CN112656946A

CN112656946A - miR-4298在制备抗胶质瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN112656946A
Application number: CN202110023195.1A
Authority: CN
Inventors: 姜国胜; 张丹凤; 王希娣; 孙王男; 任海山; 陈梅英
Original assignee: Shandong Shuoke Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Shuoke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明主要涉及miR‑4298在制备抗胶质瘤药物中的应用。本发明提供了一种基于药物TSA靶向调控miRNA‑4298抑制PADI4基因表达而诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的方法。主要包括药物TSA对miRNA‑4298和PADI4基因表达水平调控、miRNA‑4298 mimic制备、miRNA‑4298靶向结合PADI4的区域序列和双荧光素酶报告实验、两者之间靶向调控的凋亡功能学测定等。本发明miRNA具有内源性、特异性靶向抑制PADI4基因表达，能够制备由于抑制PADI4介导的人脑胶质瘤细胞凋亡的药物。

Description

miR-4298在制备抗胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及药物TSA通过提高miR-4298的表达量抑制PADI4从而实现了对脑胶质瘤细胞凋亡诱导作用的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

越来越多的统计数据表明，随着环境污染等因素的增加，实体肿瘤的发生率出现升高趋势，已经成为危害着人类身体健康的重大疾病。目前的放、化疗往往会引起免疫抑制等较严重的毒副作用，或者出现耐药或复发现象。因此，国内外学者都在积极探索其他有效的治疗药物、技术或方案。脑胶质瘤不仅具有恶性程度高，侵袭性强和容易复发等特点，而且其治疗也相当困难。随着手术方案的改进，影像技术和设备的支撑水平提升，多数手术治疗的效果得到了明显的提升，但是其总体的治疗效果仍然不能得到理想的目标。近几年的研究发现，脑胶质瘤的发生和发展也与表观遗传学的异常改变有关，例如DNA或组蛋白的甲基化、组蛋白的乙酰化、磷酸化等。因此，有关表观遗传调控的关键酶等，成为了肿瘤治疗的重要途径。组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研发则是重要的方向之一。该研究则主要在预实验基础上，选择HDAC抑制因子TSA作为候选药物，以脑胶质瘤细胞为靶细胞，重点探讨该药物体外抗脑胶质瘤细胞增殖作用，并分析其作用的分子机制。

PADI4是肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)家族中的一员，其编码的蛋白有663个氨基酸，PADI4的酶活性活化催化精氨酸残基转化为瓜氨酸残基，并参与肿瘤细胞的分化、凋亡过程。目前在实体瘤方面，PADI4在多种实体肿瘤中均表达。其发挥作用的主要机制之一是其过表达可以催化精氨酸残基转化为瓜氨酸残基，抑制精氨酸甲基化转移酶对H3组蛋白的甲基化作用，导致P53靶基因表达下调。P53基因是目前研究最多的抑癌基因，PADI4降低则可以促进野生型P53基因表达，阻止细胞DNA复制合成，诱导肿瘤细胞凋亡等。现有研究表明PAD家族中的相关蛋白在低氧诱导的胶质瘤转换中发挥作用，与胶质预后状况相关。还有研究表明PADI4可用于肿瘤的免疫治疗，但是PADI4是否与胶质瘤的增殖、凋亡等生理行为相关尚不完全明确。

发明内容

依据上述研究背景，本发明认为，明确PADI4在胶质瘤细胞中的作用机制有望为胶质瘤的治疗提供新的治疗靶点。基于该目的，本发明选择了HDAC抑制因子TSA作为观察药物，首先建立药物抗脑胶质瘤细胞U251增殖和诱导凋亡的细胞模型，为分子机制研究打下基础。结果表明HDAC抑制因子TSA可以明显抑制U251细胞增殖，引起细胞周期阻滞于G0/G1期，其增殖抑制作用主要与诱导凋亡的发生有关。凋亡的主要机制主要与TSA诱导Bax/Bcl-2蛋白比值升高，继而通过通道活性调节线粒体细胞色素C的释放，并启动caspase级联反应有关。

但是，该药物诱导的凋亡现象的上游分子机制并不明确。在成功诱导凋亡发生的基础上，本发明进行了深入的分子机制研究。发现miRNA-4298和PADI4在脑胶质瘤中存在异常表达变化，而且两者存在靶向结合的序列基础，推测该信号轴可能是介导药物诱导U251凋亡的可能上游机制之一。研究结果表明，TSA作用前miRNA-4298表达降低，PADI4表达升高，药物诱导凋亡后，miRNA-4298表达升高，PADI4表达降低。Luciferase实验证实miRNA-4298可以靶向结合PADI4，同时引起U251细胞凋亡的发生。为了进一步证实miRNA-4298对PADI4表达的抑制作用是否介导细胞生物功能作用，本发明还进行了相应的救援实验、在miRNA-4298mimics转染实验过程中同时转染PADI4质粒，结果表明，与miRNA-4298mimics比较，miRNA-4298mimics+PADI4的PADI4表达水平明显回升，并分别对应着凋亡水平的相对降低和细胞增殖水平的相对回升。结果初步表明miRNA-4298可以通过PADI4发挥U251细胞功能的调控作用。

基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。

本发明证实了TSA作为一种HDAC抑制剂能够激动miR-4298从而抑制PADI4实现诱导胶质瘤细胞凋亡作用，基于本领域技术人员的常规研究思路，其他HAC抑制效果的药物也有望发挥上述药理活性，实现上述通路的调节作用。进一步的，本发明还提供了药物TSA能够调控miR-4298实现PADI4的抑制作用。因此，本发明第二方面，提供HDAC抑制剂作为miR-4298激动剂的应用。

本发明第三方面，提供HDAC抑制剂作为PADI4抑制剂的应用。

本发明第四方面，提供miR-4298作为PADI4抑制剂的应用。

本发明第五方面，提供miR-4298在制备抗胶质瘤药物中的应用。

本发明第六方面，提供PADI4抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。

本发明第七方面，提供一种抗胶质瘤药物，所述抗胶质瘤药物中包括但不限于HDAC抑制剂、miR-4298、PADI4抑制剂中的一种或几种的混合物。

本发明第八方面，提供一种胶质瘤治疗方法，所述治疗方法包括但不限于通过药物、介入治疗或生物工程手段对患病个体进行以下任一操作：

(1)采用HDAC药物进行治疗；

(2)提升病灶组织中miR-4298的含量；

(3)抑制病灶组织中PADI4的含量。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明研究结果明确了药物TSA作为脑胶质瘤凋亡诱导剂的机制，揭示了PADI4与胶质瘤细胞凋亡的相关性，并且进一步提供了miR-4298有望作为抗胶质瘤活性成分进行应用。miR-4298作为一种内源性成分，应用于抗胶质瘤药物，有望得到一种生物相容性良好、副作用更小的药物。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中HDAC抑制因子TSA对U251细胞的增殖影响折线图；

其中，图1A为0.2μM TSA作用不同天数后细胞增值变化(OD450nm)；

图1B为0.2μM TSA作用不同天数后活细胞数量变化。

图2为实施例1中HDAC抑制因子TSA诱导后U251细胞周期和细胞凋亡变化的结果图；

其中，图2A为0.2μM TSA作用48h前后细胞周期FACS检测结果；

图2B为0.2μM TSA作用48h前后细胞周期分布变化；

图2C为0.2μM TSA作用48h前后细胞凋亡FACS检测结果；

图2D为0.2μM TSA作用48h前后细胞凋亡率变化。

图3为实施例1中所述HDAC抑制因子TSA诱导后U251细胞miRNA-4298和PADI4表达水平的变化；

其中，图3A为PADI4基因表达水平；

图3B为PADI4基因相对表达水平；

图3C为PADI4蛋白表达水平；

图3D为PADI4蛋白相对表达水平；

图3E为miRNA-4298表达水平变化；

图3F为miRNA-4298和PADI4表达相关性分析结果。

图4为实施例1中所述PADI4干扰和双荧光素酶报告实验结果；

其中，图4A为PADI4的siRNA干扰PADI4的表达变化；

图4B为PADI4的Luciferase报告基因活性检测结果。

图5为实施例1中miRNA-4298与PADI4作用结果图；

其中，图5A为miRNA-4298mimic与TSA对PADI4的干扰作用；

图5B为miRNA-4298inhibitor与TSA对PADI4的干扰作用。

图6为实施例1中miRNA-4298mimics对PADI4表达影响的功能救援实验；

其中，图6A为过表达PADI4对miRNA-4298作用的影响；

图6B为PADI4的相对表达密度变化；

图6C为细胞凋亡的救援实验结果；

图6D为细胞增殖的救援实验结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，为了明确PADI4在胶质瘤中的作用机制，为胶质瘤治疗提供新的治疗靶点，本发明提出了HDAC抑制剂在制备脑胶质瘤药物中的应用。

本发明第一方面，提供HDAC抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。

优选的，所述HDAC抑制剂包括但不限于脂肪酸、氧肟酸盐、环肽或苯酰胺类。

所述脂肪酸包括但不限于丁酸盐、丁酸苯酯和丙戊酸；所述氧肟酸盐包括但不限于TSA、SAHA；所述环肽包括但不限于缩酚酸肽FK-228、apicidin和环氧肟酸；所述苯酰胺类包括但不限于MS-275、MGCD0103。

进一步优选的，所述HDAC抑制剂为氧肟酸盐类，具体的，为药物TSA。

优选的，所述HDAC抑制剂作为胶质瘤凋亡诱导剂。

优选的，所述抗胶质瘤药物中包括HDAC抑制剂及药学上所必须的辅料。

本发明第二方面，提供HDAC抑制剂作为miR-4298激动剂的应用。

本发明第三方面，提供HDAC抑制剂作为PADI4抑制剂的应用。

本发明第四方面，提供miR-4298作为PADI4抑制剂的应用。

优选的，所述PADI4抑制剂包括但不限于，具有抑制PADI4表达的化合物实体、具有PADI4沉默作用的核酸物质、具有PADI4沉默作用的质粒、慢病毒载体等。

优选的，所述抗胶质瘤药物还包括药学上所必须的辅料。

优选的，所述抗胶质瘤药物中包括其他治疗性成分，所述治疗性成分包括但不限于其他抗胶质瘤药物、免疫调节药物、抗炎药物和/或抗感染药物。

优选的，所述抗肿瘤药物为口服制剂，为汤剂、混悬剂、糖浆剂、合剂、酊剂等口服液体制剂，还可以为膏剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂或滴剂；

优选的，所述药物为汤剂或颗粒剂；所述汤剂为水煎剂，日服1到2剂；

优选的，所述药物为颗粒剂；

优选的，所述药物为吸入剂，包括但不限于为一种喷剂、气雾剂、干粉吸剂或吸入性混悬液；

优选的，所述药物为注射剂，包括但不限于为一种静脉注射、肌肉注射及皮下注射剂，进一步优选的，为一种注射液、注射乳剂或无菌粉剂。

(1)采用HDAC药物进行治疗；

(2)提升病灶组织中miR-4298的含量；

(3)抑制病灶组织中PADI4的含量。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1、细胞增殖实验

(1)细胞来源与主要试剂

U251细胞(人胶质瘤细胞株)购自山东科硕生物科技有限公司，传代细胞株，复苏后证实生长良好。细胞培养的培养液体RPMI 1640和小牛血清均为HyClone产品。

TSA，Sigma公司产品：少量DMSO助溶后以无水乙醇配制成储存液，储存终浓度为1×10^-6M，在-20℃冰箱保存。

(2)细胞增殖实验：

1)CCK8法：将液氮保存的U251细胞常规复苏后，传代培养至对数生长期，按终浓度1×10⁵/mL接种于96孔培养板中，然后加入0.2μM的HDAC抑制因子TSA，总体积为100μL，设3复孔。37℃，5％CO₂条件下培养48h后，每孔加入10μLCCK8溶液，继续培养2h后，采用酶标仪在450nm处测定OD值，绘制细胞生长抑制曲线。根据接近半数抑制率原则，选择实验浓度的TSA进行分子机制研究。每组3复孔，细胞增殖水平以酶标仪检测值(OD450nm)表示。

2)常规台盼兰拒染实验计数活细胞数量变化，按照试剂盒说明进行。

细胞增殖结果及活细胞数量如附图1所示，采用0.2μM的TSA培养U251细胞一段时间后，胶质瘤细胞增殖速度变慢，活细胞数量相比对照组具有显著的降低。这说明TSA能够抑制胶质瘤细胞的增殖。

2、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡

(1)细胞周期：收集TSA处理48h的U251细胞(至少1×10⁶)，PBS缓冲液洗涤1次(2000rpm,6min)，加入70％酒精1mL，4℃保存至少20h。固定细胞利用PBS洗涤1次，加入100mL PBS,含0.02mg/mL PI(propidium iodide，Sigma,0.2mg/mL)和0.5mg/mL Rnase A，37℃30min，再加入400mL PBS，PI染色的细胞FACScan流式细胞仪检测。

细胞周期检测结果如附图2A，2B所示，TSA作用于U251细胞48h后，细胞周期主要集中于G0/G1及G2/M区，S区细胞数量降低，说明胶质瘤细胞分裂这一过程被抑制。

(2)Annexin V/PI双染检测细胞凋亡的影响：采用上述增殖实验确认的实验浓度(0.2μM TSA)，相同实验步骤进行U251细胞的体外培养，37℃，5％CO₂条件下培养48h后，采用预冷PBS洗涤2次(1500rpm x 5min)，以结合缓冲液调节细胞浓度为1×10⁶/mL，取100μL的细胞悬液，分别加入10μL的PI(20μg/mL)5μL的AnnexinV/FITC，继续避光孵育15min，流式细胞仪检测细胞凋亡的水平。

细胞凋亡结果如附图2C、2D所示，经TSA作用48h后的胶质瘤细胞凋亡率显著上升，提高了大约五倍之多。

3、PCR检测基因的转录水平表达

(1)RT-PCR检测PADI4基因表达水平：收集经TSA处理48h的U251细胞，按TRIzolReagent(Invitrogen,USA)说明操作，进行总RNA的提取。逆转录反应合成cDNA：根据提取测量的RNA的浓度，加入1μgRNA，随机引物2μL，5×RT缓冲液4μL，4×10mM dNTP 2μL，RNase抑制剂0.5μL(20U)，M-MLV 1μL，加DEPC水补至20μL，混匀，混匀后温度参数如下：25℃反应10分钟，42℃、50分钟，72℃，10分钟，95℃，5分钟。常规PCR方法检测PADI4目的基因。

PADI4基因以及β-actin内参基因的扩增引物序列为：

PADI4(533bp)

F:CCGTGTGACCCCAGAGCAGCCC,R:GTGCTCAGGGTCAGCGACA；

β-actin(540bp)

F:GTGGGGCGCCCCAGGCACCA,R:CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。

U251细胞中PADI4基因表达水平如附图4A和4B中所示，可以看出，采用TSA培养U251细胞48h后，细胞中PADI4基因的水平出现了显著的下降，结合PADI4蛋白水平检测结果可以得知，TSA诱导后的U251细胞中PADI4的蛋白水平同样显著下降。这启示PADI4的表达可能与胶质瘤的增值抑制、凋亡等生理活动相关。

(2)qPCR检测TSA诱导前后miRNA-4298表达水平的变化：用Trizol提取细胞系中的总RNA，将OD260/OD280>1.8的光密度(ODPCR)值用于随后的定量聚合酶链反应(qPCR)检测。引物由上海三工生物工程有限公司设计和合成。qPCR反应参照试剂盒手册进行(总反应量50μL)：1.25μL上游引物，1.25μL下游引物，1.0μL探针，RNA模板10pg/g，5μL50×ROX参考染料ROX(山东科硕生物技术有限公司)，最后在50μL中加入无RNase的ddH₂O。反应过程：50℃逆转录30分钟；在95℃下进行3分钟预变性。在95℃变性40循环15s，在60℃退火30s。通过ABI 7500仪器分析获得的结果。U6和GAPDH作为内部参考基因，数据通过2-Ct标准化。

从附图3E、3F中可以看出，TSA诱导后的U251细胞中，miRNA-4298表达水平显著升高，并且miRNA-4298含量变化与PADI4具有相关性，这启示了药物TSA可能通过促进miRNA-4298的表达从而抑制PADI4。

4、PADI4上游miRNA预测与鉴定

在证实TSA诱导U251发生凋亡过程中表达降低的基础上，使用www.targetscan.org、www.mirdb.com网站预测人PADI4基因3’UTR存在着与hsa-miR-4298的结合位点。根据NCBI网站的基因3’UTR序列和Q-PCR预实验，确定hsa-miR-4298为候选PADI4上游miRNA，并且进行实验室常规hsa-miR-4298干扰实验，并观察干扰后PADI4的表达变化。

5、Western blot检测PADI4蛋白表达

收集培养48h的细胞，经过PBS洗涤两次，2500rpm离心4-5min，加入细胞裂解缓冲液(V/V为1:3)，振荡后放至冰上20分钟。14000rpm 20分钟，收集上清液。常规测定OD值并换算蛋白含量。然后进行常规电转移、ponceau染色、膜封闭和洗涤。加入5μL第一抗体(1:1000)，室温放置2h或冷室中过夜。PBS-T洗涤3-4次加入酶标抗体，室温1.5h。ECL反应液A和B按照1:1(V/V)混合，加在反应膜上，室温均匀反应2-3min，凝胶成像分析仪扫描，观察并半定量分析结果。

本实施例还采用PADI4的siRNA干扰PADI4的表达变化，结果如图4A所示，沉默PADI4后的细胞凋亡率显著上升。

6、荧光素酶实验

人PADI4基因荧光素酶报告基因载体构建：选择pmirGLO载体，分别构建人PADI4基因(hsa-miR-4298)3’UTR野生型载体和人PADI4基因(hsa-miR-4298)3’UTR突变型载体。将HEK293T细胞按照3.75×10⁴/孔接种到96孔板，培养24h；用Lipofectamine ^TM 2000试剂将pMirGLO 100ng，PADI4-WT 100ng，PADI4-MUT 100ng及hsa-miR-4298mimics 50nM，NC 50nM共同转染入HEK293T细胞。转染48小时后收取细胞进行荧光素酶报告基因的检测。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega(E1910)，检测仪器为Thermo Varioskan flash。报告基因活性分析实验至少重复三次，每次实验设置复孔。结果以萤火虫荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性的比值表示，并进行分析。从附图4B中可以看出，野生型HEK293T细胞在加入hsa-miR-4298mimics之后，细胞活性下降，而将hsa-miR-4298mimics转入PADI4基因突变后的细胞中，细胞的活性却保持不变，这可以说明PADI4是miR-4298的下游靶点，miR-4298对胶质瘤凋亡的诱导作用是通过抑制PADI4实现的。

7、miRNA-4298干扰与救援实验

(1)干扰效果用RT-PCR测定目的基因，western blot测定目的蛋白变化。包括miRNA-4298mimics干扰实验和miRNA-4298inhibitor干扰实验。观察其对PADI4表达的影响，以及引起凋亡的改变情况。基因表达、蛋白表达和凋亡水平变化的实验方法同上述实验步骤。检测结果如附图5、附图6A及6B所示，加入miRNA-4298mimics培养后，胶质瘤细胞密度显著降低，而共同加入miRNA-4298mimics及PADI4进行培养的胶质瘤细胞密度大于miRNA-4298mimics组，证明PADI4在一定程度上拮抗miRNA-4298mimics对胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。

(2)在miRNA-4298mimics转染实验过程中，同时转染PADI4质粒，按照上述1(细胞增殖实验)和2(流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡)中的方法分别进行细胞增殖和凋亡水平测定，按照5(Western blot检测PADI4蛋白表达)中的方法进行PADI4蛋白表达水平测定，结果如附图6C及6D所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.HDAC抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述HDAC抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述HDAC抑制剂包括但不限于脂肪酸、氧肟酸盐、环肽或苯酰胺类；

所述脂肪酸包括但不限于丁酸盐、丁酸苯酯和丙戊酸；

所述氧肟酸盐包括但不限于TSA、SAHA；

所述环肽包括但不限于缩酚酸肽FK-228、apicidin和环氧肟酸；

所述苯酰胺类包括但不限于MS-275、MGCD0103；

优选的，所述HDAC抑制剂为氧肟酸盐类，进一步的，为药物TSA。

3.如权利要求1所述HDAC抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述HDAC抑制剂作为胶质瘤凋亡诱导剂；

或所述抗胶质瘤药物中包括HDAC抑制剂及药学上所必须的辅料。

4.HDAC抑制剂作为miR-4298激动剂的应用。

5.HDAC抑制剂作为PADI4抑制剂的应用。

6.miR-4298作为PADI4抑制剂的应用。

7.miR-4298在制备抗胶质瘤药物中的应用。

8.PADI4抑制剂在制备抗胶质瘤药物中的应用。

9.一种抗胶质瘤药物，其特征在于，所述抗胶质瘤药物中包括但不限于HDAC抑制剂、miR-4298、PADI4抑制剂中的一种或几种的混合物，

优选的，所述抗胶质瘤药物还包括药学上所必须的辅料；

10.一种胶质瘤治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括但不限于通过药物、介入治疗或生物工程手段对患病个体进行以下任一操作：

(1)采用HDAC药物进行治疗；

(2)提升病灶组织中miR-4298的含量；

(3)抑制病灶组织中PADI4的含量。