)。
此外，在本实施例中，核酸分析装置10可用以定量样品试剂160中的核酸片段162的数量。
感测芯片120配置于电路板110上，且感测芯片120包括像素阵列以及多个接合垫124。在本实施例中，像素阵列例如是包括368×184、1024×1024或4096×3072个像素，但不以此为限。每个像素包括图像传感器122，且图像传感器122可例如是以感光二极管(Photodiode)作为感测光信号的元件，并可将光信号转换成电信号而输出成可读取的模式。在一些实施例中，图像传感器122可例如是CMOS(Complementary Metal-OxideSemiconductor)图像传感器或CCD(Charge Coupled Device)图像传感器，但不以此为限。在本实施例中，感测芯片120的材料可包括硅，但不以此为限。多个图像传感器122
微孔阵列130配置于感测芯片120上，且微孔阵列130包括多个微孔132。在本实施例中，虽然图1A示意地示出微孔阵列130中的微孔132是以4×4的矩阵方式排列且微孔132的数量为16个，但本发明并不对微孔132的排列方式及其数量加以限制。也就是说，在一些实施例中，微孔阵列中的微孔也可以例如是以12×8、24×16或其他的矩阵方式进行排列，且微孔的数量也可以例如是96个、384个或其他的数量。在本实施例中，各微孔132对应于一个像素(即图像传感器122)，但不以此为限。也就是说，在其他实施例中，各微孔132也可以对应于二个像素(即图像传感器122)，如图2所示。在一些实施例中，各微孔也可以对应于二个以上的像素(即图像传感器)(未示出)。举例来说，当感测芯片120有368×184个像素时，则至少要有67712个可对应的微孔132。在本实施例中，图像传感器122可用于感测微孔132内产生的荧光信号。此外，在本实施例中，微孔阵列130的材质例如是硅或铝，但不以此为限，只要为不透光且不会与生物分子及试剂反应的材质即可。所述生物分子及试剂例如是包括核酸、酵素、核苷三磷酸等试剂所含相关参与反应物质，但不以此为限。在一些实施例中，微孔阵列130的微孔132例如是以深反应离子式蚀刻(Deep reactive-ion etching，DRIE)制程对硅基板所挖出来的孔洞。
请再参照图1A与图1B，在本实施例中，微孔132的数量例如是大于样品试剂160中的核酸片段162的数量，如此一来可避免当样品试剂160平均地分装于各微孔132之后，各微孔132内有超过1个核酸片段162的情形发生。然而，在一些实施例中，虽然微孔132的数量大于样品试剂160中的核酸片段162的数量，但依据泊松分布(Poisson distribution)原理，当样品试剂160平均地分装于各微孔132之后，各微孔132内的核酸片段162的数量也可能为0至N个，且N为整数。
此外，在本实施例中，由于各微孔132与对应的图像传感器122之间的距离D例如是小于等于10微米，使得图像传感器122对微孔132内的荧光信号更佳灵敏。具体来说，由于图像传感器122能接收的光子数目与距离D的平方成反比，其中所述距离D也是微孔132内的荧光信号与对应的图像传感器122之间的距离。因此，相较于现有的微孔与图像传感器之间的距离为10厘米或10厘米以上，在相同感测面积的情况下，本实施例的图像传感器122能接收的光子数目为现有的图像传感器能接收的光子数目的108倍以上。换言之，相较于现有的核酸分析装置，本实施例的核酸分析装置10可检测得到较低的荧光信号强度，即本实施例的核酸分析装置10可检测的检测极限较低且灵敏度较高。
在本实施例中，温度控制元件140配置于电路板110上。温度控制元件140可包括多个加热元件142。加热元件142围绕微孔阵列130的各微孔132，以调控各微孔132的温度。在一些实施例中，温度控制元件140的加热元件142可以交错排列的方式分布在各微孔132的四周，以均匀且快速地调控各微孔132的温度，进而使各微孔132的内的样品试剂160可均匀且快速地达到反应的温度。
在本实施例中，微流体元件150包括微流道152、第一开口154、第二开口156以及封盖158。微流体元件150配置于微孔阵列130上。微流体元件150与感测芯片120分别位于微孔阵列130的相对两侧。详细来说，在本实施例中，将封盖158、封装胶体159以及微孔阵列130组立后，可定义出一容置空间(即微流道152)。也就是说，微流道152位于封盖158、封装胶体159以及微孔阵列130之间。第一开口154与第二开口156为封盖158上的开口，可分别作为注入样品试剂160的入口与出口。此外，由于第一开口154与第二开口156分别与微流道152相连通，且微流道152与微孔阵列130的各微孔132相连通，因此，从第一开口154注入的样品试剂160可直接流入到微流道152中，接着，使样品试剂160可沿着微流道152而平均地分装于各微孔132内。
在本实施例中，核酸分析装置10可还包括滤波器170。滤波器170配置于感测芯片120上，且滤波器170位于微孔阵列130与感测芯片120之间。由于感测芯片120的图像传感器122可皆收任何来自微孔132内的光信号，因此，可通过滤波器170的设置将不要感测的光波段(例如：激发光)滤除，并使欲检测的特定光波段通过所述滤波器170并被图像传感器122感测。因此，在本实施例中，滤波器170的设置可用来提高信噪比(S/N ratio)。在一些实施例中，若欲检测所有来自微孔132内的光信号且没有其他的噪音干扰时，也可不需设置滤波器170。在一些实施例中，滤波器170可包括吸收型滤光片(absorption filter)172以及干涉型滤光片(interference filter)174。吸收型滤光片172例如是有滤光效果的镜片，具有吸收光谱的特性。干涉型滤光片174可对光线产生干涉效应，以使所欲检测的波长范围的光线通过。
在本实施例中，核酸分析装置10可还包括导线180。导线180配置于电路板110上。导线180可用以电性连接感测芯片120的接合垫124与电路板110的接合垫112，以将感测芯片120所检测得到的信号通过电路板110的接合垫112输出至外部的电子元件。
简言之，在本实施例的核酸分析装置10中，可利用微流体元件150将样品试剂160平均地分装于微孔阵列130的各微孔132内，以使各微孔132内有不会有超过1个核酸片段162的情形发生。通过将感测芯片120对应于各微孔132的配置，可提高样品试剂160检测的灵敏度，进而可减少检测时间。
图3示出为本发明一实施例的核酸定量方法的流程图。请同时参照图1A、图1B以及图3，本实施例的核酸定量方法可用以定量样品试剂160中的核酸片段162的数量。在本实施例的核酸定量方法中，首先，进行步骤S210，提供核酸分析装置10。核酸分析装置10包括电路板110、感测芯片120、微孔阵列130、温度控制元件140以及微流体元件150。
接着，进行步骤S220，分别将样品试剂160及反应试剂164平均地分装至微孔阵列130的各微孔132内。详细来说，在本实施例中，首先，将混合均匀的样品试剂160(或混合均匀的反应试剂164)注入至第一开口154内，以使样品试剂160(或反应试剂164)从第一开口154流入至与第一开口154连通的微流道152。接着，使样品试剂160(或反应试剂164)沿着微流道152流入至与微流道152连通的各微孔132内，以使样品试剂160(或反应试剂164)可平均地分装至各微孔132内。在一些实施例中，在将样品试剂160及反应试剂164分装至各微孔132内之后，还可再于第一开口154加入矿物油，以使矿物油覆盖微流道152内的微孔阵列130，以避免微孔132间试剂的互相干扰以及蒸发。在本实施例中，反应试剂164包括荧光标记166、聚合酶、引子、缓冲液等其中，荧光标记166包括荧光物质。在本实施例中，荧光标记166可黏合至核酸片段162的黏合处，且荧光标记166不会发荧光。只有当新合成的DNA复制到黏合处时，才会使荧光标记166中的荧光物质释放，且所述荧光物质则可被激发而发出荧光信号。
而后，进行步骤S230，对样品试剂160进行预定次数的聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction，PCR)，以使荧光标记166黏合至核酸片段162并释放出荧光物质。详细来说，在本实施例中，可利用温度控制元件140来调控微孔132的温度，例如是使用加热元件142对微孔132加热，以使微孔132的温度在45℃至95℃之间循环，或使微孔132的温度维持在固定温度(例如是60℃，但不以此为限)，以进行聚合酶链锁反应。此外，温度控制元件140还可包括致冷芯片(未示出)，以达到快速降温的效果。在本实施例中，预定次数例如是n次，其中n为整数，n大于等于1，且n小于32。在本实施例中，当进行第1次的聚合酶链锁反应时，即可释放出荧光物质；而之后每增加1次的聚合酶链锁反应时，则可以倍数的方式增加所释放的荧光物质。
然后，进行步骤S240，检测各微孔132内的荧光物质的荧光信号强度。详细来说，在本实施例中，在每1次的聚合酶链锁反应之后，皆可利用各微孔132所对应的一个图像传感器122(或多个图像传感器122)来独立地读取所述微孔132内的荧光物质的荧光信号强度。也就是说，每个微孔132对应的图像传感器122可独立地检测所述微孔132内的荧光物质的荧光信号强度。此外，在一些实施例中，当每个微孔132所对应的图像传感器122为二个以上时，所述微孔132所对应的的每个图像传感器122也可独立地检测不同的荧光信号。
然后，进行步骤S250，根据检测到的荧光信号强度，判断各微孔132内的核酸片段162的数量。详细来说，在本实施例中，进行预定次数的聚合酶链锁反应之后，应可在不同微孔132检测到不同强度的荧光信号，且不同强度的荧光信号之间有倍数的关系。接着，将检测到的荧光信号强度由低到高排序时，可分类为1倍、2倍、3倍或4倍的荧光信号强度。此外，由于当微孔132内的核酸片段162越多时，经由聚合酶链锁反应之后所得到的荧光信号强度则越高。因此，将荧光信号强度最低(即1倍的荧光信号强度)的微孔132内的核酸片段162的数量表示为1个，且随着排序越高(即2倍、3倍、4倍的荧光信号强度)，依序使对应的微孔132内的核酸片段162的数量增加1个。举例来说，在检测到有1倍的荧光信号强度的微孔132内应有1个核酸片段162；在检测到有2倍的荧光信号强度的微孔132内应有2个核酸片段162；在检测到有3倍的荧光信号强度的微孔132内应有3个核酸片段162；在检测到有4倍的荧光信号强度的微孔132内应有4个核酸片段162；而检测不到有荧光信号强度的微孔132内则应有0个核酸片段162。换言之，在本实施例中，可根据不同微孔132之间的荧光信号强度的相对倍数关系来判断各微孔132内的核酸片段162的数量。
最后，进行步骤S260，加总各微孔132内的核酸片段162的数量，以得到样品试剂160中的核酸片段162的数量。此时，已定量完成样品试剂160中的核酸片段162的数量，且所述数量应为样品试剂160中的核酸片段162的绝对数量。
简言之，在本实施例的核酸定量方法中，由于可根据不同微孔132之间的荧光信号强度的相对倍数关系来判断各微孔132内的核酸片段162的数量，因而使得本实施例提供的核酸定量方法具有可绝对定量的效果。
[实验例1]
图4示出为本发明一实验例中，核酸片段于微孔阵列中的分布情形。为了附图清楚及方便说明，图4省略示出了核酸分析装置10a的若干元件。
请参照图4，本实施例的核酸分析装置10a与图1B的核酸分析装置10相似，而二者之间的主要差异之处在于：核酸分析装置10a的微孔阵列130a中的微孔132a是以8×4的矩阵方式排列，且微孔132的数量为32个，如图4所示。
依据泊松分布原理，当样品试剂平均地分装于各微孔132a之后，其分布情形如图4所示。举例来说，各微孔132a内的核酸片段的数量可能为0至4个的机率较高，但也可能有5、6、7个或7个以上，只是5、6、7个或7个以上的机率几乎接近0，故不列举。
[实验例2]
实例显示分别将含有不同核酸片段数量的样品试剂A、B、C、D、E装填至含有20000个微孔阵列的芯片中。所述微孔阵列有20000个微孔，且所述样品试剂A、B、C、D、E的核酸片段的总数量皆小于所述微孔阵列的微孔数。根据柏松分布可得到不同浓度的样品试剂对于芯片微孔所能装填核酸片段数目的分布状况，其结果如表1所示，此表只列举前最高机率的分布情况，即核酸片段数量0、1、2、3、4个的分布情况，而由于5个以上的数目的机率已经趋近于零，所以不列举。
表1
*λ可视为浓度，或者是数学期望值，也就是每个微孔出现一个核酸片段的机率。
由表1的结果可知，在不考虑0个核酸片段的分布情况下，当样品试剂A、B、C、D、E分装后，大部分的微孔只会有1个核酸片段，且没有或只有少数的微孔会有2个或2个以上的核酸片段。
综上所述，在本实施例的核酸分析装置及核酸定量方法中，核酸分析装置包括感测芯片、微孔阵列、温度控制元件以及微流体元件。通过微流体元件的配置，可使样品试剂平均地分装于微孔阵列的各微孔内。通过感测芯片的配置，可提高样品检测的灵敏度，进而可减少检测时间。此外，由于可根据荧光信号强度达到阀值时所对应的聚合酶链锁反应的次数来判断各微孔内的核酸片段的数量，因而使得本实施例提供的核酸定量方法具有可绝对定量的效果。
Claims (11)
1.一种核酸分析装置，用以定量样品试剂中的核酸片段的数量，其特征在于，包括：
电路板；
感测芯片，配置于所述电路板上，包括多个图像传感器；
微孔阵列，配置于所述感测芯片上，包括多个微孔，其中各所述微孔对应于一个或多个所述图像传感器；
温度控制元件，配置于所述电路板上；以及
微流体元件，配置于所述微孔阵列上，包括微流道，其中所述微流道与各所述微孔相连通，且所述微流体元件与所述感测芯片分别位于所述微孔阵列的相对两侧。
2.根据权利要求1所述的核酸分析装置，其特征在于，还包括：
滤波器，配置于所述感测芯片上，且位于所述微孔阵列与所述感测芯片之间；以及
导线，配置于所述电路板上，用以电性连接所述感测芯片与所述电路板。
3.根据权利要求1所述的核酸分析装置，其特征在于，所述温度控制元件包括多个加热元件，且所述多个加热元件围绕所述微孔阵列的各所述微孔，以调控各所述微孔的温度。
4.根据权利要求1所述的核酸分析装置，其特征在于，所述多个微孔的数量大于所述样品试剂中的所述核酸片段的数量。
5.根据权利要求1所述的核酸分析装置，其特征在于，各所述微孔内的所述核酸片段的数量为0至N个，且N为整数。
6.根据权利要求1所述的核酸分析装置，其特征在于，各所述微孔与对应的所述图像传感器之间的距离小于等于10微米。
7.一种核酸定量方法，用以定量样品试剂中的核酸片段的数量，其特征在于，包括：
提供如权利要求1所述的核酸分析装置；
将所述样品试剂及反应试剂分装至所述微孔阵列的各所述微孔内，其中所述反应试剂包括荧光标记；
对所述样品试剂进行预定次数的聚合酶链锁反应，以使所述荧光标记黏合至所述核酸片段并释放出荧光物质；
检测各所述微孔内的所述荧光物质的荧光信号强度；以及
根据检测到的所述荧光信号强度，判断各所述微孔内的所述核酸片段的数量；以及
加总各所述微孔内的所述核酸片段的数量，以得到所述样品试剂中的所述核酸片段的数量。
8.根据权利要求7所述的核酸定量方法，其特征在于，所述微流体元件还包括连通所述微流道的开口，而将所述样品试剂及所述反应试剂分装至所述微孔阵列的各所述微孔内的步骤包括：
分别将所述样品试剂及所述反应试剂注入至所述开口内；以及
所述样品试剂及所述反应试剂沿着所述微流体元件的所述微流道流入至所述微孔阵列的各所述微孔内。
9.根据权利要求7所述的核酸定量方法，其特征在于，对所述样品试剂进行所述预定次数的所述聚合酶链锁反应的步骤包括：
利用所述温度控制元件来调控所述多个微孔的温度，以使所述多个微孔的温度在45℃至95℃之间循环或使所述多个微孔的温度维持在固定温度，以进行所述聚合酶链锁反应。
10.根据权利要求7所述的核酸定量方法，其特征在于，检测各所述微孔内的所述荧光物质的所述荧光信号强度的步骤包括：
利用各所述微孔对应的一个或多个所述图像传感器，独立地读取所述微孔内的所述荧光物质的所述荧光信号强度。
11.根据权利要求7所述的核酸定量方法，其特征在于，根据检测到的所述荧光信号强度判断各所述微孔内的所述核酸片段的数量的步骤包括：
将检测到的所述荧光信号强度由低到高排序；
将所述荧光信号强度最低的所述微孔内的所述核酸片段的数量表示为1个，且随着排序越高，依序使对应的所述微孔内的所述核酸片段的数量增加1个；以及
将检测不到所述荧光信号强度的所述微孔内的所述核酸片段的数量表示为0个。
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