CN112675158A - 紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的作用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供了紫草醌在脉络膜新生血管治疗中的应用，解决了现有技术中的抗VEGF药物反复眼内注射及部分患者无应答的问题。紫草醌减少小鼠脉络膜新生血管的渗出、损伤面积及体积，抑制缺氧条件下M2型巨噬细胞的极化及促血管生成因子，并且与目前临床常用的抗血管内皮生长因子药物雷珠单抗相比，紫草醌的疗效相似。

Description

紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的作用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种紫草中提取的红色萘醌化合物—紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的作用。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是发达国家50岁以上人群中心视力受损的首要原因。据统计目前全球大约有五千万AMD患者，预计二十年以后AMD患者人数将增加一倍。随着我国经济发展及人口老龄化的加剧，AMD在我国发病率呈逐年上升的趋势，现已跃居我国第三大致盲原因，对人民健康造成极大威胁，也给家庭和社会带来了沉重负担。AMD按照病理类型分为萎缩性和渗出性两种类型。渗出性AMD是以脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)生成为特点，由脉络膜新生血管在视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium，RPE)和神经视网膜下生长的一种严重影响视力的疾病。在CNV病程中，氧化应激、光损伤、炎症等致病因素的不断累积，导致RPE细胞以及局部微环境处于缺氧状态中。虽然新生血管性AMD患者只占所有AMD患者的10％，但新生血管性AMD引起的失明占AMD患者失明的90％，因此新生血管性AMD更加引起研究者的关注。

缺氧条件下激活缺氧诱导因子1α(hypoxia-induced factor 1α，HIF-1α)信号通路，调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等一系列缺氧相关基因的表达。在CNV生成的过程中，RPE细胞分泌的VEGF主要与CECs表面的VEGF受体2结合，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和促血管生成等作用。目前对于AMD的药物治疗，大多数是基于抗VEGF或者VEGF受体，如康柏西普(conbercept，CON)和雷珠单抗(ranibizumab，RAN)，但这些药物不是对所有AMD患者均有效，一部分患者治疗无反应(约10％)，且治疗一段时间(约两年)之后，患者开始产生耐药性，此外，抗VEGF药物需要多次反复进行玻璃体腔内注射，增加了患者的经济负担和就诊困难，且会引起多种眼内及系统性副作用，如眼内炎、眼内出血和中风(Supuran CT.Agentsfor the prevention and treatment of age-related macular degeneration andmacular edema:a literature and patent review.Expert Opin Ther Pat 2019；29(10):761-7.)。因此研究CNV新的有效治疗策略迫在眉睫。

紫草醌是紫草根中提取出来的一种天然的红色萘醌化合物。紫草是广泛应用于我国的一种草药，以干燥的根入药，具有凉血活血清热解毒透疹之功效，治疗温热斑疹、湿热黄胆、吐血、烧伤、湿疹和丹毒等症。紫草醌发挥多种药理活性，包括抗炎、抗氧化应激反应和抗肿瘤作用。更重要的是紫草醌能够通过抑制HIF-1α信号通路及VEGF的表达，从而阻碍肿瘤组织的血管生成。

但是关于紫草醌对于脉络膜新生血管发生发展的作用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的治疗方法，以解决现有技术中的抗VEGF药物反复眼内注射所引起的副作用及部分患者无应答的问题。

巨噬细胞在不同条件下发生活化，并极化为两种主要的功能类型，一种是M1型巨噬细胞，受到脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的诱导极化，产生诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，并分泌促炎细胞因子如白介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)，促进炎症的发展，并抑制血管的形成。另一种是M2型巨噬细胞，在白介素4(interleukin-4，IL-4)IL-4和白介素13(interleukin-13，IL-13)的诱导下极化，表达精氨酸酶1(arginase 1，Arg1)，分泌促血管生成因子，包括转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，FGF2)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF1)，促进炎症的消退及伤口愈合。本发明发现紫草醌通过抑制巨噬细胞的M2型极化，从而缓解CNV的形成。

本发明的第一方面，提供紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备减少脉络膜新生血管的渗出的药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备降低脉络膜新生血管的损伤面积的药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备减少脉络膜新生血管的体积的药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化的药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子的分泌的药物中的应用。

更进一步的，所述的促血管生成因子，包括碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor，FGF2)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF1)。

本发明的第二方面，提供紫草醌在制备脉络膜新生血管抑制剂中的应用。

本发明的第三方面，提供紫草醌在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化的药物中的应用。

本发明的第四方面，提供紫草醌在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子的分泌的药物中的应用，所述的促血管生成因子，包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和胰岛素样生长因子1(IGF1)。

本发明的第五方面，提供紫草醌在制备新生血管性年龄相关性黄斑变性治疗药物中的应用。

本发明的第六方面，提供一种脉络膜新生血管治疗药物，所述的药物以紫草醌作为活性成分。

本发明优点在于：

1、本发明提供了紫草醌在脉络膜新生血管治疗中的应用，解决了现有技术中的抗VEGF药物反复眼内注射及部分患者无应答的问题。

2、紫草醌减少小鼠脉络膜新生血管的渗出、损伤面积及体积，抑制缺氧条件下M2型巨噬细胞的极化及促血管生成因子，包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和胰岛素样生长因子1(IGF1)的释放，并且与目前临床常用的抗血管内皮生长因子(VEGF)药物雷珠单抗(RAN)相比，100mg/kg/d紫草醌的疗效相似。

3、紫草醌为口服给药的方式，避免了眼内多次注射及其可能带来的副作用如眼内炎。

附图说明

图1.紫草醌灌胃改善小鼠CNV损伤区域的渗出。A图为眼底荧光造影(fundusfluorescein angiography，FFA)的代表图。B图为使用Image J软件分析脉络膜渗出面积的改变。^*P<0.05，与CNV 7天组相比较。

图2.紫草醌灌胃减少小鼠CNV损伤区域的面积。A图为吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)的代表图。B图为CNV区域的统计，显示相对于CNV7天组，50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃及RAN玻璃体腔内注射均能够减少CNV损伤区域的面积，且紫草醌的作用呈现剂量依赖性。^**P<0.01，与CNV 7天组相比较。

图3.紫草醌灌胃降低小鼠CNV损伤区域的体积。A图为脉络膜铺片后，运用胶原IV(Col IV，红色)、同工凝集素-B4(isolectin-B4，绿色)抗体及DAPI(蓝色)进行荧光标记。B图为CNV体积的统计，显示50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃及RAN玻璃体腔内注射均能够降低CNV损伤区域的体积，且50mg/kg/d的降低作用略优于100mg/kg/d紫草醌的降低作用。^**P<0.01，与CNV 7天组相比较。

图4.紫草醌抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化。A图为qRT-PCR检测人巨噬细胞中M1型极化的标记iNOS的mRNA水平。B图为qRT-PCR检测人巨噬细胞中M2型极化的标记Arg1的mRNA水平。

图5.紫草醌抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子的分泌。A图ELISA检测人巨噬细胞培养上清中FGF2的蛋白水平。B图ELISA检测人巨噬细胞培养上清中IGF1的蛋白水平。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

1、实验方法

(1)小鼠CNV模型的建立及分组

氪激光诱导CNV小鼠，用0.5％戊巴比妥腹腔注射麻醉，复方托吡卡胺散瞳，手持式灯光照射，保持小鼠体温。将小鼠实验眼固定于裂隙灯前，在1％甲基纤维素的辅助下，将5.4mm手持式接触镜置于角膜前，用氪离子激光机，激光波长647.1nm，功率300mw，光斑直径50μm，曝光时间0.05秒。围绕视盘并在距视盘2个乳头直径位置等距离光凝，共计4个点，分别位于3、6、9、12点处，以见到有气泡产生提示Bruch膜被击破，无玻璃体出血为光凝的成功标准。C57BL/6小鼠随机分为七组：正常组(不做任何处理)、CNV 7天组(不做任何注射)、1％二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)灌胃组、紫草醌(25mg/kg/d)灌胃组、紫草醌(50mg/kg/d)灌胃组、紫草醌(100mg/kg/d)灌胃组和RAN玻璃体腔内注射组。其中DMSO和紫草醌组均为每天灌胃一次，从激光造模之后开始第2天持续至第6天。PBS组注射同等体积的无菌PBS。

(2)小鼠玻璃体腔内注射雷珠单抗(ranibizumab，RAN)

取CNV组C57BL/6小鼠称重后，4.3％水合氯醛(0.01ml/kg，腹腔注射)麻醉后使用复方托吡卡胺散大两侧瞳孔，生理盐水湿润眼表，左氧氟沙星滴眼，使小鼠侧卧在手术台，在解剖显微镜下拨开眼睑，暴露角巩膜缘。使用10-0针在角巩膜缘后1mm做切口，33G注射器刺入玻璃体腔，注射0.5μl RAN(Lucentis，Novartis Pharma AG，Basel，Switzerland)。术后红霉素眼膏涂眼预防感染。

(3)小鼠眼底血管造影

C57BL/6小鼠随机分为七组：正常组、CNV 7天组、CNV 7天+DMSO组、紫草醌(25mg/kg/d)灌胃组、紫草醌(50mg/kg/d)灌胃组、紫草醌(100mg/kg/d)灌胃组和RAN玻璃体腔内注射组。小鼠用0.5％戊巴比妥腹腔注射处死，复方托吡卡胺散瞳。将10％荧光素钠用注射用水稀释成2％荧光素钠或者吲哚菁绿试剂，经腹腔注射0.3ml，分别进行眼底荧光造影(fundus fluorescein angiography，FFA)或者吲哚菁绿血管造影(indocyanine greenangiography，ICGA)。注射后100-140秒开始用共焦激光视网膜断层扫描仪记录造影过程。记录时间为30min。CNV分级：0级为无渗出，1级为轻度渗出，2a级为中度渗出，2b级为重度渗出。使用Image J软件分析脉络膜渗出面积的改变。研究人员通过徒手绘制工具在ICGA渗出的区域画出边缘，应用ImageJ软件的感兴趣区域(region of interest，ROI)管理器计算出像素区域。之后根据像素与微米之间的比例(我们所使用的比例为0.5249)将像素区域转化为微米的平方(microns²，mm²)，得到最终的CNV面积。

(4)脉络膜铺片及免疫荧光染色

C57BL/6小鼠随机分为六组：CNV 7天组、CNV 7天+DMSO组、紫草醌(25mg/kg/d)灌胃组、紫草醌(50mg/kg/d)灌胃组、紫草醌(100mg/kg/d)灌胃组和RAN玻璃体腔内注射组。将小鼠用过量0.5％戊巴比妥腹腔注射处死，立即摘出眼球，放入4％多聚甲醛中快速固定1h。在解剖显微镜下，沿赤道部环行剪开巩膜，去除眼前节，小心分离视网膜神经上皮层，获得视网膜-视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)-脉络膜复合体眼杯，用冷ICC缓冲液反复冲洗眼杯。在暗光下，将1μg/μl胶原IV(collagen type IV，Col IV)和同工凝集素-B4(isolectin-B4)抗体以1:150的稀释度加入ICC缓冲液中。充分混匀后，分别移入装有眼杯的EP管中进行染色，避光置于4℃冰箱过夜。常温下复温2h，再用ICC缓冲液充分冲洗眼杯。将视网膜-RPE-脉络膜复合体平铺于载玻片上，沿视盘方向做4个放射状切口，封片用荧光显微镜观察。CNV的三维图像用ZEN软件(Zeiss，德国)生成，CNV的体积用Imaris软件(瑞士)进行测量。

(5)人外周血单核细胞的分离及巨噬细胞的分化

取健康志愿者外周血60ml，加入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)和右旋糖酐硫酸酯钠溶液沉淀红细胞并离心，以Percoll密度梯度法分离单核细胞，用免疫抗体磁珠提纯人原代单核细胞，将分离获得的PBMC调整浓度为5×10⁵/ml，铺于35mm玻璃小皿，37℃、5％CO₂条件培养2小时使PBMC贴壁。实验者轻轻晃动玻璃小皿，弃掉玻璃小皿中的培养液以去除未贴壁的淋巴细胞及血小板，每皿加2ml人巨噬细胞集落刺激因子(human macrophage-colony stimulating factor，hM-CSF)终浓度10ng/ml的含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO₂，隔天更换培养基，培养7天。巨噬细胞培养于95％O₂和5％CO₂长达24小时条件下为正常组，巨噬细胞培养于94％N₂、1％O₂和5％CO₂长达24小时条件下为低氧组。

(6)定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR)

人巨噬细胞分为正常组、低氧组、低氧+1％DMSO组(10μl/ml)、低氧+紫草醌(5μM处理24小时)、低氧+紫草醌(10μM处理24小时)和低氧+紫草醌(20μM处理24小时)组，qRT-PCR检测人巨噬细胞中M1型巨噬细胞标记诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)和M2型巨噬细胞标记精氨酸酶1(arginase1，Arg1)的mRNA表达。提取人巨噬细胞总RNA，按照日本TaKaRa公司PrimeScript逆转录试剂盒和天根公司Super Real PreMixPlus(SYBR Green)试剂盒说明书，进行qRT-PCR反应。所用引物序列如下。

iNOS上游引物：5’-CGCATGACCTTGGTGTTTGG-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物：5’-CATAGACCTTGGGCTTGCCA-3’(SEQ ID NO.2)；

Arg1上游引物：5’-TCATCTGGGTGGATGCTCACAC-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物：5’-GAGAATCCTGGCACATCGGGAA-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH上游引物：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’(SEQ ID NO.5)，下游引物：5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’(SEQ ID NO.6)。

20μl反应体系，95℃15min预变性15min，95℃10s，60℃1min，共45个循环。以GAPDH作为内参，通过2^-ΔΔCT法计算基因表达水平的差异。

(7)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

人巨噬细胞分为正常组、低氧组、低氧+DMSO组、低氧+紫草醌(5μM)、低氧+紫草醌(10μM)和低氧+紫草醌(20μM)组，运用ELISA检测人巨噬细胞培养上清中FGF2和IGF1的蛋白水平。将人巨噬细胞蛋白进行匀浆，人巨噬细胞培养基在4℃下以12,000rpm的速度离心10分钟，并收集上清液。在使用Bio-Rad方法检测人巨噬细胞蛋白质浓度后，将人巨噬细胞培养上清置于相应的ELISA试剂盒中，根据制造商的说明测定FGF2和IGF1的蛋白水平。在自动酶标仪上读取450nm处的吸光度。所有测量均一式三份进行，并根据标准曲线计算组织样品浓度并校正蛋白质浓度。

(8)统计学分析

各数据表示为至少三个独立实验的均值±均值的标准误(standard error ofthe mean，SEM)。两组数据之间的比较运用双侧Student-t检验，而多组数据之间的比较用单因素方差分析及Bonferroni事后检测。P<0.05为具有统计学差异。

2、实验结果

为了检测紫草醌在湿性年龄相关性黄斑变性中的治疗作用，我们建立了激光诱导的小鼠脉络膜新生血管模型，三个剂量(25mg/kg/d、50mg/kg/d和100mg/kg/d)紫草醌灌胃，并用目前使用广泛的抗VEGF药物雷珠单抗玻璃体腔内注射作为阳性对照。

(1)紫草醌灌胃改善小鼠CNV损伤区域的渗出

见图1，眼底荧光造影(fundus fluorescein angiography，FFA)显示脉络膜渗出面积的改变；其中A图为眼底荧光造影的代表图。B图为使用Image J软件分析脉络膜渗出面积的改变。与CNV 7天组相比，紫草醌灌胃和RAN玻璃体腔内注射组0级和1级渗出增加，而2a和2b级渗出减少。结果表明50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃及RAN玻璃体腔内注射均能够减少CNV损伤区域的渗出，且紫草醌的作用呈现剂量依赖性。^*P<0.05，与CNV 7天组相比较。

小鼠眼底荧光造影FFA表明，50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃显著减少CNV区域的渗出，且效果与雷珠单抗相似(图1A和1B)。

(2)紫草醌灌胃减少小鼠CNV损伤区域的面积

见图2，眼底吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)显示紫草醌灌胃减少小鼠CNV损伤区域的面积。其中A图为吲哚菁绿血管造影的代表图。B图为CNV区域的统计，显示相对于CNV 7天组，50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃及RAN玻璃体腔内注射均能够减少CNV损伤区域的面积，且紫草醌的作用呈现剂量依赖性。^**P<0.01，与CNV 7天组相比较。

小鼠眼底吲哚菁绿血管造影ICGA表明，50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃显著降低CNV损伤区域的面积，且效果与雷珠单抗相似(图2A和2B)。

(3)紫草醌灌胃降低小鼠CNV损伤区域的体积

见图3，胶原蛋白IV(Collagen IV；血管内皮细胞标记)和同工凝集素(isolectin-4，血管内皮细胞标记)荧光标记显示紫草醌灌胃降低小鼠CNV损伤区域的体积。其中A图为脉络膜铺片后，运用胶原IV(Col IV，红色)、同工凝集素-B4(isolectin-B4，绿色)抗体及DAPI(蓝色)进行荧光标记。B图为CNV体积的统计，显示50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃及RAN玻璃体腔内注射均能够降低CNV损伤区域的体积，且50mg/kg/d的降低作用略优于100mg/kg/d紫草醌的降低作用。^**P<0.01，与CNV 7天组相比较。

胶原IV(Col IV；组织纤维化标记)和同工凝集素(isolectin-4，血管内皮细胞标记)荧光标记显示50mg/kg/d和100mg/kg/d紫草醌灌胃显著减少小鼠CNV的体积，且效果与雷珠单抗相似(图3A和3B)。

(4)紫草醌抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化

见图4，qRT-PCR检测人巨噬细胞中M1型巨噬细胞标记诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)和M2型巨噬细胞标记精氨酸酶1(arginase1，Arg1)的mRNA表达。其中A图为qRT-PCR检测人巨噬细胞中M1型极化的标记iNOS的mRNA水平。B图为qRT-PCR检测人巨噬细胞中M2型极化的标记Arg1的mRNA水平。图4A和4B中，^**P<0.01，与正常组相比较。^#P<0.05，与低氧组相比较。与正常组相比，低氧组iNOS的mRNA水平降低，Arg1 mRNA水平增高，表明低氧条件诱导巨噬细胞向M2型极化，而10μM和20μM紫草醌抑制低氧条件下巨噬细胞的M2型极化。

qRT-PCR检测显示10μM和20μM紫草醌抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化(图4A和4B)。

(5)紫草醌抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子的分泌

见图5，ELISA检测人巨噬细胞培养上清中FGF2和IGF1的蛋白水平。其中A图为ELISA检测人巨噬细胞培养上清中FGF2的蛋白水平。B图为ELISA检测人巨噬细胞培养上清中IGF1的蛋白水平。图5A和5B中，^**P<0.01，与正常组相比较。^#P<0.05，与低氧组相比较。与正常组相比，低氧组巨噬细胞分泌的FGF2和IGF1增多，而10μM和20μM紫草醌能够抑制低氧条件下巨噬细胞分泌FGF2和IGF1。

ELISA检测显示10μM和20μM紫草醌抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子FGF2和IGF1的分泌(图5A和5B)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 苏州市立医院

<120> 紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的作用

<130> /

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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cgcatgacct tggtgtttgg 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

accaccctgt tgctgtagcc aa 22

Claims (10)

1.紫草醌在制备脉络膜新生血管治疗药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为在制备减少脉络膜新生血管的渗出的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为在制备降低脉络膜新生血管的损伤面积的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为在制备减少脉络膜新生血管的体积的药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子的分泌的药物中的应用。

7.紫草醌在制备脉络膜新生血管抑制剂中的应用。

8.紫草醌在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞的M2型极化的药物中的应用。

9.紫草醌在制备抑制低氧条件下人巨噬细胞促血管生成因子的分泌的药物中的应用，所述的促血管生成因子，包括碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1。

10.一种脉络膜新生血管治疗药物，所述的药物以紫草醌作为活性成分。

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