CN112624455A - 对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，将待处理水样置于紫外照射下，加入次氯酸盐，进行消毒处理，即完成。与现有技术相比，本发明采用的UV/氯消毒方法能够释放出反应活性物质(Cl·,Cl2·‑,ClO·和1O2)，进而通过氧化还原反应灭活超级细菌及其抗生素抗性基因(blaNDM‑1)，从而能够有效快速的灭活超级细菌和控制抗生素抗性基因水平基因转移的风险，具有很好的实际应用前景。
Description
技术领域
本发明属于水净化处理技术领域，涉及一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法。
背景技术
近年来，抗生素滥用与抗生素耐药菌(Antibiotic Resistance Bacteria,ARB)的问题越来越受到人们的关注。残留的抗生素对环境中的微生物施加选择性压力，使环境中的微生物通过基因进化和变异获得对抗生素的抗性。抗生素抗性基因(AntibioticResistance Genes,ARGs)也可以通过水平基因转移(Horizontal Gene Transfer,HGT)在不同物种的微生物之间进行转移，加速ARGs在环境中的进化。 2009年，携带blaNDM-1的多重抗生素耐药菌几乎对所有类型的抗生素都表现出耐药性。目前，携带blaNDM-1的致病性或条件致病菌(如不动杆菌和肠球菌)在水环境中持续存在，对人类健康构成重大挑战和风险。
紫外线可以杀死细菌和破坏ARGs，使其可用于城市污水或饮用水处理厂。但该处理工艺在去除ARGs方面仍存在着去除效率低、反应时间长等缺点。氯消毒因其消毒效果好、成本低，已广泛应用于城市污水和饮用水的消毒。然而，氯消毒仍然存在ARB和ARGs灭活不完全的问题。因此，需要一种能够协同控制耐药超级细菌及其抗生素抗性基因的高效去除方法。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，以实现有效快速的灭活阴性细菌，特别是超级细菌，控制抗生素抗性基因水平基因转移的风险。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，将待处理水样置于紫外照射下，加入次氯酸盐，进行消毒处理，即完成。
进一步的，所述革兰氏阴性超级细菌为携带抗生素抗性基因的革兰氏阴性细菌。
更进一步的，所述抗生素抗性基因为抗生素抗性基因blaNDM-1。优选的，抗生素抗性基因blaNDM-1定性分析的基因序列大小为660bp，PCR扩增反应的退火温度为61.1℃。更优选的，抗生素抗性基因blaNDM-1定量分析的基因序列大小为130bp， PCR扩增反应的退火温度为60℃。
更进一步的，所述的革兰氏阴性超级细菌为不动杆菌属，菌株代码为CS-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC PB 2020025，保藏时间为 2020年9月14日。
进一步的，在灭活处理前，待处理水样先调节pH至6-9。
进一步的，所述的次氯酸盐为次氯酸钠。
进一步的，次氯酸盐的加入量满足：待处理水样中的有效氯浓度为5-20mg/L。
进一步的，紫外照射条件采用紫外灯提供，且消毒处理前，紫外灯先预热20-30min。
进一步的，消毒处理过程中提供的紫外强度为100-300μW/cm2，消毒处理的时间为1-60min。
进一步的，消毒处理完成后，还加入2倍次氯酸盐摩尔量的硫代硫酸钠来淬灭反应。
与现有技术相比，本发明采用UV/氯联合的方式对水样进行处理，其能够释放出反应活性物质(Cl·,Cl2·-,ClO·和1O2)，进而通过氧化还原反应灭活超级细菌及其抗生素抗性基因(blaNDM-1)。本发明的方法能够有效快速的灭活超级细菌和控制抗生素抗性基因水平基因转移的风险。相较于传统的单独UV和氯消毒过程，更快速高效，且能够在较长的时间内发挥作用。此外，本发明还完善了传统单独UV 和氯消毒对于耐药微生物的研究，对水环境和人体微生物风险管控方面具有重要的作用。而且本发明的方法高效实用，操作简单，不仅能够有效灭活超级细菌，而且能够完全灭活超级细菌抗生素抗性基因(blaNDM-1)。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中UV，氯和UV/氯对超级细菌灭活情况。
图2为本发明实施例2中UV，氯和UV/氯对超级细菌抗生素抗性基因blaNDM-1的灭活情况。
图3为本发明实施例3中UV，氯和UV/氯对超级细菌抗生素抗性基因blaNDM-1的灭活情况。
图4为本发明实施例4中未处理的超级细菌形态(a)、UV处理后(b)、氯处理后(c)和UV/氯处理后(d)超级细菌细胞结构形态。
图5为本发明实施例5中氯投加量对抗生素抗性基因的去除的影响情况。
图6为本发明实施例6中pH和水质对抗生素抗性基因的去除的影响情况及 UV/氯体系的自由基鉴定。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施方式或实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。
本发明提供了一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，将待处理水样置于紫外照射下，加入次氯酸盐，进行灭活处理，即完成。
在一种具体的实施方式中，所述革兰氏阴性超级细菌为携带抗生素抗性基因的革兰氏阴性细菌。
更具体的实施方式中，所述抗生素抗性基因为抗生素抗性基因blaNDM-1。优选的，抗生素抗性基因blaNDM-1定性分析的基因序列大小为660bp，PCR扩增反应的退火温度为61.1℃。更优选的，抗生素抗性基因blaNDM-1定量分析的基因序列大小为130bp，PCR扩增反应的退火温度为60℃。
更具体的实施方式中，所述的革兰氏阴性超级细菌为不动杆菌属，菌株代码为CS-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC PB 2020025，保藏时间为2020年9月14日。
在一种具体的实施方式中，在灭活处理前，待处理水样先调节pH至6-9。
在一种具体的实施方式中，所述的次氯酸盐为次氯酸钠。
在一种具体的实施方式中，次氯酸盐的加入量满足：待处理水样中的有效氯浓度为5-20mg/L。
在一种具体的实施方式中，紫外照射条件采用紫外灯提供，且消毒处理前，紫外灯先预热20-30min。
在一种具体的实施方式中，消毒处理过程中提供的紫外强度为100-300 μW/cm2，消毒处理的时间为1-60min。
在一种具体的实施方式中，消毒处理完成后，还加入2倍次氯酸盐摩尔量的硫代硫酸钠来淬灭反应。
此外，本发明在灭活后，还包括对灭活水样的抗生素抗性基因的提取，PCR 扩增，凝胶电泳和荧光定量PCR的检测。
在本发明中，抗生素抗性基因的浓度需要及时进行检测，若DNA提取后不能及时进行检测实验，需要优选的放入-80℃冰箱内保存。
本发明还提供了上述方案所述方法在污水处理或水质净化中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
特别的，在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，即表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
本发明涉及的携带blaNDM-1基因的阴性细菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，菌株代码为CS-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC PB 2020025，保藏时间为2020年9月14日。同时，本发明涉及的携带blaNDM-1基因的阴性细菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)来源于医院污水中。筛选方法如下：医院污水稀释涂布到添加有碳青霉烯类抗生素的固体平板上，在37℃培养24h后，挑取固体平板菌落进行划线分离、扩大培养、提取DNA和blaNDM-1基因测序验证。最终筛选得到本发明涉及的携带blaNDM-1基因的阴性细菌为不动杆菌属 (Acinetobacter sp.)。
实施例1：
(1)超级细菌的培养和溶液配置
CS-2菌株在添加有32mg/L美罗培南的Luria-Bertani培养基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L)37℃下培养24h后。用磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾0.24g/L，磷酸氢二钠1.42g/L，氯化钠8.0g/L，氯化钾0.2g/L)清洗三次以除去营养物质。最后用磷酸盐缓冲液重悬，使得菌液最终浓度为106～107 CFU/mL。
(2)消毒过程
紫外灯打开预热20min～30min后，用紫外辐照计测量和调节紫外强度为200 μW/cm2。调节完毕后，用铝箔纸包住紫外光源。取重悬的菌液50mL加入到90mm 培养皿中，放置于磁力搅拌器中以100rpm～200rpm的转速进行不断搅拌。取标定好的适当体积的次氯酸钠溶液加入到菌液中，使得菌液中的有效氯浓度为20 mg/L，并同时取下铝箔纸，进行UV/氯去除超级细菌消毒。在设定好的取样时间取出1mL加入到含2倍摩尔比的硫代硫酸钠淬灭剂的1.5mL离心管中，充分摇匀进行稀释涂布。
(3)超级细菌计数实验具体流程如下：
梯度稀释上一步得到的样品，每个样品设置3个稀释梯度，每个梯度设置3 个平行。取100μL加入到配置好的固体LB培养基中，进行平板涂布，并倒置放入37℃恒温培养箱中24h进行计数。
同时，以单独采用UV光照以及加入次氯酸钠溶液作为对比(UV光照与所加入的次氯酸钠溶液与本实施例分别一样)，所得结果参见图1：UV，氯和UV/氯对超级细菌灭活情况。如图1所示，单独UV在反应1min时仍有4.26Log (CFU/mL)，而UV/氯能够在1min时完全灭活超级细菌。说明UV/氯能够快速有效的灭活水中的超级细菌。
实施例2
超级细菌的DNA提取和抗生素抗性基因检测具体流程如下：
取实验得到的样品，按照
DNA Mini Kit试剂盒说明书提取样品的DNA，并按照如下表体系进行定量检测。
表1定量PCR反应体系
| 试剂 | 体积 | 阴性对照 | 终浓度 |
| SYBRPremix Ex Taq II(2×) | 10μL | 10μL | 1× |
| 上游引物(10μM) | 0.4μL | 0.4μL | 0.2μM |
| 下游引物(10μM) | 0.4μL | 0.4μL | 0.2μM |
| 倍比稀释后的标准质粒 | 1μL | - | |
| ddH<sub>2</sub>O | 8.2μL | 9.2μL | |
| 模板DNA | 1μL | - | |
| 终体积 | 20μL | 20μL |
具体检测过程参考上述实施例1，同样以UV，氯和UV/氯(即UV与氯结合) 作为对比，结果参见图2，UV，氯和UV/氯对超级细菌抗生素抗性基因blaNDM-1的灭活情况(UV：200μW/cm2；氯：20mg/L；blaNDM-1长度：130bp)。如图2 所示，单独UV和单独氯去除blaNDM-1具有局限性，反应60min分别仅能够去除 1.12Log和3.26Log。而UV/氯能够增加blaNDM-1的去除效果，反应60min能够去除4.40Log。说明UV与氯结合能够有效的去除超级细菌的抗生素抗性基因。
实施例3
超级细菌的DNA提取和抗生素抗性基因检测具体流程如下：
取实验得到的样品，按照DNA Mini Kit试剂盒说明书提取样品的DNA，并按照如下表2体系进行定性检测。取PCR产物进行凝胶电泳检测：电压 80V，电流80mA，时间40min。
表2定性PCR反应体系
| 试剂 | 体积 | 阴性对照 | 终浓度 |
| 2×TaqPCR MasterMix | 12.5μL | 12.5μL | 1× |
| 上游引物(20μM) | 1μL | 1μL | 0.8μM |
| 下游引物(20μM) | 1μL | 1μL | 0.8μM |
| ddH<sub>2</sub>O | 7.5μL | 7.5μL | |
| 模板DNA | 3μL | - | |
| 终体积 | 25μL | 25μL | - |
PCR循环条件：①预变性：95℃，15min；②扩增(35个循环)：95℃，60s；退火温度61.1℃，60s；72℃，30s③延伸：72℃，10min。
具体检测过程参考上述实施例1，同样以UV，氯和UV/氯(即UV与氯结合) 作为对比，结果参见图3：UV，氯和UV/氯对超级细菌抗生素抗性基因blaNDM-1的灭活情况(UV：200μW/cm2；氯：20mg/L；blaNDM-1长度：660bp)。如图3 所示，单独UV在反应60min时仍能扩增出blaNDM-1，不能完全断裂blaNDM-1。单独氯去除效果较好于单独UV，但是在反应30min时仍能扩增出blaNDM-1，不能快速有效的控制抗生素抗性基因的水平基因转移。本发明采用UV/氯能够在10min 内完全断裂blaNDM-1，说明UV/氯能够快速有效的断裂抗生素抗性基因，控制了超级细菌抗生素抗性基因水平转移的风险。
实施例4
(1)实验条件
紫外处理过程：紫外灯打开预热20min～30min后，用紫外辐照计测量和调节紫外强度为200μW/cm2。调节完毕后，用铝箔纸包住紫外光源。取重悬的菌液 50mL加入到90mm培养皿中，放置于磁力搅拌器中以100rpm～200rpm的转速进行不断搅拌。取下铝箔纸，在设定好的取样时间加入硫代硫酸钠淬灭剂进行淬灭反应后，转移至50mL离心管中。
氯消毒处理过程：取重悬的菌液50mL加入到90mm培养皿中，放置于磁力搅拌器中以100rpm～200rpm的转速进行不断搅拌。取标定好的适当体积的次氯酸钠溶液加入到菌液中，使得菌液中的有效氯浓度为20mg/L。在设定好的取样时间加入硫代硫酸钠淬灭剂进行淬灭反应后，转移至50mL离心管中。
紫外/氯处理过程：紫外灯打开预热20min～30min后，用紫外辐照计测量和调节紫外强度为200μW/cm2。调节完毕后，用铝箔纸包住紫外光源。取重悬的菌液50mL加入到90mm培养皿中，放置于磁力搅拌器中以100rpm～200rpm的转速进行不断搅拌。取标定好的适当体积的次氯酸钠溶液加入到菌液中，使得菌液中的有效氯浓度为20mg/L。在设定好的取样时间加入硫代硫酸钠淬灭剂进行淬灭反应后，转移至50mL离心管中。
扫描电镜样品前处理：取紫外、氯和紫外/氯处理后50mL样品，在10000rpm 转速下离心15min。加入2.5％的戊二醛溶液固定8h后，用磷酸盐缓冲液清洗三次。用30％、50％、70％、90和100％的乙醇进行梯度脱水，每次脱水时间为15min。脱水完毕后，高速离心后倾去乙醇，并放置-80℃冰箱中8h。最后，放置冷冻干燥仪中干燥24h后，进行扫描电镜观察。
结果参见图4，其中，(a)为未处理的超级细菌形态、(b)为UV处理后的超级细菌细胞结构形态、(c)为氯处理后的超级细菌细胞结构形态、(d)为UV/ 氯处理后的超级细菌细胞结构形态。如图4所示，超级细菌经单独UV处理后，其形态变化不大，说明不能有效的破坏超级细菌细胞膜。单独氯相较于单独UV具有较好的效果，但是仍有大部分超级细菌形态完好。本发明采用的UV/氯处理后，明显观察到超级细菌形态不完整、模糊，说明UV/氯能够有效的破坏超级细菌细胞膜和细胞形态，具有完全破坏超级细菌的优点。
实施例5
氯投加量分别为0mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L和40mg/L，在上述氯投加量和UV共同作用10min后取样进行DNA的提取和抗生素抗性基因的定量检测。
结果参见图5：氯投加量对抗生素抗性基因的去除的影响。如图5所示，单独 UV的去除效果最差，仅为0.90Log。在氯投加量在5mg/L～20mg/L，blaNDM-1的去除效果比单独UV较高，去除效率在2.15Log～4.22Log。说明本发明的UV/氯消毒方法能够在较宽的氯投加浓度下对抗生素抗性基因具有较高的协同去除效果。
实施例6
(1)pH的影响实验具体流程
菌液pH预先调节至6，7，8和9，UV/氯作用10min后取样进行DNA的提取和抗生素抗性基因的定量检测。
结果参见图6a：pH和水质对抗生素抗性基因的去除的影响情况及UV/氯体系的自由基鉴定。如图6a所示，在pH＝6～9时，blaNDM-1的去除效果为3.77Log～4.95 Log，在pH＝8时，blaNDM-1的去除效果最高为4.95Log。因此，本发明的UV/氯消毒方式能够在较宽的pH条件下对抗生素抗性基因具有较高的协同去除效果。
(2)水质的影响实验具体流程如下：
在紫外和投加次氯酸钠之前，首先分别加入饮用水源水和不同浓度的Br-和HCO3 -。取标定好的适当体积的次氯酸钠溶液加入到菌液中，并同时取下铝箔纸，进行UV/氯去除超级细菌实验。在设定好的取样时间取出1mL加入到含有2倍摩尔比的硫代硫酸钠淬灭剂的1.5mL离心管中，进行DNA提取和抗性基因定量检测，检测方法和实施例2一致。
结果参见图6b：pH和水质对抗生素抗性基因的去除的影响情况及UV/氯体系的自由基鉴定。如图6b所示，本发明的UV/氯消毒方法在饮用水(DW)、Br-、 HCO3 -和医院污水(HWW)水质条件中均对blaNDM-1有较好的去除效果，Kobs在 6.29×10-3s-1～11.6×10-3s-1。说明UV/氯消毒方法能够在饮用水和医院污水的消毒处理进行应用。
(3)自由基检测定性检测具体流程如下：
本方法采用电子顺磁光谱进行自由基的检测，具体实施方法如下：在紫外和氯反应体系中预先加入自由基捕获剂5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-Oxide(DMPO)和 TEMP分别用于捕获氯自由基(Cl·、Cl2·-和ClO·)和单线态氧(1O2)。取样至毛细管中并进行上机检测。
结果参见图6c和图6d：pH和水质对抗生素抗性基因的去除的影响情况及UV/ 氯体系的自由基鉴定。如图6c所示，氯自由基(Reactive chlorine species,RCS)能够与DMPO结合形成具有强度特征为1:2:1:2:1:2:1的峰图，说明UV/氯消毒方法能够产生氧化性较强的RCS自由基。如图6d所示，单线态氧(1O2)具有强度特征为1:1:1的峰图，说明UV/氯消毒方法能够产生强度较高的单线态氧(1O2)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，将待处理水样置于紫外照射下，加入次氯酸盐，进行消毒处理，即完成。
2.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，所述革兰氏阴性超级细菌为携带抗生素抗性基因的革兰氏阴性细菌。
3.根据权利要求2所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因为抗生素抗性基因blaNDM-1。
4.根据权利要求2或3所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，所述的革兰氏阴性超级细菌为不动杆菌属，菌株代码为CS-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC PB 2020025，保藏时间为2020年9月14日。
5.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，在灭活处理前，待处理水样先调节pH至6-9。
6.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，所述的次氯酸盐为次氯酸钠。
7.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，次氯酸盐的加入量满足：待处理水样中的有效氯浓度为5-20mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，紫外照射条件采用紫外灯提供，且消毒处理前，紫外灯先预热20-30min。
9.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，消毒处理过程中提供的紫外强度为100-300μW/cm2，消毒处理的时间为1-60min。
10.根据权利要求1所述的一种对水中具有抗生素抗性的革兰氏阴性超级细菌的消毒方法，其特征在于，消毒处理完成后，还加入2倍次氯酸盐摩尔量的硫代硫酸钠来淬灭反应。
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