CN112656800A - 巯嘌呤及其衍生物在制备解除恶性肿瘤免疫抑制药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了巯嘌呤及其衍生物的新用途，即其在制备解除恶性肿瘤免疫抑制药物中的应用，将巯嘌呤及硫鸟嘌呤作用于人肺癌、结直肠癌、肝癌、黑色素瘤，乳腺癌等肿瘤细胞，均可显著降低糖基转移酶GLT8D1的表达，进而抑制PD‑L1的蛋白水平和糖基化水平，从而增加外周血单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤作用达到抑制肿瘤的目的；本发明发现干扰核酸生物合成的，被广泛用于抗白血病药物‑‑‑‑巯嘌呤/硫鸟嘌呤可通过靶向性抑制糖基转移酶GLT8D1和细胞程序性死亡‑配体1（PD‑L1），加强T细胞对肿瘤杀伤，从而达到治疗多种肿瘤的药物目的；本发明为多种肿瘤的治疗提供了新的治疗药物。

Description

巯嘌呤及其衍生物在制备解除恶性肿瘤免疫抑制药物中的 用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗领域，具体涉及巯嘌呤及其衍生物在制备解除恶性肿瘤免疫抑制药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

根据全球所有年龄段、性别，包括非黑色素瘤皮肤癌在内的所有癌症发病比例的推算，2018年全球预计有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。新增的1810万癌症患者中，亚洲占将近50%；而死亡的960万癌症患者中，亚洲则占了近70%。全球新发癌症发病率最高的依次为：肺癌（11.6%）、乳腺癌（11.6%）、结肠直肠癌（10.2%）、前列腺癌（7.1%）、胃癌（5.7%）；全球死亡率最高的癌症依次为：肺癌（18.4%）、结肠直肠癌（9.2%）、胃癌（8.2%）、肝癌（8.2%）、乳腺癌（6.6%）。1800万新增癌症病例及960万癌症死亡病例中，我国新增病例数占380.4万例、死亡病例数占229.6万例。这一组数据也就意味着：全球每新增100个癌症患者中，中国人就占了21个。也就是说，我国每天有超过1万人确诊癌症，平均每分钟有7个人得癌症。全球每死亡100个癌症患者中，中国人占将近24个。平均每天都有6000多人死于癌症，每分钟就有将近5人死于癌症。在中国，肺癌同样是发病率和死亡率最高的癌种，高发的还有乳腺癌、结直肠癌、肝癌等。而现有的常规治疗手段以手术切除为主，辅以放疗、化疗、靶向治疗以及免疫治疗等。免疫疗法的出现不仅革命性地改变癌症治疗的标准，同时也革命性地改变了治疗癌症的理念，被称为继传统化疗药物、靶向肿瘤治疗的第三次革命。

近年来，肿瘤免疫治疗已成为晚期恶性肿瘤治疗的重要手段之一。肿瘤免疫治疗并不直接攻击癌细胞，而是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应。肿瘤免疫治疗目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性。PD-1/PD-L1作为一对免疫抑制分子参与免疫调节，也是肿瘤细胞抑制免疫应答的最大的“帮手”之一。PD-1分子在免疫反应的初期并不会表达，大约在免疫发生的10-15天，PD-1分子的表达水平急速上升，这个表达水平的改变可回调免疫反应，防止免疫过激；也参与维持免疫耐受，保护自身细胞。肿瘤正是利用这种“保护体制”，通过表达PD-L1，与效应T细胞表面的PD-1分子结合，促进T细胞的“活化无能”。PD-1/PD-L1抑制剂疗法，正是阻断了这一过程，重新活化效应T细胞。据统计，2018年针对PD-1/PD-L1的药物在2250项临床试验中进行评估，比2017年增加了748项。然而，目前PD-1抗体治疗的疗效十分有限，且其疗效不体现在对多少患者存在反应，而是对该种疗法有反应的患者可大幅度延长生存期及生存质量。需要强调的是，此种疗法目前价格相对昂贵，也存在一些耐药现象，急需寻找新的PD-1/PD-L1抑制剂。

翻译后糖基化是真核细胞中最广泛存在的蛋白修饰形式之一，在决定蛋白质的各种性质及影响体外多种分子进程方面发挥重要作用，例如参与免疫防御，细胞生长、发炎和细胞间的附着等过程。临床上有2/3的蛋白质包括单克隆抗体是糖基化修饰。糖基转移酶在生物体内催化活化的糖链接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖和脂上，糖基化的产物具有很多生物学功能并具有高度的底物专一性，参与体内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成，糖基转移酶的作用是把相应的活性供体（通常是二磷酸核苷NDP-糖）的单糖部分转移到糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工，并实现其相应的生物功能。GLT8D1即糖基转移酶8结构域1，其作为糖基转移酶的一种，比普通糖基转移酶更为复杂，其C-端结构增加识别未进行折叠的蛋白质（多肽）结构；GLT8D1存在于人体绝大部分正常组织，包括脑组织。前期我们的研究发现，在胶质瘤中高表达的GLT8D1可以糖基化并稳定胶质瘤干细胞的标志物CD133，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进胶质瘤干细胞的活性。

已有文献表明PD-L1的免疫抑制活性通过泛素化和N-糖基化进行严格调节。糖原合成酶激酶3β（GSK3β）与PD-L1相互作用，通过β-TrCP诱导PD-L1的磷酸化依赖蛋白酶体降解。PD-L1 N192、N200和N219糖基化可以拮抗糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的结合。只有非糖基化的PD-L1可以和GSK3β及β-TrCP结合而被降解。PD-L1的蛋白糖基化是否受GLT8D1的调控尚未见报导。

嘌呤（Purine），是指主要以嘌呤核苷酸的形式存在于身体内的一种物质。在作为能量供应、代谢调节及组成辅酶等方面起着十分重要的作用。巯嘌呤(Mercaptopurine，6-MP) 属于抑制嘌呤合成途径的细胞周期特异性药物，化学结构与次黄嘌呤相似，因而能竞争性地抑制次黄嘌呤的转变过程，6-MP进入体内，在细胞内必须由磷酸核糖转移酶转为6-巯基嘌呤核糖核苷酸后才具有活性。6-MP通过抑制磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPP酰胺转移酶)，抑制嘌呤核苷酸合成和代谢。PRPP酰胺转移酶是嘌呤合成的限速酶。它会改变RNA和DNA的合成和功能，是一种广泛使用的抗白血病药剂。

兰快舒又名6-硫代鸟嘌呤（Thioguanine ,6-TG）、硫鸟嘌呤，应用于各类急性白血病，均有较好的疗效。临床与阿糖胞苷合用为目前治疗急性粒细胞白血病常用方案之一。对慢性粒细胞白血病及其急性变也有一定疗效。其作用类似巯嘌呤，在体内必需由磷酸核糖转移酶转化成硫鸟嘌呤苷酸(6-TGRP)后才具有活性。最后转变成脱氧鸟嘌呤核苷酸，干扰DNA功能，产生抗癌作用。为S期特异性抗肿瘤药，对S/G2边界有延缓作用。属于抑制嘌呤合成途径的常用嘌呤代谢拮抗药物，是细胞周期特异性药物，对处于S期细胞最敏感。目前还未见硫鸟嘌呤在除血液恶性肿瘤治疗外，在其他恶性肿瘤治疗方面的相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供巯嘌呤（6-MP）及其衍生物硫鸟嘌呤（6-硫代鸟嘌呤，6-TG）的新用途，即其在制备治疗多种人恶性肿瘤药物中的应用，巯嘌呤及其衍生物能用于解除肿瘤的免疫抑制。

本发明所述的巯嘌呤及其衍生物的用途，是将巯嘌呤及其衍生物用作治疗除血液恶性肿瘤外的人恶性肿瘤的药物，或用于制备治疗除血液恶性肿瘤外的人恶性肿瘤药物的药物，即以巯嘌呤及其衍生物为活性成分，在制备解除恶性肿瘤免疫抑制的解除剂中的应用，包括但不局限于巯嘌呤及硫鸟嘌呤。

所述巯嘌呤（Ⅰ）及硫鸟嘌呤（Ⅱ）的化学结构式如下：

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本发明所述的治疗恶性肿瘤药物的成分（或有效成分）为巯嘌呤及其衍生物，还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，以改善药物吸收效果或便于服用，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等，即制成药剂学上适宜的使用剂型。

本发明发现当巯嘌呤及硫鸟嘌呤处理不同的恶性肿瘤细胞系，如肺癌细胞系H1299和A549，结直肠癌细胞系HCT116、DLD-1和Lovo，肝癌细胞系Huh-7，乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SUM149或MDA-MB-453及黑色素瘤细胞系A375和SK-MEL-5时，随着6-MP或6-TG浓度的增加，GLT8D1的蛋白表达递减，同时细胞内PD-L1的蛋白水平及蛋白分子量都发生了明显的改变，PD-L1蛋白的总量明显减少，PD-L1蛋白分子量因糖基化水平降低而变小，且细胞膜表面的PD-L1的表达也显著降低。当6-MP或6-TG处理肿瘤细胞，并与激活的PBMC细胞（外周血单个核细胞）共孵育，PBMC对肿瘤细胞的杀伤效果显著增加。

本发明发现巯嘌呤及硫鸟嘌呤对多种恶性肿瘤细胞的作用是通过降低GLT8D1蛋白的表达水平，从而降低PD-L1蛋白水平，进而解除肿瘤免疫抑制，达到抑制肿瘤的发生发展。

本发明的优点和技术效果：

本发明为巯嘌呤及其衍生物的使用开拓了一个新的医疗应用途径，本发明通过实验发现在多种恶性肿瘤中，6-MP及6-TG通过降低GLT8D1蛋白的表达水平，从而降低PD-L1蛋白水平，进而解除肿瘤免疫抑制，达到抑制肿瘤的发生发展的目的，本发明为多种肿瘤的治疗提供了新的治疗药物，具有临床应用价值和市场推广应用的前景。

附图说明

图1为IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）处理肺癌细胞A549后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图2为IFN-γ及巯嘌呤（6-MP）（左）、IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）（右）处理肺癌细胞H1299后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图3为IFN-γ及巯嘌呤（6-MP）（左）、IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）（右）处理结直肠癌细胞HCT116后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图4为IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）处理结直肠癌细胞LoVo后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图5为为IFN-γ及巯嘌呤（6-MP）（左）、IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）（右）处理乳腺癌细胞MDA-MB-231后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图6为IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）处理乳腺癌细胞SUM149后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图7为IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）处理肝癌细胞Huh-7后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图8为IFN-γ及巯嘌呤（6-MP）（左）、IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）（右）处理黑色素瘤细胞A375后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图9为IFN-γ及巯嘌呤（6-MP）（左）、IFN-γ及硫鸟嘌呤（6-TG）（右）处理黑色素瘤细胞SK-MEL-5后，GLT8D1和PD-L1蛋白的表达检测结果示意图；

图10为激活的PBMC在硫鸟嘌呤（6-TG）不处理和处理后对肺癌细胞A549的杀伤结果示意图；

图11为激活的PBMC在巯嘌呤（6-MP）（左）、硫鸟嘌呤（6-TG）（右）不处理和处理后对肺癌细胞H1299的杀伤结果示意图；

图12为激活的PBMC在巯嘌呤（6-MP）（左）、硫鸟嘌呤（6-TG）（右）不处理和处理后对结直肠癌细胞HCT116的杀伤结果示意图；

图13为激活的PBMC在硫鸟嘌呤（6-TG）不处理和处理后对结直肠癌细胞LoVo的杀伤结果示意图；

图14为激活的PBMC在硫鸟嘌呤（6-TG）不处理和处理后对结直肠癌细胞DLD-1的杀伤结果示意图；

图15为激活的PBMC在巯嘌呤（6-MP）（左）、硫鸟嘌呤（6-TG）（右）不处理和处理后对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤结果示意图；

图16为激活的PBMC在硫鸟嘌呤（6-TG）不处理和处理后对乳腺癌细胞MDA-MB-453的杀伤结果示意图；

图17为激活的PBMC在硫鸟嘌呤（6-TG）不处理和处理后对肝癌细胞Huh-7的杀伤结果示意图；

图18为激活的PBMC在巯嘌呤（6-MP）（左）、硫鸟嘌呤（6-TG）（右）不处理和处理后对黑色素瘤细胞A375的杀伤结果示意图；

图19为肺癌细胞A549在IFN-γ处理或与6-TG联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图20为肺癌细胞H1299在IFN-γ处理或与6-TG联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图21为结直肠癌细胞HCT116在IFN-γ处理或与6-TG联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图22为乳腺癌细胞MDA-MB-231在IFN-γ处理或与6-MP(左)/6-TG（右）联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图23为乳腺癌细胞MDA-MB-453在IFN-γ处理或与6-MP(左)/6-TG（右）联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图24为黑色素瘤细胞A375在IFN-γ处理或与6-MP(左)/6-TG（右）联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图25为黑色素瘤细胞SK-MEL-5在IFN-γ处理或与6-MP(左)/6-TG（右）联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果；

图26为肝癌细胞Huh-7在IFN-γ处理或与6-MP联合处理，PD-L1在膜上表达水平的检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。

实施例1：蛋白免疫印迹（Western Blotting）实验

首先在A549、H1299、HCT116、LoVo、MDA-MB-231、SUM149、Huh-7、A375、SK-MEL-5细胞中加入不同浓度6-MP或6-TG预处理12h，而后加入IFN-γ（10ng/mL）处理，IFN-γ处理24h后，加RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白样品，BCA蛋白定量后将蛋白样品通过移液枪加入凝胶板中，150V电压下电泳直至溴酚蓝快要跑出。转膜：把转膜架放在预冷的转膜液中，黑色塑料板面向下，白色在上，在黑色面上方放一块海绵垫，海绵垫上方放一张滤纸；轻轻把凝胶从电泳玻璃板上取下来后放到滤纸上，把PVDF膜放到凝胶上方，再放一张滤纸，滤纸上方放一块海绵垫，把黑白两块塑料板固定牢固，放入已经预冷的转膜缓冲液中；冰浴条件下，恒流500mA转膜110min；把PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h；加入用含5% BSA的TBST稀释的一抗，4℃缓慢摇动中孵育过夜；TBST洗膜10min×3次；加入HRP标记的二抗室温孵育1h；TBST洗膜10min×3次；把PVDF膜转移到显影仪中，避光条件下加入ECL试剂（用前把A和B液进行等量混合），显影拍照；检测GLT8D1以及PD-L1蛋白的变化情况（GLT8D1: abcam ab236974 ，PD-L1: CST 13684，α-Tubulin: sigma75168）；

结果如图1-9所示，与单独用6-MP或6-TG处理的细胞相比，添加IFN-γ处理的肿瘤细胞（肺癌：A549和/或H1299；结直肠癌：HCT116和/或LoVo；乳腺癌：MDA-MB-231和/或SUM149；肝癌：Huh-7及黑色素瘤：A375和/或SK-MEL-5）中PD-L1的表达显著提高，与对照相比，添加6-MP或6-TG处理后，不同的肿瘤细胞系中糖基转移酶GLT8D1的蛋白表达水平随着6-MP或6-TG浓度的增加逐渐降低，同时PD-L1蛋白的表达水平和糖基化水平呈现出与GLT8D1的蛋白表达一样的降低趋势，结果表明6-MP或6-TG可以通过降低GLT8D1蛋白的表达水平进而降低PD-L1蛋白表达水平。

实施例2：PBMC肿瘤杀伤实验

PBMC细胞的抽提，取健康人的血液，在离心管中加入恢复室温的Fico分离液，将血液缓慢的加入（不要打破分离液与血液的界限），室温下1590转离心半小时，离心结束后取中间层的细胞即为PBMC细胞，吸出PBMC细胞加入到PBS中，1590转离心10min，重复两遍，而后用1640全培养基重悬细胞沉淀加入到细胞培养皿中沉淀2h，2h后取出不贴壁的细胞放入新的培养皿中，加入CD3（100ng/mL）以及IL-2（10ng/mL）激活48h；

将肿瘤细胞计数后接种于24孔板，待细胞贴壁后加不同浓度的6-MP或6-TG预处理12h，而后按比例加入激活好的PBMC细胞与肿瘤细胞共培养，共培养48h后弃上清，PBS洗一遍，加入4%的PFA固定细胞，而后再用PBS洗两遍，每孔加入300µL的结晶紫染色5min，而后用去离子水将多余的结晶紫清洗干净并拍照整理结果。

结果如图10-18所示，与对照相比，6-MP或6-TG处理后，激活的PBMC细胞对不同的肿瘤细胞（肺癌：A549和/或H1299；结直肠癌：HCT116、LoVo和/或DLD-1；乳腺癌：MDA-MB-231和/或MDA-MB-453；肝癌：Huh-7及黑色素瘤：A375）杀伤效果显著提高，且随着6-MP或6-TG浓度的增加，杀伤效果随之加强，与6-MP相比，6-TG的杀伤效果更强。

实施例3：膜表面PD-L1的检测

首先在A549、H1299、HCT116、MDA-MB-231、MDA-MB-453、A375、SK-MEL-5和Huh-7细胞中加入6-MP（10µM）或6-TG（4µM）预处理12h，而后加入IFN-γ（10ng/mL）处理，IFN-γ处理24h后，用胰酶将细胞消化为单个细胞，790转离心细胞，而后用5mL的PBS重悬细胞，再一次离心后弃上清，每管细胞中加入500µL的细胞染色缓冲液重悬细胞，而后加入5µL的PD-L1APC抗体，37℃孵育30min，将敷好抗体的细胞790转离心并弃上清，用3mL的细胞染色缓冲液洗细胞两次，最后用500µL的细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，用滤膜过滤细胞后用流式仪检测荧光强度，最后用Flow Jo软件分析流式结果；

结果如图19-26所示，与对照相比，6-MP或6-TG处理后，在IFN-γ处理的不同的肿瘤细胞（肺癌：A549和/或H1299；结直肠癌：HCT116；乳腺癌：MDA-MB-231和/或MDA-MB-453；黑色素瘤：A375和/或SK-MEL-5及肝癌:Huh-7）PD-L1在细胞膜上的表达较未用6-MP或6-TG处理的细胞显著降低。

Claims (2)

1.巯嘌呤及其衍生物在制备解除恶性肿瘤免疫抑制药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：恶性肿瘤为人肺癌、结直肠癌、肝癌、黑色素瘤或乳腺癌。

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