CN112626240A - 一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其包括以下步骤：菌群样品的采集与宏基因组、宏转录组数据的测试和处理；筛选菌群中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因；比较不同菌群高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因表达丰度差异；基于不同菌群之间高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的差异来判断不同菌群中细菌相互作用的强弱关系。高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因表达丰度高的菌群中细菌相互作用强。本发明通过比较不同菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的高低，直接、准确、快速地判断菌群中细菌相互作用的强弱关系，降低了现有判断菌群中细菌间相互作用强弱关系的技术难度。

Description

一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法
技术领域
本发明属于细菌微生物检测的技术领域，具体涉及一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法。
背景技术
在由多物种组成的细菌群落中，细菌间存在着代谢物交换、信号传导、对特定生态位竞争等相互作用。对于菌群中一定数量的细菌，彼此间存在的相互作用数量越多，意味着细菌间的相互作用关系越复杂、强度越高。不同环境或条件下细菌互相作用的强弱对比及其动态变化是近年来微生物生态领域的研究热点。
目前，科研人员采用的一种技术是通过实验手段研究细菌间相互作用，例如通过对比向某菌群中引入另一种细菌前后菌群结构的差异与基因表达差异来研究该引入的细菌与菌群内原有各细菌之间是否存在相互作用关系及相互作用的强弱。这种技术的局限在于若待研究菌群群落结构复杂，则需要进行多组实验且仅限于对可纯培养的细菌进行研究。
另一种技术是基于细菌共生网络来指示菌群中多种细菌相互作用的强弱关系，这种方法的局限性在于：一方面，该方法是基于细菌丰度的相关性表征细菌相互作用关系，细菌的丰度不属于细菌相互作用，而是细菌相互作用的结果之一，因此该方法不是从本质上直接判断细菌互作强度的方法；另一方面，该方法不仅需要计算所有待研究细菌在各个样本中的表达量，还要计算丰度占比、做相关性分析并统计共生网络的参数以得出细菌互作的变化与差异，因此也相对烦琐。
细菌通讯，也称群感效应，属于细菌之间的相互作用的一类，可由不同种信号分子介导。而由高丝氨酸内酯类信号分子介导的细菌通讯过程参与调控的很多表现型都与细菌间的相互作用有关。例如：其参与调控的蛋白酶、毒力因子等代谢物的合成与分泌可以促进细菌间的互养或竞争；其参与调控的细菌的团聚可以为细菌在微环境中近距离交换代谢物或传导信号创造有利条件；其参与调控细菌的生长与活性，使得菌群处于一个高生物量、高代谢活跃度的状态，有利于更多细菌间相互作用的发生。此外，高丝氨酸内酯的生物合成过程涉及底物合成、终产物合成等诸多反应需要消耗一定资源与能源，且可产生正反馈效应。因此，活跃的高丝氨酸内酯合成过程更易发生在生物量高、代谢活跃、细菌相互作用强的菌群中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，通过比较不同菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的高低，直接、准确、快速地判断菌群中细菌相互作用的强弱关系，降低了现有判断菌群中细菌间相互作用强弱关系技术的难度。
本发明提供一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其包括以下步骤：
步骤1，菌群样品的采集与宏基因组、宏转录组数据的测试和处理；
步骤2，筛选菌群中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因；
步骤3，比较不同菌群高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因表达丰度差异；
步骤4，基于不同菌群之间所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的差异来判断所述不同菌群中细菌相互作用的强弱关系。
优选地，在步骤4中，当一个菌群的所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度高于另一个菌群的所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度时，则判定所述一个菌群中的细菌相互作用强于所述另一个菌群中的细菌相互作用。
优选地，步骤1中的所述菌群宏基因组数据的测试和预处理包括：提取菌群样品的总DNA样本、对所述DNA样本进行测序获得原始序列数据、对所述原始序列数据进行测试和质量控制、Contigs和Scaffolds的组装以及开放阅读框的判断。
优选地，步骤1中的所述菌群宏转录组数据的测试和预处理包括：提取菌群样品的总RNA样本、对所述RNA样本进行测序获得原始序列数据、对所述原始序列数据进行测试和质量控制、将所述原始数据与所述菌群宏基因组数据进行基因图谱比对、计算每个开放阅读框的表达量、将计算得到的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数进行归一化处理得到所述开放阅读框对应基因的表达丰度。
优选地，所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因包括类HdtS基因、类LuxI 基因和类LuxM基因。
优选地，逐一将步骤1中的所述数据测试与预处理得到的开放阅读框在pfam 数据库中进行检索，选出注释结果为Acyltransferase且期望值小于10-5的第一序列，然后从所述第一序列中选出含有溶血磷酸脂酰基转移酶的酶活性必需的保守基元的序列作为所述类HdtS基因；
从所述第一序列中选出注释结果为Auto-synth且期望值小于10-5的第二序列，然后从所述第二序列中选出N端含有与LuxI蛋白酶活性相关的同源氨基酸的序列作为类LuxI基因；
从所述第二序列中选出注释结果为AHL-synthase的且期望值小于10-5则的序列作为类LuxM基因。
优选地，分别将所述类HdtS基因、所述类LuxI基因和所述类LuxM基因在转录水平上的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数进行归一化处理，然后将所述归一化处理的结果相加得到所述高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度。
本发明的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，通过比较不同菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的高低直接、快速的判断菌群中细菌相互作用的强弱关系，降低了现有判断菌群中细菌间相互作用强弱关系的技术难度。
附图说明
图1是本发明的一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
需要说明的是，本发明申请文件权利要求书、说明书中的“第一”和“第二”仅仅用于区分相似的对象，而不必理解为描述特定的次序或先后顺序。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的试验用品如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的试验用品。
本发明提供的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，根据微生物菌群中高丝氨酸内酯信号分子介导的细菌通信过程与菌群中细菌相互作用的相关性，依据不同菌群之间高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因表达丰度的高低判断不同菌群中细菌相互作用强弱关系。
图1示出了本发明的一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法的流程。该流程按照先后顺序主要包括：步骤1，菌群样品的采集与宏基因组、宏转录组数据的测试和处理；步骤2，筛选菌群中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因；步骤3，比较不同菌群高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因表达丰度差异；步骤4，基于不同菌群之间高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的差异来判断不同菌群中细菌相互作用的强弱关系。
在菌群样品的采集与宏基因组、宏转录组数据的测试和处理的步骤S101中，先选取不同的微生物菌群样品，然后进行菌群宏基因组、宏转录组数据的测试和预处理。
在菌群宏基因组数据的测试和预处理过程中，先分别提取上述菌群样品中的总DNA样本，再采用高通量测序技术对不同的总DNA样本进行测序获得原始序列数据，最后对这些原始序列数据进行测定和质量控制、重叠群(Contigs) 和Scaffolds的组装以及开放阅读框的判断。其中，在提取总DNA样本时可自行配置DNA提取试剂或采用市售的商品试剂盒，优选使用商品试剂盒(如 PowerSoil DNAIsolation Kit，土壤DNA提取试剂盒)。
在菌群宏转录组数据的测试和预处理过程中，先分别提取上述不同菌群样品的总RNA样本，然后采用高通量测序技术对不同的总RNA样本进行测序获得原始序列数据，最后对这些原始序列数据进行测试和质量控制、并将这些原始数据与相应的菌群宏基因组数据进行基因图谱比对(map)、计算每个开放阅读框的表达量、将计算得到的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数(RPKM，Reads Per Kilobase per Millionmapped reads)进行归一化处理得到每个开放阅读框对应基因的表达丰度。其中，在提取总RNA样本时可自行配置RNA提取试剂或采用市售的商品试剂盒，优选使用商品试剂盒(如
Figure BDA0002688946020000051
RiboPureTM-Bacteria Kit总RNA制备试剂盒)。
在筛选菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的步骤S102中，高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因主要包括类HdtS基因、类LuxI基因和类LuxM基因。三种基因的筛选过程如下：
1、类HdtS基因的筛选：先将步骤S101中所有的开放阅读框与pfam数据库中的数据进行比对和检索，选择出注释结果为酰基转移酶(Acyltransferase) 且期望值(e-value)小于10-5的第一序列作为类HdtS基因的候选序列。然后检查类HdtS基因的候选序列中是否含有溶血磷酸脂酰基转移酶的酶活性必需的保守基元，含有此保守基元的序列即为类HdtS基因。
2、类LuxI基因的筛选：将步骤S101中所有的开放阅读框与pfam数据库中的数据进行比对和检索，选择出注释结果为Auto-synth且期望值(e-value)小于 10-5的第二序列作为类LuxI基因的候选序列。然后从类LuxI基因的候选序列中选出N端含有与LuxI蛋白酶活性相关的同源氨基酸的序列作为类LuxI基因。
3、类LuxM基因的筛选：将步骤S101中所有的开放阅读框与pfam数据库中的数据进行比对和检索，选择出注释结果为酰基高丝氨酸内酯合成酶 (AHL-synthase)的且期望值(e-value)小于10-5的序列即为类LuxM基因。
在比较不同菌群高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因表达丰度差异的步骤 S103中，先将所有高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因(类HdtS基因、类LuxI 基因和类LuxM基因)在转录水平上的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数(RPKM)进行归一化处理。然后将各个处理后的RPKM数值相加，得到的和即为高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度。最后将不同微生物菌群样品相对应的高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度逐一相互比较，并将这些高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度按照由高到低的顺序进行排列。
在基于不同菌群之间高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的差异来判断不同菌群中细菌相互作用的强弱关系的步骤S104中，根据步骤S103中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的高低排序结果判断不同菌群中细菌相互作用强弱的关系。其中，若上述不同微生物菌群样品中某一个菌群的高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因表达丰度高于另一个菌群的高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因表达丰度，则该菌群中的细菌相互作用强于另一个菌群中的细菌相互作用。
为了帮助更好的理解本发明的技术方案，以下提供实施例用于说明判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法的具体流程及应用效果。
实施例一
本实施例中不同厌氧氨氧化污泥样品中细菌相互作用强弱关系判断的主要流程包括如下步骤：
一、菌群样品的采集与宏基因组、宏转录组数据的测试和处理
首先，启动厌氧氨氧化膜生物反应器，接种污泥为实验室序批式反应器中培养的厌氧氨氧化污泥。厌氧氨氧化反膜生物应器连续运行130d左右，期间在不同时间段共采集15份污泥样品，采集样品后立即用液氮淬灭细菌，储存于-80℃用于后续总DNA样本、总RNA样本的提取。
其次，采用PowerSoil DNA Isolation Kit(土壤DNA提取试剂盒)分别提取这些样品中的总DNA样本，然后采用高通量测序技术和HiSeq 2500对不同的总 DNA样本进行测序。再对这些原始序列数据进行测试和质量控制、重叠群 (Contigs)和Scaffolds的组装以及开放阅读框的判断。
最后，采用
Figure BDA0002688946020000061
RiboPureTM-Bacteria Kit总RNA制备试剂盒分别提取这些样品中的总RNA样本，然后采用高通量测序技术和HiSeq 2500对不同的总 RNA样本进行测序。再对这些原始序列数据进行测试和质量控制、将原始序列数据与相应的菌群宏基因组数据进行基因图谱比对(map)，计算每个开放阅读框的表达量并将计算得到的RPKM进行归一化处理得到每个开放阅读框对应基因的表达丰度。
二、筛选菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因
高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因主要包括类HdtS基因、类LuxI基因和类 LuxM基因。三种基因的翻译产物可以催化合成高丝氨酸内酯类信号分子，有研究表明厌氧氨氧化反应器启动过程中HdtS类基因是监测的种内、种间细菌通讯基因中表达量最高的。三种基因的筛选方法如下：
1、类HdtS基因的筛选：将步骤一中所有的开放阅读框与pfam数据库中的数据进行比对和检索，选择出注释结果为酰基转移酶(Acyltransferase)且期望值(e-value)小于10-5的序列作为类HdtS基因的候选序列。然后检查这些候选序列中是否含有溶血磷酸脂酰基转移酶的酶活性必需的保守基元，含有此保守基元的序列即为类HdtS基因。
2、类LuxI基因的筛选：将步骤一中所有的开放阅读框与pfam数据库中的数据进行比对和检索，选择出注释结果为Auto-synth且期望值(e-value)小于 10-5的序列作为类LuxI基因的候选序列。然后从这些候选序列中选出N端含有与LuxI蛋白酶活性相关的同源氨基酸的序列作为类LuxI基因。
3、类LuxM基因的筛选：将步骤一中所有的开放阅读框与pfam数据库中的数据进行比对和检索，选择出注释结果为酰基高丝氨酸内酯合成酶 (AHL-synthase)的且期望值(e-value)小于10-5的序列，这些序列即为类LuxM 基因。
三、比较不同菌群高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因表达丰度差异
先计算所有高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因(类HdtS基因、类LuxI基因和类LuxM基因)在转录水平上的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数(RPKM)，然后将每个RPKM归一化处理之后的数值相加，得到的和即为高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度。厌氧氨氧化反应器的 15份污泥样品的采样顺序为反应器运行时期的先后顺序。反应器运行初期污泥样品中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度为153.66，反应器运行末期污泥样品中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度78.92，且二者具有显著差异(p<0.001)。
四、基于不同菌群之间高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的差异来判断不同菌群中细菌相互作用的强弱关系
从步骤三的结果可以看出，反应器运行初期污泥样品中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度高于反应器运行末期污泥样品中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度，说明反应器运行初期污泥样品中细菌间相互作用强于反应器运行末期污泥样品中细菌间相互作用，即反应器运行初期菌群中存在的相互作用关系数量更多。
实施例二
本实施例采用细菌共存网络分析方法验证高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因表达丰度方法判断菌群中细菌相互作用强弱关系的应用效果。
细菌共存网络分析是目前应用较为广泛的判断细菌互相作用强度的方法，若本发明用于指示细菌互作强度的指标与细菌共存网络中指示细菌互作强度的指标显著正相关，则认为通过实施本发明技术得到的判断结果准确、可靠。
由于做细菌共存网络分析涉及相关性分析需要同时对几个样品进行分析才可得出结论。因此，从上述厌氧氨氧化反应器的15个污泥样品中随机选取9个样品分为1组，每组作为一个微生物菌群，选取6个组成不同的微生物菌群做共存网络分析。具体分析过程包括以下步骤：
一、将经过质控的宏基因组数据拼接为基因组草图，然后根据转录组数据分别计算每个基因组草图所含片段的reads数，并且将这些reads数加和。再根据每份污泥样品转录组的总mapped reads数与基因组长度分别计算每个基因组草图的RPKM值，即该基因组草图对应物种在转录水平上的表达量。
二、根据第一步中的RPKM值计算每个基因组草图在菌群中的丰度，分别生成6组样品的物种丰度矩阵。
三、利用R语言的psych包，根据上述物种丰度矩阵生成两两相关系数矩阵，本实施例中确定物种间存在相互作用关系的阈值设为相关系数绝对值大于0.6，且p值小于0.05，将相关性系数矩阵内不符合的数据剔除。
四、在Gephi0.9.2中输入筛选后的相关系数矩阵，生成绘制网络图所必需的点文件与边文件。
五、在Gephi0.9.2中输入点文件与边文件，生成细菌共存网络图后，在软件中计算该网络图的参数。本实施例中采用参数“平均度”来表征菌群中细菌相互作用的强弱，平均度的计算方式为无向网络图中边的条数(即所有存在的细菌间相互作用关系数量)*2/点的个数(即研究的细菌物种的数量)。因此，平均度越高意味着菌群中相互作用关系越复杂，可用来表征多种细菌互相作用的强弱。
按照细菌共存网络分析方法，6组样品网络关系的平均度分别为：1组平均度33.73、2组平均度45.05、3组平均度34.45、4组平均度37.83、5组平均度 45.96、6组平均度34.8。将6组样品按照平均度由大到小的顺序排列为： 5>2>4>6>3>1(数字表示分组序号)，说明6组样品中菌群的互相作用强弱关系由强到弱为：5>2>4>6>3>1(数字表示分组序号)。
另外，采用本发明比较高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度。6 组样品的高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因RPKM值归一化处理后的平均值分别为：1组113.01、2组145.52、3组120.83、4组140.44、5组132.59、6组 125.94。因而，6个不同菌群中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度由高到低的排列顺序为：2>4>5>6>3>1(数字表示分组序号)，说明6组样品中菌群的互相作用强弱关系由强到弱为：2>4>5>6>3>1(数字表示分组序号)。
在SPSS中对上述实施例中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度与网络关系的平均度两项重要指标作斯皮尔曼相关性分析。分析结果为，两项指标的相关性系数大于0.8，且该相关关系具有显著性(p<0.05)。说明本发明检测指标与细菌共生网络检测指标呈显著正相关关系，采用菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度高低判断菌群中细菌间相互作用强弱关系的方法是准确、可靠的。
上述实施例表明，本发明通过比较不同菌群中高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的高低直接、准确、快速的判断菌群中细菌相互作用的强弱关系，降低了现有判断菌群中细菌间相互作用强弱关系的技术难度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的改进和修改也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其包括以下步骤：
步骤1，菌群样品的采集与宏基因组、宏转录组数据的测试和处理；
步骤2，筛选菌群中高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因；
步骤3，比较不同菌群高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因表达丰度差异；
步骤4，基于不同菌群之间所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度的差异来判断所述不同菌群中细菌相互作用的强弱关系。
2.如权利要求1所述的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其特征在于：
在步骤4中，当一个菌群的所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度高于另一个菌群的所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因的表达丰度时，则判定所述一个菌群中的细菌相互作用强于所述另一个菌群中的细菌相互作用。
3.如权利要求1所述的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其特征在于：
步骤1中的所述菌群宏基因组数据的测试和预处理包括：提取菌群样品的总DNA样本、对所述DNA样本进行测序获得原始序列数据、对所述原始序列数据进行测试和质量控制、Contigs和Scaffolds的组装以及开放阅读框的判断。
4.如权利要求1所述的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其特征在于：
步骤1中的所述菌群宏转录组数据的测试和预处理包括：提取菌群样品的总RNA样本、对所述RNA样本进行测序获得原始序列数据、对所述原始序列数据进行测试和质量控制、将所述原始数据与所述菌群宏基因组数据进行基因图谱比对、计算每个开放阅读框的表达量、将计算得到的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数进行归一化处理得到所述开放阅读框对应基因的表达丰度。
5.如权利要求1所述的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其特征在于：所述高丝氨酸内酯信号分子合成酶基因包括类HdtS基因、类LuxI基因和类LuxM基因。
6.如权利要求5所述的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其特征在于：
逐一将步骤1中的所述数据测试与预处理得到的开放阅读框在pfam数据库中进行检索，选出注释结果为Acyltransferase且期望值小于10-5的第一序列，然后从所述第一序列中选出含有溶血磷酸脂酰基转移酶的酶活性必需的保守基元的序列作为所述类HdtS基因；
从所述第一序列中选出注释结果为Auto-synth且期望值小于10-5的第二序列，然后从所述第二序列中选出N端含有与LuxI蛋白酶活性相关的同源氨基酸的序列作为类LuxI基因；
从所述第二序列中选出注释结果为AHL-synthase的且期望值小于10-5则的序列作为类LuxM基因。
7.如权利要求5所述的判断复杂菌群中细菌相互作用强弱关系的方法，其特征在于：
分别将所述类HdtS基因、所述类LuxI基因和所述类LuxM基因在转录水平上的每百万读段序列中来自目标基因每千碱基长度的读段序列数进行归一化处理，然后将所述归一化处理的结果相加得到所述高丝氨酸内酯类信号分子合成酶基因的表达丰度。
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