CN112672739A - 治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于治疗癌症的方法和组合物。本发明的方面涉及向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂。本发明的另一方面涉及向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶，所述癌症包含GSK3α中的失活突变。

Description

治疗癌症的方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年7月12日提交的美国临时申请No.62/697,053、2018年10月26日提交的美国临时申请No.62/751,129、以及2019年4月29日提交的美国临时申请No.62/839,912的权益，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。
技术领域
本发明的领域涉及癌症的治疗。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款No.R01 CA193651的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
白血病是儿童癌症中最常见的，约占诊断的30％。存在两种主要的亚型：急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)。AML不太常见，约占儿童白血病诊断的18％。这些白血病类型也发生在成年人中，并且AML在老年个体中变得更加普遍。根据细胞谱系以及发病率和危险因素的流行病学研究，两种亚型的病因可能很不相同。需要进行积极的化学疗法以改善诊断患有ALL或AML等白血病的患者的预后。
天冬酰胺酶是一种消耗非必需氨基酸天冬酰胺的细菌酶，是急性白血病治疗的组成部分1,2。天冬酰胺酶的抗肿瘤作用很可能是由如下引起：其耗尽了细胞外天冬酰胺和谷氨酰胺，造成了氨基酸缺乏状态，进而抑制了蛋白质的合成。然而，其它机制仍有待确定。尽管天冬酰胺酶对ALL有效，但仅偶尔用于治疗其它白血病和实体瘤。先前的体外研究已经观察到法-美-英分型对急性髓系白血病(AML)中的天冬酰胺酶的不同反应。天冬酰胺酶抗性仍然是白血病患者的常见临床问题，其中对抗性的生物学基础了解甚少。
发明内容
本文所述的发明部分地涉及GSK3α致敏的癌细胞(例如白血病细胞)对天冬酰胺酶的抑制的发现。因此，本文描述的一个方面提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂。
在任何方面的一个实施方式中，癌症为恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
在任何方面的一个实施方式中，癌症为实体瘤。
在任何方面的一个实施方式中，癌症为选自急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的白血病。
在任何方面的一个实施方式中，癌症对天冬酰胺酶具有抗性。
在任何方面的一个实施方式中，癌症对天冬酰胺酶不具有抗性。
在任何方面的一个实施方式中，天冬酰胺酶选自于由如下所组成的组：L-天冬酰胺酶(Elspar)、培门冬酶(PEG-天冬酰胺酶；Oncaspar)、SC-PEG天冬酰胺酶(Calaspargasepegol)和欧文氏菌天冬酰胺酶(Erwinaze)。
在任何方面的一个实施方式中，抑制GSK3α的药剂选自于由小分子、抗体、肽、基因组编辑系统、反义寡核苷酸和RNAi所组成的组。
在任何方面的一个实施方式中，小分子选自于由如下所组成的组：BRD0705、BRD4963、BRD1652、BRD3731、CHIR-98014、LY2090314、AZD1080、CHIR-99021(CT99021)HCl、CHIR-99021(CT99021)、BIO-丙酮肟、SB216763、SB415286、Abemaciclib(LY2835210)、AT-9283、RGB-286638、PHA-793887、AT-7519、AZD-5438、OTS-167、9-ING-41、Tideglusib(NP031112)和AR-A014418。在任何方面的一个实施方式中，小分子是BRD0705。
在任何方面的一个实施方式中，RNAi为微小RNA、siRNA或shRNA。
在任何方面的一个实施方式中，抑制GSK3α是抑制GSK3α的表达水平和/或活性。例如，与合适的对照相比，GSK3α的表达水平和/或活性被抑制至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。
在任何方面的一个实施方式中，受试者先前已被给予抗癌治疗。
在任何方面的一个实施方式中，受试者先前未被给予抗癌治疗。
在任何方面的一个实施方式中，该方法进一步包括以下步骤：在给药之前，诊断受试者患有癌症。
在任何方面的一个实施方式中，该方法进一步包括以下步骤：在给药之前，从将受试者诊断为患有癌症的测定中接收结果。
本文所述的另一方面提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶，其中，所述癌症包含引起GSK3α的抑制的突变。
在任何方面的一个实施方式中，该突变引起癌症细胞中的WNT信号转导通路的激活。
在任何方面的一个实施方式中，突变是在选自于由如下所组成的组的基因中：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。
在任何方面的一个实施方式中，该突变改变了选自于由如下所组成的组的基因的表达：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。
在任何方面的一个实施方式中，癌症为结肠癌或胰腺癌。
在任何方面的一个实施方式中，癌症为转移性的。
在任何方面的一个实施方式中，在给药前，受试者被鉴定为患有癌症；所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。
在任何方面的一个实施方式中，在从受试者获得的生物样品中鉴定出突变。在任何方面的一个实施方式中，生物样品为组织样品或血液样品。
在任何方面的一个实施方式中，癌症对癌症治疗具有抗性。在任何方面的一个实施方式中，癌症在癌症治疗后复发。示例性的癌症治疗包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术、激素疗法、干细胞疗法、靶向疗法、基因疗法和精确疗法。
本文所述的另一方面提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括：(a)从患有癌症的受试者获得生物样品；(b)分析样品并鉴定出具有引起GSK3α抑制的突变的癌症；以及(c)将天冬酰胺酶给予至已鉴定出患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
本文所述的另一方面提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括：(a)接收鉴定受试者患有癌症的测定的结果，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变；以及(b)将天冬酰胺酶给予至已鉴定出患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
定义
为了方便起见，以下提供在说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中有所暗示，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，并非旨在限制要求保护的技术，因为该技术的范围仅由权利要求书限制。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与该技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如果术语的使用与此处提供的定义之间存在明显的差异，则以说明书中提供的定义为准。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“减轻(amelioration)”是指治疗性处理，其中，目的是逆转、缓解、减轻、抑制、减慢或停止与癌症(例如白血病、结肠癌或胰腺癌)有关的疾病的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或缓解至少一种癌症的不良作用或症状。如果减少一种或多种症状或临床标志，治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且包括与存在治疗时预期的情况相比症状的进展或恶化的中止或至少减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于缓解一种或多种症状、减小疾病程度、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、减轻或减缓疾病状态、缓和(无论是部分还是全部)和/或死亡率降低(无论是否可检测)。术语疾病的“治疗”还包括疾病的症状或副作用的舒解(包括姑息治疗)。
如本文所用，术语“给予/给药”是指通过使得将药剂至少部分递送给受试者的方法或途径将本文所公开的治疗剂(例如，抑制GSK3α的药剂和/或天冬酰胺酶)或药物组合物置于受试者中。可通过在受试者中产生有效治疗的任何适当的途径给予包含本文公开的药剂的药物组合物。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，动物为脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括例如黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿动物包括例如小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括例如牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)，以及鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物、例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文可互换使用。
所述受试者优选为哺乳动物。哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病(例如癌症)的动物模型的受试者。受试者可为雄性或雌性。
受试者可为先前已被诊断出患有或被鉴定为患有或遭受需要治疗的疾病或病症(例如癌症)或与该疾病或病症有关的一种或多种并发症的人、并且任选已经经历该疾病或病症或与该疾病或病症有关的一种或多种并发症的治疗(例如一种或多种癌症治疗)。或者，受试者也可为先前未被诊断出患有这种疾病或病症或相关并发症的受试者。例如，受试者可为表现出该疾病或病症或与该疾病或病症有关的一种或多种并发症的一种或多种危险因素的受试者，或者为并未表现出危险因素的受试者。
如本文所用，“药剂”是指例如分子、蛋白质、肽、抗体或核酸，其抑制多肽或多核苷酸的表达，或结合至多肽或多核苷酸，部分或完全地阻断多肽或多核苷酸的刺激，减少、防止、延迟多肽或多核苷酸的活化，使多肽或多核苷酸失活、脱敏或下调。抑制GSK3α的药剂例如抑制多肽的表达(例如翻译，翻译后加工)、稳定性、降解或细胞核定位或细胞质定位，或抑制多核苷酸的转录、转录后加工、稳定性或降解，或结合至多肽或多核苷酸，完全或部分地阻断多肽或多核苷酸的刺激、DNA结合、转录因子活性或酶活性，减少、防止、延迟多肽或多核苷酸的活化，使多肽或多核苷酸失活、脱敏或下调。药剂可直接或间接起作用。
如本文所用，术语“药剂”是指任何化合物或物质，例如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“药剂”可为任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白类实体和非蛋白类实体。在一些实施方式中，药剂为核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸的寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核糖酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体以及它们的修饰和组合等。在某些实施方式中，药剂为具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基部分、芳基部分或杂环基部分，包括大环内酯、细霉素和相关的天然产物或其类似物。已知化合物具有所需的活性和/或性质，或者可选自各种化合物的库。
药剂可为来自一种或多种化学类别的分子，例如有机分子，其可包括有机金属分子、无机分子、遗传序列等。药剂也可为来自一种或多种蛋白质的融合蛋白、嵌合蛋白(例如相关或不同分子的功能上重要的区域的结构域转换或同源重组)、合成蛋白质或其它蛋白质变型(包括取代、缺失、插入和其它变体)。
如本文所用，术语“小分子”是指化学药剂；所述化学药剂可包括但不限于肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、适体、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机化合物(例如，包括杂金属和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500克/摩尔的有机或无机化合物，以及此类化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
如本文所用，术语“RNAi”是指干扰RNA或RNA干扰。RNAi是指通过结合和抑制mRNA加工(例如抑制mRNA翻译或导致mRNA降解)的分子破坏特定的mRNA而选择性转录后基因沉默的手段。如本文所用，术语“RNAi”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于siRNA、shRNA、内源性微小RNA和人工微小RNA。例如，其包括先前鉴定为siRNA的序列，而与RNA下游加工的机制无关(即，尽管据信siRNA具有产生mRNA切割的体内加工的特定方法，但可将此类序列掺入在本文所述的侧翼序列的背景下的载体中)。
如本文所用，术语“癌症治疗”或“癌症疗法”是指可用于治疗癌症的疗法。抗癌治疗剂的实例包括但不限于例如手术、化学治疗剂、免疫疗法、生长抑制剂、细胞毒性剂、放射疗法中使用的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、以及用于治疗癌症的其它药剂，例如抗HER-2抗体(例如
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)、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼
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)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GLEEVECTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如celecoxib)、干扰素、细胞因子，与下列靶标中的一个或多个结合的拮抗剂(例如中和抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2，以及其它生物活性和有机化学药剂等。其组合也被考虑以本文所述的方法使用。
本文所述的方法和组合物要求抑制GSK3α的水平和/或活性。如本文所用，“糖原合酶激酶3α(GSK3α)”是指牵涉到对多种调节蛋白的控制中的多功能Ser/Thr蛋白激酶，所述调节蛋白包括糖原合酶和转录因子(例如JUN)。其还在WNT和PI3K信号转导通路中起作用，并调节与阿尔茨海默病相关的β-淀粉样肽的产生。许多物种的GSK3α序列是已知的，例如人GSK3α(NCBI基因ID：2931)多肽(例如NCBI参考序列NP_063937.2)和mRNA(例如NCBI参考序列NM_019884.2)。GSK3α可以指人GSK3α，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。GSK3α是指哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等)的GSK3α。SEQ ID NO：1的核酸序列包含编码GSK3α的核酸序列。
SEQ ID NO：1为编码GSK3α的核酸序列。
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Figure BDA0002970131260000081
术语“减少”(decrease)、“降低”(reduced/reduction)或“抑制”在本文中全部用于表示减少统计学上显著的量。在一些实施方式中，“降低”、“减少”或“抑制”通常是指与适当的对照(例如，不存在给定的治疗)相比减少至少10％，并且可包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”或“抑制”不包括与参考水平相比完全抑制或降低。“完全抑制”为与适当的对照相比100％抑制。
如本文所用，“参考水平”是指正常的、在其它方面未受影响的细胞群或组织(例如，从健康受试者获得的生物样品，或在先前时间点从受试者获得的生物样品、例如，在被诊断出患有癌症之前从患者获得的生物样品，或者尚未与本文公开的药剂接触的生物样品)。
如本文所用，“适当的对照”是指未经治疗的、在其它方面相同的细胞或群体(例如，与非对照细胞相比，未给予本文所述的药剂或仅给予本文所述的药剂的子集的受试者)。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学上的显著性，并且通常是指两个标准偏差(2SD)或更大的差异。
如本文所用，术语“包括”或“包含”用于指对方法或组合物必不可少但对未指定的要素(不论是否必要)的含有而言开放的组合物、方法及其各自的组分。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些元素。该术语允许存在不会实质上影响该实施方式的基本和新颖或功能性的特征的要素。术语“由……组成”是指排除了在该实施方式的描述中未列举的任何要素的本文所述的组合物、方法及其各自的组分。
除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数对象。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。缩写“例如”衍生自拉丁文“例如(exempli gratia)”，并且在本文中用于指示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g.)”与“例如(for example)”一词同义。
附图说明
图1A-图1H显示了Wnt通路激活使白血病细胞对天冬酰胺酶致敏。图1A显示出，将表达Cas9的CCRF-CEM细胞用生物学复制物(biologic duplicates)中的GeCKO全基因组的引导RNA库进行转导。嘌呤霉素筛选后，将每组分成用溶媒或天冬酰胺酶(10U/L)处理，并在处理5天后评估引导RNA表达(representation)。图1B显示出，如通过使用MAGeCK分析计算的稳健排序整合(RRA)评分所评估的，GeCKO文库覆盖的基因通过经天冬酰胺酶处理的条件下的耗竭显著性进行排序来显示。需注意的是，未显示微小RNA基因。图1C显示出，用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，并通过RT-PCR分析评估了针对归一化至β-肌动蛋白的所示基因的表达的敲低效率。需注意的是，CT值大于36被定义为未检测到(N.D.)。对于多重比较，采用具有Dunnett调整的单因素方差分析计算显著性。图1D显示出，CCRF-CEM细胞用所示的shRNA进行转导，并使之经受活化的(非磷酸化的)β-连环蛋白(Ser33/37/Thr41)或GAPDH的蛋白印迹分析。图1E显示出，首先用慢病毒7xTcf-EGFP(TopFLASH)报告基因转导CCRF-CEM细胞，然后用所示的shRNA转导，并通过流式细胞术评估报告基因驱动的EGFP荧光。对于多重比较，通过具有Dunnett调整的单因素方差分析评估显著性。图1F显示出，用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，并用所示剂量的天冬酰胺酶处理8天。通过基于台盼蓝活性染料染色对活细胞计数来评估相对活力，并将细胞计数归一化至shLuc转导的无天冬酰胺酶对照中的细胞数。图1G显示出，用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，用天冬酰胺酶(10U/L)处理48小时，并评估了半胱天冬酶3/7活性测定。对于多重比较，通过具有Tukey调整的双因素方差分析评估显著性。图1H显示出，用100ng/ml Wnt3A配体或溶媒对照以及所示剂量的天冬酰胺酶处理CCRF-CEM细胞。通过台盼蓝活性染料染色对处理8天后的活细胞数量进行计数，并将结果归一化至无-Wnt3α、无天冬酰胺酶对照的结果。所有柱状图和相对活力曲线代表3次生物重复的平均值，误差棒代表平均值的标准误差(s.e.m.)。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。n.s.，P＞0.05。
图2A-图2D显示出，GSK3抑制使不同的急性白血病亚型对天冬酰胺酶诱导的细胞毒性致敏，但对正常的造血祖细胞不致敏。图2A-图2B，所示细胞用GSK3抑制剂CHIR99021(1μM)或溶媒对照以及所示剂量的天冬酰胺酶处理8天。通过台盼蓝活性染色对活细胞的数目进行计数，并归一化至无CHIR、无天冬酰胺酶对照的计数。图2C显示了用CHIR99021(1μM)或溶媒以及所示剂量的天冬酰胺酶处理的正常的CD34+人造血祖细胞。在处理的第4天，通过台盼蓝活性染色对活细胞的数目进行计数，并归一化至无CHIR、无天冬酰胺酶对照的计数。需注意的是，这些正常的造血祖细胞在培养物中不能维持超过4天。图2D示出了用CHIR99021(1μM)或溶媒和所示的化疗药物处理CCRF-CEM细胞8天。通过台盼蓝拒染法对活细胞的数目进行计数，并归一化至无CHIR、无化学疗法对照中的计数。所显示的所有蛋白印迹均指示出在用CHIR 99021(1μM)或溶媒处理后，活化的(非磷酸化的)β-连环蛋白(Ser33/37/Thr41)或GAPDH的水平。显示的结果是至少n＝3次生物重复的平均值，误差棒代表s.e.m。
图3A-图3I显示了蛋白的Wnt依赖性稳定介导了对天冬酰胺酶的致敏。图3A显示了用编码组成型活性ΔN90β-连环蛋白等位基因或载体对照的表达构建体转导CCRF-CEM细胞。通过蛋白印迹分析评估所示蛋白的转导效率，并通过7xTcf-EGFP(TopFLASH)报告基因表达评估对经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的影响(顶部)。通过Welch t检验评估统计学显著性。然后，将所示的构建体转导的细胞用所示剂量的天冬酰胺酶处理8天，并通过台盼蓝活性染料染色对活细胞的数量进行计数(底部)。将活细胞计数归一化至载体转导的无天冬酰胺酶对照。图3B显示出，用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，并且分别通过RT-PCR分析和7xTcf-EGFP(TopFLASH)报告基因活性评估对APC mRNA和经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的影响(顶部)。使用具有Dunnett调整的单因素方差分析对三组的多重比较进行统计学显著性计算，并使用Welch t检验对两组进行统计学显著性计算。用所示剂量的天冬酰胺酶处理经所示shRNA转导的细胞8天，并对活细胞的数量进行计数(图3A)。图3C显示了用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，然后用双重mTORC1/mTORC2抑制剂AZD2014(10nM)或溶媒对照以及所示剂量的天冬酰胺酶处理8天。通过台盼蓝活性染料染色对活细胞的数量进行计数，并将其归一化至无AZD2014、无天冬酰胺酶对照中的活细胞计数。如所示出的，将经转导的细胞用AZD2014处理，并经受针对磷酸化p70S6激酶(Thr389)或GAPDH的蛋白印迹分析。图3D显示了用溶媒或天冬酰胺酶(10U/L)处理CCRF-CEM细胞48小时，并通过具有前向散射高度(FSC-H)的流式细胞术分析评估了细胞大小。图3E显示了用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，并用天冬酰胺酶(10U/L)处理48小时。通过具有前向散射高度(FSC-H)的流式细胞术分析评估细胞大小。对于多重比较，通过具有Dunnett调整的单因素方差分析评估显著性。图3F显示了用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，用18小时脉冲的细胞可渗透性蛋氨酸类似物叠氮高丙氨酸进行孵育，然后从标记中释放并用天冬酰胺酶(10U/L)处理。通过点击化学对叠氮高丙氨酸进行荧光标记，并在所示的时间点通过流式细胞术测量标记保留的程度。图3G显示了用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞。如所示出的，还用编码野生型FBXW7或具有受损的底物结合能力的R465C FBXW7点突变体的表达构建体转导细胞。通过针对所示蛋白的蛋白印迹分析评估了转导效率。然后用所示剂量的天冬酰胺酶处理细胞8天，并通过台盼蓝活性染色对活细胞的数量进行计数。将细胞计数归一化至在经shLuc转导的无天冬酰胺酶对照中的细胞计数。图3H显示了用溶媒或蛋白酶体抑制剂硼替佐米和所示剂量的天冬酰胺酶处理CCRF-CEM细胞8天。通过台盼蓝活性染色对活细胞的数量进行计数，并将其归一化至无硼替佐米、无天冬酰胺酶对照中的计数。图3I显示了用所示的shRNA和编码GFP对照或蛋白酶体亚基PSMA4(ΔN3-PSMA4)的高活性突变体或溶媒对照的表达构建体转导CCRF-CEM细胞。然后用所示剂量的天冬酰胺酶处理细胞8天，并通过台盼蓝活性染色对活细胞的数量进行计数。将细胞计数归一化至经GFP转导的无天冬酰胺酶对照的计数。显示的结果为至少n＝3次生物重复的平均值，误差棒代表s.e.m。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。n.s.，P＞0.05。
图4A-图4F显示了人白血病中的GSK3α抑制和天冬酰胺酶的合成致死率。图4A显示出用溶媒、GSK3α-选择性抑制剂BRD0705或GSK3β-选择性抑制剂BRD0731与天冬酰胺酶一起以所示剂量处理CCRF-CEM细胞8天。通过台盼蓝活性染色对活细胞的数目进行计数，并归一化至经溶媒处理的对照中的计数。通过蛋白印迹分析评估了所示蛋白的蛋白水平(插图)。磷酸特异性GSK3抗体(p-GSK3)识别GSK3α的Tyr279和GSK3β的Tyr216的自身磷酸化27。需注意的是，可通过分子量区分GSK3旁系同源物。图4B显示了用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，并通过针对总GSK3或GAPDH的蛋白印迹分析评估了敲低功效(插图)。然后用所示剂量的天冬酰胺酶处理细胞8天，并进行基于台盼蓝活性染色的活细胞计数。将细胞计数归一化至shLuc、无天冬酰胺酶的对照。图4C显示了用所示的shRNA转导CCRF-CEM细胞，不具有或具有逃避shRNA靶向的GSK3α表达构建体。通过针对总的GSK3或GAPDH的蛋白印迹分析评估所示蛋白的表达(插图)。然后用所示剂量的天冬酰胺酶处理细胞8天，并通过台盼蓝活性染色对活细胞的数量进行计数。将细胞计数归一化至shLuc、无天冬酰胺酶对照中的细胞计数。图4D显示了将从源自患者的异种移植物而来的T-ALL细胞注射到NRG免疫缺陷小鼠中。植入白血病(外周血中≥5％的白血病细胞)后，每12小时静脉内用天冬酰胺酶或溶媒×1剂以及通过口服灌胃用BRD0705或溶媒对小鼠进行处理，持续12天。通过Kaplan-Meier分析计算存活率。通过对数秩检验比较经溶媒治疗的小鼠与用天冬酰胺酶和BRD0705组合治疗的小鼠计算P值。用溶媒、单独的天冬酰胺酶或单独的BRD0705处理的小鼠的存活率差异并不显著。这些组中的每一个与用天冬酰胺酶和BRD0705的组合(联合)治疗的小鼠之间的差异均为P<0.0001。图4E示出了图4D所示的实验中的小鼠的体重。图4F示出了建议的模型。
图5示出了人T-ALL细胞系的天冬酰胺酶的敏感性。用100U/L天冬酰胺酶或溶媒对照处理所示的人T-ALL细胞系48小时，并通过基于台盼蓝活性染料染色对活细胞进行计数来评估活力。对于每种细胞系，将结果归一化至经溶媒处理的细胞中的活力。柱状图表示重复实验的平均值。对于遗传筛选，选择CCRF-CEM细胞是因为在SUPT1或KOPTK1细胞中无法实现有效的CRISPR/Cas9基因组编辑。
图6A-图6C显示出，天冬酰胺合成酶(ASNS)是经天冬酰胺酶处理的CCRF-CEM细胞中的耗竭的阳性对照。图6A显示出，在ASNS蛋白(https://www.uniprot.org/uniprot/P08243)上显示出靶向天冬酰胺合成酶催化结构域的阳性对照引导RNA诱导的突变的预测位置。图6B显示出，用靶向天冬酰胺合成酶(ASNS)的催化结构域的阳性对照引导RNA或靶向安全港基因座AAVS1的阴性对照转导表达Cas9的CCRF-CEM细胞，并且通过目标基因座的下一代测序和PCR扩增评估切割效率。图6C显示出，用靶向ASNS或AAVS1的引导RNA池(n＝靶向每个基因座的3个引导RNA)转导表达Cas9的CCRF-CEM细胞，然后用溶媒(PBS)或10U/L天冬酰胺酶处理。处理5天后，通过下一代测序评估了引导RNA的表达。将每种引导RNA的丰度归一化至其在经溶媒处理的细胞中的丰度。棒表示平均值+/-平均值的标准误差，并使用Welch t检验计算统计学显著性。****，P＜0.0001。n.s.，P≥0.05。
图7显示了所利用的全基因组的引导RNA文库中的引导RNA表达。扩增保存在两个不同的半文库池(A和B)中的GeCKO全基因组的引导RNA文库，并使用下一代测序评估每个半文库的引导RNA表达。
图8显示出，mTORC1抑制不能挽救对天冬酰胺酶的致敏。用所示的shRNA感染CCRF-CEM细胞，并用所示剂量的天冬酰胺酶和雷帕霉素(1nM，左侧)或RAD001(10nM，右侧)处理8天。通过使用台盼蓝活性染料染色对活细胞进行计数来评估相对活力，并将细胞计数归一化至经shLuc转导的对照(无天冬酰胺酶、无mTORC1抑制剂)中的细胞计数。相对活力曲线代表3次生物重复的平均值，误差棒代表s.e.m.。
图9显示出，在脉冲期间，wnt通路的激活不影响标记掺入的程度。将经所示的shRNA转导的CCRF-CEM细胞用叠氮高丙氨酸(AHA)孵育18小时。脉冲后，随后将细胞固定，并通过流式细胞术评估加标签的AHA的荧光强度。所显示的结果是n＝3次生物重复的平均值，误差棒代表s.e.m.。针对多重比较，采用具有Dunnett调整的单因素方差分析(ANOVA)评估统计学显著性。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。n.s.，P＞0.05。
图10显示出，中等剂量的硼替佐米是剧毒的。用所示剂量的硼替佐米处理CCRF-CEM细胞48小时。通过基于台盼蓝活性染料染色对活细胞进行计数来评估细胞活力，并将细胞计数归一化至无硼替佐米的对照。柱状图代表三重复实验的平均值，点代表每次实验的结果。
图11显示出，shRNA敲低引起GSK3α(左侧)和GSK3β(右侧)的mRNA表达显著降低。对所示基因进行定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)，以测试敲低效率。将结果归一化至shLuc细胞。对于多重比较，通过具有Dunnett调整的单因素方差分析(ANOVA)评估显著性。误差棒代表3次生物重复的s.e.m.。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。n.s.，P＞0.05。
图12A和图12B显示了对白血病负担的确认。图12A显示了从对照NRG小鼠收获的骨髓细胞。图12B显示了注射有人T-ALL PDX并用溶媒治疗的NRG小鼠(来自图4D)。用所示的抗体对细胞染色，并通过流式细胞术评估人细胞的阳性。
图13显示了Wnt/STOP信号转导的激活使结肠癌细胞对天冬酰胺酶致敏。所示的人结肠癌细胞系利用了APC的港口突变(harbor mutation)，该突变激活了GSK3下游的经典Wnt/β-连环蛋白信号转导，因此在基线处没有活跃的Wnt/STOP信号转导。用溶媒或人重组RSPO3(75ng/ml)和Wnt3A(100ng/ml)以及所示剂量的天冬酰胺酶处理细胞8天，以诱导配体依赖的Wnt受体信号转导的激活，其激活Wnt/STOP信号转导。需注意的是，通过用RSPO3和Wnt3A处理激活Wnt/STOP信号转导会诱导天冬酰胺酶致敏。
图14A-图14C显示了与天冬酰胺酶联用的GSKα-选择性抑制剂的深远的治疗活性。图14A示出了GSKα-选择性抑制剂和天冬酰胺酶的剂量示意图。通过静脉内注射以1000U/kg的单剂量将天冬酰胺酶给予至小鼠。每12小时以15mg/kg向小鼠给予GSKα-选择性抑制剂(BRD0705)或溶媒。图14B显示了移植有人T细胞急性淋巴细胞白血病(抗化学疗法)的免疫缺陷小鼠的存活百分比。图14C显示了移植有人MLL-重排的B-淋巴母细胞性白血病(从化疗后复发的患者收集的样品)的免疫缺陷小鼠的存活百分比。与各自作为单一疗法相比，将GSKα-选择性抑制剂和天冬酰胺酶联用时，两种白血病模型的生存率均大大提高。
图15A-图15I显示了激活GSK3上游的Wnt信号转导的突变诱导天冬酰胺酶超敏性。图15A显示了在重组Rspondin3(75ng/ml)和Wnt3α(100ng/ml)或溶媒存在下，用所示剂量的天冬酰胺酶处理SW-480和HCT-15细胞10天。对活细胞的数目进行计数，并将所有细胞计数归一化至溶媒、无天冬酰胺酶细胞中的计数。对每种细胞系进行双因素方差分析，并且包括天冬酰胺酶剂量和Wnt配体之间的相互作用项。Wnt配体相对于溶媒的主要作用的p值展示在每个图中，并且相互作用项总体而言是显著的(p<0.0001)。图15B显示出，用GSK3抑制剂CHIR99021(CHIR，1μM)或溶媒与所示剂量的天冬酰胺酶一起处理SW-480和HCT-15细胞10天。如图15A中评估活力。使用双因素方差分析计算统计学显著性，并包括天冬酰胺酶剂量和GSK3抑制剂之间的相互作用项。Wnt配体相对于溶媒的主要作用的p值展示在每个图中，并且所有相互作用项均显著(p<0.0001)。图15C示出了用CHIR99021(1μM)或溶媒与所示剂量的天冬酰胺酶一起处理源自正常的人结肠上皮的CCD-841细胞10天，并且如图15A中所述评估了活细胞计数。对每种细胞系进行双因素方差分析，并且包括天冬酰胺酶剂量和GSK3抑制剂之间的相互作用项。图中展示了CHIR99021相对于溶媒的主要作用的p值，并且所有相互作用项均不显著(p＝n.s.)。图15D显示用所示的shRNA转导SW-480和HCT-15细胞，然后用所示剂量的天冬酰胺酶处理。处理10天后，通过对活细胞进行计数来评估活力。将所有细胞计数归一化至shLuc转导的、经溶媒处理的对照中的细胞计数。图15E显示出在所示剂量的天冬酰胺酶存在下，用溶媒、GSK3α-选择性抑制剂BRD0705(1μM)或GSK3β-选择性抑制剂BRD3731(1μM)处理所示的细胞系10天。如图15A中评估活力。图15F显示了在基础的类器官培养基(不含Wnt3A和Rspondin1蛋白)中培养具有p53和Kras突变以及Rspo3易位的小鼠肠道类器官，并用溶媒或天冬酰胺酶(100U/L)处理10天。通过使用Axio Imager A1显微镜对活的类器官进行计数来评估活力。图像取自三次实验的代表，并使用ImageJ软件进行分析。使用双侧Welch t检验计算统计学显著性。图15G显示出在基础的类器官培养基(不含Wnt3A和Rspondin 1蛋白)中培养具有p53和Kras突变的Apc缺陷型类器官，并用溶媒、天冬酰胺酶(100U/L)、BRD0705(1μM)或组合(100U/L天冬酰胺酶+1μM BRD0705)处理10天。如图15F中评估活力。图像取自三次实验的代表，并使用ImageJ软件进行分析。使用溶媒组作为参考组，使用具有Dunnett调整的单因素方差分析对组之间的差异进行了多重比较。****p≤0.0001。n.s.，p＞0.05。图15H显示了将所示的类器官在基础的类器官培养基中培养，用所示的构建体转导，并用溶媒、天冬酰胺酶(100U/L)、BRD0705(1μM)或组合(100U/L天冬酰胺酶+1μM BRD0705)处理10天。如图15F中评估活力。图像取自三次实验的代表，并使用ImageJ软件进行分析。使用针对多重比较的具有Tukey调整的单因素方差分析对组之间的差异进行分析。****p≤0.0001。n.s.，p＞0.05。图15I显示了将所示的类器官在基础的类器官培养基中培养，用所示的构建体转导并用溶媒、天冬酰胺酶(100U/L)、BRD0705(1μM)或组合(100U/L天冬酰胺酶+1μM BRD0705)处理10天。如图15F中评估活力。图像取自三次实验的代表，并使用ImageJ软件进行分析。使用针对多重比较的具有Tukey调整的单因素方差分析对组之间的差异进行分析。*p≤0.05；***p≤0.001；****p≤0.0001。n.s.，p＞0.05。所有误差棒代表SEM。还参见图17A-图17D和图18A-图18B。
图16A-图16I示出了借助结直肠癌中的Wnt通路激活和天冬酰胺酶的合成致死的方法。图16A示出了实验概要。将具有p53和Kras突变以及Rspo3融合或Apc缺陷的小鼠肠道类器官经皮下注射到雄性裸鼠中(每组n＝9)。一旦确认了肿瘤植入(通过卡尺测量>100mm3肿瘤体积)，将小鼠随机分配至治疗组，并按指示进行治疗。图16B示出了在图16A所示的实验中注射有肠道类器官的小鼠的肿瘤体积。图中的箭头表示治疗的开始，每两天通过卡尺测量评估肿瘤的体积。对植入Rspo3融合的类器官的小鼠进行了双因素方差分析，并且包括溶媒和天冬酰胺酶之间的相互作用项。图中展示了开始治疗后的天冬酰胺酶相对于溶媒的主要作用的p值。所有误差棒代表SEM。图16C显示了在注射有所示的类器官的小鼠中对天冬酰胺酶治疗的响应的瀑布图。每个棒代表单个小鼠。图16D显示了注射有所示类器官并用溶媒或天冬酰胺酶治疗的小鼠的Kaplan-Meier无进展生存曲线。对数秩检验用于检验注射有Rspo3融合的类器官并用天冬酰胺酶与溶媒治疗的小鼠的无进展生存期差异。图16E示出了实验概要。将源自人类患者的APC突变的CRC异种移植物皮下植入雄性裸鼠(每组n＝8)。如图16A中所述在肿瘤植入时对小鼠进行治疗。图16F示出了在图16E所示的实验中植入人CRCPDX的小鼠的肿瘤体积。箭头表示治疗的起点和终点。每两天通过卡尺测量评估肿瘤体积。进行了双因素方差分析，并且包括溶媒和组合之间的相互作用项。图中展示了治疗开始后组合相对于溶媒的主要作用的p值，并且所有相互作用项总体上是显著的(p<0.0001)。所有误差棒代表SEM。图16G显示了在植入人CRC PDX的小鼠中对天冬酰胺酶、BRD0705或组合治疗的响应的瀑布图。每个棒代表单个小鼠。图16H显示了用天冬酰胺酶、BRD0705或组合治疗的小鼠的Kaplan-Meier无进展生存曲线。使用对数秩检验来检验组合和溶媒治疗的小鼠的无进展生存期差异。图16I显示了来自图16E所示实验的植入有APC突变的CRC PDX的小鼠的代表性图像。在处理后30天从用异氟烷麻醉的小鼠拍摄图像。还参见图19A-19C。
图17A-图17D(与图15A-图15I有关)显示了GSK3α抑制和天冬酰胺酶诱导结直肠癌细胞中的线粒体凋亡。图17A显示了用所示的构建体转导SW-480细胞，并通过RT-PCR分析评估敲低效率。对于多重比较，使用具有Dunnett调整的单因素方差分析计算统计分析。图17B显示了用所示的构建体感染HCT-15细胞，并且如图17A中所述评估敲低效率。图17C显示出，将SW-480细胞用shLuciferase或shGSK3α感染，并随后用溶媒(PBS)或天冬酰胺酶(100U/L)处理。使用半胱天冬酶Glo 3/7测定法评估半胱天冬酶3/7活性，并归一化至shLuciferase，溶媒对照。对于多重比较，使用具有Dunnett调整的单因素方差分析计算统计学显著性。图17D显示了用所示的构建体感染HCT-15细胞并用溶媒(PBS)或天冬酰胺酶(100U/L)处理。如图17A中所述评估半胱天冬酶活性。****p≤0.0001。n.s.，p＞0.05。
图18A-图18B(与图15A-图15I有关)显示出，用Wnt配体处理逆转了天冬酰胺酶诱导的细胞尺寸的减小。图18A示出了用溶媒或天冬酰胺酶(100U/L)与人RSpondin3(75ng/ml)和Wnt3A蛋白(100ng/ml)一起处理HCT-15细胞，并在Beckton-Dickinson LSR-II仪器上通过具有前向散射高度(FSC-H)的流式细胞术评估了细胞尺寸。图18B示出了描绘各次生物重复的结果的散点图，其中水平棒表示平均值，而误差棒表示SEM。针对多重比较，使用具有Dunnett调整的单因素方差分析对组之间的差异进行分析。**p≤0.01；****p≤0.0001。
图19A-图19C(与图16A-图16I有关)显示出治疗是良好耐受的，并且在裸鼠中未引起体重减轻。图19A示出了注射类器官并按所示处理的小鼠的体重。在治疗开始之前将值归一化至体重。误差棒代表SEM。图19B示出了植入有人CRC PDX的小鼠的体重。在治疗开始之前将值归一化至体重。误差棒代表SEM。图19C显示了植入有人CRC PDX并用溶媒或联合疗法(天冬酰胺酶+BRD0705)治疗的小鼠的胆红素水平。
图20显示了示例性的GSK3α的小分子抑制剂的化学结构。
具体实施方式
治疗癌症的方法
本文所述的发明部分涉及以下发现：通过给予GSK3α抑制剂来抑制GSK3α以使癌细胞(例如白血病细胞)对天冬酰胺酶的治疗敏感。具体而言，用GSK3α抑制剂治疗使抗天冬酰胺酶的细胞致敏，从而使其易于受天冬酰胺酶的治疗的影响。因此，本发明的一个方面提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂。
本发明的进一步的方面部分基于以下发现：天冬酰胺酶对APC突变的人结直肠癌(CRC)或小鼠肠道类器官几乎无功效，但在R-spondin易位的情况下具有极度的细胞毒性；所述易位刺激Wnt配体诱导的GSK3的抑制。在APC突变的CRC中，GSK3α的药理学抑制作用足以使天冬酰胺酶致敏。因此，Wnt通路激活在CRC中提供了可利用的治疗弱点。
大多数CRC具有激活Wnt/β-连环蛋白信号转导的突变，但对于患有无法切除的疾病的患者而言结果仍然很差。特别考虑的是可以利用Wnt依赖性的蛋白的稳定和天冬酰胺酶的合成的杀伤性相互作用进行CRC治疗。本文实施例2中提供的数据表明，在用天冬酰胺酶处理的人CRC细胞和小鼠肠道类器官中，Wnt配体诱导的GSK3抑制作用对肿瘤具有极度的毒性，但对具有预计会激活β-连环蛋白而不抑制GSK3的APC突变的CRC却没有毒性作用。通过重组Wnt/R-spondin配体治疗或选择性抑制GSK3α，使APC突变的CRC对天冬酰胺酶致敏。
因此，本文还提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶，其中，所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。在一个实施方式中，与不具有引起GSK3α抑制的突变的实质上相同的细胞(例如，不具有该突变的癌细胞或非癌的野生型细胞)相比，GSK3α被抑制至少50％。在一个实施方式中，与不具有引起GSK3α抑制的突变的相同细胞相比，GSK3α被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更多。本领域技术人员可例如通过基于PCR的测定法或蛋白印迹法分别测量GSK3α的mRNA和蛋白水平来确定癌细胞是否具有抑制GSK3α的突变。评估GSK3α活性的功能测定法可进一步用于确定GSK3α是否被抑制。例如，本领域技术人员可以确定β-连环蛋白的核易位是否未能发生，表明GSK3α被抑制。
在各种实施方式中，本文所述的方法包括以下步骤：在给予治疗(例如，天冬酰胺酶和/或抑制GSK3α的药剂)之前，诊断受试者患有癌症或接收诊断受试者患有癌症的测定结果。熟练的临床医生可以使用本领域已知的各种测定方法诊断受试者患有癌症，示例性的测定包括：(1)体检，其中，熟练的临床医生感觉受试者的机体的区域的可能预示肿瘤的肿块或异常现象，例如可能表明癌症存在的皮肤颜色变化或器官肿大；(2)实验室检查，例如尿液和血液检查，以识别由癌症引起的异常。例如，在患有白血病的人中，称为全血细胞计数的常规血液检查可能揭示异常数量或类型的白细胞；(3)非侵入性影像学检查以检查你的骨骼和内脏的癌症或肿瘤的迹象。用于诊断癌症的影像学检查可包括计算机断层扫描(CT)、骨扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、超声和X射线等；以及(4)活检，其中熟练的临床医生从怀疑患有癌症的机体区域收集细胞样品进行测试。活检可以使用本领域已知的任何方法获得。使用本领域已知的标准检查活检样品以鉴定癌细胞的存在。
进行本文所述治疗方法的临床医生无需进行诊断癌症的测定。例如，第一临床医生可进行该测定以诊断并将测定的结果提供给将进行本文所述的治疗方法的第二临床医生。
在一个实施方式中，在给药之前，受试者被鉴定患有癌症，所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。在一个实施方式中，抑制GSK3α的突变是选自以下的基因中的突变：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)。在一个实施方式中，突变处于GSK3α基因中。例如，可以通过对该生物样品进行基因组测序并将该序列与该基因的野生型序列进行比较，在从受试者获得的生物样品中鉴定突变。示例性的生物样品包括组织样品或血液样品。可使用本领域已知的标准技术从受试者获得生物样品，例如，可从活检或标准抽血获得生物样品。
表1显示了上面列出的基因的基因ID号和别名。将理解的是，表1中列出的基因(例如，RSPO1)可指该基因的人类形式(例如，人RSPO1)，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。表1中列出的基因可以指该基因的哺乳动物形式，例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等。可通过在万维网www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/上搜索NCBI Gene ID而容易地识别表1中所列基因的核酸序列。
Figure BDA0002970131260000201
在另一实施方式中，抑制GSK3α的突变是改变选自以下的基因的表达的突变：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。如本文所用，“改变表达”是指与来自健康个体的样本中可比较的组织(例如，细胞类型)中的基因的表达相比，基因的水平(例如，增加或减少)或功能(例如，基因产物的产生)的改变显著不同。例如，本领域技术人员可以使用蛋白印迹法或基于PCR的测定法分别评估给定基因的基因产物或mRNA水平，或通过功能测定法来确定例如基因的下游功能是否正常出现，以确定给定基因的基因表达是否改变。
在一个实施方式中，所述突变引起WNT通路(例如经典WNT通路)的激活。经典的Wnt通路引起β-连环蛋白在细胞质中积累，并最终转移到细胞核中，充当属于TCF/LEF家族的转录因子的转录辅激活因子。没有Wnt，β-连环蛋白不会在细胞质中积聚，因为破坏复合体通常会降解它。这些破坏复合体包含以下的蛋白：轴蛋白、结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、糖原合酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1α(CK1α)。通过针对其进行泛素化作用来降解β-连环蛋白，随后将其发送至蛋白酶体进行消化。然而，一旦Wnt结合Fz和LRP5/6，破坏复合体功能就会被破坏。这是由于Wnt引起负Wnt调节剂、轴蛋白以及破坏复合体易位至质膜。破坏复合体中的其它蛋白的磷酸化随后将轴蛋白与LRP5/6的胞质尾结合。轴蛋白被去磷酸化，并且其稳定性和水平降低。然后，通过磷酸化激活Dsh，并且其DIX和PDZ结构域抑制了破坏复合体的GSK3活性。这使β-连环蛋白能够积累并定位至细胞核，并随后通过基因转导与TCF/LEF(T细胞因子/淋巴增强因子)转录因子一起诱导细胞响应。将理解的是，引起Wnt通路活化的突变可以是任何基因内的突变，并且不限于Wnt通路内的基因。激活Wnt通路的突变可以例如在调节Wnt通路上游的Wnt通路组分(例如轴蛋白)的基因中。
在一个实施方式中，与合适的对照相比，WNT信号转导被激活至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更多。如本文所用，“适当的对照”是指在其它相同的细胞群中的WNT信号转导的水平和/或活性，所述细胞群中没有携带已知能激活WNT信号转导的任何突变。本领域技术人员可通过例如经由免疫荧光鉴定细胞中的核β-连环蛋白的增加、或通过癌细胞的核组分的蛋白印迹法以探测β-连环蛋白的核水平来评估WNT信号转导是否激活。应将癌细胞中的核β-连环蛋白水平与没有WNT激活的突变的野生型细胞中的核β-连环蛋白水平进行比较。
本发明的另一方面提供了治疗癌症的方法，该方法包括：(a)从患有癌症的受试者获得生物样品；(b)分析样品并鉴定出具有引起GSK3α抑制的突变的癌症；以及(c)将天冬酰胺酶给予至已被鉴定患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
另一方面提供了治疗癌症的方法，该方法包括：(a)接收鉴定受试者患有癌症的测定的结果，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变；(b)将天冬酰胺酶给予至已被鉴定患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
癌症
如本文所用，“癌症”是指失去正常的细胞控制、导致失调的生长、缺乏分化、局部组织浸润和转移的细胞过度增殖。根据组织学类型(例如，其起源的组织)及其主要部位(例如，癌症首先发展的机体的位置)对癌症进行分类，并且可以是恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。“癌症”也可以指实体瘤。如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长，例如恶性类型或良性类型。“癌症”可能是转移性的，这意味着癌细胞已从其主要起源部位扩散并迁移至次级部位。
在各种实施方式中，本文治疗的癌症为恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或实体瘤。
恶性上皮肿瘤是起源于上皮组织的癌。恶性上皮肿瘤约占所有癌症的80％-90％。恶性上皮肿瘤可影响能够分泌的器官或腺体(例如，乳房、肺、前列腺、结肠或膀胱)。恶性上皮肿瘤有两种亚型：在器官或腺体中发展的腺癌，以及起源于鳞状上皮的鳞状细胞癌。腺癌通常发生在粘膜中，并被观察到为增厚的斑块状白色粘膜。其通常容易通过它们在其处发生的软组织扩散。示例性的腺癌包括但不限于肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食管癌和结直肠癌。鳞状细胞癌可起源于机体的任何区域。恶性上皮肿瘤的实例包括但不限于前列腺癌、结直肠癌、微卫星稳定性结肠癌、微卫星不稳定性结肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、原位导管癌、导管癌。
肉瘤是起源于支持和结缔组织(例如骨骼、肌腱、软骨、肌肉和脂肪)的癌。肉瘤肿瘤通常看起来像其生长的组织。肉瘤的非限制性实例包括骨肉瘤或成骨肉瘤(起源于骨骼)、软骨肉瘤(起源于软骨)、平滑肌肉瘤(起源于平滑肌)、横纹肌肉瘤(起源于骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(起源于体腔的膜状内衬)、纤维肉瘤(起源于纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(起源于血管)、脂肪肉瘤(起源于脂肪组织)、胶质瘤或星形细胞瘤(起源于见于大脑中的神经源性结缔组织)、粘液肉瘤(起源于原始的胚性结缔组织)、或间叶或混合的中胚叶肿瘤(起源于混合的结缔组织类型)。
黑色素瘤是从含色素的黑色素细胞形成的一类癌症。黑色素瘤通常在皮肤中发展，但也可能发生在口腔、肠道或眼睛中。
骨髓瘤是起源于骨髓的浆细胞的癌症。骨髓瘤的非限制性实例包括多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和淀粉样变性。
淋巴瘤在净化体液并产生白细胞或淋巴细胞的淋巴系统(例如，脾、扁桃体和胸腺)的腺体或淋巴结中发展。与白血病不同，淋巴瘤形成实体瘤。淋巴瘤也可出现在特定的器官中，例如胃、乳房或脑；这被称为结外淋巴瘤。淋巴瘤被细分为两类：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤中的Reed-Sternberg细胞的存在在诊断学上将霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤区分开来。淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)。在一个实施方式中，癌症是DLBCL或滤泡性淋巴瘤。
白血病(也称为“血癌”)是骨髓的癌症，所述骨髓是血细胞产生的部位。白血病通常与不成熟白细胞的过量产生有关。不成熟白细胞不能正常行使功能，使患者易于感染。白血病额外影响红细胞，并可因贫血而导致凝血不良和疲劳。
在任何方面的一个实施方式中，白血病为急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。白血病的实例包括但不限于：骨髓性或粒细胞性白血病(髓系和粒细胞性白细胞系列的恶性肿瘤)，淋巴性、淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病(淋巴样和淋巴细胞性血细胞系列的恶性肿瘤)以及真性红细胞增多症或红细胞增多症(各种血细胞产物的恶性肿瘤，但以红细胞为主)。
在一个实施方式中，癌症为实体瘤。实体瘤的非限制性实例包括肾上腺皮质肿瘤、腺泡状软组织肉瘤、软骨肉瘤、结直肠癌、硬纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦肿瘤、上皮样血管内皮瘤、尤文氏肉瘤、生殖细胞瘤(实体瘤)、骨和软组织的巨细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、脊椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和Wilms瘤。实体瘤可见于骨骼、肌肉或器官中，并且可为肉瘤或恶性上皮肿瘤。
在任何方面的一个实施方式中，癌对癌症治疗具有抗性。在任何方面的一个实施方式中，癌对天冬酰胺酶具有抗性。对治疗(例如天冬酰胺酶)有抗性的癌是以前对治疗有响应的癌，但是尽管存在持续治疗，现在仍能够生长或持续存在。对治疗的抗性可能由于如下而出现：例如癌细胞中的获得性突变，癌细胞中的基因扩增或癌细胞发展出阻止利用治疗的机制。在任何方面的一个实施方式中，癌对癌症治疗或天冬酰胺酶不具有抗性。
在一个实施方式中，癌是转移性的(例如，癌已经从其主要位置扩散到至少一个次级位置)。
在一个实施方式中，在给予癌症治疗后癌已经复发。“复发癌”定义为在一段时间的改善后疾病或疾病的征象和症状的恢复。
天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂
天冬酰胺酶(一种降解非必需氨基酸天冬酰胺的抗白血病酶)是用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的化学疗法药物。其也可用于治疗一些其它的血液障碍。天冬酰胺酶在本领域中也称为例如Erwinase、Cristantaspase或L-天冬酰胺酶。天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺转化为天冬氨酸和氨，从而使白血病细胞失去天冬酰胺循环，从而导致细胞死亡。
在一个实施方式中，天冬酰胺酶为L-天冬酰胺酶(Elspar)、培门冬酶(PEG-天冬酰胺酶；Oncaspar)、SC-PEG天冬酰胺酶(Calaspargase pegol)、欧文氏菌天冬酰胺酶(Erwinaze，重组Crisantaspase或半衰期延长或聚乙二醇化的重组Crisantaspase)。
天然形式或与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化的)的L-天冬酰胺酶(Elspar)、培门冬酶(PEG-天冬酰胺酶；Oncaspar)和SC-PEG天冬酰胺酶(Calaspargase pegol)均基于大肠杆菌(Escherichia coli)天冬酰胺酶基因ansB，其编码具有SEQ ID NO：23的序列的基因产物。
Figure BDA0002970131260000251
天然形式或与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化的)的欧文氏菌天冬酰胺酶(Erwinaze，重组Crisantaspase或半衰期延长或聚乙二醇化的重组Crisantaspase)基于来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi；也称为Dickeya chrysanthemi)的ansB基因，其编码具有SEQID NO：24的序列的基因产物。
Figure BDA0002970131260000252
在一个实施方式中，天冬酰胺酶编码具有如下序列的基因产物，所述序列包含与SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列。在一个实施方式中，天冬酰胺酶编码具有包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的整个序列的序列的基因产物。在另一实施方式中，天冬酰胺酶编码具有SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的序列的基因产物，其中，该片段保留了天冬酰胺酶的期望功能，例如抗白血病的酶活性。
纯化和递送天冬酰胺酶的方法、以及包含天冬酰胺酶的组合物进一步描述于例如美国专利No.3440142、3511754、3511755、3597323、3652402、3620925、3686072、3773624、4617271、6368845、7666652、9181552、9920311、10273444；美国专利公开No.2002/0102251、2003/0186380、2010/00183765、2012/0100249、2013/0023029；以及国际申请No.WO1999/039732；其内容通过引用以其整体并入本文。
在一个方面，将抑制GSK3α的药剂与天冬酰胺酶组合给予至患有癌症(例如白血病)的受试者。在一个实施方式中，抑制GSK3α的药剂为小分子、抗体或抗体片段、肽、反义寡核苷酸、基因组编辑系统或RNAi。
本文描述的药剂靶向GSK3α以用于其抑制。如果例如在给药时，该药剂抑制细胞中的GSK3α的存在、量、活性和/或水平，则认为该药剂有效抑制GSK3α。在一个实施方式中，与适当的对照相比，药剂将GSK3α的水平和/或活性抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多。如本文所用，“适当的对照”是指在给予药剂之前的GSK3α的水平和/或活性，或未与药剂接触的细胞群中的GSK3α的水平和/或活性。抑制GSK3α将阻止WNT信号通路的激活。本领域技术人员可使用基于PCR的测定法或蛋白印迹法分别评估GSK3αmRNA或蛋白质水平，或通过抗GSK3α抗体的免疫荧光使GSK3α蛋白可视化，来确定GSK3α的存在、数量或水平是否已降低。本领域技术人员可使用功能性测定来确定GSK3α的活性是否降低，所述功能测定评估GSK3α的下游作用，例如用抗磷酸化β-连环蛋白的特异性抗体通过蛋白印迹或免疫荧光来确定其下游底物β-连环蛋白是否被磷酸化。
例如，药剂可抑制细胞中的GSK3α的转录或翻译。药剂可抑制细胞中的GSK3α的活性或改变其活性(例如，以使该活性不再出现或以降低的比率出现)(例如，GSK3α的表达)。
在一个实施方式中，抑制GSK3α的药剂促进程序性细胞死亡，例如杀死细胞。为了确定药剂是否有效抑制GSK3α，可以分别使用RT-PCR和蛋白印迹评估给定靶标(例如GSK3α)的mRNA和蛋白水平。检测GSK3α活性(例如WNT激活)的生物学测定法可用于评估是否发生了程序性细胞死亡。
药剂可以以其给药的形式直接起作用。或者，可以在细胞内修饰或利用该药剂以产生抑制GSK3α的物质，例如将核酸序列引入细胞并且其转录引起GSK3α的核酸和/或蛋白抑制剂的产生。在一些实施方式中，所述药剂为任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白类实体。在某些实施方式中，所述药剂为具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳基或杂环基部分(包括大环内酯、细霉素和相关的天然产物或其类似物)。已知药剂可具有期望的活性和/或性质，或者可以从多种化合物的文库中鉴定。
在各种实施方式中，所述药剂为抑制GSK3α的小分子。GSK3α的示例性小分子抑制剂包括BRD0705、BRD4963、BRD1652、BRD3731、CHIR-98014、LY2090314、AZD1080、CHIR-99021(CT99021)HCl、CHIR-99021(CT99021)、BIO-丙酮肟、SB216763、SB415286、Abemaciclib(LY2835210)、AT-9283、RGB-286638、PHA-793887、AT-7519、AZD-5438、OTS-167、9-ING-41、Tideglusib(NP031112)和AR-A014418。表2示出了示例性的GSK3α小分子抑制剂的化学结构。
Figure BDA0002970131260000271
Figure BDA0002970131260000281
Figure BDA0002970131260000291
此外，在一个实施方式中，小分子为本文描述的任何小分子(例如在表2中列出的)的衍生物、变体或类似物，或基本上类似于本文所述的任何小分子。当分子包含通常不是该分子的一部分的额外的化学部分和/或已被化学修饰时，其称为另一分子的“衍生物”。这样的部分可改善分子的表达水平、酶活性、溶解性、吸收、生物学半衰期等。这些部分能够可选地降低分子的毒性，消除或减轻分子的任何不良副作用等。在A.R.Gennaro编的“Remington's Pharmaceutical Sciences”，第18版，MackPubl.,Easton,PA(l990)中公开了能够介导这种作用的方法。分子的“变体”是指在结构和功能上与整个分子或其片段基本上相似的分子。如果两个分子都具有基本相似的结构和/或如果两个分子都具有相似的生物活性，则称该分子与另一分子“基本相似”。因此，假如两个分子具有相似的活性，即使其中一个分子的结构在另一分子中未发现，或者结构不相同，也可以将它们视为此处使用的术语变体。分子的“类似物”是指功能与整个分子或其片段基本上相似的分子。
在一个实施方式中，将GSK3α的小分子抑制剂(例如表2中列出的小分子)缀合至E3泛素连接酶招募元件。如本文所用，“缀合”是指将两个以上的较小实体(例如，小分子和E3泛素连接酶招募元件)连接、联合、缔合、键合(共价或非共价)或其任何组合，以形成更大的实体。缀合的E3泛素连接酶招募元件招募E3；所述E3介导泛素从E2转移到蛋白底物。泛素与蛋白底物的结合标志着蛋白通过泛素蛋白酶体系统降解。因此，与E3泛素连接酶招募元件缀合的GSK3α小分子抑制剂将例如与GSK3α结合并随后促进其降解。E3泛素连接酶招募元件可以包括但不限于沙利度胺、来那度胺、泊马度胺或模拟HIF1-α的羟脯氨酸降解基序的VHL配体。示例性的E3泛素连接酶招募元件的化学结构在本文表3中给出，并在例如“Pavia，SL，and Crews，CM.Current Opinion in Chemical Biology.2019.50；111-119”中进一步描述，其内容通过引用整体并入本文。在美国专利No.7,208,157B2和9,770,512中进一步描述了缀合的E3泛素连接酶招募元件的使用，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，与E3泛素连接酶招募元件缀合的小分子进一步包含接头。本文中特别考虑的是，为了小分子和E3泛素连接酶招募元件的最大功效，将优化接头的规格(例如，长度、序列等)。例如，将接头设计成使其不干扰小分子与其靶标(例如，感兴趣的蛋白上的结合口袋)的结合或泛素从E2向蛋白底物的转移。
表3
Figure BDA0002970131260000311
在各种实施方式中，抑制GSK3α的药剂为抗体或其抗原结合片段，或对GSK3α而言特异性的抗体试剂。如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白可变域序列并且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可包含抗体或多肽；所述多肽包含抗体的抗原结合结构域。在任何方面的一些实施方式中，抗体试剂可包含单克隆抗体或多肽；所述多肽包含单克隆抗体的抗原结合结构域。例如，抗体可包含重(H)链可变区(在本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文缩写为VL)。在另一实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖了抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv、CDR和结构域抗体(dAb)片段(例如参见de Wildt等，Eur J.Immunol.1996；26(3)：629-39；通过引用整体并入本文))以及完整抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM(以及其亚型和组合)的结构特征。抗体可来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)和灵长类动物化抗体。抗体还包括midibodies、纳米抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
在一个实施方式中，抗体或抗体试剂结合至对应于编码GSK3α的氨基酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
Figure BDA0002970131260000321
在另一实施方式中，抗GSK3α抗体或抗体试剂结合至包含SEQ ID NO：2的序列的氨基酸序列；或结合至包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的序列的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗GSK3α抗体或抗体试剂结合至包含SEQ ID NO：2的整个序列的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗体或抗体试剂结合至包含SEQ ID NO：2的序列的片段的氨基酸序列，其中，该片段足以结合其靶标(例如GSK3α)，并抑制GSK3α活性和/或表达。
在一个实施方式中，将抗GSK3α抗体或抗体试剂缀合至E3泛素连接酶招募元件。在一个实施方式中，与E3泛素连接酶招募元件缀合的抗GSK3α抗体或抗体试剂进一步包含接头。
在一个实施方式中，抑制GSK3α的药剂为反义寡核苷酸。如本文所用，“反义寡核苷酸”是指与DNA或mRNA序列(例如微小RNA的序列)互补的合成的核酸序列。反义寡核苷酸通常被设计成通过与靶标结合并在转录、翻译或剪接水平上停止表达来阻断DNA或RNA靶标的表达。本发明的反义寡核苷酸是被设计成在细胞条件下与基因(例如GSK3α)杂交的互补的核酸序列。因此，选择与靶标充分互补的寡核苷酸，即，在细胞环境的情况下充分杂交并具有足够特异性的寡核苷酸，以产生期望的效果。例如，抑制GSK3α的反义寡核苷酸可分别包含与人GSK3α基因的编码序列的一部分(例如，SEQ ID NO：1)互补的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或更多个碱基。
在一个实施方式中，使用包括但不限于锌指核酸酶、TALENS、大范围核酸酶和CRISPR/Cas系统的任何基因组编辑系统从细胞的基因组中耗竭GSK3α。在一个实施方式中，用于将编码一种或多种引导RNA的核酸掺入细胞基因组的基因组编辑系统不是CRISPR/Cas系统；这可以防止保留少量Cas酶/蛋白的细胞中的不期望的细胞死亡。本文还考虑的是Cas酶或sgRNA各自在不同的诱导型启动子的控制下表达，从而允许其各自的时序表达以防止这种干扰。
当编码一种或多种sgRNA的核酸和编码RNA引导的核酸内切酶的核酸各自需要在体内给予时，特别考虑的是使用腺病毒相关载体(AAV)。用于将核酸同时递送至基因组编辑/片段化系统的两个组分(例如sgRNA、RNA引导的核酸内切酶)的其它载体包括慢病毒载体，例如Epstein Barr、人免疫缺陷病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)。RNA引导的基因组编辑系统的每个组分(例如，sgRNA和核酸内切酶)可以如本领域已知的或如本文所述的以分开的载体递送。
在一个实施方式中，药剂通过RNA抑制来抑制GSK3α。给定基因表达的抑制剂可为抑制性核酸。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸为抑制性RNA(iRNA)。RNAi可为单链或双链的。
iRNA可为siRNA、shRNA、内源性微小RNA(miRNA)或人工miRNA。在一个实施方式中，如本文所述的iRNA引起对靶标(例如GSK3α)的表达和/或活性的抑制。在任何方面的一些实施方式中，药剂为抑制GSK3α的siRNA。在任何方面的一些实施方式中，药剂为抑制GSK3α的shRNA。
例如，本领域技术人员能够使用公开可用的设计工具设计靶向GSK3α的siRNA、shRNA或miRNA。通常使用Dharmacon(Layfayette，CO)或Sigma Aldrich(St.Louis，MO)等公司生产siRNA、shRNA或miRNA。
在任何方面的一些实施方式中，iRNA可为dsRNA。dsRNA包括两条RNA链，其在将使用dsRNA的条件下足够互补以杂交形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包含互补区域，所述区域与靶序列实质上互补，并且通常完全互补。靶序列可以衍生自在靶标表达过程中形成的mRNA的序列。另一条链(正义链)包含与反义链互补的区域，以使得当在合适条件下结合时，两条链杂交并形成双链体结构。
iRNA的RNA可被化学修饰以增强稳定性或其它有益特性。可通过本领域良好建立的方法(例如Beaucage，S.L.等编的“Current protocols in nucleic acid chemistry”John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中描述的那些方法，其通过引用并入本文)来合成和/或修饰本发明中表征的核酸。
在一个实施方式中，药剂为抑制GSK3α的miRNA。微小RNA为具有平均长度为22个核苷酸的小的非编码RNA。这些分子通过与通常在3'非翻译(3'UTR)区域中的mRNA分子内的互补序列结合而起作用，从而促进靶mRNA降解或抑制mRNA翻译。微小RNA和mRNA之间的相互作用由所谓的“种子序列”介导，所述序列为微小RNA的6-8个核苷酸的区域，其通过不完全的沃森-克里克碱基配对指导与mRNA的序列特异性结合。已知在哺乳动物中表达了900多种微小RNA。这些中的许多可基于其种子序列分组为家族，从而鉴定相似的微小RNA的“簇”。例如，miRNA可作为裸DNA在细胞中表达。例如，miRNA可作为裸DNA由在细胞中表达的核酸编码，或者可由载体中包含的核酸编码。
例如，药剂可使用RNAi分子(例如，siRNA或miRNA)引起靶基因(例如，GSK3α)的基因沉默。这需要靶细胞中的mRNA水平比不存在该药剂的细胞中的mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。在一个优选的实施方式中，mRNA水平降低至少约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。例如，通过将siRNA、shRNA或miRNA转染到细胞中并通过蛋白印迹法检测在细胞内发现的基因(例如GSK3α)的水平，本领域技术人员将能够容易地评估siRNA、shRNA或miRNA是否有效靶向例如GSK3α使其下调。
药剂可包含在载体中，并因此进一步包括载体。有许多可用于将外源基因转移到靶哺乳动物细胞中的此类载体。载体可为附加型载体(例如质粒、病毒衍生的载体(例如巨细胞病毒、腺病毒等))，或者可通过同源重组或随机整合而整合到靶细胞基因组中(例如，逆转录病毒衍生的载体，例如MMLV、HIV-1、ALV等)。在一些实施方式中，也可发现使用逆转录病毒和合适的包装细胞系的组合，其中衣壳蛋白将具有感染靶细胞的功能。通常，将细胞和病毒在培养基中孵育至少约24小时。然后，在进行分析之前，允许细胞在培养基中短时间生长(例如在某些应用中，24-73小时)，或生长至少两周，并且可允许生长5周或更长。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”，即不能产生有效感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中生长。
如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可为病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒粒等。
如本文所用，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽(例如，GSK3α抑制剂)从其中包含的核酸序列表达的载体，所述核酸序列与载体上的转录调控序列连接。表达的序列通常但不必然与细胞异源。表达载体可包含额外的元件，例如，表达载体可具有两个复制系统，从而使其可保持在两种生物体中，例如在人类细胞中进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白以及适当时分泌蛋白的细胞过程，可应用时包括但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。术语“基因”是指当可操作地连接至合适的调控序列时，在体外或体内转录为RNA的核酸序列(DNA)。基因可包括或可不包括编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾随”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
整合载体将其递送的RNA/DNA永久掺入宿主细胞染色体中。非整合载体保持游离，这意味着其中所含的核酸从未整合到宿主细胞染色体中。整合载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、杂交腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
非整合载体的一个实例为非整合病毒载体。非整合病毒载体消除了整合逆转录病毒带来的风险，因为其不会将其基因组整合到宿主DNA中。一个实例为Epstein Barr oriP/核抗原-1(“EBNA1”)载体，所述载体能够有限的自我复制并且已知在哺乳动物细胞中起作用。由于包含Epstein Barr病毒的两个元件oriP和EBNA1，因此EBNA1蛋白与病毒复制子区oriP的结合维持了在哺乳动物细胞中的质粒的相对长期的游离存在。oriP/EBNA1载体的这一特定特征使其理想地用于产生无整合的iPSC。另一非整合病毒载体为腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。
另一非整合病毒载体为RNA Sendai病毒载体，所述载体可产生蛋白而不会进入经感染细胞的细胞核。F缺损型Sendai病毒载体在经感染细胞的细胞质中保留了数代，但在数代(例如10代)后迅速被稀释并完全消失。
非整合载体的另一实例为微环载体。微环载体为环状载体，其中质粒骨架已被释出，而仅留下了真核启动子和待表达的cDNA。
如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含病毒来源的至少一个元件并且具有被包装入病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可包含编码本文所述的多肽的核酸替代非必需的病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。多种形式的病毒载体是本领域已知的。
给予/给药
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及治疗患有或被诊断为患有癌症(例如，白血病、结肠癌或胰腺癌)的受试者，包括将本文所述的天冬酰胺酶与抑制GSK3α的药物联合给药。在一些实施方式中，本文所述的方法涉及治疗患有或被诊断患有包含引起GSK3α抑制的突变的癌症的受试者，包括给予本文所述的天冬酰胺酶。可通过医师使用当前的诊断症状的方法来鉴别患有癌症的受试者。表征该疾病并有助于诊断的癌症症状和/或并发症在本领域中是众所周知的。例如，可帮助诊断癌症的测试包括血液测试和非侵入性成像。特定癌症的家族史也将有助于确定受试者是否可能患有该疾病或做出癌症诊断。
本文所述的药剂(例如，抑制GSK3α的药剂)和天冬酰胺酶可联合给予至患有或被诊断为患有癌症(例如，白血病、结肠癌或胰腺癌)的受试者。本文所述的药剂或天冬酰胺酶的给药可以以多种方式进行，例如以单剂量、以重复的多个剂量、通过连续输注、通过脉冲给药。在一个实施方式中，本文所述的药剂或天冬酰胺酶可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时；或每1、2、3、4、5、6或7天；或每1、2、3或4周；或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长时间至少一次给予至受试者。例如，本文中特别考虑的是，本文所述的药剂或天冬酰胺酶的服用基于药剂的半衰期来确定，例如以使得患者中的药剂的作用(例如，对GSKα的抑制)是连续的或接近连续的。例如，如果给定的GSKα抑制剂的半衰期为12小时，则应每12小时对受试者给药一次，以使其在受试者中维持GSKα的持续抑制。
在一个实施方式中，抑制GSK3α和天冬酰胺酶的药剂以相同的方式给药，例如，抑制GSK3α和天冬酰胺酶的药剂以单剂量、多剂量、通过连续输注、通过脉冲给药。在一个实施方式中，抑制GSK3α的药剂和天冬酰胺酶以不同的方式给药，例如，抑制GSK3α的药剂通过连续输注给药，而天冬酰胺酶以单剂量给药。
在一个实施方式中，将抑制GSK3α的药剂和天冬酰胺酶一起配制在用于给药的一个组合物中。在一个实施方式中，将抑制GSK3α的药剂和天冬酰胺酶配制在单独的组合物中，并作为单独的组合物给药。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的药剂，以减轻给定癌症的至少一种症状。如本文所用，“减轻给定癌症的至少一种症状”是缓解与癌症有关的任何病症或症状。与等同的未处理对照相比，按任何标准技术测得的减少至少为5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。用于向受试者给予本文所述的药剂和/或天冬酰胺酶的多种手段是本领域技术人员已知的。在一个实施方式中，将药剂全身或局部给药(例如，给予至受影响的器官，例如结肠)。在一个实施方式中，将药剂静脉内给药。在一个实施方式中，将药剂连续地、间隔地或偶发地给药。药剂的给药途径将针对所递送的药剂的类型(例如抗体、小分子、RNAi)进行优化，并且可以由熟练的从业者确定。
如本文所用，术语“有效量”是指可向患有或诊断为患有需要缓解至少一种或多种癌症症状的癌症(例如白血病、结肠癌或胰腺癌)的受试者给予的药物(例如，抑制GSK3α的药剂)和/或天冬酰胺酶的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予典型的受试者时，足以提供特定的抗癌作用的药剂和/或天冬酰胺酶的量。在各种情况下，本文中使用的有效量还包括足以延迟癌症症状的进展、改变癌症症状的过程(例如，减慢癌症的进程)或逆转癌症的症状的药剂和/或天冬酰胺酶的量。因此，通常无法指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的“有效量”。
在一个实施方式中，将药剂和/或天冬酰胺酶连续给药(例如，在一段时间内以恒定水平给药)。例如，可以通过表皮贴剂、连续释放制剂或随身注射器(on-body injector)来实现药剂的连续给药。
可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序评估有效量、毒性和治疗功效。剂量可以根据所采用的剂型和所采用的给药途径而变化。毒性作用和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并可以表示为LD50/ED50之比。表现出高的治疗指数的组合物和方法是优选的。可从细胞培养测定中初步评估治疗有效剂量。同样，可在动物模型中配制剂量，以达到循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养物或适当的动物模型中测定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的药剂的浓度)。例如，可通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。可通过合适的生物测定法(例如测量神经功能或血液功能等)来监测任何特定剂量的效果。如有需要，剂量可由医生确定并调整以适合所观察到的治疗效果。
剂量
本文使用的术语“单位剂型”是指合适的一次给药的剂量。举例来说，单位剂型可为置于递送装置(例如注射器或静脉滴注袋)中的治疗剂的量。在一个实施方式中，单位剂型以单次给药进行给予。在另一实施方式中，可同时给予多于一个的单位剂型。
通常，剂量范围在0.001mg/kg体重至5g/kg体重之间，包括端值。在一些实施方式中，剂量范围从0.001mg/kg体重至1g/kg体重、从0.001mg/kg体重至0.5g/kg体重、从0.001mg/kg体重至0.1g/kg体重。从0.001mg/kg体重至50mg/kg体重、从0.001mg/kg体重至25mg/kg体重、从0.001mg/kg体重至10mg/kg体重、从0.001mg/kg体重至5mg/kg体重、从0.001mg/kg体重至1mg/kg体重、从0.001mg/kg体重至0.1mg/kg体重、从0.001mg/kg体重至0.005mg/kg体重。或者，在一些实施方式中，剂量范围从0.1g/kg体重至5g/kg体重、从0.5g/kg体重至5g/kg体重、从1g/kg体重至5g/kg体重、从1.5g/kg体重至5g/kg体重、从2g/kg体重至5g/kg体重、从2.5g/kg体重至5g/kg体重、从3g/kg体重至5g/kg体重、从3.5g/kg体重至5g/kg体重、从4g/kg体重至5g/kg体重、从4.5g/kg体重至5g/kg体重、从4.8g/kg体重至5g/kg体重。在一个实施方式中，剂量范围是从5μg/kg体重至30μg/kg体重。或者，对剂量范围进行滴定测量以保持血清水平在5μg/mL和30μg/mL之间。
如有需要，如本文所述的药剂和/或天冬酰胺酶的剂量可由医师确定并进行调整，以适合所观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，对熟练的临床医生而言，一般监测受试者以确定该治疗何时提供治疗益处，并确定是否给予进一步的细胞、中止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其它改变。剂量不应太大而引起不良副作用，例如细胞因子释放综合征。通常，剂量将随患者的年龄、状况和性别而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可由个别医生进行调整。
组合治疗
一方面，将本文所述的药剂和天冬酰胺酶组合给药以治疗癌症。如本文所用，“组合”给药是指在受试者受障碍折磨的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗(例如，天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂或癌症治疗)，例如，在已经诊断出受试者患有所述疾病(例如，癌症)之后，并在所述疾病被治愈或消除或由于其它原因而停止治疗之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方式中，当开始第二种治疗时，一种治疗仍在进行中，因此在给药方面存在重叠。在本文中有时将其称为“同时”或“并行递送”。在其它实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方式中，由于组合给药，治疗更有效。例如，诸如与如果在不存在第一治疗的情况下给予第二治疗所观察到的相比，用更少的第二治疗观察到等同的效果、或第二治疗更大程度减少症状，第二治疗更有效，或用第一治疗观察到相似的情况。在一些实施方式中，递送使得症状或与障碍有关的其它参数的降低大于在不存在另一种治疗的情况下所递送的一种治疗观察到的降低。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可使得当递送第二种治疗时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。本文所述的药剂和至少一种另外的疗法可以同时、以相同或分开的组合物或顺序给药。对于顺序给药，可首先给予本文所述的药剂和/或天冬酰胺酶，并且可随后给予另外的药剂，或者可颠倒给药顺序。可在障碍活跃期或在缓解期或疾病较不活跃期间给予药剂和/或其它治疗药剂、程序或模式。可在另一种治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在障碍缓解期间给予药剂。
当组合给药时，可以以比单独使用的每种药剂(例如，作为单一疗法)的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量来给予药剂和天冬酰胺酶或全部。在某些实施方式中，与每种药剂的单独使用的量或剂量相比，药剂、额外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的给药量或剂量更低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实施方式中，与达到相同治疗效果所需的每种药剂的量或剂量相比，产生期望效果(例如，癌症的治疗)的药剂、额外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量更低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在一个实施方式中，癌症治疗选自于由如下所组成的组：化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术、激素疗法、干细胞疗法、靶向疗法、基因疗法和精准疗法。
在本文描述的任何方法的其它实施方式中，癌症治疗选自于由如下所组成的组：生长抑制剂、细胞毒剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、抗HER-2抗体、抗-CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂、HER1/EGFR抑制剂、血小板衍生生长因子抑制剂、COX-2抑制剂、干扰素和细胞因子(例如，G-CSF，粒细胞集落刺激因子)。
在其它实施方式中，癌症治疗选自于由如下所组成的组：13-顺-视黄酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巯基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤、乙酸阿比特龙、Abraxane、
Figure BDA0002970131260000401
放线菌素-D、
Figure BDA0002970131260000402
阿地白介素、阿仑单抗、力比泰、阿利维甲酸、
Figure BDA0002970131260000403
全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、
Figure BDA0002970131260000404
阿那曲唑、阿糖胞苷、Ara-C、
Figure BDA0002970131260000405
Figure BDA0002970131260000406
三氧化二砷、ArzerraTM、天冬酰胺酶、ATRA、
Figure BDA0002970131260000411
阿昔替尼、阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、
Figure BDA0002970131260000412
比卡鲁胺、BiCNU、
Figure BDA0002970131260000413
博来霉素、硼替佐米、白消安、
Figure BDA0002970131260000414
C225、卡巴他赛、甲酰四氢叶酸钙、
Figure BDA0002970131260000415
Figure BDA0002970131260000416
喜树碱-11、卡培他滨、
Figure BDA0002970131260000417
CaracTM、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀膜片、
Figure BDA0002970131260000418
CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、
Figure BDA0002970131260000419
西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、甲酰四氢叶酸、克拉屈滨、可的松、
Figure BDA00029701312600004110
CPT-11、克唑替尼、环磷酰胺、
Figure BDA00029701312600004111
阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、
Figure BDA00029701312600004112
达卡巴嗪、Dacogen、放线菌素D、阿法达比泊汀、达沙替尼、柔红霉素、道诺霉素、道诺霉素盐酸盐、道诺霉素脂质体、
Figure BDA00029701312600004113
地塞米松、地西他滨、
Figure BDA00029701312600004114
Figure BDA00029701312600004115
Denileukin Diftitox、Denosumab、DepoCytTM、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、磷酸钠地塞米松、右丙亚胺、DHAD、DIC、Diodex、多西他赛、
Figure BDA00029701312600004116
阿霉素、阿霉素脂质体、DroxiaTM、DTIC、
Figure BDA00029701312600004117
Figure BDA00029701312600004118
Eculizumab、
Figure BDA00029701312600004119
EligardTM、EllenceTM、乐沙定TM、
Figure BDA00029701312600004120
表柔比星、Epoetin Alpha、Erbitux、Eribulin、埃罗替尼、欧文氏菌L-天冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol、
Figure BDA00029701312600004121
依托泊苷、磷酸依托泊苷、
Figure BDA00029701312600004122
依维莫司、
Figure BDA00029701312600004123
依西美坦、
Figure BDA00029701312600004124
Figure BDA00029701312600004125
非格司亭、氟尿苷、
Figure BDA00029701312600004126
氟达拉滨、
Figure BDA00029701312600004127
氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、
Figure BDA00029701312600004128
Fulvestrant、吉非替尼、吉西他滨、Gemtuzumab ozogamicin、健择、格列卫TM、
Figure BDA00029701312600004129
膜片、戈舍瑞林、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、
Figure BDA00029701312600004130
Hexadrol、
Figure BDA00029701312600004131
六甲三聚氰胺、HMM、
Figure BDA00029701312600004132
Hydrocort
Figure BDA00029701312600004133
氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松丁二酸钠、磷酸氢化可的松、羟基脲、替伊莫单抗、Ibritumomab Tiuxetan、
Figure BDA00029701312600004134
伊达比星、
Figure BDA00029701312600004135
IFN-α、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼、咪唑羧酰胺、
Figure BDA00029701312600004136
干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白介素-2、白介素-11、
Figure BDA00029701312600004137
(干扰素α-2b)、伊匹单抗、
Figure BDA00029701312600004138
伊立替康、异维A酸、伊沙匹隆、IxempraTM、
Figure BDA00029701312600004139
Kidrolase(t)、
Figure BDA00029701312600004140
拉帕替尼、L-天冬酰胺酶、LCR、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、瘤可宁、沙格司亭TM、亮丙瑞林、长春新碱、克拉立平TM、脂质体Ara-C、Liquid
Figure BDA00029701312600004141
洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素、
Figure BDA00029701312600004142
Lupron
Figure BDA0002970131260000421
Maxidex、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺盐酸盐、
Figure BDA0002970131260000422
甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、MesnexTM、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲泼尼龙、
Figure BDA0002970131260000423
丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、
Figure BDA0002970131260000424
MTC、MTX、
Figure BDA0002970131260000425
氮芥、
Figure BDA0002970131260000426
MylocelTM、
Figure BDA0002970131260000427
Figure BDA0002970131260000428
奈拉滨、环磷酰胺、NeulastaTM、
Figure BDA0002970131260000429
Figure BDA00029701312600004210
尼洛替尼、Nilutamide、
Figure BDA00029701312600004211
氮芥子气、
Figure BDA00029701312600004212
Figure BDA00029701312600004213
Nplate、奥曲肽、乙酸奥曲肽、奥法木单抗、
Figure BDA00029701312600004214
Figure BDA00029701312600004215
OnxalTM、奥普瑞白介素、
Figure BDA00029701312600004216
奥沙利铂、紫杉醇、与紫杉醇结合的蛋白、帕米膦酸盐、帕尼单抗、
Figure BDA00029701312600004217
Figure BDA00029701312600004218
PEG干扰素、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、PEG-INTRONTM、PEG-L-天冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥、
Figure BDA00029701312600004219
泼尼松龙、强的松、
Figure BDA00029701312600004220
甲苄肼、
Figure BDA00029701312600004221
带有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、
Figure BDA00029701312600004222
雷洛昔芬、
Figure BDA00029701312600004223
利妥昔单抗、
Figure BDA00029701312600004224
(干扰素α-2a)、Romiplostim、
Figure BDA00029701312600004225
盐酸柔红霉素、
Figure BDA00029701312600004226
善得定
Figure BDA00029701312600004227
沙格司亭、Sipuleucel-T、
Figure BDA00029701312600004228
Figure BDA00029701312600004229
索拉非尼、达沙替尼TM、STI-571、链脲菌素、SU11248、舒尼替尼、
Figure BDA00029701312600004230
他莫昔芬、
Figure BDA00029701312600004231
Figure BDA00029701312600004232
替莫唑胺、西罗莫司、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、
Figure BDA00029701312600004233
硫鸟嘌呤、
Figure BDA00029701312600004234
Thiophosphoamide、
Figure BDA00029701312600004235
噻替派、
Figure BDA00029701312600004236
拓扑替康、托瑞米芬、
Figure BDA00029701312600004237
托西莫单抗、曲妥珠单抗、
Figure BDA00029701312600004238
维甲酸、TrexallTM、
Figure BDA00029701312600004239
TSPA、
Figure BDA00029701312600004240
戊柔比星、Valstar、vandetanib、VCR、VectibixTM、
Figure BDA00029701312600004241
Vemurafenib、
Figure BDA00029701312600004242
ViadurTM、
Figure BDA00029701312600004243
长春碱、硫酸长春碱、Vincasar
Figure BDA00029701312600004244
长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VM-26、伏立诺他、帕唑帕尼、VP-16、
Figure BDA00029701312600004245
赛科瑞胶囊、
Figure BDA00029701312600004246
Zelboraf、ZevalinTM、
Figure BDA00029701312600004247
唑来膦酸、Zolinza、
Figure BDA00029701312600004248
和
Figure BDA00029701312600004249
肠胃外剂型
可通过多种途径向受试者给予本文所述的药剂和/或天冬酰胺酶的肠胃外剂型，包括但不限于皮下的、静脉内的(包括推注)、肌内的和动脉内的。由于肠胃外剂型的给药通常绕过患者对污染物的天然防御，因此肠胃外剂型优选是无菌的或能够在给予患者之前灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备好注射的溶液、准备好溶解或悬浮在药学上可接受的注射溶媒中的干燥产品、准备好注射的混悬剂、控释的肠胃外剂型和乳剂。
可用于提供本公开的肠胃外剂型的合适的溶媒是本领域技术人员众所周知的。实例包括但不限于：无菌水、注射用水USP、盐水溶液、葡萄糖溶液、水性溶媒(例如但不限于氯化钠注射剂、林格氏注射剂、右旋糖注射剂、右旋糖和氯化钠注射剂以及乳酸化的林格氏注射剂)、与水混溶的溶媒(例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇)、以及非水性溶媒(例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯)。
控释和延迟释放剂型
在本文描述的方面的一些实施方式中，通过控释或延迟释放手段向受试者给予药剂和/或天冬酰胺酶。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控释制剂的特征在于，在最短的时间内使用最少的药物来治愈或控制症状。控释制剂的优点包括：1)延长药物活性；2)降低给药频率；3)增加患者依从性；4)总药物用量较少；5)减少局部或全身性副作用；6)减少药物积累；7)减少血液水平波动；8)治疗效果的改善；9)减少药物活性的增强或丧失药物活性；以及10)疾病或病症的控制速度的改善。(Kim，Cherng-ju，Controlled Release DosageForm Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000))。控释制剂可用于控制制剂(I)的化合物的作用起始、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平和峰值血液水平。特别地，控释或延长释放的剂型或制剂可用于确保在降低潜在的不良影响和安全隐患的同时实现药物的最大功效，所述不良影响和安全隐患可在药物剂量不足(例如低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平时出现。
多种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可适于与本文所述的任何药剂一起使用。示例包括但不限于如下中描述的那些：美国专利No.：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120，548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；和6,365,185，其各自均通过引用以其整体并入本文。例如，这些剂型可使用羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可透过膜、渗透系统(例如
Figure BDA0002970131260000441
(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))、多层包衣、微粒、脂质体或微球或其组合，以用于提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控释，从而提供不同比例的期望的释放曲线。另外，离子交换材料可用于制备所公开化合物的固定的、吸附的盐形式，并因此实现药物的受控递送。具体的阴离子交换剂的实例包括但不限于
Figure BDA0002970131260000442
A568和
Figure BDA0002970131260000443
AP143(Rohm&Haas，Spring House，Pa.USA)。
功效
例如，本文描述的药剂和/或天冬酰胺酶用于治疗癌症的功效可由熟练的从业者确定。然而，如本文所用，如果以有益的方式改变了一种或多种癌症的征象或症状，其它临床可接受的症状得到改善，甚至得到缓解，或者根据本文所述的方法在治疗后例如至少诱发10％的期望的响应，则治疗被视为“有效治疗”。例如可以通过测量标志物、指标、症状和/或根据本文所述的方法治疗的病症(例如癌症)的发生率或任何其它合适的可测量参数，来评估疗效。也可通过住院治疗评估个体恶化的失败，或需要医疗干预(即癌症进程)来衡量疗效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文已描述的。
视情况而定，可在本文所述病症的动物模型(例如，给定癌症的小鼠模型或合适的动物模型)中评估功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物的统计学上显著变化(例如肿瘤大小减小或房子转移时)，证明了治疗的功效。
出于描述和公开的目的，将所示出的所有专利、专利申请和出版物以引用方式明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本发明结合使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这方面没有任何内容应被理解为承认本发明人没有权利凭借先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开提前。所有关于这些文件的日期的陈述或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本文所述的发明可在以下编号的段落中进一步描述：
1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂。
2.如段落1所述的方法，其中，所述癌症选自于由如下所组成的列表：恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
3.如段落1所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
4.如段落2所述的方法，其中，所述白血病为急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
5.如段落1所述的方法，其中，所述癌症对天冬酰胺酶具有抗性。
6.如段落1所述的方法，其中，所述癌症对天冬酰胺酶不具有抗性。
7.如段落1所述的方法，其中，所述天冬酰胺酶选自于由如下所组成的组：L-天冬酰胺酶(Elspar)、培门冬酶(PEG-天冬酰胺酶；Oncaspar)、SC-PEG天冬酰胺酶(Calaspargase pegol)和欧文氏菌天冬酰胺酶(Erwinaze)。
8.如段落1所述的方法，其中，所述抑制GSK3α的药剂选自于由如下所组成的组：小分子、抗体、肽、基因组编辑系统、反义寡核苷酸和RNAi。
9.如段落8所述的方法，其中，所述小分子选自于由如下所组成的组：BRD0705、BRD4963、BRD1652、BRD3731、CHIR-98014、LY2090314、AZD1080、CHIR-99021(CT99021)HCl、CHIR-99021(CT99021)、BIO-丙酮肟、SB216763、SB415286、NP031112、Abemaciclib(LY2835210)、AT-9283、RGB-286638、PHA-793887、AT-7519、AZD-5438、OTS-167、9-ING-41和Tideglusib(NP031112)。
10.如段落8所述的方法，其中，小分子为BRD0705。
11.如段落8所述的方法，其中，所述RNAi为微小RNA、siRNA或shRNA。
12.如段落1所述的方法，其中，抑制GSK3α是抑制GSK3α的表达水平和/或活性。
13.如段落12所述的方法，其中，与合适的对照相比，所述GSK3α的表达水平和/或活性被抑制至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。
14.如段落1所述的方法，其中，所述受试者先前已被给予抗癌治疗。
15.如段落1所述的方法，其中，所述受试者先前未被给予抗癌治疗。
16.如段落1-15中任一段所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：在给药之前，诊断受试者患有癌症。
17.如段落1-15中任一段所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：在给药之前，从将受试者诊断为患有癌症的测定中接收结果。
18.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶，其中，所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。
19.如段落18所述的方法，其中，所述突变引起癌症细胞中的WNT信号转导通路的激活。
20.如段落18所述的方法，其中，所述突变是在选自于由如下所组成的组的基因中：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。
21.如段落18所述的方法，其中，所述突变改变了选自于由如下所组成的组的基因的表达：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。
22.如段落18所述的方法，其中，所述癌症选自于由如下所组成的列表：恶性上皮肿瘤、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
23.如段落18所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
24.如段落18所述的方法，其中，所述癌症为结肠癌或胰腺癌。
25.如段落18所述的方法，其中，所述癌症是转移性的。
26.如段落18所述的方法，其中，在给药前，所述受试者被鉴定为患有癌症，所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。
27.如段落26所述的方法，其中，在从所述受试者获得的生物样品中鉴定出所述突变。
28.如段落27所述的方法，其中，所述生物样品为组织样品或血液样品。
29.如段落1或18所述的方法，其中，所述癌症对癌症治疗具有抗性。
30.如段落1或18所述的方法，其中，所述癌症在癌症治疗后复发。
31.如段落29或30所述的方法，其中，所述癌症治疗为化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术、激素疗法、干细胞疗法、靶向疗法、基因疗法和精准疗法。
32.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
a.从患有癌症的受试者获得生物样品；
b.分析样品并鉴定出具有引起GSK3α抑制的突变的癌症；以及
C.将天冬酰胺酶给予至已鉴定出患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
33.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
a.接收鉴定受试者患有癌症的测定的结果，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变；以及
b.将天冬酰胺酶给予至已鉴定出患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
34.如段落32和33所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
35.如段落32和33所述的方法，其中，所述癌症为结肠癌或胰腺癌。
36.如段落32和33所述的方法，其中，所述癌症是转移性的。
37.如段落32和33所述的方法，其中，所述生物样品为组织样品或血液样品。
实施例
实施例1
为了鉴定促进经天冬酰胺酶处理的白血病细胞的适应性的分子通路，在天冬酰胺酶抗性的T-ALL细胞系CCRF-CEM中进行了全基因组的CRISPR/Cas9功能丧失基因筛选(图5)。使用靶向天冬酰胺合成酶(ASNS)(该酶合成了天冬酰胺)的阳性对照引导RNA(ASNS)优化了漏失(drop-out)筛选条件(图6)6。
ASNS的上调可诱导对天冬酰胺酶的抗性7，但这不是天冬酰胺酶响应的唯一决定因素8,9。然后用GeCKO全基因组的引导RNA文库10转导表达Cas9的CCRF-CEM细胞(图1a和图7)，用无可检测毒性的溶媒或10U/L剂量的天冬酰胺酶处理，并评估了引导RNA表达。ASNS是经天冬酰胺酶处理的细胞中最显著耗竭的基因，紧随其后的是两个Wnt信号转导调节因子NKD2和LGR6(图1b)。
NKD2通过结合和抑制散乱蛋白而负调控Wnt信号转导11，而LGR蛋白是R-spondin受体，据报道其激活或抑制Wnt信号转导12,13。为了测试这些基因如何调节Wnt信号转导，用靶向NKD2或LGR6的shRNA或用shLuciferase对照对CCRF-CEM细胞进行转导(图1c)。NKD2或LGR6的敲低增加了活化的(非磷酸化的)β-连环蛋白的水平(图1d)，以及经典的Wnt/β-连环蛋白转录活性的TopFLASH报告基因的活性14(图1e)。因此，NKD2和LGR6是T-ALL细胞中的Wnt信号转导的负调控因子。为了证实NKD2或LGR6的缺失使这些细胞对天冬酰胺酶致敏，将CCRF-CEM细胞用这些shRNA进行转导并用天冬酰胺酶处理。NDK2或LGR6的敲低可使细胞对天冬酰胺酶高度敏感(图1f)，并增强天冬酰胺酶诱导的半胱天冬酶活化，提示诱导细胞凋亡(图1g)。通过用Wnt配体Wnt3A进行的处理表面模拟出这一效应(图1h)。因此，Wnt通路激活使T-ALL细胞对天冬酰胺酶致敏。
糖原合酶激酶3(GSK3)活性的抑制是Wnt诱导的信号转导中的关键事件15，促使确定是否可以由CHIR99021(GSK3旁系同源物GSK3α和GSK3β的ATP竞争性抑制剂16)表面上模拟该效应。CHIR99021在一组代表治疗抗性的急性白血病(包括T-ALL、急性髓系白血病和亚二倍体B-ALL)的不同亚型的细胞系中诱导了显著的天冬酰胺酶致敏作用(图2a，图2b)。重要的是，CHIR99021不会增加天冬酰胺酶对正常的人CD34+造血祖细胞的毒性(图2c)，表明对白血病细胞具有选择性作用。它也没有使白血病细胞对其它常用的抗白血病药物(包括微管抑制剂长春新碱、核苷类似物6-巯基嘌呤、糖皮质激素受体激动剂地塞米松和DNA损伤剂阿霉素)致敏(图2d)。因此，GSK3抑制不仅可以增强T-ALL中的天冬酰胺酶毒性，还可以增强其它常见的急性白血病变体中的天冬酰胺酶毒性。
经典的Wnt信号转导是最著名的β-连环蛋白依赖性转录活性的激活剂17,18，这引发了如下问题，β-连环蛋白的激活是否足以诱导天冬酰胺酶致敏。因此，将CCRF-CEM细胞用组成型活性ΔN90β-连环蛋白等位基因或靶向β-连环蛋白拮抗剂基因APC19的shRNA转导，并用天冬酰胺酶处理它们。出乎意料的是，尽管如同通过TopFLASH报告基因活性所评估的β-连环蛋白诱导的转录的有效激活，但这些修饰对天冬酰胺酶的敏感性没有任何可辨别的影响(图3a-图3b)。Wnt通路还通过激活mTOR复合物mTORC120和mTORC221来调节蛋白的合成和代谢。然而，用mTORC1抑制剂雷帕霉素和RAD001或用双重mTORC1/2抑制剂AZD2014进行治疗均无Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用(图3c和图8)。总而言之，这些数据表明天冬酰胺酶的致敏作用与β-连环蛋白或mTOR活性无关。
Wnt信号转导的激活通过抑制GSK3依赖性蛋白泛素化和蛋白酶体降解而增加总的细胞蛋白含量和细胞大小，这种作用称为蛋白的Wnt依赖性稳定作用(Wnt/STOP)4,22,23。Wnt通路的这种功能似乎与天冬酰胺酶致敏有关。甚至在对天冬酰胺酶诱导的细胞毒性高度抵抗的CCRF-CEM细胞中，也观察到了用酶处理后的细胞大小的可测量的减小(图3d)，并且这种作用被Wnt通路激活逆转(图3e)。为了测试Wnt通路激活是否抑制经天冬酰胺酶处理的细胞中的蛋白降解，采用脉冲追踪实验测量总的蛋白半衰期。首先用靶向NKD2和LGR6的Wnt激活的shRNA或用shLuciferase对照转导CCRF-CEM细胞。然后将细胞用脉冲的蛋氨酸类似物叠氮高丙氨酸(AHA)孵育，然后追踪(其中，用天冬酰胺酶处理细胞)，并通过流式细胞术测量由于蛋白降解引起的AHA释放速率。Wnt通路的激活在脉冲期间不影响AHA标记掺入的程度(图9)；然而，在这些细胞中，LGR6或NDK2的shRNA敲低将总蛋白半衰期增加约40％(图3f)。这些发现表明，Wnt通路激活抑制了经天冬酰胺酶处理的细胞中的蛋白降解。
E3泛素连接酶组分FBXW7识别被GSK3磷酸化的经典的磷酸-降解决定子，并且FBXW7的过表达恢复通过Wnt/STOP信号转导稳定的蛋白亚组的降解4。因此，考虑的是FBXW7过表达也可逆转Wnt/STOP诱导的天冬酰胺酶致敏。用Wnt活化的shRNA或shLuciferase对照转导CCRF-CEM后，用编码野生型FBXW7或FBXW7 R465C点突变等位基因的表达构建体转导相同的细胞；所述等位基因具有与其经典的磷酸-降解决定子的受损的结合24。野生型FBXW7的过表达阻断了Wnt通路激活触发天冬酰胺酶超敏性的能力，而R465C突变体则没有作用(图3g)。然而，FBXW7是可以靶向特定的癌蛋白的T-ALL肿瘤抑制剂25，这引发了如下问题，直接操作蛋白酶体活性是否可以调节Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用。使用硼替佐米(使用缺乏单药毒性的10nM剂量)抑制26S蛋白酶体的催化活性26，表面上模拟了Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用(图3h)。测试了蛋白酶体活性的直接刺激，以确定这种作用是否足以逆转Wnt通路激活的天冬酰胺酶选择性毒性，并利用蛋白酶体亚基PSMA4的高度活跃的开放门(open-gate)(ΔN3)突变体，所述突变体的表达足以刺激广泛的蛋白酶体底物的降解5。首先用对照或Wnt活化的shRNA转导CCRF-CEM细胞，然后用组成型活性蛋白酶体亚基ΔN3-PSMA4或GFP对照转导。组成型活性ΔN3-PSMA4蛋白酶体亚基的表达完全阻断了Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用(图3i)。这些发现表明，Wnt通路活化通过抑制蛋白的蛋白酶体降解而使白血病细胞对天冬酰胺酶致敏。
为了探索先前描述的研究的治疗潜力，GSK3是作为治疗靶点的焦点，因为与蛋白酶体抑制剂硼替佐米相比，GSK3抑制对这些细胞没有可检测到的毒性，而硼替佐米在中等剂量时却是高毒性的(图10)。尽管用于细胞系中的泛-GSK3抑制剂缺乏适用于体内研究的药代动力学特性，但最近已开发出具有有利的药理特性的各GSK3旁系同源物的同工型选择性抑制剂27。GSK3α选择性抑制剂BRD0705有效地使CCRF-CEM细胞对天冬酰胺酶致敏，而GSK3β选择性抑制剂BRD0731仅具有中等作用(图4a)。为了确定该结果是否反映了GSK3同工型之间的丰度，或者GSK3β抑制剂BRD0731shRNA对GSK3α的部分抑制被用于选择性地消耗GSK3α或GSK3β。GSK3α的耗竭表面上模拟了Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用，而GSK3β敲低没有作用(图4b和图11)。通过逃避shRNA靶向的GSK3α表达构建体的转导挽救了靶向GSK3α的shRNA的作用(图4c)。
NRG小鼠很好地耐受GSK3α抑制剂BRD0705和天冬酰胺酶的组合治疗，没有明显的体重变化或血清胆红素水平的增加，这是成体中的天冬酰胺酶的重要的剂量限制性毒性(数据未显示)。最后，向一组NRG小鼠注射来自原发性天冬酰胺酶抗性T-ALL患者来源的异种移植物的白血病细胞。一旦检测到外周血中有白血病植入物，即用溶媒、天冬酰胺酶、BRD0705或天冬酰胺酶与BRD0705的组合来治疗小鼠。尽管异种移植物被证明对天冬酰胺酶和BRD0705单一疗法具有高度抗性，但天冬酰胺酶和BRD0705的组合既高效又耐受性良好(图4d-图4e和图12)。
这些研究证明了在对这种酶有抗性的急性白血病中，Wnt/STOP信号转导的激活与天冬酰胺酶之间的先前未识别的合成的致死相互作用。这些发现支持了如下模型，在所述模型中天冬酰胺酶抗性的白血病通过增加蛋白降解来补充细胞内天冬酰胺的池，以适应天冬酰胺的消耗，从而抑制细胞死亡(图4f)。有趣的是，Wnt/STOP活化和天冬酰胺酶的组合对白血病细胞有选择性的毒性，而正常细胞似乎具有有效的补偿机制。该结果可信地反映了通常将增殖与天冬酰胺可用性耦合的检查点，而这一联系很容易被致癌突变破坏。Wnt/STOP活化和天冬酰胺酶的组合可能对容纳有相关基因突变的肿瘤具有广泛的疗效。本文中特别考虑的是天冬酰胺酶单一疗法在由激活Wnt/STOP信号转导的突变(例如增强结直肠癌中配体诱导的Wnt信号转导的R-spondin易位或RNF43的失活突变28-30)衍生的肿瘤中具有治疗用途。
材料和方法
细胞系和细胞培养。293T细胞、T-ALL细胞系、AML细胞系和B-ALL细胞系获自ATCC(Manassas,VA,USA)、DSMZ(Braunschweig，德国)，A.Thomas Look实验室(Boston，MA，USA)或Alex Kentsis实验室(New York,NY,USA)，并在37℃、5％CO2下，在具有10％或20％胎牛血清(FBS,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)或TET系统认证的FBS(Clontech，MountainView，CA)以及1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)的DMEM、RPMI 1640或MEMα(Thermo Fisher Scientific)中培养。来自健康供体的动员外周血的人CD34+祖细胞从Fred Hutchinson Cancer Research Center(Seattle,WA,USA)获得(例如，见于万维网的sharedresources.fredhutch.org/products/cd34-cells)。CD34+祖细胞在补充有20％FBS和各自终浓度为50ng/ml的重组人白介素-3(R&D systems，Minneapolis，MN)、重组人白介素-6(R&D systems，Minneapolis，MN)和重组人干细胞因子(R&D systems,Minneapolis,MN)的IMDM(Thermo Fisher Scientific)中培养。
在Dana-Farber Cancer Institute Molecular Diagnostics Laboratory使用STR概况(profiling)验证了细胞系特性(最近在2018年6月)，并根据制造商的说明使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza，Portsmouth，NH；最近在2018年3月)排除了支原体污染。
慢病毒和逆转录病毒的生产、转导和筛选。如前所述2，通过使用OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)和Fugene(Promega,Madison,WI)将感兴趣的pLKO.1质粒与包装载体psPAX2(来自Didier Trono的馈赠；addgene质粒#12260)和VSV.G(来自TannishthaReya1的馈赠；addgene质粒#14888)共转染产生慢病毒。通过将质粒与包装载体gag/pol1(来自Tannishtha Reya的馈赠；addgene质粒#14887)和VSV.G共转染产生逆转录病毒。
慢病毒和逆转录病毒感染通过在存在8μg/ml凝聚胺(Merck Millipore，Darmstadt，德国)的情况下用含病毒的培养基(1,500g×90分钟)旋转接种T-ALL细胞系来进行。用新霉素(700μg/ml至少持续5天；Thermo Fisher Scientific)、嘌呤霉素(1μg/ml至少48小时；Thermo Fisher Scientific)或杀稻瘟菌素(15μg/ml持续至少5天；Invivogen)在感染后24小时开始抗生素筛选。
使用Lipofectamine 2000试剂(invitrogen)进行瞬时转染。简而言之，将800,000个细胞接种在24孔板中的2ml生长培养基中。将5μg感兴趣的质粒和10μl lipofectamine与300μl OptiMEM混合，孵育10分钟，然后添加到孔中。孵育48小时后开始抗生素筛选。
汇合的ASNS/AAVS1文库。如所述的，设计具有靶向编码ASNS的催化结构域的基因组座的3个独特的引导RNA(例如，见于万维网的www.uniprot.org/uniprot/P08243)、以及靶向位于PPP1R12C基因的内含子1的安全港AAVS1基因座的3个独特的引导RNA的汇合的引导RNA文库3。将寡核苷酸克隆到经修改版本的lentiGuide-Puro(Zhang Feng的馈赠，addgene质粒#52963)中，其中引导RNA支架被先前报道的结构优化的形式(A-U翻转和茎延伸，称为组合修饰)替代，以增加Cas9靶向的效率5。简而言之，使用Zhang实验室CRISPR设计工具(例如，可见于万维网的crispr.mit.edu/)设计靶向相关基因座的引导RNA。将1μl 100μM的正向和反向寡核苷酸与1μl 10×T4 DNA连接缓冲液(NEB，Ipswich，MA)、6.5μl ddH2O、0.5μl T4 PNK(NEB)混合，并在37℃退火30min和95℃退火5min。然后在室温下，使用1μl快速连接酶(NEB)、5μl 2×快速连接酶缓冲液(NEB)和2μl ddH2O将1μl磷酸退火的寡核苷酸(按1:500稀释)连接至1μl BsmBI消化的慢病毒pHK09-puro质粒中，持续5分钟。
引导RNA靶序列如下：
Figure BDA0002970131260000531
如上所述，通过共转染等量的这些引导RNA中的每一个以及psPAX2和VSV.G载体来产生汇合的慢病毒。使用Beckmann XL-90超速离心机(Beckman Coulter)在100,000g(24,000rpm)下于4℃浓缩病毒2小时。如所述的(例如，见于万维网portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols)，使用alamarBlue染色确定病毒滴度。将感染有lentiCas9-blast(Zhang Feng的馈赠；addgene质粒#52962)的CCRF-CEM细胞(在100μl RPMI培养基中每孔40,000个)以96孔格式铺板，并以0.3的感染复数(MOI)用慢病毒转导。在感染后48小时，用1μg/ml的嘌呤霉素筛选感染的细胞7天。感染的细胞用溶媒(PBS)或天冬酰胺酶以24孔形式(在1ml RPMI培养基中每孔400，000个细胞)处理。在开始天冬酰胺酶处理后5天，收获细胞，并使用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)提取基因组DNA。使用pHKO9测序引物(pHKO9F–TCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG(SEQID NO：9；pHKO9 R–TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGT(SEQ ID NO：10))PCR扩增引导RNA序列，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行PCR纯化，在MGH CCIB DNA Core设备(例如，见于万维网的dnacore.mgh.harvard.edu/new-cgi-bin/site/pages/crispr_sequencing_main.jsp)中进行了下一代“CRISPR测序”。使用CrispRVariantsLite v1.1评估切割效率6。
全基因组功能丧失筛选和数据分析。如前所述4，7，使用GeCKO v2人类文库进行全基因组功能丧失筛选。首先用lentiCas9-blast转导CCRF-CEM细胞，并用杀稻瘟菌素进行筛选，然后使用自切除的GFP构建体pXPR_0118(John Doench&David Root的馈赠；addgene质粒#59702)确认Cas9活性。GeCKO v2由两个半文库(A和B)组成，每个半文库均以生物学重复形式以MOI＝0.3转导到1.8×108个表达Cas9的CCRF-CEM细胞中。转导后24小时开始，用嘌呤霉素(1μg/ml)筛选细胞，持续8天。根据筛选后存活的细胞数量和估计的增长率，将GeCKO半文库A的覆盖率估计为663x，GeCKO半文库B的覆盖率估计为891x。细胞每隔一天分裂，并且对于各半文库，将最小细胞数在每次分裂时保持为8400万，以减少引导RNA覆盖率的损失。从第10天开始用10U/L天冬酰胺酶处理细胞，并在处理5天后收获细胞。使用Blood&CellCulture DNA Maxi Kit(Qiagen)提取基因组DNA。如上所述，在MGH CCIB DNA Core设备中使用CRISPR测序对样品进行测序。使用MAGeCK软件(例如见于万维网的sourceforge.net/projects/mageck/)计算基于引导RNA缺失的基因耗竭的显著性9。
shRNA和表达质粒。下列具有嘌呤霉素抗性的pLKO.1中的慢病毒shRNA载体由Broad Institute的RNAi Consortium文库产生，并从Sigma-Aldrich获得：shLuciferase(TRCN0000072243)，shNKD2#1(TRCN0000187580)，shNKD2#3(TRCN0000428381)，shLGR6#2(TRCN0000063619)shLGR6#4(TRCN0000063621)，shAPC#1(TRCN0000010296)，shAPC#2(TRCN0000010297)，shGSK3α#1(TRCN0000010340)，shGSK3α#4(TRCN0000038682)，shGSK3β#2(TRCN0000039564)，shGSK3β#6(TRCN0000010551)。
编码组成型活性β-连环蛋白(ΔN90)等位基因的构建体是Bob Weinberg的馈赠(例如，见于万维网www.addgene.org/36985/)10。表达野生型FBXW7(也称为CDC4)或其R465C突变体的表达构建体是Bert Vogelstein的馈赠(例如，见于万维网的www.addgene.org/16652/和www.addgene.org/16653/)11。7TGC(TxTcf-eGFP//SV40-mCherry)TopFLASH报告基因是Roel Nusse的馈赠(例如，见于万维网的www.addgene.org/24304/)12。基于Choi和同事的数据13，设计了人蛋白酶体亚基PSMA4的高活性开放门突变体(称为ΔN-PSMA4)，其容纳有2-10个N端氨基酸(基于同工型NP_002780.1)的缺失，并通过GeneCopoeia(Rockville，MD)在pLX304慢病毒表达载体中合成，其具有C端V5标签。GSK3αpWZL表达载体先前已有描述14。
评估化疗响应和化疗诱导的细胞凋亡
将细胞(每孔25,000个)接种在96孔板中的100μl完全生长培养基中，并用化学治疗剂或溶媒孵育。每48小时以1:5的比例分裂T-ALL细胞。简言之，将20μl细胞与补充有所示剂量的溶媒或化学治疗药物的80μl新鲜培养基混合。如上所述，AML细胞每72小时分裂。根据制造商的说明，通过基于台盼蓝活性染料染色(Invitrogen)的活细胞计数来评估细胞活力。化学治疗药物包括：PEG-天冬酰胺酶(“oncaspar”，Shire，Lexington,MA)、地塞米松(Sigma-Aldrich)、长春新碱(Selleckchem,Houston,TX)、阿霉素(Sigma-Aldrich)、6-巯基嘌呤(Abcam，Cambridge,UK)、CHIR99021(Selleckchem)、硼替佐米(Selleckchem)、雷帕霉素(Selleckchem)、RAD001(Selleckchem)、AZD2014(Selleckchem)和Wnt3A(R&D systems，Minneapolis，MN)。如所述的11合成BRD0705和BRD0731。根据制造商的说明，使用半胱天冬酶Glo 3/7测定(Promega,Madison，WI)评估半胱天冬酶3/7活性。
TopFLASH报告基因。简而言之，如上文慢病毒感染部分所述，用TopFLASH报告基因7TGC转导400,000个CCRF-CEM细胞12。通过荧光激活细胞分选术(FACS)选择表达组成型mCherry选择标记的细胞，用Wnt配体Wnt3A处理5天，并通过分选mCherry和GFP双阳性细胞筛选具有Wnt诱导性的GFP表达的细胞。从Wnt配体释放所选择的细胞最少7天，然后用表达质粒进一步操作。在Beckton-Dickinson LSR-II仪器上评估了mCherry阳性细胞部分的GFP阳性。
蛋白印迹和抗体。在补充有cOmplete蛋白酶抑制剂(Roche，Basel，瑞士)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(Merck Millipore)中裂解细胞。将Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA)和β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)与20μg蛋白裂解物混合，然后在4％-12％Novex bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(Thermo Fisher Scientific)上进行电泳。将印迹转移至PVDF膜(Thermo Fisher Scientific)上，并在具有0.1％Tween的磷酸盐缓冲盐水(Boston Bioproducts，Ashland，MA)中用5％BSA(New England Biolabs)封闭，并用以下抗体进行探测：非磷酸化β-连环蛋白(Ser33/37/Thr41)抗体(1:1000，CellSignaling Technologies#8814)、总β-连环蛋白抗体(1:1000，Cell SignalingTechnologies#8480)、总的GSK3α/β抗体(1:1000，Cell Signaling Technologies#5676)、磷酸化GSK3α/β(Tyr279/216)抗体(Thermo Fisher Scientific#OPA1-03083)、Myc-tag抗体(1:1000，Cell Signaling Technologies#2272)、磷酸化p70 S6激酶(Thr389)抗体(1:1000Cell Signaling Technologies#9234)或GAPDH(1∶1000，Cell SignalingTechnologies#2118)。使用Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)使带有辣根过氧化物酶底物(Thermo Fisher Scientific)的辣根过氧化物酶连接的抗体(1∶2000，Cell Signaling Technologies#7074S)的二次检测可视化。
评估细胞尺寸。将细胞(每孔400,000个)铺板于24孔板形式中的含有终浓度为10U/L的天冬酰胺酶的1ml完全生长培养基中。处理48小时后，通过流式细胞术评估前向散射(FSC-H)。
定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)和引物
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA，并使用SuperScript III第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)制备cDNA。使用Power
Figure BDA0002970131260000561
Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。使用的引物如下：
人β肌动蛋白F：CTGGCACCCAGCACAATG(SEQ ID NO：11)
人β肌动蛋白R：GCCGATCCACACGGAGTACT(SEQ ID NO：12)
人NKD2 F：ACCCTCCGTGTGAAGCTAAC(SEQ ID NO：13)
人NKD2 R：GGGCCTCCTGACGTGTG(SEQ ID NO：14)
人LGR6 F：TCGGGCTGTCCGCCGTTC(SEQ TD NO：15)
人LGR6 R：GCTCCTCCAAGAAGCGCAGGTG(SEQ ID NO：16)
人APC F：AACCGCTGCAGATGGCTGATGTG(SEQ ID NO：17)
人APC R：TGCAGCCATCCTTGGCTACCCT(SEQ ID NO：18)
人GSK3α F：TCCCCAGCGGGCACTACCA(SEQ ID NO：19)
人GSK3α R：TGAGGGTAGGTGTGG CATCGGT(SEQ ID NO：20)
人GSK3β F：CCAGGGGATAGTGGTGTGGATCAGT(SEQ ID NO：21)
人GSK3β R：GAAGACCCGCACTCCTGAGCTGA(SEQ ID NO：22)
小鼠。从Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME；Stock#007799)购买6-8周龄的NOD rag γ(NRG)小鼠。严格按照实验室动物福利办公室定义的良好动物操作对小鼠进行处理。所有动物工作均在波士顿儿童医院(BCH)机构动物护理和使用委员会批准(协议编号15-10-3058R)下完成。
使小鼠暴露于亚致死剂量的辐射(4.5Gy)，然后注射人白血病细胞。所有注射均通过尾静脉注射进行。进行血液收集以监测注射有白血病细胞的小鼠中的白血病发作，所述发作通过使用抗人CD45-PE-Cy7(1:400，BD#560915)抗体染色对人CD45表达进行染色来评估。一旦基于外周血中的≥5％的人白血病细胞证实了白血病的植入，便开始治疗小鼠。在药物治疗的第1天，通过尾静脉注射以单剂量注射天冬酰胺酶(1,000U/kg)或PBS，并通过口服灌胃每12小时给予BRD0705(15mg/kg)或溶媒，持续12天。如先前所述配制溶媒15。在灌胃前，用异氟烷(Patterson Veterinary，Greeley，CO)麻醉小鼠。开始治疗后，每三天监测体重。为了评估胆红素水平，进行下颌静脉采集，并在波士顿儿童医院临床实验室中测量胆红素水平。该实验的主要终点为生存率。小鼠出现体重减轻超过15％或疾病进展的迹象/症状时，便对其实施安乐死。通过提取骨髓细胞进行白血病负荷的事后分析，将所述骨髓细胞通过40μM网状过滤器过滤，然后使用BD Biosciences Red Blood Cell Lysis试剂(BD#555899)裂解红细胞。使用来自BD Biosciences的以下抗体对分离的骨髓细胞进行染色以评估白血病负荷：抗人CD4-APC-Cy7(1:100，BD#561839)和抗人CD8-PerCP-Cy5.5(1:100，BD#560662)。
通过脉冲追踪评估蛋白稳定性。如前所述16，使用蛋氨酸类似物L-叠氮高丙氨酸(AHA)的非放射性定量来评估蛋白降解。简言之，将400,000个CCRF-CEM细胞接种到1ml含10％经透析的FBS的无蛋氨酸的RPMI中。30分钟后，通过用补充有10％经透析的FBS和AHA(终浓度为50μM)的1ml RPMI替代该培养基进行18小时的脉冲步骤。在追踪步骤中，通过将培养基替换为含有10％经透析的FBS和10×L-蛋氨酸(2mM)的RPMI，从AHA中释放细胞2小时。随后将培养基替换为常规生长培养基，并用终浓度10U/L的天冬酰胺酶处理细胞，然后固定细胞。使用TAMRA炔烃点击化学对经AHA标记的蛋白加标签，并通过流式细胞术测量荧光强度。包括无AHA标记但具有TAMRA炔烃标签的样品作为阴性对照，以计算背景荧光。
统计分析。对于连续测量的两组比较，使用双尾Welch不等方差t检验。对于三组比较，进行方差模型(ANOVA)的单因素分析，并使用用于多重比较的Dunnett调整。为了分析两种效应，构建双因素方差分析模型，并且除非指明，否则包括两种效应之间的相互作用项。用于双因素方差分析的多重比较的事后调整包括Tukey调整。对数秩检验用于检验各组之间的生存率差异，并且Kaplan和Meier的方法用于构建生存曲线。柱状图显示的数据代表至少3次生物学重复的平均值和平均值的标准误差(s.e.m)。报告的所有p值都是双向的，如果＜0.05，则认为是显著的。
实施例1的参考文献
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实施例2
引言
结直肠癌(CRC)在美国仍然是癌症死亡的第二大主要原因，并且对于患有转移性疾病的患者而言结果令人沮丧(Siegel等，2017；Siegel等，2019)。估计96％的CRC具有激活经典的Wnt/β-连环蛋白信号转导的突变(Yaeger等，2018)，并且这些突变促进肠道转化(Cheung等，2010；Su等，1992)。尽管该通路的治疗抑制的令人信服的理由(Dow等，2015)，但致癌的β-连环蛋白转录很难直接抑制(Nusse和Clevers，2017)。大约15％的CRC具有驱动Wnt信号转导的配体依赖性激活的突变(例如染色体内R-spondin
(RSPO)重排和RNF43突变(Giannakis等，2014；Han等，2017；Hao等，2012；Koo等，2012；Seshagiri等，2012))的发现，引起了对Wnt配体活性的治疗抑制的相当大的兴趣。这在药理学上是更易处理的，并且已经开发出许多靶向Wnt配体诱导的Wnt通路激活的治疗方法[综述于(Nusse和Clevers，2017)]。然而，抑制Wnt配体活性会导致显著的骨毒性和病理性骨折(Tan等，2018)。这也是Wnt配体的种系突变引起的靶向毒性(Fahiminiya等，2013；Zheng等，2012)。尽管正在进行减轻这种毒性的努力，但尚不清楚Wnt信号转导的抑制是否具有足够有利的癌症治疗指数。
天冬酰胺酶(降解非必需氨基酸天冬酰胺的抗白血病酶(Rizzari等，2013))在未筛选的CRC患者中几乎没有活性(Clarkson等，1970；Ohnuma等，1970；Wilson等，1975)，其中的大多数具有APC突变(Yaeger等，2018)。我们最近发现，在耐药性急性白血病中，GSK3上游的Wnt信号转导的激活诱导对天冬酰胺酶的有效致敏，但在正常的造血祖细胞中则不然(Hinze等，2019)。Wnt诱导的信号转导由激酶GSK3的抑制介导(Siegfried等，1992；Stamos等，2014；Taelman等，2010)，而GSK3抑制足以用于白血病中的天冬酰胺酶致敏。然而，这种作用似乎独立于APC或β-连环蛋白。替代地，天冬酰胺酶的致敏作用由蛋白的Wnt依赖性稳定作用(Wnt/STOP)介导，Wnt信号转导的β-连环蛋白独立分支抑制GSK3依赖性蛋白的泛素化和蛋白酶体降解(Acebron等，2014)。蛋白泛素化和蛋白酶体降解是白血病中的天冬酰胺酶抗性所需的氨基酸(Suraweera等，2012)的分解代谢来源(Hinze等，2019)，而这种适应性响应被Wnt诱导的GSK3抑制所阻断。
CRC提供了独特的实验环境，在其中测试来自我们模型的预测，因为预测在CRC中自发产生的突变将Wnt/β-连环蛋白从Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏中解开连接。确实，大约80％的人类CRC具有APC的功能丧失突变(Yaeger等，2018)，该突变激活β-连环蛋白而不诱导对天冬酰胺酶的敏感性。相比之下，约15％的病例具有RSPO融合或RNF43突变，其刺激配体诱导的Wnt通路活化(Chartier等，2016；de Lau等，2011；Giannakis等，2014；Han等，2017；Seshagiri等，2012；Storm等，2016)。我们的模型预测，通过抑制GSK3，Wnt配体信号转导将刺激β-连环蛋白激活和Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用。这项研究的目的是在CRC中自发产生的突变的背景下测试这些预测。
结果
GSK3上游的Wnt通路活化诱导天冬酰胺酶超敏性
为了测试配体诱导的Wnt通路活化是否在CRC中诱导天冬酰胺酶超敏性，发明人以人APC突变的CRC细胞系HCT-15和SW-480开始(Barretina等，2012；Gayet等，2001)。这两种细胞系均证明对天冬酰胺酶单一治疗而言是难治疗的(refractory)，但是重组配体Rspo3和Wnt3α的处理引起对天冬酰胺酶的显著致敏作用(图15A)。通过抑制GSK3激酶介导Wnt诱导的信号转导(Siegfried等，1992；Stamos等，2014；Taelman等，2010)，并且用GSK3α和GSK3β两者的小分子抑制剂CHIR-99021(Bennett等，2002)处理这些细胞足以诱导天冬酰胺酶致敏(图15B)。重要的是，GSK3抑制和天冬酰胺酶的组合对源自正常的人结肠上皮的CCD-841细胞几乎没有毒性(图15C)(Thompson等，1985)。
哺乳动物细胞具有两种GSK3旁系同源物(GSK3α和GSK3β)，其在数个实验背景下对于经典的Wnt/β-连环蛋白信号转导的调控而言是冗余的(Banerji等，2012；Doble等，2007；Wagner等，2018)。然而，发现敲低GSK3α足以使CRC中的天冬酰胺酶致敏，而敲低GSK3β几乎没有作用(图15D，图17A-17B)，这与发明人先前在白血病中的发现一致(本文和Hinze等提出，2019)。用天冬酰胺酶联合GSK3αshRNA敲低来处理HCT-15或SW-480细胞引起半胱天冬酶3/7活性(凋亡诱导的标志)的诱导(图17C-图17D)。然后，将最近描述的同工型选择性GSK3抑制剂用于在药理学上验证这些发现(Wagner等，2018)。实际上，用GSK3α选择性抑制剂BRD0705处理使HCT-15和SW-480细胞对天冬酰胺酶诱导的细胞毒性敏感，而GSK3β选择性抑制剂BRD3731几乎没有作用(图15E)。
然后询问这些发现是否与CRC中自发产生的内源性突变的情况有关。发明人旨在在除了内源性Wnt激活突变的类型之外的尽可能相似的实验模型中对此进行测试。因此，发明人转向被设计用于再现人类CRC的遗传学的遗传学上工程化的小鼠肠道类器官(Dow等，2015；Han等，2017)。Kras、p53和Wnt激活突变的组合是转移性CRC中最常见的基因型(Yaeger等，2018)，因此利用了包含这些突变的三突变体类器官。内源性Wnt/β-连环蛋白激活突变为预期激活β-连环蛋白而不抑制GSK3或刺激天冬酰胺酶的敏感性的Apc缺陷，或者是增强Wnt配体诱导的GSK3抑制作用的Ptprk-Rspo3融合，预期二者都激活β-连环蛋白并刺激Wnt诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用。对这些类器官的处理表明，天冬酰胺酶单一治疗对Rspo3融合类器官而言是高毒性的，而它对Apc缺陷的类器官则几乎没有活性(图15F-图15G)。在Apc缺陷的类器官中，用GSK3α抑制剂BRD0705进行的单一治疗也几乎没有毒性，但是BRD0705和天冬酰胺酶的组合具有强毒性(图15G)，表明GSK3α的抑制足以使天冬酰胺酶致敏。
天冬酰胺酶致敏由蛋白的Wnt依赖性稳定介导
本文提出的工作表明，耐药性白血病通过依靠GSK3依赖性蛋白的泛素化和作为天冬酰胺的分解代谢来源的蛋白酶体降解来耐受天冬酰胺酶治疗。这种适应性响应被蛋白的Wnt依赖性稳定(Wnt/STOP)(Wnt信号转导的GSK3依赖性分支，抑制蛋白降解并增加细胞大小(Acebron等，2014；Huang等，2015；Taelman等，2010))阻断(Hinze等，2019)。发明人发现天冬酰胺酶单一治疗显著减小了CRC细胞系HCT-15中的细胞大小，并且这种作用通过用Wnt配体治疗而得以逆转(图18A-图18B)。为了测试Wnt/STOP是否介导Wnt配体诱导的对天冬酰胺酶的致敏作用，发明人首次利用了以下事实：E3泛素连接酶FBXW7的过表达恢复了通过Wnt诱导的GSK3抑制而稳定的蛋白亚组的降解(Acebron等，2014)。发现天冬酰胺酶与GSK3α抑制剂BRD0705组合对Apc突变型类器官的毒性通过野生型FBXW7的过表达来逆转，但不会通过其结合蛋白底物能力受损的FBXW7 R465C点突变等位基因来逆转(图15H)(Koepp等，2001)。此外，该组合的毒性通过蛋白酶体亚基PSMA4的高活性开放门突变体的表达而被逆转(图15H)，该突变体直接刺激了一系列蛋白酶体底物的蛋白酶体降解(Choi等，2016)。因此，GSK3上游的Wnt信号转导的激活通过抑制GSK3依赖性蛋白降解来诱导天冬酰胺酶致敏。
利用用于结直肠癌治疗的Wnt通路活化和天冬酰胺酶的合成的致死率
为了测试这些发现的体内治疗潜能，在用三突变体小鼠肠道类器官注射的免疫缺陷小鼠中产生皮下肿瘤，所述类器官具有Kras和p53突变以及Apc缺陷或Rspo3融合。一旦植入了肿瘤(通过明显可测量的肿瘤生长评估)，将小鼠随机用溶媒或单剂量天冬酰胺酶治疗(图16A)。天冬酰胺酶对Apc缺陷型肿瘤几乎没有影响，但对Rspo3融合肿瘤具有显著的治疗活性。实际上，天冬酰胺酶治疗不仅显著延迟了Rspo3融合肿瘤中的疾病进程(图16B)，而且在大多数经处理的小鼠中诱导了肿瘤消退(图16C)，并且延长了无进展生存期(图16D)，而没有引起可察觉到的体重减轻(图19A)。
然后询问使用源自患者的具有APC突变CRC的异种移植物(PDX)，药理学上的GSK3α抑制作用是否可在体内诱导天冬酰胺酶致敏作用。免疫缺陷小鼠移植有人类患者来源的CRC异种移植物，所述异种移植物容纳有截短的APC突变(p.T1556fsX3)和Kras p.G12R激活突变。植入肿瘤后，小鼠随机用溶媒、天冬酰胺酶(1000U/kg×1剂)、GSK3α选择性抑制剂BRD0705(每12小时25mg/kg×21天)或天冬酰胺酶和BRD0705的组合进行处理(图16E)。组合处理耐受性良好，无可察觉的体重下降或血清胆红素水平升高(图19B和图19C)，体重下降或血清胆红素水平升高是成人中的天冬酰胺酶的常见毒性。天冬酰胺酶或BRD0705的单一治疗无活性，但天冬酰胺酶和BRD0705的组合处理对肿瘤生长具有有效作用，包括所有经处理的小鼠中的肿瘤消退，以及无进展生存期显著延长(图16F-图16I)。
讨论
本文显示出GSK3抑制和天冬酰胺酶的合成的致死相互作用可用于CRC治疗。GSK3抑制是Wnt诱导的信号转导的关键媒介物(Siegfried等，1992；Stamos等，2014；Taelman等，2010)，因此作为上游Wnt通路突变的结果，预期该激酶在CRC子集中被内源性抑制。确实，已发现具有染色体重排的CRC引起Rspo3的过表达，所述Rspo3是增强Wnt配体活性的CRC中的复发的致癌性改变(Chartier等，2016；de Lau等，2011；Han等，2017；Seshagiri等，2012；Storm等，2016)深刻且选择性地对天冬酰胺酶单一治疗致敏。本文提出的模型预测，具有其它的上游Wnt激活突变(如Rspo2融合或Rspo受体RNF43突变)的肿瘤也应对天冬酰胺酶敏感。
在本文中特别考虑到的是，如本文所述，天冬酰胺酶单一治疗在具有预期刺激Wnt诱导的GSK3抑制的突变的其它肿瘤类型中是有效的，例如RNF43突变的胰腺癌、子宫内膜癌或胃癌(2014年；Giannakis等，2014；Jiang等，2013；Wu等，2011)。
已经发现，除非在这些肿瘤中抑制了GSK3功能，否则APC突变的CRC对于天冬酰胺酶单一治疗而言是难治的。GSK3α的选择性抑制对于这种效果而言是足够的。尽管GSK3α和GSK3β的ATP结合口袋因单个氨基酸而异，但已开发出GSK3α的同工型选择性抑制剂(Wagner等，2018)；对于大多数患有CRC病例的患者，所述抑制剂现在提供了利用这种合成的致死性治疗相互作用的策略；所述患者具有APC或CTNNB1(其编码β-连环蛋白)的突变。虽然GSK3β的同时抑制并未对抗GSK3α抑制的治疗益处，但在不同的实验环境下，GSK3α和GSK3β对于调节β-连环蛋白的活性是冗余的(Banerji等，2012；Doble等，2007；Wagner等，2018)。因此，由于致癌性β-连环蛋白信号转导的广泛活化，预期泛-GSK3抑制剂具有毒性，而预期对GSK3α的同工型选择性抑制被更好的耐受。
结合本文实施例1中展示的在白血病方面的工作(Hinze等，2019)，这些数据表明在结肠癌和耐药性白血病中，阻断GSK3依赖性蛋白降解诱导了对天冬酰胺酶的肿瘤选择性致敏。这产生出乎意料的结论，即实体瘤中的固有的天冬酰胺酶抗性机制与白血病中获得性抗性的机制重叠，但与允许正常细胞耐受该酶处理的机制有根本区别。鉴于GSK3α抑制和天冬酰胺酶的合成的致死性相互作用在源自肠道上皮细胞和造血细胞等多种细胞谱系的肿瘤中得以保留，只要其依靠GSK3依赖性的蛋白降解来耐受天冬酰胺酶的处理，这种方式可能对多种人类癌症具有有意义的治疗活性。
材料详情
源自患者的异种移植物
随着根据赫尔辛基宣言的知情同意，从患有APC突变的结肠癌的患者中收集样本(Bullman等，2017)。人体研究由Dana-Farber癌症研究所机构审查委员会批准。如下所述，将源自患者的异种移植物植入免疫缺陷小鼠中。小鼠研究符合所有法规标准，并获得了波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会的批准。
细胞系、细胞培养物和类器官培养物
293T细胞、结直肠癌细胞系和正常的结肠细胞购自ATCC(Manassas,VA,USA)、DSMZ(Braunschweig，德国)，并在37℃、5％CO2下，在具有10％或20％胎牛血清(FBS,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)或TET系统认证的FBS(Clontech，Mountain View，CA)和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)的DMEM、RPMI 1640或Leibovitz’s L-15培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养。
携带Ptprk-Rspo3重排和LSL-KrasG12D的类器官源自转基因小鼠。通过在无外源R-Spondin下培养类器官7天来筛选Ptrpk-Rspo3重排，并通过对Ptprk-Rspo3融合连接进行测序来验证。使用Lenti-sgTrp53-Cas9-Cre创建KrasG12D活化和p53丧失(Han等，2017)。为了筛选p53丧失，将类器官用5μM Nutlin-3培养7天，并且在该筛选过程中间接筛选KrasG12D活化。通过sgRNA靶向位点测序和蛋白印迹来验证P53丧失，并通过RNA测序验证KrasG12D活化。
在含有高级DMEM/F-12(Thermo Fisher Scientific)、1％青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich，Saint Louis,MO)、1mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich，SaintLouis,MO)和10mM HEPES(Sigma-Aldrich，Saint Louis,MO)的基础类器官培养基中培养小鼠结肠类器官。如前所述(O'Rourke等，2016)，在补充有鼠Wnt3A(50ng/ml，MerckMillipore，Darmstadt，德国)、鼠Noggin(50ng/ml)、鼠EGF(R&D systems,Minneapolis,MN，50ng/ml)和人R-Spondin 1(R&D systems,Minneapolis,MN)的基础类器官培养基中培养Apc缺陷的类器官。如前所述(O'Rourke等，2016)，在存在鼠Noggin(50ng/ml)、鼠EGF(R&Dsystems,Minneapolis,MN，50ng/ml)和人R-Spondin 1(R&D systems,Minneapolis,MN)情况下在基础培养基中培养Rspo3-融合的类器官。
在Dana-Farber Cancer Institute Molecular Diagnostics Laboratory使用STR概况验证了细胞系特性(最近在2018年12月)，并根据制造商的说明使用MycoAlert支原体检测药物盒(Lonza，Portsmouth，NH；最近在2018年11月)排除了支原体污染。
小鼠
Nu/J小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME；Stock#0007850)。将7-9周龄雄性裸鼠用于实验，并将同窝仔关在单独的笼子中。将小鼠随机分配到实验组中，并严格按照实验动物福利办公室定义的良好动物操作进行处理。所有动物工作均在波士顿儿童医院(BCH)机构动物护理和使用委员会批准(协议编号18-09-3784R)下完成。
结肠癌细胞系的慢病毒转导
如前所述(Burns等，2018)，通过使用OptiMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)和聚乙烯亚胺(VWR，Radnor，PA)将感兴趣的pLKO.1质粒与包装载体psPAX2(来自Didier Trono的馈赠；Addgene质粒#12260)和VSV.G(来自Tannishtha Reya的馈赠；Addgene质粒#14888)共转染产生慢病毒。
慢病毒感染通过在存在8μg/ml聚凝胺(Merck Millipore，Darmstadt，德国)的情况下用含病毒的培养基(1,500g×90分钟)旋转接种结直肠癌细胞系来进行。用嘌呤霉素(1μg/ml持续至少48小时；Thermo Fisher Scientific)或杀稻瘟菌素(15μg/ml持续至少5天；Invivogen)在感染后24小时开始抗生素筛选。
小鼠肠道类器官的慢病毒转导
在慢病毒转导之前，通过上下吸取基质胶和类器官培养基，收获全部0.95cm2的孔的小鼠肠道类器官。简而言之，将破坏的类器官以300g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于250μl冷的0.25％胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)中，并在37℃孵育5分钟。随后，通过添加750μl基础类器官培养基使胰蛋白酶失活，并离心(300g×5分钟)。将细胞重悬于250μl补充有8μg/ml聚凝胺(Merck Millipore，Darmstadt，德国)的浓缩的慢病毒中。对于慢病毒感染，将类器官病毒混合物在37℃、5％CO2下孵育12小时。随后，将750μl类器官培养基添加至孔中，并将混合物以300g离心5分钟。将沉淀物重悬于40μl冰冷的基质胶中，并在基质胶固化后，将250μl的基础类器官培养基添加到每个孔中。感染后24小时开始抗生素筛选。
方法详情
shRNA和表达质粒
具有嘌呤霉素抗性的pLKO.1中的下列慢病毒shRNA载体由Broad Institute的RNAi Consortium文库生成，并从Sigma-Aldrich获得：shLuciferase(TRCN0000072243)、shGSK3α#1(TRCN0000010340)、shGSK3α#4(TRCN0000038682)、shGSK3β#2(TRCN0000039564)、shGSK3β#6(TRCN0000010551)。
通过基因合成来合成表达野生型FBXW7(也称为CDC4)或其R465C突变体的表达构建体，并通过GeneCopoeia(Rockville，MD)克隆到pLX304慢病毒表达载体中。
基于Choi及其同事的数据(Choi等，2016)，通过删除编码PSMA4同工型NP_002780.1(由转录本NM_002789.6编码)的2-10位氨基酸(SRRYDSRTT)的cDNA序列，设计了人类蛋白酶体亚基PSMA4的高活性开放门突变体，称为ΔN-PSMA4。该ΔN-PSMA4编码序列通过基因合成来合成，并通过GeneCopoeia(Rockville，MD)克隆到具有框内的该载体提供的C末端V5标签的pLX304慢病毒表达载体中。
结肠癌细胞系中的化疗响应和细胞凋亡的评估
将细胞(100,000个/孔)接种到12孔板中的100μl完全生长培养基中，并用化学治疗剂或溶媒孵育。细胞每48小时分裂，并根据制造商的说明，通过基于台盼蓝活性染料染色(Invitrogen)的活细胞计数来评估细胞活力。化学治疗药物包括：天冬酰胺酶(培门冬酶，Shire，Lexington，MA)、CHIR99021(Selleckchem)、重组人Wnt3A蛋白(R&D systems,Minneapolis，MN)和重组人R-Spondin 3蛋白(R&D systems，Minneapolis，MN)。如所述的(Wagner等，2018)，合成BRD0705和BRD3731。根据制造商的说明，使用半胱天冬酶Glo 3/7测定(Promega，Madison，WI)评估半胱天冬酶3/7活性。
对小鼠肠道类器官中的化学疗法响应的评估
为了评估小鼠肠道类器官中的化学疗法响应，在基础类器官培养基(不含鼠Wnt3A、鼠Noggin和人R-spondin 1蛋白的培养基)中培养Apc缺陷和Rspo3融合类器官。将全部0.95cm2的孔的类器官分离至新的孔，目的是获得每孔约25个类器官。根据先前公布的方案(O'Rourke等，2016)分离类器官。将基质胶和基础类器官培养基补充溶媒或化学治疗剂，并且每48小时分离。培养10天后，通过光学显微镜对每孔的总的类器官数进行计数。显微检查是在Axio Imager A1显微镜(Zeiss，Oberkochen，德国)上使用100倍物镜进行的，并使用CV-A10数码相机(Jai，Yokohama，日本)和Cytovision软件(Leica Biosystems，Wetzlar，德国)捕获图像。
接触孔边缘的类器官被排除在计数之外。图像取自三个独立实验的代表，并使用ImageJ软件进行分析(Schneider等，2012)。
细胞尺寸的评估
将细胞(每孔100,000个)铺板于1ml完全生长培养基中，所述完全生长培养基在12孔形式中含有终浓度为10U/L的天冬酰胺酶或100ng/ml的Wnt3A配体。处理48小时后，在Beckton-Dickinson LSR-II仪器上通过流式细胞术评估前向散射高度(FSC-H)。
定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA，并使用SuperScript III第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)制备cDNA。使用Power
Figure BDA0002970131260000691
Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。表S2中描述了所使用的引物。
源自患者的异种移植物(PDX)和类器官的体内药物治疗
为了植入APC突变型人CRC PDX，将患者肿瘤材料收集在PBS中，并保存在湿冰上以在切除术后24小时内植入。达成后，使用手术刀片小心切除坏死和支持组织。如所述的(Bullman等，2017)，将约1mm×1mm的组织碎片皮下植入雄性裸鼠的侧腹区域。对于注射肠道类器官(Rspo3；p53；Kras或Apc；p53；Kras)，每只小鼠皮下注射全部9.5cm2的孔的类器官。
一旦肿瘤达到约150mm3的体积，就开始治疗小鼠。对于APC突变型人CRC PDX，在治疗的第1天通过尾静脉注射来注射单剂量的天冬酰胺酶(1,000U/kg)或PBS，并每12小时通过口服灌胃给予BRD0705(15mg/kg)或溶媒，持续21天。如先前所述(Wagner等，2018)配制溶媒。
治疗开始后，每隔一天评估体重和肿瘤大小。通过卡尺测量评估肿瘤大小，并使用公式(l×w×w)×(π/6)计算肿块的近似体积，其中l为主肿瘤轴，且w为次肿瘤轴。通过将时间t处的肿瘤体积变化与其基线进行比较来确定响应：如前所述(Gao等，2015)，肿瘤体积变化％＝100％×((Vt-V初始)/V初始)。当其达到1500mm3的肿瘤体积、发展出超过15％的体重减轻和/或显示出肿瘤溃疡的迹象时，将小鼠安乐死。对于图16B和图2F，最后记录死亡小鼠的肿瘤体积。
由于肿瘤的进展而对小鼠进行检查。
图16B和图16F为达到1500mm3的肿瘤体积的小鼠。
为了评估胆红素水平，进行了眼眶后血液收集，并在波士顿儿童医院临床实验室中测量了胆红素水平。(单位，检出限)
定量与统计分析
对于连续测量的两组比较，使用双尾Welch不等方差t检验。对于三组比较，进行方差模型(ANOVA)的单因素分析，并使用用于多重比较的Dunnett调整。为了分析两种效应，构建双因素方差分析模型，并且包括两种效应之间的相互作用项。用于双因素方差分析的多重比较的事后调整包括Tukey-Kramer调整。对数秩检验用于检验各组之间的生存率差异，并且Kaplan和Meier的方法用于构建生存曲线。除非另有指明，否则以柱状图显示的数据代表至少3次生物重复的平均值和平均值的标准误差(s.e.m)。报告的所有p值都是双向的，如果＜0.05，则认为是显著的。
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Claims (37)

1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶和抑制GSK3α的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症选自于由如下所组成的列表：恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述白血病为急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症对天冬酰胺酶具有抗性。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症对天冬酰胺酶不具有抗性。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述天冬酰胺酶选自于由如下所组成的组：L-天冬酰胺酶(Elspar)、培门冬酶(PEG-天冬酰胺酶；Oncaspar)、SC-PEG天冬酰胺酶(Calaspargase pegol)和欧文氏菌天冬酰胺酶(Erwinaze)。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述抑制GSK3α的药剂选自于由如下所组成的组：小分子、抗体、肽、基因组编辑系统、反义寡核苷酸和RNAi。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述小分子选自于由如下所组成的组：BRD0705、BRD4963、BRD1652、BRD3731、CHIR-98014、LY2090314、AZD1080、CHIR-99021(CT99021)HCl、CHIR-99021(CT99021)、BIO-丙酮肟、SB216763、SB415286、Abemaciclib(LY2835210)、AT-9283、RGB-286638、PHA-793887、AT-7519、AZD-5438、OTS-167、9-ING-41、Tideglusib(NP031112)和AR-A014418。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述小分子为BRD0705。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述RNAi为微小RNA、siRNA或shRNA。
12.如权利要求1所述的方法，其中，抑制GSK3α是抑制GSK3α的表达水平和/或活性。
13.如权利要求12所述的方法，其中，与合适的对照相比，所述GSK3α的表达水平和/或活性被抑制至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者先前已被给予抗癌治疗。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述受试者先前未被给予抗癌治疗。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：在给药之前，诊断受试者患有癌症。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：在给药之前，从将受试者诊断为患有癌症的测定中接收结果。
18.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向患有癌症的受试者给予天冬酰胺酶，其中，所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述突变引起癌症细胞中的WNT信号转导通路的激活。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述突变是在选自于由如下所组成的组的基因中：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述突变改变了选自于由如下所组成的组的基因的表达：R-spondin 1(RSPO1)、R-spondin 2(RSPO2)、R-spondin 3(RSPO3)、R-spondin 4(RSPO4)、环指蛋白43(RNF43)和糖原合酶激酶3α(GSK3A，更通常称为GSK3α)。
22.如权利要求18所述的方法，其中，所述癌症选自于由如下所组成的列表：恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
23.如权利要求18所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
24.如权利要求18所述的方法，其中，所述癌症为结肠癌或胰腺癌。
25.如权利要求18所述的方法，其中，所述癌症为转移性的。
26.如权利要求18所述的方法，其中，在给药前，所述受试者被鉴定为患有癌症，所述癌症包含引起GSK3α抑制的突变。
27.如权利要求26所述的方法，其中，在从所述受试者获得的生物样品中鉴定出所述突变。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述生物样品为组织样品或血液样品。
29.如权利要求1或18所述的方法，其中，所述癌症对癌症治疗具有抗性。
30.如权利要求1或18所述的方法，其中，所述癌症在癌症治疗后复发。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中，所述癌症治疗为化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术、激素疗法、干细胞疗法、靶向疗法、基因疗法和精准疗法。
32.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
a.从患有癌症的受试者获得生物样品；
b.分析所述样品并鉴定出具有引起GSK3α抑制的突变的癌症；以及
c.将天冬酰胺酶给予至已鉴定出患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
33.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
a.接收鉴定受试者患有癌症的测定的结果，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变；以及
b.将天冬酰胺酶给予至已鉴定出患有癌症的受试者，所述癌症具有引起GSK3α抑制的突变。
34.如权利要求32和33所述的方法，其中，所述癌症为实体瘤。
35.如权利要求32和33所述的方法，其中，所述癌症为结肠癌或胰腺癌。
36.如权利要求32和33所述的方法，其中，所述癌症为转移性的。
37.如权利要求32和33所述的方法，其中，所述生物样品为组织样品或血液样品。
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