CN112616484A - 一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法，所述纳米泡浓度为1～4×10⁷个/mL；所述湿地植物包括黄菖蒲和皇冠草。对于促进黄菖蒲生长，所述纳米泡浓度不大于3.45×10⁷个/mL；对于促进皇冠草生长，所述纳米泡浓度不大于1.23×10⁷个/mL。产生纳米气泡的方法包括加压法和气旋剪切法。在该阈值以下，纳米气泡浓度的增加增强植物有氧呼吸和活性氧世代，使植物生长得更好；在该阈值以上，高浓度的纳米气泡会引起高氧胁迫，特别是在沉水植物中，导致抗氧化系统的崩溃和植物生理活性的抑制。

Description

一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法

技术领域

本发明涉及水生植物生长技术领域，尤其是一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法。

背景技术

作为水生生态系统的重要组成部分，水生植被提供多种重要的生态服务，包括改善水透明度、稳定沉积物、为水生动物提供食物和栖息地。然而，人为活动引起的过量营养物质的排放，导致自然水体富营养化。这种富营养化会导致赤潮及有害藻华，并引发从清晰的大型植物主导状态向浑浊的藻类主导状态的转变，以及导致城市水体黑臭问题。

全球定量评估表明，全球范围内水生植被的损失正在加速，从面积或覆盖面积的13.5％/年(1900-1980年)到21.8％/年(1980-2000年)和33.6％/年(2000年后)。水生植被的丧失导致水生生物栖息地的退化，并可能导致生态系统服务功能的减少，这也对水质、经济发展(如渔业)和人类健康构成严重威胁。

去除(赤潮/有害藻华)HABs和控制外部和内部营养负荷可以重新创造自然水域的清水状态，这将为水生植被的恢复提供一个机会。纳米气泡技术代表了一种新的、可持续的方法，并且在富营养化的现场控制方面的研究和部署日益增加。

纳米气泡的定义是直径小于1000nm，与普通气泡相比具有寿命长、浮力小等特殊特性的气泡，可以显著增加氧气/空气向周围水体的传递速率。纳米气泡的自然崩溃产生活性氧(ROS)，包括羟基自由基(^·OH)、超氧化物自由基(^·O₂ ^-) 和单线态氧(¹O₂)。

纳米气泡的后一特性已被直接用于去除耗氧降解污染物，如有机污染物 (BOD)和污水中的氨氮。此前的研究也表明，纳米气泡可以改善对有害藻类细胞的分解和微囊藻毒素的降解，亚洲、美国和欧洲的公司越来越多地参与使用纳米气泡技术缓解HAB的项目。

除了大量纳米气泡的使用之外，2018年还开发了一种涉及界面纳米气泡的新改进技术，使用含氧的天然矿物将氧纳米气泡输送到沉积物表面。该方法成功地逆转了沉积物缺氧，减少了沉积物中氮和磷的通量达四个多月之久。

然而，体积纳米泡和界面纳米泡处理主要集中在水修复的第一步，即污染物去除和缺氧修复。随着水质的改善，纳米气泡对水生植被生长和稳定的后期过程的潜在影响尚不清楚。

与陆生植物不同，水生植物，特别是在完全淹没水中时，更有可能面临缺氧的问题。细胞呼吸所需氧气供应的减少可能会限制能量生产，并对植物生长产生负面影响。纳米气泡具有优越的氧气/空气传递效率，有望帮助水生植物克服这种氧气短缺；事实上，它们已被用于改善植物种子萌发、生物量生长(如生菜和菠菜)和作物产量(如番茄)。

此外，有报道称，水中的纳米气泡可以刺激植物内部内源性ROS生成。植物需要适当的ROS水平以激活植物的增殖途径，因此可以认为它们可以促进植物生长。

然而，纳米气泡技术应用于水恢复时，其适宜的操作时间和纳米气泡浓度等参数并没有得到准确的确定。这一点很重要，因为过量的氧和ROS水平可能会导致氧化损伤，从而压倒植物的氧化应激反应，并对其代谢产生负面影响。事实上，间歇的微/纳米气泡通气已被证明会对根尖细胞造成氧化损伤，从而抑制菠菜植株的生长。

Liu et al.(2016a)也报道了水中高水平纳米气泡产生的外源羟基自由基降低了胡萝卜和菠菜的下胚轴伸长和叶绿素形成。此外，在申请人之前的研究中，申请人发现，即使溶解氧(DO)水平相似，在微/纳米气泡曝气的水中，沉水植物皇冠草获得的生物量也比大气泡曝气的植物少25％。

大多数浅水湖泊和湿地的植被主要由挺水水生植物组成，它们可能对纳米气泡有更高的耐受性，因为大多数植物生物量都在水面以上，但这一点从未被详细研究过。因此，定量研究纳米气泡对出水和沉水水生植物生长的影响，对于纳米气泡技术在水体修复中的应用具有重要的指导意义。申请人特别感兴趣的是了解植物在激素产生和基因表达方面对纳米气泡处理的生理反应。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法。本发明专利公开了纳米气泡可以增强植物的氧气输送，适当的纳米气泡水平可以促进植物的生长，过量的纳米气泡会抑制植物的生长和光合作用。

本发明的技术方案如下：

一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法，所述纳米泡浓度为1～4×10⁷个/mL。

进一步的，所述湿地植物包括黄菖蒲和皇冠草。

优选的，对于促进黄菖蒲生长，所述纳米泡浓度不大于3.45×10⁷个/mL。

优选的，对于促进皇冠草生长，所述纳米泡浓度不大于1.23×10⁷个/mL。

更优选的，对于促进黄菖蒲生长，水中的溶解氧浓度为7.52±0.65^ab mg/l。

更优选的，对于促进皇冠草生长，水中的溶解氧浓度为7.08±0.27^a mg/l。

优选的，产生纳米气泡的方法包括加压法和气旋剪切法。

本发明有益的技术效果在于：

本申请提供的对黄菖蒲和皇冠草从促进生长到抑制生长的纳米泡浓度阈值分别为3.45×10⁷和1.23×10⁷个/mL。在该阈值以下，纳米气泡浓度的增加增强植物有氧呼吸和活性氧世代，使植物生长得更好。在这个阈值以上，高浓度的纳米气泡会引起高氧胁迫，特别是在沉水植物中，导致抗氧化系统的崩溃和植物生理活性的抑制。与氧化还原电位和氧化应激反应有关的基因表达以及相关激素的产生也发生了改变。

附图说明

图1为实施例中，纳米气泡在L-NB(a)、M-NB(b)、H-NB(c)和S-NB(d) 组中的大小分布；L-NB、M-NB、H-MB、S-NB分别代表低、中、高、超高纳米气泡浓度组。

图2为实验结束时，黄菖蒲(a)和皇冠草(c)的生物量生长率、黄菖蒲的平均根长(b)和皇冠草(c)的叶绿素含量；MAB、L-NB、M-NB、H-MB、 S-NB分别代表大气泡曝气、低、中、高和超高纳米气泡浓度组；不同的字母与同一植物的其它类群相比有显著性差异(p<0.05)。

图3(a)为黄菖蒲和根中超氧自由基浓度、(b)为总抗氧化能力(T-AOC)、(c) 为实验结束时皇冠草叶片超氧化物自由基浓度、(d)为T-AOC；MAB、L-NB、 M-NB、H-MB、S-NB分别代表大气泡曝气、低、中、高、超高纳米气泡浓度组。不同字母表示差异显著(p<0.05)与同株其他组比较。

图4(a)为H-NB组(DO＝7.52±0.65mg/L)与MAB组(DO＝7.49±0.56mg/L) 的黄菖蒲基因表达变化、(b)为差异表达基因显著富集基因本体论(GO)分类 (p<0.05)。

图5(a)为H-NB组(DO＝7.52±0.65mg/L)与MAB组(DO＝7.49±0.56mg/L) 皇冠草基因表达变化、(b)为差异表达基因显著富集基因本体论(GO)分类 (p<0.05)。

图6为实施例中主成分分析(PCA)对不同类群黄菖蒲(a)和皇冠草(b)形态学和生理反应结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以黄菖蒲和皇冠草为例，分别选取了自然挺水植被和沉水植被。从一个轻度富营养化水库收集沉积物和水作为两种植物的生长培养基，然后将其置于不同浓度的纳米气泡(10⁶-10⁸个/mL)中。在植物培养中，DO浓度保持在一个相似的水平，以研究单一因素(即纳米气泡浓度)的影响。

实施例：具体的操作方法如下

步骤1：水生植物的制备和沉积物和水的就地收集

水和泥沙/土壤采集自一个表面积2.7km²、平均水深3m的轻富营养化水库。在水库入口采用纳米气泡曝气，并与湿地区结合。水库每年夏季都有藻华发生，藻密度高达10⁷个/mL。收集水体中总氮和总磷的浓度分别为1.05-2.27和 0.06-0.16mg/L。黄菖蒲和皇冠草都是常见的本土植物；两种植物的幼苗均购自当地一家园艺公司(融悦有限公司，中国上海)。黄菖蒲的初始高度约为10厘米，皇冠草的初始重量约为20克。

步骤2：实验装置与操作

黄菖蒲和皇冠草在光照周期为10h/d的室温(25±5℃)条件下培养。鸢尾生长在尺寸为55×18×30cm的聚甲基丙烯酸甲酯缸中，每组16株。将出苗插入浮在水中的聚苯乙烯泡沫板孔中培养21天。皇冠草生长在内径为35cm、高度为40cm的聚甲基丙烯酸甲酯圆筒中，每个圆筒中三株。沉水育苗在沉积物中培养40天。在每个槽或柱中使用来自水库的地表水(20L)。在实验前，所有的植物都被稳定了七天。

设置水体条件模拟纳米气泡富营养化后期修复过程。对于挺水植物和沉水植物，申请人准备了六个平行的小组来研究不同纳米气泡浓度对植物生长的影响。每组重复三次。根据纳米气泡浓度的不同，将纳米气泡曝气处理分为低、中、高、超高组。对照组不通气。在一组中，使用正常气泵进行大气泡充气以评价在类似DO水平但不使用纳米气泡的情况下的植物生长效果(表1)。

表1各组试验条件及曝气方法

备注：MAB、L-NB、M-NB、H-MB、S-NB分别代表大气通气组、低、中、高、超高纳米气泡通气组。

步骤3：纳米气泡分布与水质测量

每次纳米气泡曝气处理均在纯水中模拟栽培前的实验条件。使用NanoSightNS300仪器，通过动态光散射测量各组的纳米气泡大小分布(<1000nm)。每项测量重复三次。在实验过程中，每两天使用YSI 556多参数系统测定各组水中的温度、pH、DO水平。为了避免交叉污染，探针在两次测量之间用超纯水仔细清洗。

测试例：评估纳米气泡对植物生长的影响

通过监测植物形态，如生物量、根/叶长度和叶绿素含量，评估纳米气泡对植物生长的影响。申请人还评估了植物的生理特征，包括氧化剂/抗氧化剂种类的产生，基因表达模式和激素的产生，以揭示植物对纳米气泡处理的反应机制。总的来说，本发明旨在获得支持水生植被生长的纳米气泡阈值水平，并提供基于证据的结果，以支持纳米气泡技术在自然水体修复中的应用。

一、植物形态和生理反应的检测方法

在实验结束时，收获所有植物，测量鲜重、根/叶长度和叶绿素含量，进行组间比较。

1、氧化剂和抗氧化剂种类

每一种植物的叶片和根随机取5g组织样本；样品在磷酸盐缓冲液中以1:9 (w/v)的混合比例在冰上机械均匀化。将悬浮液4℃，12000rpm条件下离心5 min。在超氧自由基存在下，羟胺被氧化成亚硝酸盐，可通过在1ml反应混合物中加入17mM的磺胺酸溶液和7mM的1-萘乙酸溶液各1ml来测定。将各组分混合，室温放置20分钟后，测量A₅₃₀，计算超氧化物自由基的浓度。

总抗氧化能力(T-AOC)采用T-AOC试剂盒(比色法，A015，南京建成生物工程研究所)测定。按照试剂盒说明书配制缓冲液、ABT溶液、过氧化物溶液、 Trolox溶液和样品，使用Synergy^TMHT多模式酶标仪在405nm波长下读取各管OD值。所有的测量都进行了三次。

2、核糖核酸测序分析

在培养后，对来自MAB和nanobubble类群(在相似的DO水平)的大型植物的转录组进行分析，以获得与大型植物对生长条件响应相关的基因的详细表达谱。将每种处理三次重复的相同数量的组织混合在一起用于RNA-Seq实验。过滤后的差异表达基因(DEGs)使用GOseq映射到GO数据库中，获得显著富集的GO项。

3、植物激素

为了解植物激素对植物生长发育的调节作用，需要准确有效地测量叶片和根中的单个植物激素。采用HPLC-ESI-MS/MS对3-吲哚乙酸(IAA)、水杨酸 (SA)、茉莉酸(JA)和茉莉酸异亮氨酸(JA-ILE)等内源植物激素进行定量分析。每一种植物随机从叶片和根中取5g植物组织样品，分离后的组织用液氮冷冻，然后用陶瓷珠高速搅拌将冻干后的组织样品磨成粉末，搅拌5s。

用乙腈-水(1:1,v/v)从土壤组织中提取代谢物，4℃，12000rpm的条件下离心10min。样本的一部分(2μL)加载到高效液相色谱系统，配有50*2.1毫米水域高速钢T3质列使用的流量2μL/min和二元溶剂体系包括水和0.1％(v/v)乙酸 (A)和乙腈0.1％(v/v)乙酸(B)作为移动阶段。电喷雾电离质谱的主要参数为：电压：-2800V；温度:350℃；气体:氮；雾化气体:40psi；辅助气体:10psi。所有的测量都进行了三次。

4、统计分析

植物生长差异显著性采用单因素方差分析，Tukey’s HSD检验，p<0.05。对于RNA测序分析，在差异基因表达分析之前，使用一尺度归一化因子用 edgeR程序包调整读取计数。用q值调整p值,将差异表达的阈值设定为“q值 <0.005&|log2(foldchange)|>1”。Origin2018b用于绘图。

二、水中纳米气泡的产生和DO水平

为了在不同的组中实现不同的纳米气泡浓度，申请人使用了不同的方法来产生纳米气泡，即加压法和剪切法，这是在实际项目中最常用的两种方法(表 1)。

纳米气泡的浓度(<1000nm)在L-NB组为6.88×10⁶个/mL(图1a)，在M-NB 组为1.23×10⁷个/mL(图1b)。H-NB组和S-NB组纳米气泡浓度较高，分别为 3.45×10⁷和2.70×10⁸个/mL(图1c和图1d)。

值得注意的是，控制组和大气泡组的纳米气泡始终小于10⁵个/mL(数据未显示)。尽管各组之间的纳米气泡浓度存在显著差异，但在黄菖蒲和皇冠草培养物中，各组的DO水平均处于一个相对较小的范围，分别为7.08-7.65和7.01-7.26 mg/L(表2)。

表2在两种水生植物的栽培过程中水中的平均DO水平

备注：上标字母表示与同株其他类群相比差异显著(p<0.05)。MAB、L-NB、M-NB、 H-MB、S-NB分别代表大气泡曝气、低、中、高、超高纳米气泡浓度组。

在两种植物中，对照组和L-NB组的DO水平相似，但在统计学上低于其他组。

在曝气过程中，气泡的大小分布影响水中DO含量，因为较小的气泡比大气泡具有更大的表面积比例，可以提供更好的氧传递率。然而，可能有争议的是，在目前的研究中，纳米级气泡曝气并没有在水中产生很高的DO水平。

之前的研究发现，纳米气泡在数天内是稳定的。原子力显微镜(AFM)检测了纳米气泡内的非均匀压力，并在分子动力学模拟中模拟为高气体密度状态。纳米气泡的气体扩散很可能很慢，而且会持续很长一段时间。因此，对经纳米气泡充气的水样的DO水平的瞬时测量可能不能完全反映纳米气泡对气体输送的任何增加的贡献。

三、植物形态对纳米气泡的反应

黄菖蒲对照组、MAB组、L-NB组、M-NB组、H-NB组和S-NB组的移植成活率分别为68.8％、81.3％、81.3％、93.8％和100％。所有纳米气泡处理组的生物量生长比均较高(1.39±0.15～1.54±0.08)，其次是大气泡处理组(1.32±0.14) 和对照组(1.28±0.09)(图2a)。

纳米气泡组的最终植物生物量生长率随着纳米气泡浓度的增加而增加，在纳米气泡浓度为3.45×10⁷个/mL的H-NB组中达到最高值1.54±0.08。在最高纳米气泡浓度(S-NB,2.70×10⁸个/mL)下，生物量生长比较低，为1.41±0.14。

与对照组相比，MAB组、L-NB组、M-NB组、H-NB组和S-NB组最终生物量增幅分别为3％、8％、14％、20％和9.5％。黄菖蒲根增长遵循了类似的趋势,平均根长12.04±2.24,13.78±2.51,14.29±2.71和14.31±2.09cm,对应 L-NB M-NB,H-NB和S-NB组(图2b)。

相比之下，大气泡组(10.59±2.26cm)和对照组(10.44±3.12cm)。不同类群黄菖蒲的叶长和叶绿素含量没有显著差异，这可能是由于挺生植物叶片脱离了水，因此不太容易受到水中纳米气泡的影响。与纳米气泡直接接触的根的生长可能被植物增加的好氧呼吸促进，这可能导致新根的形成。

在沉水物种皇冠草中，各大气泡和纳米气泡组的生物量生长比(约1.5)没有显著差异(图2c)，但总体上明显高于对照组(1.24±0.14)。这些类群的根和叶的长度都遵循相同的趋势。

虽然在所有充气组中生物量都有类似的增加，但纳米气泡充气组的叶绿素含量有所下降，且出现了一些发黄现象(图2d)，这与申请人之前的研究一致。确定了M-NB组中影响叶绿素含量所需的纳米气泡浓度阈值(1.51mg/g FW)。 H-NB组(3.45×10⁷个/mL)和S-NB组((2.70×10⁸个/mL)中过量的纳米气泡使叶绿素含量显著降低(分别为1.29和0.72mg/gFW)，这支持了高浓度纳米气泡可能对光合作用产生不利影响的观点。

沉水植物和挺水植物对纳米气泡的反应不同，挺水植物似乎有更高的耐受性，这可能是由于植物部位的空间位置和物种特有的抗氧化能力不同。尽管如此，可以得出结论，水生植物生长可受益于暴露于一定浓度的纳米气泡，但过量使用纳米气泡会损害植物的生长(生物量)和健康(叶绿素含量)。

四、纳米气泡对植物生理的影响

4.1活性氧(ROS)和总抗氧化能力(T-AOC)

除了形态上的变化，植物还可以改变它们的生理以适应不同的环境条件，包括温度、光照和生长介质。含有高水平DO和氧化物质的生长培养基可能会刺激植物组织内内源性ROS生成，从而促进植物生长。因此，在当前的调查中，黄菖蒲在大气泡和纳米气泡组(6.12-7.49和2.35-6.33μg/g FW分别在叶和根中)中的ROS的浓度(超氧化物自由基(^·O₂ ^-))明显高于对照组(4.87和1.79 μg/g FW分别在叶和根中)(图3)。

唯一的例外是S-NB组(3.55μg/g FW分别在叶和根中)。值得注意的是， H-NB组的ROS水平最高，而S-NB组在纳米气泡浓度较高时ROS水平下降。这与生物量结果一致(图2a)，其中H-NB组虹膜黄菖蒲生物量最高。

这可能是由于植物体内积聚的ROS水平增加，从而引起氧化应激。在极端氧化条件下，植物的氧化应激反应将受到刺激，导致总抗氧化能力(T-AOC)的增加，从而将ROS维持在一个适当的水平。

根中T-AOC随纳米气泡浓度的增加而持续增加，从MAB、L-NB和M-NB 组的26U/g FW左右增加到H-NB组的50.79U/g FW，而S-NB组达到最高水平(84.96U/g FW)(图3b)。叶片中T-AOC含量也呈类似趋势，从约170U/g FW 增加到230U/g FW。高氧化条件下ROS活性氧清除剂的增加可能解释了S-NB 植物中较H-NB组显著降低ROS浓度的原因(图3a)。

据推测，皇冠草与自然生长的黄菖蒲有不同的表现，因为整个植株生长在水下，因此与纳米气泡有直接接触。由于皇冠草根含量不足，仅测定叶片中 ROS和T-AOC含量。

与对照组(23.76μg/g FW)相比，大泡组叶片超氧化物根(^·O₂ ^-)含量增加 (27.28μg/g FW)，L-NB组(27.32μg/g FW)和M-NB组(32.42μg/g FW)随纳米气泡浓度增加而增加。而H-NB组和S-NB组则分别下降到28.73和22.95。(图3c) 叶片中T-AOC含量也有相同的变化趋势，但H-NB组最高(125.51U/g FW)， S-NB组为105.23U/g FW(图3d)。

因此，由于大气泡组和纳米气泡组中的DO水平相似，上述对植物氧化剂和抗氧化剂水平的影响可能是由于纳米气泡的存在。先前的一项研究报道，大豆暴露于增加的氧化应激48小时后，抗氧化酶活性持续增加，这与申请人目前的研究结果一致。氧对植物生长有促进作用，但当水中的纳米气泡浓度分别超过黄菖蒲和皇冠草的3.45×10⁷和1.23×10⁷个/mL时，就可能成为高氧胁迫。值得注意的是，其他植物的阈值可能因每种植物的物种特异性抗氧化能力而不同。

4.2转录反应

根据对植株形态的影响，选择大气泡和H-NB组的黄菖蒲以及大气泡和 S-NB组的皇冠草，鉴定对纳米气泡和微气泡处理具有相似DO水平响应的差异表达基因(DEGs)。

与大气泡植株相比，H-NB组的黄菖蒲中共鉴定出1321个上调的序列,1074 个下调的序列(图4a)。这些基因的分子功能由相关的GO项显示，其中一些在黄菖蒲植物中显著富集的基因与氧结合、转移和还原有关(图4b)。

植物利用血红蛋白有效地结合和转移氧气，然后用于呼吸。与“血红素结合”、“四吡啶结合”和“铁离子结合”相关基因的上调表明，纳米气泡处理的植物利用氧气的能力增强了。此外，“氧化还原酶活性，作用于配对供体，与分子氧的掺入或减少”这一术语也得到了丰富，表明植物接受了过量的分子氧，导致参与分子氧减少的基因被过多表达。

增强植物对氧的输送可诱导ROS的产生(图3a)，这与“氧化-还原过程”伞下的141个基因是生物过程类别中最占优势的基因一致；其中103个序列上调，38个序列下调(图4b)。此外，在生物过程类别中，大多数与“防御反应”和“应激反应”相关的基因也被上调，这意味着纳米气泡诱导了高氧胁迫(图 4b)。

与MAB组相比，S-NB组的皇冠草组中，下调的(4209)基因明显多于上调的(2140)基因(图5a)。皇冠草的潜水性质意味着它完全浸泡在大量的纳米气泡水中，这可能导致比黄菖蒲更大的氧应激和随后的抗氧化系统的破坏。

此外，大多数与光合作用相关的基因，如“类囊体”、“类囊体膜”、“光系统”和“光合膜”都被下调(图5b)。

在高纳米气泡浓度下，叶绿体结构被严重破坏，叶绿素含量显著下降(图2d 和图5b)，这也与高氧胁迫一致。有文献表明，光合作用的速率可以被高氧浓度所抑制。氧是二氧化碳固定的竞争性抑制剂，可导致光合效率和光合输出显著下降(高达60％)。

因此，根据植物生理活性的降低，具有“代谢过程”一词的基因被下调。在申请人之前的实验中，在高纳米气泡浓度下培养60天后，皇冠草的生长受到了显著抑制(25％)。综上所述，RNA测序分析表明，与大泡处理相比，纳米气泡处理在相似的DO水平上提高了黄菖蒲的结合、转移和减氧能力以及抗逆性。然而，皇冠草的抗氧化系统崩溃，光合作用和一般代谢过程均受到抑制。

4.3植物激素的一代

植物生长发育的各个方面都受到植物激素网络的控制，它使植物能够适应并在高度动态的自然环境中生存，包括水中氧含量发生变化的环境。在相同 DO水平下，纳米气泡处理组(M-NB、H-NB和S-NB)的3-吲哚乙酸(IAA)含量均显著高于纳米气泡处理组(M-NB、H-NB和S-NB)。

此外，IAA含量增加而提高纳米气泡浓度从31.25ng/g(MAB)到84.63ng/ g(S-NB组)对黄菖蒲，1.04ng/g(MAB)到1.55ng/g(S-NB组)对皇冠草(表3)。 IAA可促进根起始和诱发的增长已存在的根源和不定根的形成。

因此，高水平的IAA可能在很大程度上促进了植物根系结构的快速改变(图 2b)，从而促进了生物量的增加(图2a)。

此外，申请人观察到的叶绿素降解(光合破坏)也可能与皇冠草IAA水平的升高有关(图2d和图5b)。之前的一项研究证实了这一点，该研究表明IAA处理后的小麦胚芽鞘叶绿体膜系统不发达，叶绿素含量较低。

内源性活性氧生成在植物光合作用过程的主要副反应的结果,因此IAA可能减少ROS生成S-NB组通过改造光合仪,从而减少氧化损伤(图2d和图5)。

此外，水杨酸(SA)的水平，茉莉酸(JA)和茉莉酸异亮氨酸(JA-ILE),在植物对各种生物和非生物胁迫的响应中扮演了一个重要的角色，也在纳米气泡组中显著增加(表3)。

表3具有相似DO水平的不同组植物的激素变化

备注：IAA、SA、JA、JA-ILE分别代表3-吲哚乙酸、水杨酸、茉莉酸、茉莉酸异亮氨酸。不同字母表示差异显著(p<0.05)与同株其他组比较。

在这两种植物物种中，SA含量在S-NB组中达到最高水平，而JA和JA-ILE 在S-NB组中先随纳米气泡浓度的增加而增加，然后降低。这些升高的激素水平进一步证明，纳米气泡在植物中引起高氧胁迫，从而触发植物防御并促进生理适应。

目前所述的结果表明，暴露于纳米气泡可以改变植物的氧化还原稳态、基因表达和激素生成。之前的研究表明，ROS信号通路由一个复杂的网络组成，该网络与基因和激素通路之间存在频繁的串扰。因此，纳米气泡诱导的内源性 ROS可以与T-AOC、基因和植物激素协同调节植物的生长发育。

4.4整体机制和环境重要性

主要成分分析(PCA)是用来想象纳米气泡浓度对植物生长的影响(图6a和 b)的反应。生长介质条件(和纳米气泡浓度)，植物形态学参数(生物量增长比率和黄菖蒲根长度,生物量增长比率和叶绿素含量皇冠草)，和植物生理学参数 (ROS和T-AOC黄菖蒲叶和根，皇冠草叶)被纳入分析。

对于两种物质(图6a和图b)，纳米气泡浓度的因素明显驱使S-NB基团远离坐标中的其他基团。仔细观察皇冠草的数据(图6b)可以发现，H-NB基团也遵循纳米气泡浓度因子的方向，这使得它们与其他基团有所区别。

这与申请人的研究结果一致，能够显著影响黄菖蒲和皇冠草生长的纳米气泡浓度阈值可能分别为3.45×10⁷个/mL(H-NB组)和1.23×10⁷个/mL(M-NB组) 在阈值以下，增加纳米气泡浓度可以显著提高植物的生长(图2)。

随着纳米气泡浓度的增加(从对照到MAB组和H-NB组)，两种植物的其他类群都朝正方向聚集(图6)。生物量生长率、ROS(黄菖蒲或皇冠草)、根系长度和叶绿素含量是影响皇冠草向正确率的主要因素。

内源性ROS似乎是影响植物生长的主要因素(图6)，这与适当水平的ROS 可以改善植物性能是一致的。此外，纳米气泡浓度的增加促进了黄菖蒲和根中 T-AOC含量的增加(图6a)，而叶绿素含量则相反，随着纳米气泡浓度的增加而降低(图6b)。新生物种显然对纳米气泡有更高的耐受性。

在该阈值以下，由于纳米气泡的稳定性和较高的气体密度，水中的氧气输送得到增强，可促进植物有氧呼吸和植物内源ROS的生成，从而提高植物抗氧化能力，促进植物生长。然而，当纳米气泡浓度超过阈值时，氧的毒性就会占据主导地位，引发高氧胁迫，特别是在沉水植物中，可能导致抗氧化系统的崩溃和光合作用的抑制。

综合以上所述，本申请研究了挺水和沉水植物在纳米气泡诱导水体恢复过程后期的形态和生理反应。本申请表明，纳米气泡浓度阈值对黄菖蒲和皇冠草从促进生长转变为抑制生长分别为3.45×10⁷和1.23×10⁷个/mL。在这个阈值下，由于改善了植物的有氧呼吸和活性氧的生成，两种水生植物的生长都得到了促进。

然而，过度处理的纳米气泡可以诱导高氧胁迫，影响基因的表达和相关激素的产生。因此，使用较高浓度的纳米气泡可以有效改善水质，但应控制适当的纳米气泡浓度(约10⁷个/mL)，以促进水生植被的生长向整个富营养化管理和水体恢复。同时，对其他水生植被物种可能存在的不同阈值还需要进一步研究。

近年来，大体积纳米气泡和界面纳米气泡技术已被广泛应用于富营养化和黑臭水的修复。纳米气泡技术作为一种绿色高效的技术，在控制内部营养物质负荷、去除有害有害物质和改善水质方面具有许多优势。一般情况下，使用浓度较高的纳米气泡或纯氧纳米气泡可以使水质得到更大的改善。

然而，天然水恢复是一个系统的过程，其中水质改善后的水生植被恢复是一个重要的组成部分。申请人的结果表明，纳米气泡可以促进植物有氧呼吸和植物内源性ROS的产生，从而促进植物生长。M-NB组的能耗(31.25W/m³)是 MAB组(150W/m³)的1/5(表1)，但在促进植物生长方面表现出更好的效果。然而，极高的纳米气泡浓度会诱导高氧胁迫并抑制植物的生理活性，如氧化还原、光合作用和代谢过程。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种采用纳米气泡促进湿地植物生长的方法，其特征在于，所述纳米泡浓度为1～4×10⁷个/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述湿地植物包括黄菖蒲和皇冠草。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对于促进黄菖蒲生长，所述纳米泡浓度不大于3.45×10⁷个/mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对于促进皇冠草生长，所述纳米泡浓度不大于1.23×10⁷个/mL。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，对于促进黄菖蒲生长，水中的溶解氧浓度为7.52±0.65^abmg/l。

6.根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于，对于促进皇冠草生长，水中的溶解氧浓度为7.08±0.27^amg/l。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，产生纳米气泡的方法包括加压法和气旋剪切法。

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