CN112625944A - 假蕈状芽孢杆菌及其在减轻铜离子对植物胁迫作用方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及假蕈状芽孢杆菌及其在减轻铜离子对植物胁迫作用方面的应用，所述假蕈状芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）C6于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020404；该菌可用于减轻铜离子对植物的胁迫作用。本发明涉及的假蕈状芽孢杆菌，对铜离子有吸附作用，能够明显减缓铜离子对植物的胁迫作用，并促进植物生长，作为生物菌剂高效、便捷地减少重金属对植物的严重影响，克服化学制剂的缺陷。

Description

假蕈状芽孢杆菌及其在减轻铜离子对植物胁迫作用方面的 应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种假蕈状芽孢杆菌及其在减轻铜离子对植物胁迫作用方面的应用。

背景技术

铜(Cu)是生产行业(例如电气，防污和涂料行业)中最常用的元素之一，因其在食物链中的生物积累及其持续性也成为生态系统中毒性最大的重金属之一，存在于土壤、河流和沿海水域中，并在环境中传播。

物理与化学法去除效率较低、二次污染严重，且成本较高。生物学方法是指通过微生物或植物的絮凝，吸收，积累和富集来去除重金属的方法，例如生物絮凝，植物修复和生物吸附。具有修复重金属污染功能的细菌主要有芽孢杆菌、假单胞菌、根瘤菌等；真菌主要有黑曲霉、黄曲霉、假丝酵母、酿酒酵母等。微生物及其代谢产物可以使污泥中的重金属离子化，从而将重金属从固相转化为液相。生物表面活性剂对重金属的交换态，可溶态，氧化物态和有机态具有良好的去除效果。据报道，阴沟肠杆菌菌株显示出强大的螯合特性，可以有效去除100mg/L的铜(20％)，镉(65％)和钴(8％)。硫酸盐还原细菌(SRB)是所有可以还原硫酸盐的微生物的总称，以硫化物形式析出重金属。已有研究证明SRB可原位生成纳米级硫化物，形成生物硫化铁复合材料(BISC)，对铜离子的去除效果显著，经过16天培养，复合材料对Cu²⁺的去除率最高可达77.12％。曲霉Aspergillus sp.F-1同样被报道可用于去除含铜废水。生物修复重金属具有处理成本低、二次污染危害小、耐受性高、修复效率高等优点。

有研究发现假蕈状芽孢杆菌代谢产物中的环(脯氨酸-甘氨酸)二肽(C7H10O2N2)能够显著增强小鼠免疫力，产生的聚β-羟基丁酸(PHB)可作为一种新型的塑料替代品以及生物医学材料。假蕈状芽孢杆菌产品以清水稀释600倍施用，能够有效降低蜜柚的裂果率，有利于蜜柚果实可溶性总糖、可溶性固形物和维生素C的积累，从而提高果实品质。假蕈状芽孢杆菌能进入植物体内与其共生，并且诱导植物抗病机能，使植物可以对抗外来的病原菌，对于短期叶菜类作物也有明显促进其生长的效果。并且发现假蕈状芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄微球菌等多种细菌都有良好的抑制作用，但鲜有假蕈状芽孢杆菌具有去除铜离子的能力的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种假蕈状芽孢杆菌及其在减轻铜离子对植物胁迫作用方面的应用，能够快速、高效地减缓铜离子对植物的胁迫作用并促进植物生长，整个去除过程快速高效、操作方便，可有效减少重金属对植物的严重影响作用。

本发明所采用的技术方案为：

假蕈状芽孢杆菌，其特征在于：

所述假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)C6于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020404。

如所述的假蕈状芽孢杆菌的获取方法，其特征在于：

所述方法包括以下步骤：

步骤一：采集土壤样品，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上；

步骤二：培养12h后挑取单菌落进行划线纯化；

步骤三：纯化后的菌株进行铜离子去除实验，以铜离子去除率为指标得到一株优势菌；

步骤四：液体培养菌株后离心得到菌体，优化去除条件为铜离子初始浓度、pH、作用时间、菌体生物量、其他干扰金属离子。

步骤三中，铜离子去除实验的过程为：

在37℃下用牛肉膏蛋白胨培养基培养12小时后，使用高速离心机获得多份菌种，将每份菌种0.1g分别添加到10mL、50mg/L的铜离子溶液中，pH调整为7，37℃、130rpm条件下振动30分钟后，将反应混合物离心，取上清液测定残留铜离子的浓度，筛选出具有最高铜离子去除效率的菌株作为优势菌。

步骤四中，其他干扰金属离子包括Mn、Zn、Ni、Pb。

如所述的假蕈状芽孢杆菌的应用，其特征在于：

所述假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)C6用于减轻铜离子对植物的胁迫作用。

菌体生物量为0.1g/L的假蕈状芽孢杆菌菌剂，在pH 7条件下对50mg/L的铜离子溶液混合作用10min，得到最大去除率。

本发明具有以下优点：

本发明涉及的假蕈状芽孢杆菌，对铜离子有吸附作用，能够明显减缓铜离子对植物的胁迫作用，并促进植物生长，作为生物菌剂高效、便捷地减少重金属对植物的严重影响，克服化学制剂的缺陷。

附图说明

图1为筛选目的菌株的菌落形态、系统发育进化树和生长曲线。(A为菌落形态，B为系统发育进化树，C为生长曲线)

图2为C6菌株吸附Cu²⁺前后的红外光谱分析图。

图3为C6菌株吸附Cu²⁺前后的XPS分析图。(A：菌体吸附Cu²⁺前的宽扫描XPS图谱；B：菌体吸附Cu²⁺后的宽扫描XPS图谱；C：菌体吸附Cu²⁺后的Cu 2p高分辨率图谱；D：菌体吸附Cu^{2 +}之前的O1s高分辨率图谱；E：菌体吸附Cu²⁺之前的N1s高分辨率图谱；F：菌体吸附Cu²⁺之前的C 1s高分辨率图谱；G：菌体吸附Cu²⁺之后的O1s高分辨率图谱；H：菌体吸附Cu²⁺之后的N1s高分辨率图谱；I：菌体吸附Cu²⁺之后的C1s高分辨率图谱)

图4为不同因素对去除率的影响。(A：初始铜离子浓度；B：pH值；C：反应时间；D：C6菌体剂量；E：其他金属离子)

图5为C6菌株吸附Cu²⁺过程的拟一阶模型和拟二阶模型的拟合曲线。(A为一级动力学拟合曲线，B为二级动力学拟合曲线)

图6为C6菌株吸附Cu²⁺过程的活化能。

图7为C6菌株吸附Cu²⁺过程的lnKad和温度倒数(1/T)的线性图。

图8为C6菌株吸附Cu²⁺过程的吸附等温线。(A为Langmuir和Freundlich，B为Elovich，C为Temkin)

图9为C6菌株菌株减缓Cu²⁺对植物生长的胁迫作用。(A为C6减缓不同浓度的Cu²⁺(mg/L)对燕麦幼苗的胁迫作用，B为燕麦幼苗根中铜离子含量，C为根茎中铜离子含量，D为叶片中的铜离子含量)

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一种假蕈状芽孢杆菌，所述假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)C6于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2020404。

上述假蕈状芽孢杆菌的获取方法包括以下步骤：

步骤一：采集土壤样品，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上；

步骤二：培养12h后挑取单菌落进行划线纯化；

步骤三：纯化后的菌株进行铜离子去除实验，以铜离子去除率为指标得到一株优势菌；

步骤四：液体培养菌株后离心得到菌体，优化去除条件为铜离子初始浓度、pH、作用时间、菌体生物量、其他干扰金属离子。

步骤三中，铜离子去除实验的过程为：

在37℃下培养12小时后，使用高速离心机获得多份菌种，将每份菌种0.1g分别添加到10mL、50mg/L的铜离子溶液中，pH调整为7，37℃、130rpm条件下振动30分钟后，将反应混合物离心，取上清液测定残留铜离子的浓度，筛选出具有最高铜离子去除效率的菌株作为优势菌。

步骤四中，其他干扰金属离子包括Mn、Zn、Ni、Pb。

上述假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)C6可用于减轻铜离子对植物的胁迫作用，可以吸附固定铜离子，减少铜离子进入植物体内，具有去除铜离子的作用的同时还具有促进植物生长的作用。

菌体生物量为0.1g/L的假蕈状芽孢杆菌菌剂，在pH 7条件下对50mg/L的铜离子溶液混合作用10min，得到最大去除率。

以下结合附图对本发明作进一步详细说明：

1.1材料：

牛肉膏蛋白胨培养基(NB培养基)，固体牛肉膏蛋白胨培养基(液体牛肉膏培养基加琼脂15-20g/L)、HCL溶液(1mol/L)、NaOH溶液(1mol/L)购自中国上海国药化学试剂有限公司。CuSO4·5H2O购自天津天力化学试剂有限公司，MnSO4·H2O、ZnSO4·5H2O、NiSO4·6H2O、Pb(NO3)2购自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1采样

选取重金属污染地的土壤进行采样，采集距离表层15-20cm处的土壤样品。

1.2.2筛选目标菌株

取土壤样品25g，加入225mL生理盐水中并混匀，进行10倍梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-4、10^-6、10^-8；再将不同梯度的稀释液分别涂布到NB固体平板中，于37℃下培养24h。每个稀释梯度设三个重复。12h后挑取单菌落采用平板划线法划线三次后进行镜检确定单菌落。

将所有分离的菌株分别在NB培养基上培养。在37℃下培养12小时后，使用高速离心机获得每种菌株的菌体，将每株菌体0.1g分别添加到10mL的铜离子溶液(50mg/L，pH 7)中，37℃(130rpm)振动30分钟后，将反应混合物离心，取上清液测定残留铜离子的浓度，筛选出具有最高铜离子去除效率的菌株作为优势菌进行下一步研究。

1.2.3菌株的分类鉴定及生长曲线测定

将筛选得到的优势菌株送至生物工程有限公司进行16sRNA测序，得到测序结果后进行系统发育进化树的构建。

在牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃恒温摇床中培养该菌株，于1.5、3、4h及之后的每隔两小时取样，采用紫外分光光度计测定OD₆₀₀，做出菌株的生长曲线。

1.2.4 C6菌体吸附Cu²⁺前后的表征

C6菌株在37℃的NB培养基中培养14小时。培养后，使用高速离心机(C165048；美国新泽西州)收集菌体。将收集的C6菌体添加到Cu²⁺溶液(50mg/L)中制备反应混合物，混合液在37℃(130rpm)下振动60分钟后，高速离心收集C6菌体进行真空冷冻干燥，以进行傅立叶红外光谱分析(FTIR)和X光射线电子检测(XPS)。

使用傅里叶变换红外光谱(FTIR；Nicolet 6700；Thermo Fisher，USA)表征了C6菌体吸附Cu²⁺前后的官能团变化。X射线光电子能谱(XPS；Shimadzu Kratos，UN)用于分析C6菌体的元素组成和其吸附Cu²⁺前后的元素变化。使用紫外分光光度计(UV 2600，Shimadzu，东京，日本)确定C6的生长曲线。使用AG ZEEnit 700P原子吸收光谱仪(AAS；Analytik，耶拿，德国)确定反应混合物中的总Cu²⁺和残留Cu²⁺的含量。用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH溶液调节反应混合物的pH。

1.2.5不同初始铜离子浓度、pH值、作用时间、菌量、其他干扰金属离子对去除率的影响

探究不同初始铜离子浓度(3.125-200mg/L)对C6(0.1g/L)去除效率的影响，原始pH值为5，在30℃(130rpm)下作用10min。

利用HCL与NaOH溶液将铜离子溶液(50mg/L)的pH调为2、4、6、7、10、12，探究pH值对优势菌株(0.1g/L)去除铜离子的影响。

pH值为7，50mL铜离子溶液，浓度为50mg/L，在30℃，130rpm条件下作用，在1min、5min、10min、30min、60min、120min、240min时分别取样测定溶液中铜离子剩余含量，探究作用时间对去除作用的影响。

在pH为7的条件下，C6生物量为0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5g/L，初始铜离子浓度为50mg/L，反应溶液在30℃下作用10min，研究C6生物量对去除效果的影响。

在铜离子溶液中加入其他不同金属离子(Mn、Zn、Ni、Pb)，使铜与另一金属离子的终浓度均为50mg/L，探究其他干扰金属离子对优势菌(0.1g/L)去除铜离子作用的影响，pH值为7，在30℃下作用10min。

采用公式(1)计算优势菌C6对Cu²⁺的吸附能力，采用公式(2)计算优势菌C6对Cu²⁺的去除效率。

q＝V(C₀-C_t)/m (1)

式中：q表示在时间t时优势菌对Cu²⁺的吸附量(mg/g)；C₀表示初始Cu²⁺浓度(mg/L)；Ce为平衡时Cu²⁺浓度(mg/L)；V代表实验体系的体积(L)；m表示吸附剂的生物量(g)。

1.2.6吸附动力学，吸附热力学，吸附等温线

在不同温度下(20、30、40℃)评价优势菌(0.1g/L)对Cu²⁺的吸附率，将50mg/L的Cu^{2 +}溶液调至pH 7，130rpm，于5、10、20、30、40min时采集样品进行AAS检测。

原始PH值为5，不同浓度的Cu²⁺溶液(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200mg/L)与优势菌(0.1g/L)作用，在30℃(130rpm)下作用10min，采集样品进行AAS检测。

1.2.7植物应用

燕麦(白燕11)用于植物实验。设置了四组不同的实验组以表征C6菌体在不同水平的Cu²⁺胁迫下对燕麦幼苗生长的影响，A组：不同初始Cu²⁺浓度(3.125-200mg/L)；B组：将0.5g/L的C6生物质加入A组；C，仅0.5g/L的C6菌体；D组：水。

将30粒燕麦种子添加到培养皿中，然后添加15mL一系列浓度的Cu²⁺(3.125-200mg/L)。之后将0.075g的C6菌体添加至上述B组和C组，并将15mL的水和C6菌体添加至对照组。最后，将培养皿置于植物培养箱中进行培养。每24小时向其相应的处理中添加10mL相应的Cu²⁺溶液，C6菌体和水。培养1周后，评估燕麦的发芽率和燕麦幼苗的生长情况。根据燕麦培养水体中残留的铜离子浓度和燕麦幼苗不同部位的铜含量，分析C6降低铜对植物生长的胁迫作用。

2实验结果

2.1筛选目标菌株

划线后共得到23株菌，将得到的所有菌株进行Cu²⁺去除试验筛选出对Cu²⁺具有较大去除作用的菌株C6。其菌落表面粗糙、卷曲、边缘有毛状突起，菌落根状，发丝团样、缠绕交织的根状菌落，为革兰氏阳性菌，丝状细菌的比表面积大(图1A)。

2.2菌株的分类鉴定及生长曲线测定

以去除率为标准筛选得到一株具有较高铜离子去除率的菌株，将16sRNA测序结果提交NCBI得到菌株序列号(ID：CP009651.1)，制作系统进化树(图1B)，结合其菌落形态与在NCBI的序列比对确定为假蕈状芽孢杆菌。

为了进一步了解该菌的最适生长环境及其生长周期，采用紫外分光光度计测定菌株的OD₆₀₀值，得到该菌株的生长曲线(图1C)。该菌株在第4小时进入对数生长期，第14小时趋于稳定，在第14小时可以取得较多菌体量。

2.3 C6吸附铜离子前后的表征

FTIR用于鉴定添加金属后分子中某些官能团的变化。图1显示了C6菌体的FTIR光谱。峰在3417cm^-1处出现的大条带可归因于醇中-OH的拉伸振动。1737cm^-1和1652cm^-1处的峰可能是由-C＝O的拉伸振动引起的。1543cm^-1处的谱带可能是由于酰胺II中的N–H弯曲。1058cm^-1处的强峰可以归因于-C-O-C或-C-O-H拉伸振动，这被认为是多糖的典型特征。

吸附Cu²⁺后，C6菌体的FTIR光谱显示出相似的吸附峰，但化学位移较小。另外还有一些峰，-N-H-形变振动导致在3085cm^-1处出现一个新峰，表明C6菌体的-N-H-基团可能在Cu²⁺吸附中起关键作用。Cu²⁺吸收后，在3417cm^-1处的峰明显红移至3297cm^-1，在1246cm^-1处的峰红移至1236cm^-1。这一发现表示C6菌体对Cu²⁺的生物吸附可能通过微环境以及与醇中的-OH和乙酰酯中的-C-O-官能团的紧密连接而受到干扰。最后，在1737、1652、1543和1058cm-¹处的峰没有变化。该发现表明C6菌体结构组成在Cu²⁺吸附后仍保持其完整性。

为了分析金属离子与含氧基团和氨基的结合，详细研究了C6菌体的C1s，O 1s和N1s峰，以表征C6菌体的化学状态和结构特征。如XPS分析(图3A)所示，三个结合能(Bindingenergy，BE)峰284、399和532eV分别代表C，N和O。另外，在931eV处的BE峰对应于Cu 2p(图3C)，表明发生了C6菌体对Cu的吸附。

此外，吸附剂的原子组成和质量分数通过XPS分析确定(表1)。根据表1所示的数据，可以推断出C6菌体吸附Cu的比例为0.87％。

表1吸附前后C6生物量中不同元素的含量

O 1s的高分辨率扫描(图3D)可以分为三个峰：534.1eV的C-O峰，532.4eV的O＝C-O峰和530.8eV的C＝O峰。N 1s峰(图3E)可分为两个峰：399.8eV处的-NH-基团和401.4eV处的-NH₂-基团。C 1s峰(图3F)可分为三个峰：287.9eV，286.1eV和284.6eV，相应的基团分别为C＝O、C-O和O-(C,H)。

根据C1s光谱所示(图3G)，吸收Cu²⁺之后，C＝O基团的结合能下降0.8eV，O＝C-O基团的结合能增加0.2eV，而C-O基团的结合能保持不变。根据N1s谱图(图3H)，C6菌体中-NH-基团和-N＝基团的结合能分别增加了0.6eV，表明C6菌体中Cu²⁺与-NH-和-N＝基团之间存在强烈的螯合作用，-N-H-和-N＝基团的N原子与Cu²⁺共享其孤对电子，导致结合能增加。如图3I所示C1s光谱在Cu²⁺加入后，C-(C，H)基团的结合能降低了0.3eV，C＝O和C-O基团的结合能提高了0.1eV。O 1s光谱和N1s光谱之间的差异表明，C6生物量中的含氧基团和含氮基团(如羧基和酰胺基)可能会与Cu²⁺发生复杂反应。

2.3优化去除条件对去除率的影响

2.3.1初始Cu²⁺浓度

去除效率与Cu²⁺初始浓度成反比，较低浓度的Cu²⁺去除率较大，在12.5mg/L时去除率达到最大(75.98％)，但q_e为32.53mg/g。随浓度逐渐增加，假蕈状芽孢杆菌的去除效率降低(图4A)。由于细胞膜上具有铜离子吸附靶点，超出吸附靶点的铜离子无法与细菌结合，导致无法去除。

2.3.2 pH对C6去除Cu²⁺的影响作用

中性pH值时，去除效率最高(83.59％)，q_e达到167.18mg/g，pH值为2时去除率最低(12.38％)，q_e为24.77mg/g(图4B)。过高或过低的pH值会破坏细菌活性与细胞膜表面的作用基团，导致去除率降低。

2.3.3不同时间对C6去除Cu²⁺的影响作用

随时间的增加去除率逐渐增加，在10min时达到最大值60.69％，之后开始趋于平缓(图4C)。说明作用在10min时达到平衡，C6可以短时、高效去除Cu²⁺。

2.3.4吸附菌量对C6去除Cu²⁺的影响作用

C6的菌体量是影响Cu²⁺去除率的重要因素，随作用菌量的0.01g/L增加到0.5g/L，去除率也从35.72％增加到82.63％，但q_e呈明显下降趋势，从178.62mg/g下降为8.26mg/g(图4D)。低剂量的菌体导致吸附链接不足，去除率较低，而高剂量的菌体制作成本高，且q_e较低，导致去除Cu²⁺性价比低。

2.3.5不同金属离子对C6去除Cu²⁺的影响作用

不同金属离子对C6去除Cu²⁺的影响不同(图4E)，其中Mn²⁺导致C6对Cu²⁺的去除率降低为40.81％，q_e为81.63mg/g，去除率与q_e值均低于其他干扰离子。而Pb²⁺则增加了去除率和q_e，使去除率达到了58.07％，q_e为116.14mg/g。

2.4吸附动力学曲线和活化能

研究了在20℃(293K)、30℃(303K)和40℃(313K)下C6菌体对Cu²⁺的吸附，以确定C6菌体对铜离子的生物吸附机理。从理论上讲，如果细菌对铜离子的吸附量q_t随时间t呈指数变化，则符合一级动力学。如果吸附速率由吸附剂表面上未占据的吸附空位数的平方确定，q_e和t之间存在线性关系，则符合二级动力学。

如图5所示，温度会影响C6对Cu²⁺的吸附动力学和平衡吸附容量。Cu²⁺的吸附在10分钟内达到平衡。随着温度升高，平衡时间减少，在30℃下，q_e为115.6mg/g。这些实验的数据可以通过一级(公式(3))和二级(公式(4))动力学方程很好地拟合。

ln(q_e-q_t)＝ln(q_e)-k₁*t (3)

其中q_e(mg/g)和q_t(mg/g)分别表示在平衡时间e和时间t(min)时C6吸附Cu²⁺的量；k₁(min^-1)和k₂(g/(mg·min))分别表示一级动力学和二级动力学的速率常数。

图5和表2显示二级动力学模型可以更好地解释实验数据。二级动力学模型的R²值高于一级动力学模型，表明二级动力学模型更适合于C6吸附Cu²⁺的过程。由二级动力学模型(q_e2)计算出的Cu²⁺吸附容量比一级动力学模型更接近实验数据(q_e ^exp)。

吸附活化能(E_a，J/mol)通过Arrhenius方程(公式(5))计算，

其中，k为一(二)级动力学速率常数，T(K)表示温度，R(8.314J/(mol·K))表示通用气体常数，A表示预指数因子。

吸附速率常数(K₁，K₂)随着温度的升高而增加(图6)。对于拟一阶模型，活化能(Ea)为12.437kJ/mol，对于拟二阶模型，活化能为30.943kJ/mol。

表2拟一阶和拟二阶曲线模型的吸附动力学参数

2.5吸附过程的热力学

吸附热力学的研究可以阐明吸附过程的程度，驱动力以及各种因素对吸附的影响。通过公式(6)计算Cu²⁺的两相分布系数(Kad)，通过热力学方程(7)和(8)计算吉布斯自由能(ΔG)，焓变(ΔH)和熵变(ΔS)。

lnK_ad＝ΔS/R-ΔH/(RT) (7)

ΔG＝ΔH-T*ΔS (8)

其中M(g)是Cu²⁺溶液的重量，W(g)是C6菌体的重量，R(8.314J(mol·K))表示通用气体常数。通过lnKad和温度的倒数(1/T)线性图从斜率和截距计算出ΔH和ΔS值(图7)。随着温度升高，ΔG值降低，而Kad值降低(表3)，ΔG的负值表明吸附反应在所研究的温度下自发进行。ΔH值为-2.935kJ/mol，负值表明C6对Cu²⁺的吸附反应容易发生。ΔS的值为2.75J/mol/K。正值ΔS表示在生物吸附过程中固溶界面的无序性和无规性在增加，这表明C6对Cu²⁺的吸附是熵驱动的过程。

表3三种温度下C6菌体吸附Cu²⁺的热力学参数

2.6吸附等温线

在等温条件下，吸附现象发生在溶液的固体表面上，并且在固体表面上吸附的Cu²⁺的量与溶液中残留的Cu²⁺之间达到平衡。常用的拟合模型是Langmuir方程和Freundlich方程，如方程式(9)和(10)所示。

q_e＝q_m*K_L*C_e/(1+K_L*C_e) (9)

其中q_m(mg/g)是最大吸附容量；n代表异质性因子；K_L和K_F分别是Langmuir方程和Freundlich方程的吸附等温线常数；q_e(mg/g)是在平衡状态下对Cu²⁺的吸附能力；C_e(mg/L)是平衡时上清液中的Cu²⁺浓度。

R_L表示吸附性能，是一个无量纲的常数因子，并用等式(11)计算。

R_L＝1/(1+K_L*C₀) (11)

其中C₀(mg/L)代表溶液的初始Cu²⁺浓度。当R_L＞1时，表示吸附过程不利。当R_L＝1时，表示吸附过程是线性的；当0＜R_L＜1时，表示吸附过程良好。当R_L＝0时，表示吸附过程是不可逆的。

Elovich方程用于描述固体表面上的化学吸附现象。金属离子在表面上的吸附可以从一种类型的吸附部位转移到另一种类型的吸附部位，如果平衡值(q_t)随时间(t)的变化满足对数关系，则C6菌体对Cu²⁺的吸附具有Elovich吸附动力学的特征，如公式(12)所示。

ln(q_e/C_e)＝-q_e/q_m+ln(K_E*q_m) (12)

其中K_E是Elovich吸附动力学速率常数，q_m(mg/g)是最大吸附容量，q_e(mg/g)是平衡状态下Cu²⁺的吸附容量；C_e(mg/L)表示平衡时上清液中的Cu²⁺浓度。

Temkin等温线表示假设吸附热的变化是线性的，这可以通过结合能的均匀分布来表征，Temkin等温线由公式(13)表示。

q_e＝AlnK_T+AlnC_e (13)

其中A是Temkin等温线速率常数，K_T是反应温度，C_e(mg/L)是平衡时上清液中Cu²⁺的浓度。

图8和表4表明，Langmuir吸附等温线模型拟合相关系数R²为0.992。因此，C6在Cu²⁺上的吸附过程为单层吸附，这与Langmuir吸附等温线模型一致。另外，C6吸附的Cu²⁺的q_m为354.88mg/g，R_L值为0-1，表明吸附容易进行。

表4 Langmuir，Freundlich，Elovich和Temkin方程的吸附参数。

2.7 C6减缓铜离子对燕麦生长的胁迫作用

2.7.1不同浓度的Cu²⁺对燕麦幼苗生长的影响

随着Cu²⁺浓度的增加，燕麦幼苗的发芽率和根系生长减少(图9A)。200mg/L Cu²⁺溶液培养的燕麦幼苗成活率低，根茎细，几乎没有根。这些结果表明，高浓度的Cu²⁺对燕麦的生长有害。添加C6细菌的实验组具有更高的发芽率，更高的存活率和更多的根须。与D组(水)相比，C组(具有C6菌体)的发芽率更高，根系更强，叶片更绿，鲜重更高。这些观察结果表明，C6并没有降低燕麦种子的发芽率，甚至具有促进小麦幼苗生长发育的作用。

2.7.2燕麦幼苗中铜离子的分布

对于没有C6的组，较高浓度的Cu²⁺导致燕麦幼苗中的铜含量较高。在200mg/L的铜离子浓度下，小麦幼苗根部位的铜离子含量为77.26mg/g(图9B)，茎中铜离子含量为40.43mg/g(图9C)，而叶片中的铜离子含量为17.8mg/g(图9D)。在C6存在的情况下，燕麦幼苗中的残留铜含量大大降低，燕麦幼苗根中的残留铜含量为11.84mg/g，茎中为2.54mg/g，叶子中为1.35mg/g。与仅用水培养的组相比，C6的存在可以促进燕麦苗良好的生长和粗壮的根叶。此结果表明假蕈状芽孢杆菌C6的存在可以抑制铜离子进入燕麦幼苗，甚至改善有铜污染和无铜污染的植物的生长。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.假蕈状芽孢杆菌，其特征在于：

所述假蕈状芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）C6于2020年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020404。

2.如权利要求1所述的假蕈状芽孢杆菌的获取方法，其特征在于：

所述方法包括以下步骤：

步骤一：采集土壤样品，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上；

步骤二：培养12 h后挑取单菌落进行划线纯化；

步骤三：纯化后的菌株进行铜离子去除实验，以铜离子去除率为指标得到一株优势菌；

步骤四：液体培养菌株后离心得到菌体，优化去除条件为铜离子初始浓度、pH、作用时间、菌体生物量、其他干扰金属离子。

3.根据权利要求2所述的假蕈状芽孢杆菌的获取方法，其特征在于：

步骤三中，铜离子去除实验的过程为：

在37℃下用牛肉膏蛋白胨培养基培养12小时后，使用高速离心机获得多份菌种，将每份菌种0.1g分别添加到10 mL、50 mg / L的铜离子溶液中，pH调整为 7，37℃、130 rpm条件下振动30分钟后，将反应混合物离心，取上清液测定残留铜离子的浓度，筛选出具有最高铜离子去除效率的菌株作为优势菌。

4.根据权利要求3所述的假蕈状芽孢杆菌的获取方法，其特征在于：

步骤四中，其他干扰金属离子包括Mn、Zn、Ni、Pb。

5.如权利要求1所述的假蕈状芽孢杆菌的应用，其特征在于：

所述假蕈状芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）C6用于减轻铜离子对植物的胁迫作用。

6.根据权利要求5所述的假蕈状芽孢杆菌的应用，其特征在于：

菌体生物量为0.1 g/L的假蕈状芽孢杆菌菌剂，在pH 7条件下对50 mg/L的铜离子溶液混合作用10 min，得到最大去除率。

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