CN112601536B - 多菌株种群控制系统和方法 - Google Patents

多菌株种群控制系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112601536B
CN112601536B CN201980053732.8A CN201980053732A CN112601536B CN 112601536 B CN112601536 B CN 112601536B CN 201980053732 A CN201980053732 A CN 201980053732A CN 112601536 B CN112601536 B CN 112601536B
Authority
CN
China
Prior art keywords
toxin
strain
bacterial
bacterial strain
strains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980053732.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112601536A (zh
Inventor
J·哈斯提
M·J·廖
M·O·丁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN112601536A publication Critical patent/CN112601536A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112601536B publication Critical patent/CN112601536B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Abstract

本文提供了一种多菌株种群控制系统、方法、试剂盒和组合物。还提供了用于在多菌株生态系统，以及使用同步裂解回路结合多种毒素/抗毒素系统在长时间内连续循环以瞬时排列多菌株生态系统或培养物中培养细菌细胞的方法、系统、试剂盒和组合物。

Description

多菌株种群控制系统和方法
优先权的主张
本申请要求于2018年6月8日提交的美国临时专利申请序列号62/682,755的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文。
联邦资助研究或开发
本发明是在国立卫生研究院和国立普通医学科学研究所授予的RO1-GM069811下由政府资助完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明涉及用于培养细菌细胞的方法、系统、试剂盒和组合物，更具体地，涉及用于多菌株生态系统(包括群体调节的多裂解系统)的方法、系统、试剂盒和组合物。
背景技术
微生物生态学家越来越倾向于将小型合成生态系统1–5作为还原论工具来探究天然微生物组的复杂性6,7。同时，合成生物学家已从单细胞基因回路8–11转向用细胞间信号转导来控制整个种群12–16。
发明内容
在不希望受到理论约束的情况下，本发明人公开了一种三裂解或多裂解系统，其可用于工程改造多菌株生态系统和/或实现一种或多种有效载荷(例如治疗剂)的循环递送。例如，每种菌株可递送一种或多种治疗蛋白的有效载荷，同时排除疾病部位中先前给予的菌株或先前存在的菌株。例如，可能存在构成该系统的至少三种菌株，其中每种菌株产生一种毒素(杀死另外两种菌株中的一种)和一种保护自身的抗毒素，而其他菌株未被毒素靶向。例如，在包含标记为菌株A、菌株B和菌株C的菌株的示例性系统中，菌株A可产生杀死菌株B的毒素；菌株B反过来可产生杀死菌株C的毒素，而菌株C可产生杀死菌株A的毒素。系统中可存在更多菌株，可能参与也可能不参与循环毒素系统。该系统不限于三种菌株系统，它可能由三种以上菌株(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12种菌株)组成，其中每种菌株产生一种毒素，能够杀死系统中不具有抗毒素的另一种菌株，从而允许一种循环系统(由4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多菌株组成)。此外，系统可能由三种以上菌株组成(例如，4、5、6、7、8、9、10、11或12种菌株)，其中至少三种菌株中的每一种都产生一种毒素，能够杀死系统中不具有抗毒素的另一种菌株，从而允许在所述菌株中的至少三种菌株之间形成循环系统，而系统的其它菌株不根据所述三裂解或多裂解回路进行控制。在一个方面中，该系统可在一定时间内经由工程菌株提供治疗剂的特定递送，直到给予系统中的后续菌株为止，从而根据需要在空间和时间上分离特定治疗剂的递送。
在一些实施方式中，每种菌株可产生治疗性蛋白质或一套治疗性蛋白质，其表达可由诸如同步裂解回路(SLC)的遗传回路控制。在一些实施方式中，示例性SLC可包括国际申请PCT/US18/33555中描述的那些，其通过引用整体并入本文中。
在一些实施方式中，三裂解或多裂解系统利用良好表征的大肠杆菌特异性毒素-抗毒素系统，结合Lux-AHL群体感应裂解回路，不仅能提供细菌种群规模的自限制性控制，而且能够以循环的“石头-布-剪刀”方式精确去除不需要的菌株，以实现长期连续培养。三裂解或多裂解系统可在一定时间内经由工程菌株提供治疗性蛋白质的特定递送，直到给予系统中的后续菌株为止，从而在空间和时间上分离特定治疗性蛋白质的递送。三裂解或多裂解系统也可被工程改造成向疾病部位输出治疗性蛋白质的特定图谱。
在另一方面，三裂解或多裂解系统也可适用于工程改造“分工”生态系统，其中多种菌株可代谢或产生某些中间体，目的是合成具有商业价值的化合物。其他类似应用-三裂解或多裂解系统可包括修复和传感应用。
此外，使用三裂解或多裂解系统作为确保回路稳定性的方法并不一定局限于治疗应用，它可能适用于任何需要细菌中工程基因构建物稳定性的应用。
本文提供通过群体感应来维持共培养物的方法，其包括：在一段时间内以一定比率(例如1:1:1)共同培养至少三种(例如3、4、5、6、7、8、9、10种)菌株；其中至少三种菌株中的每一种都包含裂解质粒和激活子质粒。
本文还提供通过群体感应来维持共培养物的方法，包括：在一段时间内以一定比率(例如1:1:1)共同培养至少三种(例如3、4、5、6、7、8、9、10种)菌株；其中至少三种菌株中的每一种都包含毒素系统。
本文还提供了维持共培养物的方法，包括：在一段时间内以一定比率(例如1:1:1)共同培养至少三种(例如3、4、5、6、7、8、9、10种)菌株；其中至少三种菌株中的每一种都包含毒素系统。
在一些实施方式中，至少三种细菌菌株为大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)或其细菌变体。在一些实施方式中，至少三种细菌菌株是革兰氏阴性细菌菌株，例如沙门氏菌属(Salmonella)菌株、醋酸杆菌属(Acetobacter)菌株、肠杆菌属(Enterobacter)菌株、梭杆菌属(Fusobacterium)菌株、螺杆菌属(Helicobacter)菌株、克雷伯氏菌属(Klebsiella)菌株或大肠杆菌(E.coli)菌株。在一些实施方式中，至少三种细菌菌株是革兰氏阳性细菌菌株，例如放线菌属(Actinomyces)菌株、芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、梭菌属(Clostridium)菌株、肠球菌属(Enterococcus)菌株或乳杆菌属(Lactobacillus)菌株。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株均为革兰氏阴性细菌菌株或均为革兰氏阳性细菌菌株。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株中的至少一种为革兰氏阴性细菌菌株。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株中的至少一种为革兰氏阳性细菌菌株。
在一些实施方式中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒包含激活子基因、降解标签和任选的报告基因。在一些实施方式中，所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。在一些实施方式中，所述可激活启动子是LuxR-N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)可激活luxI启动子，并且所述激活子基因是LuxI。在一些实施方式中，所述可激活启动子是RpaR-N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)可激活RpaI启动子，并且所述激活子基因是RpaI。在一些实施方式中，所述报告基因是绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体。在一些实施方式中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株各自包含裂解质粒和激活子质粒。在一些实施方式中，至少三种细菌菌株中的每一种包含不同的报告基因。
在一些实施方式中，以1:1:1的比率接种共培养物。在一些实施方式中，可以共同培养一种或多种细菌菌株。在一些实施方式中，基于所用菌株、系统的期望特性、结果目标等以特定比率(例如，1:1、1:5、1:10、1:1:1、1:5:1等)接种共培养物。在一些实施方式中，系统中的一种或多种菌株可比系统中的一种或多种其他菌株具有生长优势。
在一些实施方式中，质粒整合到至少三种细菌菌株中至少一种的基因组中。
在一些实施方式中，所述共培养在微流体装置中进行。在一些实施方式中，所述共培养在细胞培养容器(例如细胞培养板、生物反应器)中进行。
在一些实施方式中，所述一段时间是0至72小时(例如0至72；0至60小时；0至48小时；0至36小时；0至24小时；0至16小时；0至14小时；0至12小时；0至10小时；0至8小时；0至6小时；0至4小时；0至2小时；2至72小时；2至60小时；2至48小时；2至36小时；2至24小时；2至16小时；2至14小时；2至12小时；2至10小时；2至8小时；2至6小时；2至4小时；4至72小时；4至60小时；4至48小时；4至36小时；4至24小时；4至16小时；4至14小时；4至12小时；4至10小时；4至8小时；4至6小时；6至8小时；6至10小时；6至12小时；6至14小时；6至16小时；6至18小时；6至20小时；6至22小时6至24小时；8至10小时；8至12小时；8至16小时；8至24小时；8至36小时；8至48小时；8至60小时；8至72小时；1至2小时；1至3小时；1至4小时；1至6小时；1至8小时；1至10小时；1至12小时；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小时)。
在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株的共培养处于恒定裂解状态；其中所述恒定裂解状态的特征是所述至少三种细菌菌株的生长和裂解的稳态平衡。
本文提供包含裂解质粒和激活子质粒的细菌菌株；其中所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒包含激活子基因、降解标签和任选的报告基因。
在一些实施方式中，所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
在一些实施方式中，所述可激活启动子是LuxR-N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)可激活luxI启动子，并且所述激活子基因是LuxI。
本文也提供包含本文所述的任一细菌菌株的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物配制为用于原位药物递送。将药物组合物配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的示例包括口服或胃肠道外给药，例如静脉内、皮内、皮下、吸入、透皮(局部)、经粘膜和直肠给药。如本文所用，语言“药学上可接受的运载体”包括与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。
本文提供一种系统，其包括：本文所述至少三种细菌菌株的共培养物。
本文提供包括本文所述的任一系统的药物递送系统。本文提供包括本文所述的任一系统的周期性药物递送系统。
本文提供了一种在对象内治疗疾病的方法，包括：向需要对象给予治疗有效量的如本文所述的至少三种细菌菌株或如本文所述的药物组合物，以治疗对象中的疾病。在一些实施方式中，给予包括将至少三种细菌菌株中的每一种依次给予给对象。在一些实施方式中，给予包括将至少三种细菌菌株中的每一种同时给予给对象。在一些实施方式中，至少三种细菌菌株中的每一种表达不同的治疗剂。在一些实施方式中，所述疾病是癌症或感染。
本文提供包括本文所述的任一系统的微流体样品阱(trap)。
本文提供包括一个或多个微流体样品阱的微流体装置。在一些实施方式中，所述微流体系统还包括与所述微流体样品阱流体连通的至少一条通道。
本文提供了一种方法，包括在生长环境中培养第一细菌菌株第一时间段，将第二细菌菌株添加到生长环境中并培养第二细菌菌株第二时间段，将第三菌株添加到生长环境中并将第三菌株培养第三时间段，其中第一、第二和第三菌株中的每一菌株包括毒素系统，其中第一菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一菌株不产生第三毒素，其中第二菌株的毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二菌株不产生第一毒素，其中第三细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第三细菌菌株不产生第二毒素，和任选地其中第一、第二和第三细菌菌株中的每一种包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒，和具有激活子基因的激活子质粒，激活子基因的表达促进群体感应分子的积累，其中裂解基因的可激活启动子和激活子基因的表达都可被群体感应分子激活。
实施方式可包括以下特性中的一项或多项。群体感应分子在第一、第二和第三细菌菌株的每一种中可以是不同的。第一、第二和第三菌株中每一种的群体感应分子各自对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。群体感应分子在第一、第二和第三细菌菌株的每一种中可以是相同的。该方法还可以包括在生长环境中培养或共同培养一种或多种额外的细菌菌株。一种或多种额外细菌菌株中的每一种可包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中裂解基因的可激活启动子和激活子基因的表达都可被群体感应分子激活。群体感应分子在第一、第二和第三细菌菌株以及一种或多种额外细菌菌株的每一种中可以是不同的。第一、第二和第三菌株以及一种或多种额外细菌菌株中每一种的群体感应分子各自对于生长环境中使用的另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。群体感应分子在第一、第二和第三细菌菌株以及一种或多种额外细菌菌株的每一种中可以是相同的。一种或多种额外细菌菌株中的每一种可包括毒素系统。所述第一菌株、第二菌株、第三菌株和一种或多种额外菌株中的每一种的毒素系统可以在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合上独立编码。所述至少第一、第二和第三菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是同一质粒的拷贝。所述至少第一、第二和第三菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是不同质粒。至少第一、第二和第三细菌菌株在代谢上具有竞争性。至少第一、第二和第三菌株可以选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。与生长环境中的另一菌株相比，至少第一、第二和第三菌株中的每一种不能具有生长优势。在所述第一、第二和第三菌株的各菌株中，所述裂解质粒可包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒包含激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。至少第一、第二和第三菌株中的每一菌株中的裂解基因可以是来自噬菌体ΦX174的E。所述至少第一、第二和第三细菌菌株中的每一种中的可激活启动子可以是LuxR-AHL可激活luxI启动子并且所述激活子基因可以是LuxI。至少一个报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。降解标签可以是ssrA-LAA降解标签。质粒中的至少一种可整合到所述第一、第二和第三细菌菌株中的至少一种的基因组中。培养可在微流体装置中进行。培养可在生物反应器中进行。培养可在体内进行。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约12小时到大约72小时之间变化。第一、第二和第三时间段中的每一个可以从至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时中选择。可以从12小时、24小时、48小时、72小时和96小时中选择第一、第二和第三时间段。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约72小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约48小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约24小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约18小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约12小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约6小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约3小时之间变化。第一、第二和第三时间段可以依次发生。第一和第二、第二和第三或第一和第三时间段可以部分或完全重叠。第一、第二和第三细菌菌株中的一种或多种可编码与启动子可操作连接的异源核酸和/或异源蛋白质。启动子可以是可激活启动子。启动子可以被群体感应分子激活。启动子可以是组成型启动子。异源核酸和/或异源蛋白质可以是治疗剂。治疗剂可选自：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。抑制性核酸可以是siRNA、shRNA、miRNA或反义核酸。
本文还提供了一种方法，包括提供n种细菌菌株，包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，在生长环境中以独立的时间段依次共培养每种细菌菌株，其中，所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种细菌菌株中的每一种都包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均可被所述群体感应分子激活，其中所述n种细菌菌株中的每一种细菌菌株包括毒素系统，其中所述第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种细菌菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前细菌菌株有效，其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四种毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式可包括以下特性中的一项或多项。在所述n种菌株的各菌株中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒包含激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。n种菌株的裂解基因均为ΦX174噬菌体的E。所述n种细菌菌株中的每一种中的可激活启动子可以是LuxR-AHL可激活luxI启动子并且所述激活子基因可以是LuxI。至少一个报告子基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。降解标签可以是ssrA-LAA降解标签。质粒中的至少一种可整合到所述n种细菌菌株中的至少一种的基因组中。群体感应分子在n种细菌菌株的每一种中可以是不同的。其中所述n种菌株中每一种的群体感应分子各自对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。群体感应分子在n种细菌菌株的每一种中可以是相同的。所述n种菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是同一质粒的拷贝。所述n种菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是不同质粒。
本文还提供了一种方法，包括提供n种细菌菌株，其中包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；在生长环境中以独立的时间段依次共培养每种细菌菌株，其中，所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株，其中n可以是至少3种，其中所述n种细菌菌株中的每一种都包括毒素系统，其中所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，以及来自先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第一毒素对先前细菌菌株有效，其中所述第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。n种细菌菌株具有代谢竞争性。n种细菌菌株的每一种可以选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。在生长环境中，在生长环境中，n种细菌菌株中的每一种都不可能比另一种菌株具有生长优势。n种细菌菌株的毒素系统可在基因组、质粒、多个质粒或其组合中独立编码。培养可在微流体装置中进行。培养可在生物反应器中进行。培养可在体内进行。独立时间段的每一个都可以在大约12小时到大约72小时之间变化。独立时间段中的每一个可以从至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时中选择。可以从12小时、24小时、48小时、72小时和96小时中选择每一个独立时间段。每个时间段都可以在大约1小时到大约72小时之间独立变化。每个时间段都可以在大约1小时到大约48小时之间独立变化。每个时间段都可以在大约1小时到大约24小时之间独立变化。每个时间段都可以在大约1小时到大约18小时之间独立变化。每个时间段都可以在大约1小时到大约12小时之间独立变化。每个时间段都可以在大约1小时到大约6小时之间独立变化。每个时间段都可以在大约1小时到大约3小时之间独立变化。一个或多个时间段可以部分或完全重叠。n种细菌菌株中的一种或多种可编码与启动子可操作连接的异源核酸和/或异源蛋白质。启动子可以是可激活启动子。可激活启动子可以被群体感应分子激活。启动子可以是组成型启动子。异源核酸和/或异源蛋白质可以是治疗剂。治疗剂可选自：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。抑制性核酸可以是siRNA、shRNA、miRNA或反义核酸。第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不能产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不能产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
本文还提供一种细菌菌株，其包括裂解质粒和激活子质粒，其中裂解质粒包括裂解基因、可激活启动子和可选的报告基因，激活子质粒包括激活子基因、可选的降解标签和可选的报告基因，其中，所述细菌菌株还包括毒素系统，其中所述毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述细菌菌株不产生所述第二毒素。
实施方式可包括以下特性中的一项或多项。裂解基因可能是来自噬菌体ΦX174的E。可激活启动子可以是LuxR-AHL可激活luxI启动子，激活子基因可以是LuxI。激活子基因可以编码一种分子，其直接或间接激活可激活启动子。直接或间接激活可激活启动子的分子可以是群体感应分子。裂解基因可操作地与可激活启动子连接。裂解质粒上的报告基因可操作地与可激活启动子连接。激活子质粒可进一步包括可激活启动子。激活子质粒的可激活启动子可以是裂解质粒的可激活启动子的拷贝。激活子基因可操作地与激活子质粒的可激活启动子连接。激活子质粒的报告基因可操作地与激活子质粒的可激活启动子连接。降解标签可操作地与激活子质粒的可激活启动子连接。毒素系统可操作地与裂解质粒的可激活启动子连接。降解标签可以是ssrA-LAA降解标签。裂解质粒的报告基因、激活子质粒的报告基因或两者都可以是荧光蛋白。裂解质粒的报告基因和激活子质粒的报告基因可以是不同基因。
本文还提供包括毒素系统的细菌菌株，其中毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中细菌菌株不产生第二毒素。
实施方式可包括以下特性中的一项或多项。细菌菌株可编码与启动子可操作连接的异源核酸和/或异源蛋白质。启动子可以是可激活启动子。可激活启动子可以被群体感应分子激活。启动子可以是组成型启动子。异源核酸和/或异源蛋白质可以是治疗剂。毒素系统可在基因组、质粒、多个质粒或其组合中编码。细菌菌株还可以包括编码治疗剂的核酸。治疗剂可选自：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。治疗剂可以是治疗性多肽。治疗剂对靶细胞可具有细胞毒性或细胞抑制作用。靶细胞可以是癌细胞或感染细胞。
本文还提供包括本文所述的任何一种或多种细菌菌株的药物组合物。该药物组合物可配制成用于原位药物递送。
本文还提供一种系统，包括第一细菌菌株，其包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因，其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统，其中，所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；所述第二细菌菌株包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中，所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因，其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素；以及第三细菌菌株，其包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因，其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
本文还提供一种系统，包括第一细菌菌株，其包括第一毒素系统，其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株还任选地包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；第二细菌菌株，包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株还任选地包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；以及第三细菌菌株，包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素，其中第三细菌菌株还可任选地包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
一些系统的实施方式可以包括一项或多项以下特征。该系统还可以包括一种或多种额外细菌菌株。第一毒素系统、第二毒素系统和第三毒素系统可在基因组、质粒、多个质粒或其组合中独立编码。
本文还提供一种系统，包括n种细菌菌株，包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种菌株中的每一种包括毒素系统，其中所述第二到第n细菌菌株中的每一种的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，以及来自由先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第一毒素对先前的细菌菌株有效，其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
本文还提供了一种系统，包括提供n种细菌菌株，包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中，所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种细菌菌株中的每一种都包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均可被所述群体感应分子激活，其中所述n种细菌菌株中的每一种细菌菌株包括毒素系统，其中所述第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种细菌菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前细菌菌株有效，其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四种毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n种细菌菌株有效。
一些系统的实施方式可以包括一项或多项以下特征。n值可以是3。n的值可以是4、5、6、7、8、9或10。毒素系统中的每一种可在基因组、质粒、多个质粒或其组合中独立编码。第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不能产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
本文还提供一种试剂盒，其包括第一药物组合物，所述药物组合物包括第一细菌菌株，其包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，第一降解标签和任选的第一报告基因，其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统，其中，所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；第二药物组合物，其包括第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中，所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、第二降解标签和任选的第二报告基因，其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素；和第三药物组合物，其包括第三细菌菌株，其包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、第三降解标签，以及任选的第三报告基因，其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
本文还提供一种试剂盒，其包括第一药物组合物，包括第一细菌菌株，其包括第一毒素系统，其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株还任选地包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；第二药物组合物，包括第二细菌菌株，包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株还任选地包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；以及第三药物组合物，其包括第三细菌菌株，包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素，其中所述第三细菌菌株还任选地包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
一些试剂盒的实施方式可以包括一项或多项以下特征。第一毒素系统、第二毒素系统和第三毒素系统可在基因组、质粒、多个质粒或其组合中独立编码。试剂盒还可以包括在第一、第二、第三和/或一种或多种额外药物组合物中的一种或多种额外细菌菌株。
本文还提供一种试剂盒，包括n种细菌菌株，包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种菌株中的每一种包括毒素系统，其中所述第二到第n细菌菌株中的每一种的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，以及来自由先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第一毒素对先前的细菌菌株有效，其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和由第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
本文还提供了一种试剂盒，包括提供n种细菌菌株，包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中，所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种细菌菌株中的每一种都包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均可被所述群体感应分子激活，其中n种细菌菌株中的每一种细菌菌株的裂解质粒包括毒素系统，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种细菌菌株的裂解质粒的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前细菌菌株有效，其中第一细菌菌株裂解质粒的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
一些试剂盒的实施方式可以包括一项或多项以下特征。n值可以是3。n的值可以是4、5、6、7、8、9或10。
本文还提供了一种药物递送系统，包括本文提供的系统或试剂盒中的任何一个或多个。
本文还提供了一种周期性药物递送系统，包括本文提供的系统或试剂盒中的任何一个或多个。
本文还提供一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下细菌菌株的每一种：第一细菌菌株，其包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因，其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统，其中，所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中，所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因，其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素；以及第三细菌菌株，其包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因，其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
本文还提供一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下药物的每一种：第一药物，其包括第一细菌菌株，包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因，其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统，其中，所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；第二药物，其包括第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中，所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因，其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素；以及第三药物，其包括第三细菌菌株，其包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因，其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
本文还提供一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下的每一种：第一细菌菌株，其包括第一毒素系统，其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株还任选地包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；第二细菌菌株，包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株还任选地包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；以及第三细菌菌株，包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素，还可任选地包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
本文还提供一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下的每一种：第一药物组合物，包括第一细菌菌株，其包括第一毒素系统，其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株还任选地包括第一裂解质粒和第一激活子质粒，其中第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因，以及第一激活子质粒包括第一激活子基因，任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；还包括第二药物组合物，包括第二细菌菌株，包括第二毒素系统，其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株还任选地包括第二裂解质粒和第二激活子质粒，其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因，所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；以及第三药物组合物，其包括第三细菌菌株，包括第三毒素系统，其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素，还可任选地包括第三裂解质粒和第三激活子质粒，其中第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因，所述第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
一些方法的实施方式可以包括一项或多项以下特征。给药可包括依次对对象给予第一、第二和第三细菌菌株或第一、第二和第三药物组合物中的每一种。给药可包括同时给予所述第一、第二和第三药物组合物中的每一种，并且其中所述第一、第二和第三药物组合物中的每一种具有释放所述第一、第二和第三细菌菌株的不同释放曲线。第一、第二和第三种细菌菌株中的每一种都可以表达不同的治疗剂。
本文还提供一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下的n种细菌菌株的每一种，所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种菌株中的每一种包括毒素系统，其中所述第二到第n细菌菌株中的每一种的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，以及来自由先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第一毒素对先前的细菌菌株有效，其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和由第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
本文还提供了一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下n种细菌菌株的每一种，所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中，所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种细菌菌株中的每一种都包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均可被所述群体感应分子激活，其中n种细菌菌株中的每一种细菌菌株的裂解质粒包括毒素系统，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种细菌菌株的裂解质粒的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前细菌菌株有效，其中第一细菌菌株裂解质粒的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
一些方法的实施方式可以包括一项或多项以下特征。n值可以是3。n的值可以是4、5、6、7、8、9或10。
本文还提供一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下的m种药物组合物的每一种，每一种药物组合物包括n种细菌菌株中的至少一种，n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种菌株中的每一种包括毒素系统，其中所述第二到第n细菌菌株中的每一种的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，以及来自由先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第一毒素对先前的细菌菌株有效，其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和由第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
本文还提供了一种在有需要的对象中治疗疾病的方法，包括对对象给予治疗有效量的以下m种药物组合物中的每一种，其中每一种药物组合物包括n种细菌菌株的至少一种，其中所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株，其中，所述第二细菌菌株到所述第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株，其中n可以是至少3，其中所述n种细菌菌株中的每一种都包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均可被所述群体感应分子激活，其中n种细菌菌株中的每一种细菌菌株的裂解质粒包括毒素系统，其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种细菌菌株的裂解质粒的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前细菌菌株有效，其中第一细菌菌株裂解质粒的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
一些方法的实施方式可以包括一项或多项以下特征。n值可以是3。n的值可以是4、5、6、7、8、9或10。值m＝n。毒素系统中的每一种可在基因组、质粒、多个质粒或其组合中独立编码。第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。给药可包括依次给对象给予n种细菌菌株或m种药物组合物中的每一种。给药可包括同时给予m种药物组合物中的每一种，其中m种药物组合物中的每一种具有释放第一、第二和第三细菌菌株的不同释放曲线。第一、第二和第三种细菌菌株中的每一种都可以表达不同的治疗剂。疾病可以是癌症或感染。感染可由选自以下的感染物质导致：空肠弯曲菌(Camphylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和沙门氏菌(Salmonella)。癌症可选自：成胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌和前列腺癌。
在本文所述的任何一种或多种方法、细菌菌株、药物组合物、系统或试剂盒的一些实施例中，一种或多种细菌菌株可表达治疗剂。在本文所述的任何一种或多种方法、细菌菌株、药物组合物、系统或试剂盒的一些实施例中，一种或多种细菌菌株可表达选自以下的治疗剂：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
本文还提供了一种方法，包括在生长环境中在第一时间段培养第一细菌菌株，将第二细菌菌株添加到生长环境中并且在第二时间段培养第二细菌菌株，将第三细菌菌株添加到所述生长环境中并在第二时间段培养第三细菌菌株，其中所述第一、第二和第三细菌菌株中的每一种都包括毒素系统，其中，第一细菌菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一菌株不产生第三毒素，其中所述第二细菌菌株的毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生第一毒素，并且其中所述第三细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自所述第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生第二毒素，其中所述毒素系统可以在质粒上、多个质粒上编码，整合到宿主基因组中，或其组合。
实施方式可包括以下特性中的一项或多项。第一、第二、和第三细菌菌株的每一种可包括：裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；其中在第一、第二、第三细菌菌株的每一种中的群体感应分子可相同或不同，其中第一、第二、和第三细菌菌株中每一种的每个群体感应分子对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子可有影响或没有任何影响。第一、第二和第三细菌菌株的每一裂解质粒可以是含有所述细菌菌株的毒素系统的质粒，或者其中所述第一、第二和第三细菌菌株的每一激活子质粒可以是含有所述细菌菌株毒素系统的质粒，或者其中每一种细菌菌株的毒素系统都可以整合到基因组中。
本文还提供了一种培养n种细菌菌株的方法，包括在培养物中在第一时间段培养n种细菌菌株中的第一细菌菌株，将n种细菌菌株中的第二细菌菌株添加到培养物中并且在第二时间段培养第二细菌菌株，将n种细菌菌株中其余每一种细菌菌株添加到所述培养物中并在一定时间段培养每一种细菌菌株，其中n是3或以上的数字，其中n种细菌菌株中的每一种的质粒都包括毒素系统，其中，第一细菌菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第n毒素/第n抗毒素对的第n抗毒素，其中第一菌株不产生第n毒素，其中所述n种细菌菌株中其它细菌菌株的第m种的质粒的毒素系统产生第m毒素/第m抗毒素对和来自第(m-1)毒素/第(m-1)抗毒素的第(m-1)抗毒素，其中m可以是{2,3,…,n}组中的元素。
本文所述方法的实施方式可以包括一项或多项以下特征。n种细菌菌株的每一种可包括：裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；其中在n种细菌菌株的每一种中的群体感应分子可相同或不同，其中n种细菌菌株中每一种的每个群体感应分子对于n种细菌菌株中另一菌株的裂解基因的可激活启动子可有影响或没有任何影响。n种细菌菌株的每一裂解质粒都可以是含有该细菌菌株毒素系统的质粒。n种细菌菌株中的每一种都能产生有效载荷。n种细菌菌株中的每一种都能产生不同有效载荷。n种细菌菌株中的每一种都能产生相同有效载荷。每种有效载荷可以是治疗性的。第m细菌菌株的有效载荷通过直接或间接作用于第(m-1)细菌菌株的底物产生第m底物，并且其中第一菌株的有效载荷作用于存在于培养n种细菌菌株的环境中的底物上。n值可以是4。n值可以是5。n值可以是6。该方法还可以包括在培养物中培养或共同培养一种或多种额外的细菌菌株。一种或多种额外细菌菌株的每一种可包括：裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；其中在第一、第二、第三细菌菌株和一种或多种额外的细菌菌株的每一种中的群体感应分子可相同或不同，其中第一、第二、和第三细菌菌株和一种或多种额外细菌菌株中每一种的每个群体感应分子对于培养物中使用的另一细菌菌株的裂解基因的可激活启动子可有影响或没有任何影响。一种或多种额外细菌菌株中的每一种的裂解质粒可包括毒素系统。所述至少第一、第二和第三菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是同一质粒。所述至少第一、第二和第三菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是独立质粒。至少第一、第二和第三种细菌菌株在代谢上具有竞争性。至少第一、第二和第三菌株可以选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。与培养物中的另一菌株相比，至少第一、第二和第三菌株中的每一种不能具有生长优势。在至少第一、第二和第三菌株的每一种中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒包含激活子基因、降解标签和任选的报告基因。至少第一、第二和第三菌株中的每一菌株中的裂解基因可以是来自噬菌体ΦX174的E。所述至少第一、第二和第三细菌菌株中的每一种中的可激活启动子可以是LuxR-AHL可激活luxI启动子并且所述激活子基因可以是luxI。至少一个报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。降解标签可以是ssrA-LAA降解标签。质粒中的至少一种可整合到所述第一、第二和第三细菌菌株中的至少一种的基因组中。培养可在指定生长环境中进行。培养可在微流体装置中进行。培养可在生物反应器中进行。培养可在体内进行。每种细菌菌株都可以产生治疗有效载荷，并且可以在需要治疗有效载荷的人类或动物患者中进行培养。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约12小时到大约72小时之间变化。第一、第二和第三个时间段的每一个都可以在大约1小时到大约n小时之间变化。第一、第二和第三时间段中的每一个可以从至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时中选择。n个时间段的每一个可以部分或完全重叠。n种细菌菌株可共同培养。依次将n种细菌菌株中的每一种添加到培养物中，使得在经过(m-1)段时间传代后可以将每一种第m细菌菌株添加到培养物中。可以从12小时、24小时、48小时、72小时和96小时中选择第一、第二和第三时间段。
本文还提供了一种维持共培养的方法，包括共培养至少三种细菌菌株，其中至少三种细菌菌株的每一种包括具有在可激活启动子控制下的裂解基因的裂解质粒和具有激活子基因的激活子质粒，其表达促进群体感应分子的积累，其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均可被所述群体感应分子激活，其中在至少三种细菌菌株的每一种中群体感应分子可以是不同的，其中至少三种细菌菌株中每一种的每个群体感应分子对于另一细菌菌株的裂解基因的可激活启动子有影响或没有实质影响，其中裂解质粒包括毒素/抗毒素系统。
一些本文所述方法的实施方式可具有一项或多项以下特征。毒素/抗毒素系统可产生毒素/抗毒素对和另一菌株的不同抗毒素。至少三种细菌菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是相同质粒。至少三种细菌菌株的每一菌株的裂解质粒和激活子质粒可以是分离质粒。至少这三种菌株在代谢上具有竞争性。至少三种细菌菌株的每一种可以选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。与另一种菌株相比，至少三种菌株中的每一种都不具有生长优势。在所述至少三种菌株的每一种中，所述裂解质粒可包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒可包含激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。至少三种菌株的裂解基因可以是ΦX174噬菌体的E。可激活启动子可以是LuxR-AHL可激活luxI启动子，激活子基因可以是LuxI。至少一个报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。降解标签可以是ssrA-LAA降解标签。该共培养物可以至少三种细菌菌株中每一种1:1:1的比率接种。质粒中的至少一种可整合到所述至少三种细菌菌株中的至少一种的基因组中。培养可在微流体装置中进行。时间段可以是12-72小时。时间段可以从至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时中选择。可以从12小时、24小时、48小时、72小时和96小时中选择时间段。至少三种细菌菌株的共培养可处于恒定裂解状态；其中所述恒定裂解状态的特征是至少三种细菌菌株的生长和裂解的稳态平衡。
本文所述的方法、系统、试剂盒、细菌菌株和组合物提供多种优势。第一，三裂解或多裂解系统可在一定时间内经由工程菌株提供治疗蛋白质的特定递送，直到给予系统中的后续菌株为止，从而根据需要在空间和时间上分离特定治疗蛋白质的递送。否则这种能力在工程菌治疗方法中是不可用的，因为它们在疾病部位长时间定殖，无论是否有另一种菌株进入疾病环境，都有可能产生单一的治疗效果，同时，由于先前引入的菌株造成的疾病环境中资源减少，导致未来的菌株的定殖能力下降。
其次，三裂解或多裂解系统也可被设计成向疾病部位输出治疗性蛋白质的特定图谱。例如，这三种菌株产生的蛋白质以及让它们在疾病部位定殖的时间可以根据应用而调整。
第三，三裂解或多裂解系统可以保证回路组分在菌株中的稳定性。三裂解循环中的后续菌株能够杀死并移除疾病部位的先前菌株，即使该种群成员已经使回路机制发生突变，因此这可以实现。例如，给予菌株A并使其在疾病部位定殖一段所需时间，其中种群成员已突变裂解基因(或对回路功能至关重要的任何其他基因)。然后将菌株B引入疾病部位，使菌株A种群从环境中去除，包括种群中的突变成员，因为它们对菌株B释放的毒素没有免疫力。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文描述了本发明中所用的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例都仅是说明性的，不构成限制。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献都通过引用其全文纳入本文。若有抵触，以本包括定义在内的本申请说明书为准。
从下述发明详述和附图以及权利要求书很容易了解本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1显示了一种在连续培养中快速可靠地控制活跃种群的策略。图1A是双菌株系统的示意图，其中菌株A使用成对毒素-抗毒素系统比菌株B具有工程选择性优势。菌株A产生毒素A、抗毒素A和抗毒素B，而菌株B只产生毒素B和抗毒素B。图1B显示图1A中的菌株B在微流体细胞室中的示例性生长。通过间歇上样(灰色阴影区域)引入菌株A后，菌株A的份数呈指数增长，而菌株B的份数衰减。下图显示了在指定时间点的相差和荧光的组成。AU，任意荧光单位(扣除背景)。图1C是与群体感应同步裂解回路整合的毒素-抗毒素系统的示范性遗传图。该回路包含含有毒素、抗毒素系统和激活子/报告子质粒的裂解质粒。LuxI的瞬时生产最终导致AHL积累到激活LuxR所需的群体阈值之上，其通过驱动PluxI启动子的转录关闭来启动正反馈环，该PluxI启动子控制LuxI、报告子荧光蛋白(sfGFP、CFP或mKAte2)和裂解基因X174E的生产。该系统中，LuxR由天然LuxR启动子驱动。图1D是示范性双菌株种群动力学的示意图，其整合了同步裂解回路以控制种群大小。同步裂解回路的自我限制行为，以及当原始菌株处于其最低种群时毒素释放的同步，应该能够实现更快速的菌株接管。图1E显示了显示由振荡回路产生的相差、GFP和CFP荧光组成的胶片条。与非同步裂解回路菌株(顶条)相比，同步裂解回路(底部条)的整合减少了实现完全接管微流体阱所需的时间。注：同步裂解菌株的sfGFP和CFP荧光报告子由AHL的产生驱动，并且仅在达到群体阈值时表达。
图2显示了在工程菌株之间单向循环的三菌株系统的示例图。图2A是自裂解大肠杆菌的三菌株系统的示例性示意图。每种菌株产生自己的毒素-抗毒素对，同时也产生后续菌株的抗毒素。所有全部三种菌株利用相同的Lux-AHL群体感应系统来驱动荧光报告子蛋白的表达，以及自限制性同步裂解。图2B显示了3种菌株的示范性分批培养生长曲线，显示了每种菌株的裂解OD600。所有菌株均从相同的稀释密度开始，并且均处于相同的生长条件下(n＝3)。图2C显示了相同生长条件下在双层微流体室中测量的三菌株系统的示范性裂解循环(n＝15)。图2D显示在微流体装置中以20％的优势菌株和80％的易感菌株的初始浓度接种的两种菌株的共培养。菌株接管单向进行，使优势菌株接管微流体室。图2E显示了初始密度为40％的菌株1和60％的菌株2接种的共培养物的视频截图，展示了在双层微流体室中菌株1的菌株接管。图2F显示了初始密度为40％菌株2和60％菌株3接种的共培养物的视频截图，显示了在双层微流体室中菌株2的菌株接管。图2G显示了以40％菌株3和60％菌株1的初始密度接种的共培养物的视频截图，显示了在双层微流体室中菌株3的菌株接管。图2H、2I和2J各自显示了图E-G中所示微流体实验的荧光表达时间系列，显示了微流体室中两种菌株的同步裂解和菌株接管。同步裂解菌株的荧光报告子由AHL的产生驱动，并且仅在达到群体阈值时表达。
图3显示了三菌株共培养的动力学、模型和实验结果。图3A显示了大肠杆菌素模型的时间系列动力学，表明当三菌株同时且在估计的参数下共培养时，三菌株应各自循环一次，直到单种菌株接管阱。三幅图显示了菌株、大肠杆菌素和AHL的浓度随时间的变化。图3B显示了3菌株共培养实验中单个阱的GFP、CFP和RFP荧光表达的时间轨迹，其中所有三种菌株以大致相等的比率上样。图3C示出了图3B所示微流体室的相差、GFP、CFP和RFP的视频截图。图3D显示了图3C实验中单个阱的GFP、CFP和RFP荧光表达的时间轨迹，显示了在单次连续不间断运行中通过所有3种菌株的循环。图3D显示了大肠杆菌素模型的时间序列动力学，表明当三种菌株同时在参数估值下共培养时，以给定恒定接种量，三种菌株应无限循环。图3E所示为三菌株系统的极限循环，显示了三菌株之间的稳定转变。此外，所有合理值的输入参数都会导致收敛到稳定极限循环。图3F示出了表示在1600个微流体阱中观察到的菌株接管事件的图，其中所有三种工程菌株以大约相等的比率同时上样。箭头表示三种菌株之间的每个可能转变事件，箭头颜色表示每个箭头观察到的转变次数。
图4示出根据一些实施方式可使用的示例性毒素。
图5显示了96孔平板阅读器实验中非裂解菌株中大肠杆菌素和免疫活性的示范性验证。图5A显示具有mKate2表达质粒的MG1655野生型对照菌株。OD600和RFP荧光表达的时程轨迹。图5B显示具有GFP表达质粒的MG1655野生型对照菌株。OD600和GFP荧光表达(RFU)的时程轨迹。图5C显示MG1655菌株1(pML0001)OD600和GFP荧光表达的时程轨迹。图5D显示MG1655菌株2的OD600和RFP荧光表达的时程轨迹。图5E显示MG1655菌株3的OD600和RFP荧光表达的时程轨迹。图5F显示MG1655菌株1与大肠杆菌素E3的共培养。OD600、GFP和RFP荧光(RFU)表达的时程轨迹证实菌株1能在大肠杆菌素E3存在下生长。图5G显示MG1655菌株2与大肠杆菌素E7共孵育。OD600和GFP荧光(RFU)表达的时程轨迹证实菌株1能在大肠杆菌素E7存在下生长。图5H显示MG1655菌株3(pML0004)与大肠杆菌素V共孵育。OD600和RFP荧光表达的时程轨迹证实菌株3能够在大肠杆菌素V存在下生长。图5I、5J和5K显示大肠杆菌素E3、E7和V与MG1655野生型对照菌株共培养证明大肠杆菌素抑制MG1655野生型生长的有效性。OD600、GFP和RFP荧光(AU)的时程轨迹。
图6显示了从示范性微流体实验中获取的视频截图，显示了一种菌株的生长受到另一种菌株的毒素产生的抑制。在本实验中，菌株1产生毒素1、抗毒素1和抗毒素3。菌株3产生毒素3、抗毒素3和抗毒素2。当比较菌株3的正常生长(方案2)和菌株1在附近时的生长速率(方案3)时，菌株1释放的毒素对生长的抑制作用是明显的。结果表明，毒素活性依赖于邻近性，如(方案4)所示，当两种菌株不接近时，菌株3的生长不受影响。图6A是方案1，显示了菌株1在微流体阱中的单独生长。图6B是方案2，显示了菌株3在微流体阱中的单独生长。图6C是方案3，示出了当菌株1和菌株3彼此接近时的生长和菌株1和菌株3。菌株1抑制菌株3的生长。图6D是方案4，显示了菌株1和菌株3在彼此不接近时的生长。图6E和图6F显示了GFP和RFP中不同方案的荧光轨迹。
图7显示了平板阅读器和微流体实验中裂解菌株的典型特征。微流体实验中透射光振荡的振幅会因裂解事件表型的差异而变化。例如，菌株1的裂解事件会更剧烈发生，将细胞裂解物从陷阱中驱除。然而，菌株3的裂解事件导致在微流体阱中有更多细胞裂解物积聚。图7A显示3种裂解菌株裂解的平板阅读器OD600和相应的荧光表达(n＝3)。图7B显示微流体阱区域(100x80x2μm)的菌株1归一化到最大值的荧光强度(实线)和归一化到最大值的透射光强度(虚线)的叠加。图7C显示微流体阱区域(100x80x2μm)的菌株2归一化到最大值的荧光强度(实线)和归一化到最大值的透射光强度(虚线)的叠加。图7D显示微流体阱区域(100x80x2μm)的菌株3归一化到最大值的荧光强度(实线)和归一化到最大值的透射光强度(虚线)的叠加。
图8显示了示范性三菌株三裂解系统的确定性建模。图8A示出了作为Ac函数的作图模式的非零本征值的幅度。当λ23＝1时，在Ac＝1.25处发生向振荡的转变。图8B显示Hopf分叉附近每个开关循环的裂解事件数。图8C显示了作图模型的Hopf分叉图。图8D、8E、8F和8G各显示参数扫描，评估振荡状态下裂解事件间隔和每个切换周期裂解事件数对系统参数的依赖性。
图9显示了从分析的4个独立3菌株共培养实验中大约1600个单独示范性微流体阱。微流体装置同时加载所有3种工程菌株，从而改变每个微流体阱的初始接种细胞浓度。上面的图表中记录并显示了证明菌株间转换的阱。颜色(灰色、黑色、浅灰色)分别对应于菌株1、菌株2和菌株3，代表在给定实验时间时阱中的优势菌株。图9A显示了随时间从菌株1(灰色)到菌株3(浅灰色)的转变事件。图9B显示了随时间从菌株2(黑色)到菌株1(灰色)的转变事件。图9C显示了随时间从菌株3(浅灰色)到菌株2(黑色)的转变事件。图9D显示了随时间从菌株1(灰色)到菌株3(浅灰色)到菌株2(黑色)的转变事件。图9E显示了随时间从菌株2(黑色)到菌株1(灰色)到菌株3(浅灰色)的转变事件。
图10显示了示范性菌株和根据一些实施方式可使用的在每个质粒上发现的基因表达构建体。
图11显示了根据一些实施方式可使用的示例性质粒。
图12显示了质粒稳定毒素-抗毒素模块在多菌株种群中功能的示例性扩展。图12A显示在单克隆种群中，质粒稳定性毒素-抗毒素模块能够杀死已突变或丢失抗毒素基因的子代细胞。当扩展到一个n>1菌株的系统时，含有TA模块的菌株保持自稳定功能，同时获得额外的能力杀死任何没有抗毒素的菌株。图12B是示意图，显示每种菌株产生其自身的毒素-抗毒素对，同时也产生后续菌株的抗毒素，从而实现顺序菌株抑制。菌株R产生毒素1、抗毒素1和抗毒素2。菌株P产生毒素3、抗毒素3和抗毒素1。菌株S产生毒素2、抗毒素2和抗毒素3。图12C是RPS菌株的通用质粒图。图12D是工程化RPS和野生型大肠杆菌MG1655菌株的分批培养生长速率图(n＝3)。所有菌株都是从相同的稀释密度和在相同的生长条件下开始的。图12E是一组柱状图，描绘了以1:2优势对易感的初始比率接种的菌株共培养物随时间的大致种群份额(n＝8)。从上至下：(1)菌株R(浅灰色)抑制菌株S(黑色)；(2)菌株S(黑色)抑制菌株P(灰色)；(3)菌株P(灰色)抑制菌株R(浅灰色)。图12F是显示相差、GFP、CFP和RFP荧光组成的荧光显微镜图像。从左至右：(1)菌株R(浅灰色)抑制菌株S(深灰色)；(2)菌株S(深灰色)抑制菌株P(灰色)；(3)菌株P(灰色)抑制菌株R(浅灰色)。
图13显示了一个工程化的石头-剪刀-布生态的示范性发展。图13A是具有SLC整合的示例性双菌株种群动力学的示意图。描述了在菌株接管事件期间的连续的同步种群裂解。图13B是群体感应同步解析回路和TA模块的示例性遗传图。第一种质粒包含由luxI启动子驱动的X174E裂解蛋白和相应的毒素/抗毒素/抗毒素基因。第二“激活子”质粒包含由其天然启动子pLuxI驱动的luxI和LuxR基因。图13C是示出每种菌株产生其自身的毒素-抗毒素对，同时也产生后续菌株的抗毒素的示意图。所有三种菌株利用相同的Lux-AHL群体感应系统来驱动荧光报告子蛋白的表达，以及自限制性同步裂解。图13D示出了菌株1和菌株2以1:1比率接种的共培养物的荧光表达和视频截图的时间序列，显示了菌株1在微流体室中的菌株接管。图13E示出了菌株2和菌株3以1:1比率接种的共培养物的荧光表达和视频截图的时间序列，显示了菌株2在微流体室中的菌株接管。图13F示出了菌株3和菌株1以1:1比率接种的共培养物的荧光表达和视频截图的时间序列，显示了菌株3在微流体室中的菌株接管。图13G是说明三菌株系统极限循环的图，表明无论初始菌株比如何，三菌株之间收敛到稳定转变。图13H是表示当所有三种工程菌株同时培养时观察到的菌株接管事件的图。箭头表示三种菌株之间的每个可能转变事件，箭头阴影表示每个箭头观察到的转变次数。
图14显示了在没有抗生素的情况下回路功能的示范性延长。图14A是方案1的示意图，描绘了由于回路功能丧失而在生长阶段和裂解转变之间的振荡变为不受控制生长的系统。方案2描述了一个由三菌株系统组成的循环，在该循环中，通过添加系统的下一种菌株来防止向非受控生长转变。图14B是每种菌株的荧光表达的时间轨迹，显示了回路功能随时间的损失。根据图14A中的方案1，每种菌株在不存在卡那霉素的情况下培养32小时。图14C是描述每种菌株功能丧失时间的箱型图(n＝16)。图图14D：根据图14A中的方案2，菌株依次加载，从菌株2和菌株1开始。顶部：单个阱的GFP、CFP和RFP荧光表达的时间轨迹，显示了在单次连续不间断运行中通过所有3种菌株的循环。底部-在指定时间点的相差和荧光组成的视频截图。AU，任意荧光单位(扣除背景)。
图15显示了RPS对可突变遗传回路的示范效应。图15A示出了方案1，其描绘了一个系统，其中菌株1在96孔板中培养单个裂解事件的持续时间，并且每12小时传代一次。方案2描述了一个系统，在该系统中，菌株1在96孔板中培养单个裂解事件的时间段，并每12小时传代一次。在每第三次传代时，RPS系统的下一种菌株同时被添加到培养物中。图15B示出了图15A中的每个方案(n＝12)在12次传代的持续时间内的并排比较。浅灰色方块代表功能同步的种群裂解。灰色方块代表同步种群裂解的丧失。深灰色方块代表随后恢复的同步种群裂解的丧失。此外，每个方案中的12个对应样本在包含X174E裂解蛋白和Lux盒的1000碱基对区域进行Sanger测序。复选标记表示正确的序列，(X)表示不正确的序列，(i)表示不确定的序列读取。所有菌株均从相同的稀释密度开始，并且均处于相同的生长条件下。
图16显示了96孔平板阅读器实验中非裂解菌株中大肠杆菌素活性的示范验证。图16A是MG1655野生型大肠杆菌OD600的时程轨迹。图16B是与大肠杆菌素V产生菌株的过滤裂解物共孵育的MG1655野生型大肠杆菌OD600的时程轨迹。图16C是与大肠杆菌素E7产生菌株的过滤裂解物共孵育的MG1655野生型大肠杆菌OD600的时程轨迹。图16D是与大肠杆菌素E3产生菌的过滤裂解物共孵育的MG1655野生型大肠杆菌OD600的时程轨迹。
图17显示了平板阅读器和微流体实验中菌株的典型特征。图17A是3种裂解菌株裂解的平板阅读器OD600和相应的荧光表达(n＝3)的曲线图。图17B是微流体阱区域(100x80x1.2μm)的菌株1归一化到最大值的荧光强度(实线)和归一化到最大值的透射光强度(虚线)的叠加图。图17C是微流体阱区域(100x80x1.2μm)的菌株2归一化到最大值的荧光强度(实线)和归一化到最大值的透射光强度(虚线)的叠加图。图17D是微流体阱区域(100x80x1.2μm)的菌株3归一化到最大值的荧光强度(实线)和归一化到最大值的透射光强度(虚线)的叠加图。
图18显示了微流体装置中菌株对的示范性共培养孵育。图18A是一柱状图，显示每对菌株以优势(粗体)与易感(斜体)1:1的比率共培养(n＝35)。对于每一菌株对，在100％的培养区域中优势菌株取代了易感菌株。图18B是一柱状图，显示每对菌株以优势(粗体)与易感(斜体)1:5的比率共同培养(n＝396)。在100％、100％和92％的培养区域，每对菌株的优势菌株都取代了易感菌株。
图19显示了大肠杆菌素模型的典型时间序列动力学，假设系统关闭不引入新细胞。三张图显示了当菌株3初始浓度较高且没有引入新细胞时，随着时间的推移，菌株、大肠杆菌素和AHL的浓度。
图20显示了典型的三菌株共培养动力学。图20A是3菌株共培养实验中单个阱的GFP、CFP和RFP荧光表达的时间轨迹，在该实验中，所有三种菌株以大致相等的比率上样。图20B示出了用于图20A所示微流体室的相差、GFP、CFP和RFP的视频截图。
图21显示了根据一些实施方式可使用的示例性质粒。
图22示出根据一些实施方式可使用的示例性毒素。
图23显示了根据一些实施方式可使用的示例性菌株。
图24显示了γA＝1,γC＝0.2,α＝1,β＝1,δ＝0.02,Ac＝1,ε＝0.001的大肠杆菌素模型的示范性动力学。图24A显示了示范性时间系列。图24B显示了Pi,Qi,Ri的示范性作图。
图25显示了γA＝10,γC＝1,α＝10,β＝1,δ＝0.002,Ac＝100,ε＝0.001的大肠杆菌素模型的示范性动力学。图25A显示了示范性时间系列。图25B显示了Pi,Qi,Ri的示范性作图。
图26显示了γA＝10,γC＝1,α＝10,β＝20,δ＝0.01,Ac＝100,ε＝0.02的大肠杆菌素模型的示范性动力学。图26A显示了示范性时间系列。图26B显示了Pi,Qi,Ri的示范性作图。
具体实施方式
种群控制是合成生物学的有力工具。在过去的十年中，已经在一些系统中实现微生物群落的控制。到目前为止，种群控制可分为两大系统。第一种是单菌株群落，表现出自限性种群密度。这些系统背后的机制利用细菌群体感应系统，如LuxI/LuxR AHL系统。当细胞生长到一定的密度并达到“群体(quorum)”时，它们就会产生一种有毒的或能诱导裂解的蛋白质。第二类可归为两菌株种群，其中种群表现出捕食者-猎物行为、振荡行为或维持两菌株之间的恒定比率。两菌株系统很像单菌株系统，依靠群体感应来驱动各菌株内的毒素或裂解蛋白的产生。例如，在捕食者-猎物模型中，只有当捕食者存在时，才使用双向群体感应系统来驱动猎物中有毒蛋白质的产生。两菌株系统的其他机制包括使用正交群体感应系统，如Lux和Las，来驱动两菌株之间的振荡裂解事件，然后在一段时间内种群密度振荡。
合成生物学的进步已经导致了原理证明细菌回路的库，可以利用的应用范围从治疗到生物生产。对于大多数应用来说，一个共同的挑战是选择性压力的存在，这种压力会导致工程菌的高突变率。一种常见策略是开发克隆技术，旨在增加单细胞中有害突变的固定时间。本文提供了一种以生态相互作用为指导的互补方法，其中设计周期性种群控制以稳定细胞内基因回路的功能。
在过去的二十年里，合成生物学家已经开发出复杂的分子回路来控制各种细胞的活性(见例如M.B.Elowitz,S.Leibler,Nature 403,335(2000)；T.S.Gardner,C.R.Cantor,J.J.Collins,Nature 403,339(2000)；J.Hasty,D.McMillen,J.J.Collins,Nature 420,224(2002)；L.You,R.S.Cox III,R.Weiss,F.H.Arnold,Nature 428,868(2004)；P.E.Purnick,R.Weiss,Nature reviews Molecular cell biology 10,410(2009)；H.H.Wang,et al.,Nature 460,894(2009)；S.D./>M.Müller,M.Wieland,M.Fussenegger,Nature 487,123(2012)；P.Siuti,J.Yazbek,T.K.Lu,Naturebiotechnology 31,448(2013)；T.H.Segall-Shapiro,E.D.Sontag,C.A.Voigt,Naturebiotechnology 36,352(2018))。随着时间的推移，这些系统不可避免地由于进化选择压力而失去功能，从而导致失控突变(参见，例如，F.K.Balagaddé，L.You，C.L.Hansen，F.H.Arnold，S.R.Quake，Science 309，137(2005))。应对这一挑战的方法包括将重组元件整合到宿主基因组中(参见，例如，M.Y.Peredelchuk，g.N.Bennett，Gene 187231(1997))，或使用质粒稳定元件(参见，例如，K.Gerdes，Nature Biotechnology 61402(1988))，合成“杀伤开关”(参见，例如，C.T.Chan，J.W.Lee，D.e.Cameron，C。J.Bashor，J.J.Collins，《自然化学生物学》12，82(2016))，或合成氨基酸(见D.J.Mandel等人，《自然》518，55(2015)；A.J.Rovner等人，《自然》518，89(2015)；N.Ostrov等人，《科学》353，819(2016)；J.W.Lee，C.T.Chan，S.Slomovic，J.J.Collins，《自然化学生物学》第1页(2018))。虽然稳定元件可延长向突变方向进展，进化仍然会不可避免地使得稳定元件失效(参见，例如，F.K.Balagaddé，L.You，C.L.Hansen，F.H.Arnold，S.R.Quake，Science 309，137(2005))。这一点在抗生素难以输送的体内应用中尤其如此(参见，例如，W.C.Ruder，T.Lu，J.J.Collins，Science3331248(2011)；M.A.Fischbach，J.A.Bluestone，W.A.Lim，Science translationalmedicine 5179ps7(2013)；D.T.Riglar，P.A.Silver，Nature Reviews Microbiology16214(2018)；M.O。Din，et al.，Nature 536，81(2016)；A.P.Teixeira，M.Fussengerger，《生物技术最新观点》47，59(2017)；B.P.Landry，J.J.Tabor，《微生物学谱》5(2017))，或质粒功能中断特别成问题的地方(见J.Shong，M.R.J.Diaz，C.H.Collins，《生物技术最新观点》23，798(2012))。本文所描述的是如何设计一个小的生态系统来稳定基因回路功能，从而在单细胞水平上补充基因工程。稳定性的组成部分与生态系统的不同亚群彼此分离，而不是将稳定元件包含在一种菌株中，这样一种菌株的失控突变就不会导致稳定的生态系统失败。
在过去的十年里，合成生物学的领域已经从单细胞工程化发展到了全种群工程化。本文描述了三菌株(或更多种)种群控制系统和方法，其可在很长时间内连续循环，这是以前没有实现的。现在，三裂解或多裂解系统提出了一种新的多种群动态控制模式(生态学中的回路而不是细胞中的回路)，为工程合成系统开辟了令人兴奋的新可能性。这些多菌株系统可以使科学家实现复杂的相互作用，这在以前通过单细胞或单种群的工程改造是不可能的。
本文公开了涉及多菌株“三裂解”或“多裂解”微生物系统的方法、材料和回路/装置/系统。一种“剪刀石头布”系统提供了对于繁复回路由于选择压力导致的质粒丢失或突变的合成生物学问题的独特的解决方案。例如，可以设计三种大肠杆菌菌株，使每种菌株都可以杀死另两种菌株，或者被另两种菌株之一杀死。由此产生的“石头剪刀布”生态学显示了微流体装置中菌株的快速循环，并导致细胞培养物中基因回路功能的稳定性显著增加。这可以通过三裂解或多裂解系统来实现，因为三裂解或多裂解循环中的后续菌株能够杀死并去除先前的菌株种群，即使该种群的成员已经使回路机制发生突变。“三裂解”或“多裂解”系统使用至少三种细菌菌株以周期性或以特定时间的方式互补地杀死每种菌株。例如，给予菌株A并使其定殖于一个区域，在一段时间内，种群可能开始发生裂解基因(或对回路功能至关重要的任何其他基因)的突变。作为另一个例子，给予菌株A并使其定殖于一个区域，在一段时间内，种群可能发生感兴趣的基因(例如，编码异源核酸和/或蛋白质的基因，例如，治疗剂或有效载荷)的突变。然后将菌株B引入生态系统，使菌株A种群从环境中去除，包括种群中的突变成员，因为它们对菌株B释放的毒素没有免疫力。使用如本文所提供的系统作为确保回路稳定性的方法在治疗、生产和传感应用领域中具有许多广泛的应用。如本文所用，“裂解”包括以损害细胞完整性的方式分解细胞的过程，以及杀死细胞的任何过程。“裂解”所包含的细胞死亡的示例性过程包括裂解基因的表达、毒素的作用等。在一些示例性实施方式中，毒素导致的细胞死亡可通过以损害其完整性的方式分解细胞的过程发生。在一些实施方式中，毒素可引发细胞死亡而不分解细胞。
本文所述的任何毒素系统可由适当的细胞死亡系统取代。在某些情况下，细胞死亡系统可能包括不同的物质对(例如，类似毒素的抗毒素)。在另一些情况下，相邻的或连续的细菌菌株的不同特性可对先前的菌株具有特异性(例如，菌株可产生对先前的菌株特异且有害的物质，但由于与先前的菌株相比的某些不同特性，其本身不会被此类物质损害)。可在本文中使用的其他示例性物质对如下：(i)抗生素肽或抗菌肽和宿主防御肽(例如，从细菌、真菌或动物来源获得)；(ii)包括噬菌体的系统，该噬菌体对循环内较早的先前菌株具有特异性，例如，由细菌依次递送噬菌体以清除先前菌株，其中噬菌体对该先前菌株具有特异性；(iii)包括递送前药的系统，该前药在被对该先前菌株特异性的细菌蛋白酶活化时杀死先前菌株；(iv)包括在循环中使用不同菌株的系统，其中每种菌株是循环中先前菌株的天然捕食者(例如，不动杆菌(捕食者)和大肠杆菌(猎物)；(v)每种菌株产生相同单一毒素的系统，但用正交群体感应来活化先前菌株的毒素表达(例如，先前菌株中此类毒素的产生被另一菌株(通过该另一菌株的群体感应分子)的存在激活，例如当添加第n菌株时在n-1菌株中启动毒素或裂解蛋白产生的正交群体系统)。此外，在一些实施方式中，除了表达的抗毒素，毒素系统也可用对一些细菌物种而非其他菌株特异性的毒素(或其他类型的细胞死亡系统，如本文所述)。在这种情况下，除了表达抗毒素，表达毒素(或其他类型的细胞死亡系统，如本文所述)的细菌可具有使其对其产生的对其他菌株特异性的毒素(或其他类型的细胞死亡系统，如本文所述)不敏感的特性。例如，可以使用不同的细菌物种，其可以是对不同物种特异性的毒素(例如，大肠杆菌然后是沙门氏菌)的靶标，其中沙门氏菌产生针对大肠杆菌特异性的抗菌肽(例如，大肠杆菌素只杀死大肠杆菌而不杀死沙门氏菌)。在这样的系统中，抗毒素的类似物是后续菌株对其表达的毒素的固有不敏感性，该毒素对先前菌株物种是特异的。类似地，细菌菌株的其他特征可以构成适当的细胞死亡系统，例如其中一种菌株是革兰氏阳性细菌，接着是革兰氏阴性细菌菌株，该革兰氏阴性细菌菌株产生对革兰氏阳性菌特异性的毒素(或其他类型的细胞死亡系统，例如本文所述的细胞死亡系统)，革兰氏阴性菌抗毒素的类似物是其不是革兰氏阳性菌的状态。在另一些情况下，与其他细菌菌株相比，细菌菌株抗毒素的类似物可能是存在或不存在某些表面受体或细胞输入/输出系统，例如，大肠杆菌菌株可能具有毒素(或其他类型的细胞死亡系统，如本文所述)毒性所必需的受体，由以下缺乏该受体的大肠杆菌菌株表达，例如表达SdaC/DcrA受体的大肠杆菌(这是大肠杆菌素V毒性所必需的)，接着是不表达SdaC/DcrA受体但表达大肠杆菌素V的大肠杆菌菌株(在这种情况下，在第二菌株中不表达SdaC/DcrA受体将与抗毒素类似。在某些实施方式中，可以组合毒素系统概念上的前述变体，使得并非本发明循环中的所有细菌菌株都需要使用相同类型的毒素系统或毒素/抗毒素对组合。应理解可使用毒素系统和细胞死亡系统的任何适当组合。
此外，三裂解或多裂解系统还在一定时间内确保经由工程菌株提供治疗蛋白质的特定递送，直到给予系统中的后续菌株为止，从而在空间和时间上分离特定治疗蛋白质的递送。否则这种能力在工程菌治疗方法中是不可用的，因为它们在疾病部位长时间定殖，无论是否有另一种菌株进入疾病环境，都有可能产生单一的治疗效果，同时，由于先前引入的菌株造成的疾病环境中资源减少，导致未来的菌株的定殖能力下降。
如本文所用，术语“共培养”或“共同培养”指在单个受体或环境(例如，单个细胞培养容器、单个细胞培养板、单个生物反应器、单个微流体装置或单个对象(例如，体内))内生长或培养两种或多种(例如，三种或多种)不同细胞类型(例如，至少两种不同细菌菌株或至少三种细菌菌株)。在某些情况下，共培养可包括同时生长或培养两种或多种(例如，三种或多种)不同细胞类型。在一些情况下，共培养可包括在一段时间内在单个接受者内生长或培养两种或多种(例如，三种或多种)不同细胞类型(例如，生长第一细胞类型，接着生长第二细胞类型，接着生长第三细胞类型，其中生长期可以重叠也可以不重叠)。在一些实施方式中，共培养可包括在一段时间内在单个接受者内生长或培养两种或多种(例如，三种或多种)不同细胞类型，其中每种不同细胞类型的生长期部分重叠。
可以采用许多不同的本领域已知方法将本文所述的任一质粒导入细菌细胞(例如革兰氏阴性细菌细胞、革兰氏阳性细菌细胞)。用于将核酸导入细胞的方法的非限制性例子包括：转化、微注射、电穿孔、细胞挤压、声致穿孔。本领域技术人员应理解，本文所述的质粒可以导入本文所提供的任何细胞。
本文采用术语“治疗”来表示延缓疾病的发病、抑制疾病、缓解疾病的影响、或延长患有疾病的对象的寿命，所述疾病例如为癌症、感染。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指至少三种细菌菌株在使用一段时间(包括短期或长期给药以及定期或持续给药)本文所述的组合物或治疗后，在其给药后能有效地产生预期的效果或生理学结果的量或浓度。例如，本发明所用的表达和/或分泌治疗剂(例如本文所述的任意治疗剂)的至少三种细菌菌株的有效量例如包括：抑制癌症(例如肿瘤细胞和/或肿瘤相关免疫细胞)生长的量、改善或延缓肿瘤生长的量、改善患有癌症或有癌症发展风险的对象的生存的量、以及改善其它癌症治疗的结果的量。作为另一实例，表达和/或分泌治疗剂(例如，本文所述的任何治疗剂)的至少三种细菌菌株的有效量可包括有利影响肿瘤微环境的量。
在整个说明书中，采用术语“对象”(和“患者”互换使用)来描述对其提供根据本发明方法的治疗的动物、人类或非人类。本发明清楚地预测了兽类用途。该术语包括但不限于鸟类、爬行动物、两栖动物、以及哺乳动物如人类、其它灵长类动物、猪、啮齿动物如小鼠和大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、马、牛、猫、狗、绵羊和山羊。优选的对象是人类、家畜和家庭宠物如猫和狗。在一些实施方式中，所述对象是人。例如，在本文所述的任一方法中，所述对象可以是至少2岁或更大(例如4岁或更大、6岁或更大、10岁或更大、13岁或更大、16岁或更大、18岁或更大、21岁或更大、25岁或更大、30岁或更大、35岁或更大、40岁或更大、45岁或更大、50岁或更大、60岁或更大、65岁或更大、70岁或更大、75岁或更大、80岁或更大、85岁或更大、90岁或更大、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16,18、20、21、24、25、27、28、30、33、35、37、39、40、42、44、45、48、50、52、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、101、102、103或104岁)。
当用在名词前时，术语“种群(population)”是指两个或更多个该特定名词。例如，短语“细菌菌株的种群”是指三种或更多种细菌菌株。
术语“癌症”是指具有不受限自主生长能力的细胞。这类细胞的例子包括具有以快速增殖的细胞生长为特征的非正常状态或状况的细胞。该术语意在包括癌性生长，例如肿瘤、致癌过程、转移组织、恶性转化细胞。
转移性肿瘤可由多种原发性肿瘤种类产生，包括但不限于前列腺、结肠、肺、乳房、骨和肝来源的肿瘤。转移瘤会发展，例如，当肿瘤细胞从原发性肿瘤上脱落、脱附或迁移时，其进入血管系统，渗透进入周围组织，并在不同的解剖学位点、例如远离原发性肿瘤的位点生长而形成肿瘤。
被为认有癌症发展风险的个体可能会从本发明受益，例如由于可以在该病症的任何证据和/或诊断出现之前就开始预防性治疗。“有风险”的个体例如包括例如通过消费(例如通过吸入和/或消化)而暴露于致癌物的个体，该致癌物的水平已在统计学上被证明在易感性个体中促进癌症。也包括因为暴露于紫外线辐射、或者因为他们的环境、职业和/或遗传而有风险的个体，以及出现癌前病症迹象如息肉的个体。类似地，处于癌症或转移瘤发展的非常早期(即，只有一个或数个异常细胞存在于个体体内或存在于个体组织中的特定位点)的个体可能会受益于这种预防性治疗。
本领域技术人员应理解，对象可由例如医学专业人员如医生或护士(或者兽医，若适合于待诊断的对象)采用本领域已知的任何方法，例如通过评估对象的病史、实施诊断测试和/或应用成像技术来诊断为患有本文所述的病症(例如癌症)或有本文所述病症(例如癌症)的风险。
本领域技术人员也应理解，无需再由诊断对象的同一个体(或为对象开了治疗的同一个体)对该对象施以治疗。治疗可由例如进行诊断和/或处方的个体、和/或任何其它个体来实施(和/或可监督实施)，所述其它个体包括对象本人(例如该对象能够自行实施时)。
本文也提供产生能表达和/或分泌治疗剂(例如本文所述的任意治疗剂)的重组细菌细胞的方法，其包括：编码在重组细菌细胞中产生的治疗剂的核酸，以及任选的质粒稳定元件，其中质粒稳定元件是毒素/抗毒素系统；以及在足以表达和/或分泌毒素、抗毒素和治疗剂的条件下培养重组细菌细胞。本文也提供产生能表达和/或分泌治疗剂(例如本文所述的任意治疗剂)的重组细菌细胞的方法，其包括：向细菌细胞中导入裂解质粒、激活子质粒、编码欲在所述重组细菌细胞中生产的治疗剂的核酸、以及质粒稳定元件；以及在足以表达和/或分泌毒素、抗毒素和治疗剂的条件下培养所述重组细菌细胞。在一些实施方式中，所述质粒稳定元件是毒素/抗毒素系统。在一些实施方式中，质粒稳定元件在裂解质粒中表达。在一些实施方式中，毒素/抗毒素系统可产生毒素/抗毒素对和另一菌株的不同抗毒素。在一些实施方式中，所述导入步骤可包括向重组细菌细胞中导入包括编码欲在重组细菌细胞中生产的治疗剂的核酸的表达载体。在一些实施方式中，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞、鼠伤寒沙门氏菌细胞或其细菌变体。在一些实施方式中，所述细菌菌株是革兰氏阴性细菌菌株，例如沙门氏菌属(Salmonella)菌株、醋酸杆菌属(Acetobacter)菌株、肠杆菌属(Enterobacter)菌株、梭杆菌属(Fusobacterium)菌株、螺杆菌属(Helicobacter)菌株、克雷伯氏菌属(Klebsiella)菌株或大肠杆菌(E.coli)菌株。在一些实施方式中，所述细菌菌株是革兰氏阳性细菌菌株，例如放线菌属(Actinomyces)菌株、芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、梭菌属(Clostridium)菌株、肠球菌属(Enterococcus)菌株或乳杆菌属(Lactobacillus)菌株。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株均为革兰氏阴性细菌菌株或均为革兰氏阳性细菌菌株。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株中的至少一种为革兰氏阴性细菌菌株。在一些实施方式中，所述至少三种细菌菌株中的至少一种为革兰氏阳性细菌菌株。
培养细菌细胞的方法是本领域熟知的，并且在实施例中提供了这类方法的示例。细菌细胞可以在体外在有利于增殖和生长的条件下维持。简而言之，细菌细胞可通过将细菌细胞(例如本文所述的任一细菌细胞)与细胞培养基接触来培养，该细胞培养基包含必需的生长因子以及支持细胞活力和生长的补充剂。
将核酸和表达载体导入细菌细胞的方法的方法是本领域已知的。例如，可采用转化将核酸导入细菌细胞。在一些实施方式中，细菌细胞可包括任何本文所述的质粒。
本文提供一种细菌菌株，其包含包括毒素/抗毒素对(例如，抗毒素对毒素有效)的毒素系统(也称为毒素/抗毒素系统)。在一些实施方式中，毒素/抗毒素系统可产生毒素/抗毒素对和另一菌株的不同抗毒素。毒素系统可以包括(例如编码)在任何适当的位置。在一些实施方式中，毒素系统可包含在细菌菌株的基因组中。在一些实施方式中，毒素系统可包含在一个或多个质粒中。在一些实施方式中，毒素系统可部分包含在基因组中且部分包含在一个或多个质粒中。在一些实施方式中，毒素系统可包含在裂解质粒中。在一些实施方式中，毒素系统可包含在激活子质粒中。在一些实施方式中，毒素系统可包含在第三质粒中。第三质粒是任何合适的质粒。在一些实施方式中，毒素系统可以在细菌菌株中经工程改造或天然存在。在一些实施方式中，毒素系统可插入细菌菌株。
毒素系统可以是任何合适的毒素系统。在一些实施方式中，毒素系统包括第一毒素/第一抗毒素对(例如，第一抗毒素对第一毒素有效)和第二抗毒素。在一些实施方式中，编码这种毒素系统的菌株不编码第二抗毒素有效对抗的第二毒素。
在一些实施方式中，毒素/抗毒素系统可以是I型毒素/抗毒素系统、II型毒素/抗毒素系统、II型毒素/抗毒素系统、IV型毒素/抗毒素系统、V型毒素/抗毒素系统或VI型毒素/抗毒素系统。I型毒素/抗毒素的非限制性例子包括Hok和Sok、Fst和RNAII、TisB和IstR、LdrB和RdlD、FlmA和FlmB、Ibs和Sib、TxpA/BrnT和RatA、SymE和SymR以及XXCV2162和ptaRNA1。II型毒素/抗毒素的非限制性例子包括CcdB和CcdA；ParE和ParD；MaxF和MazE；yafO和yafN；HicA和HicB；Kid和Kis；Zeta和Epsilon；DarT和DarG。例如，III型毒素/抗毒素系统包括有毒蛋白质和RNA抗毒素、例如ToxN和ToxI之间的相互作用。例如，IV型毒素/抗毒素系统包括抵消毒素的活性、且两种蛋白质不直接相互作用的毒素/抗毒素系统。V型毒素/抗毒素系统的一个例子是GoT和GoS。VI型毒素/抗毒素系统的一个例子是SocA和SocB。
在一些实施方式中，毒素/抗毒素系统可由细菌素/免疫蛋白质系统代替。如本文所用，术语“毒素/抗毒素”包括上文所述的毒素/抗毒素系统，包括细菌素/免疫蛋白质系统。细菌素是由细菌生产的核糖体合成肽。细菌素对生产该细菌素的细菌没有毒性，而通常对其它细菌有毒性。通常，产生细菌素的细菌也会产生一种免疫蛋白，可以抑制或防止细菌素的毒性作用。因此，细菌素和相应的免疫蛋白可以类似于本文所述的毒素/抗毒素系统的方式使用。大多数细菌素都十分强效，并且在纳米分子浓度下表现出抗微生物活性。例如，真核生产的微生物具有102至103的更低活性(Kaur和Kaur(2015)Front.Pharmacol.doi:10.3389/fphar.2015.00272)。
可包含在本文所述的任一细菌菌株、系统和方法中的细菌素的非限制性例子包括：嗜酸乳杆菌素(acidocin)、阿肽加定(actagardine)、土壤杆菌素(agrocin)、蜂房哈夫尼菌素(alveicin)、金霉素(aureocin)、金霉素A53(aureocin A53)、金霉素A70(aureocinA70)、比菲德菌素(bisin)、明串珠菌素(carnocin)、环状细菌素(carnocyclin)、干酪乳杆菌素(caseicin)、蜡状菌素(cerein)、圆形细菌素A(circularin A)、大肠杆菌素(colicin)、弯曲乳杆菌素(curvaticin)、广布肉毒杆菌素(divercin)、耐久霉素(duramycin)、肠球菌素(enterocin)、肠溶素(enterolysin)、表皮素(epidermin/gallidermin)、埃维菌素(erwiniocin)、花园霉素(gardimycin)、加萨霉素A(gassericinA)、大豆斑疹病菌素(glycinecin)、嗜盐菌素(halocin)、克雷伯菌素(klebicin)、乳酸菌素S(lactosin S)、乳球菌素(lactococcin)、乳链球菌素(lacticin)、冰冷明串珠菌素(leucoccin)、溶葡球菌酶(lysostaphin)、马其顿链球菌素(macedocin)、美杀菌素(mersacidin)、肠膜明串珠菌素(mesentericin)、小双孢菌素(microbisporicin)、小菌素S(microcin S)、变链素(mutacin)、乳酸链球菌素(nisin)、类芽孢杆菌素(paenibacillin)、浮游单孢菌素(planosporicin)、乳酸片球菌素(pediocin)、戊糖乳杆菌素(pentocin)、植物乳杆菌素(plantaricin)、肺环素(pneumocyclicin)、脓菌素(pyocin)、罗伊特菌素6(reutericin 6)、清酒乳杆菌素(sakacin)、唾液乳杆菌素(salivaricin)、枯草芽孢杆菌抗菌肽(sublancin)、枯草菌素(subtilin)、硫叶菌素(sulfolobicin)、塔斯曼尼亚欧文氏杆菌素(tasmancin)、苏云金菌素17(thuricin 17)、三叶草素(trifolitoxin)、变异菌素(variacin)、弧菌素(vibriocin)、沃氏葡萄球菌素(warnericin)、溶细胞素(cytolisin)、脓菌素S2(pyocyn S2)、大肠杆菌素A(colicin A)、大肠杆菌素E1(colicin E1)、小菌素MccE492(microcin MccE492)和华法林(warnerin)。
在一些实施方式中，所述细菌素获自革兰氏阴性细菌(例如小菌素(如大肠杆菌的小菌素V、来自枯草芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌素A(subtilosin A)、大肠杆菌素(例如由大肠杆菌生产并对某些大肠杆菌菌株有毒性的大肠杆菌素(如大肠杆菌素A、大肠杆菌素B、大肠杆菌素E1、大肠杆菌素E3、大肠杆菌素E5和大肠杆菌素E7)、泰骆素(tailocin)(例如R型脓菌素、F型脓菌素))。
在一些实施方式中，所述细菌素获自革兰氏阳性细菌(例如I类细菌素(如乳酸链球菌素、羊毛硫抗生素(lantibiotic))、II类细菌素(例如IIa乳酸片球菌素样细菌素、IIb细菌素(如乳球菌素G)、IIc环肽(如肠球菌素AS-48)、IId单肽细菌素(如金霉素A53)、III类细菌素(例如IIIa(如溶菌素(bacteriolysin))和IIIb(其通过破坏膜电位来杀灭靶标)或IV类细菌素(例如含有脂质或碳水化合物部分的复合细菌素))。
本文所述的任何细菌系统可进一步包括裂解质粒和激活子质粒。裂解质粒和激活子质粒可以各自独立地包括任何适当的组分。裂解质粒和激活子质粒可以基于任何合适的现有质粒。
裂解质粒可包括裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因。在一些实施方式中，裂解基因可操作地与可激活启动子连接。在一些实施方式中，报告基因可操作地与可激活启动子连接。在一些实施方式中，裂解基因和报告基因两者可操作地连接到可激活启动子的单个拷贝。在一些实施方式中，裂解基因和报告基因两者独立地可操作连接到可激活启动子的独立拷贝。
激活子质粒可包括激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。在一些实施方式中，激活子质粒中的可激活启动子与裂解质粒中的可激活启动子相同。在一些实施方式中，激活子质粒中的可激活启动子通过与裂解质粒中的可激活启动子相同的机制(例如，通过相同的群体感应分子，直接或间接)被激活。在一些实施方式中，激活子基因可促进群体感应分子的累积(例如，激活子基因可在群体感应分子的生物合成途径中编码蛋白质)。在一些实施方式中，激活子基因可操作地连接到可激活启动子。
群体感应分子可以是任何合适的群体感应分子。在一些实施方式中，群体感应分子可以是N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)。在一些实施方式中，群体感应分子可以是高丝氨酸内酯(HSL)或其同系物。在一些实施方式中，群体感应分子可以是来自革兰氏阳性细菌的自诱导肽(AIP)。其它群体感应分子是本领域已知的。
可激活启动子可以是任何合适的可激活启动子。在一些实施方式中，可激活启动子可由群体感应分子直接或间接地激活。如此在一些实施方式中，可以建立反馈环路，使得群体感应分子的存在驱动群体感应分子的积聚。在本文所述的任何细菌菌株的一些实施方式中，可激活启动子是AHL可激活启动子。在本文所述的任何细菌菌株的一些实施方式中，可激活的启动子是LuxR-AHL可激活启动子。在一些实施方式中，可激活启动子是RpaR-AHL可激活RpaI启动子。在一些实施方式中，可激活启动子是TraR-HSL可激活traI启动子。其它可激活启动子是本领域已知的。
裂解基因可以是任何合适的裂解基因。在本文所述的任一细菌菌株的一些实施方式中，所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。在一些实施方式中，裂解基因是colE1裂解蛋白。其它裂解基因是本领域已知的。
激活子基因可以是任何合适的激活子基因。在一些实施方式中，激活子基因是LuxI。在一些实施方式中，激活子基因是RpaI。在一些实施方式中，激活子基因是TraI。其它激活子基因是本领域已知的。
在一些实施方式中，群体感应分子是AHL，可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，且激活子基因是LuxI。
在一些实施方式中，群体感应分子是AHL，可激活启动子是RpaR-AHL可激活RpaI启动子，且激活子基因是RpaI。
在一些实施方式中，群体感应分子是HSL，可激活启动子是TraR-HSL可激活traI启动子，且激活子基因是TraI。
报告基因可以是任何合适的报告基因。在一些实施方式中，所述报告基因可以是荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体)。在一些实施方式中，报告基因可以是酶(例如，β-半乳糖苷酶)。其它报告基因是本领域已知的。
降解标签可以是任何合适的降解标签。在一些实施方式中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。其它降解标签是本领域已知的。
在一些实施方式中，细菌菌株可编码可操作连接到启动子的额外核酸和/或蛋白质(例如异源核酸和/或蛋白质(例如有效载荷))在一些实施方式中，可操作连接到启动子的额外核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)在质粒上编码。质粒可以是任何合适的质粒。在一些实施方式中，质粒是裂解质粒或激活子质粒。额外的核酸和/或蛋白质可以是任何适当的核酸和/或蛋白质。例如，额外的核酸和/或蛋白质可以是治疗剂。可以使用任何合适的启动子。在一些实施方式中，所述启动子可以是可激活启动子。在一些实施方式中，启动子可以是由群体感应分子直接或间接地激活的启动子。在一些实施方式中，所述启动子可以是本文所述的可激活启动子。在一些实施方式中，所述启动子可以是组成型启动子。许多组成型启动子是本领域已知的。治疗剂可以是任何合适的治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂可以是本文所述的任何治疗剂。例如，在一些实施方式中，治疗剂可选自下组：抑制性核酸(例如，siRNA、shRNA、miRNA或反义(例如，反义DNA、反义RNA或合成类似物))、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子，以及抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，如本文所述，可从细菌菌株分泌、外泌或以其他方式输出额外的核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)。在一些实施方式中，如本文所述，可在细菌菌株裂解后释放额外的核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)。在一些实施方式中，如本文所述，可在细菌菌株表面展示额外的核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)。
在一些实施方式中，由细菌菌株编码的额外核酸和/或蛋白质(例如，有效载荷)可作用于三裂解或多裂解系统中由先前(例如，前一种)细菌菌株编码的额外核酸和/或蛋白质(或其产物)。在一些实施方式中，第m细菌菌株(例如n种细菌菌株之一)的有效载荷通过直接或间接作用于第(m-1)细菌菌株的底物产生第m底物，并且其中第一细菌菌株的有效载荷可作用于存在于培养n种细菌菌株的环境中的底物上。
本文提供了包括本文所述的两种或多种(例如三种或多种)细菌菌株的系统。在一些实施方式中，所述的系统是多裂解系统。在一些实施方式中，该系统可包括3种细菌菌株。在一些实施方式中，此类系统可包括4、5、6、7、8、9、10或更多细菌菌株。
在一些实施方式中，当使用激活子质粒/裂解质粒系统时，系统中的每种细菌菌株的群体感应分子可以不同。在一些实施方式中，系统中细菌菌株中每一种的群体感应分子对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子可没有影响或基本没有影响。在一些实施方式中，群体感应分子在细菌菌株的每一种中可以是相同的。在一些实施方式中，每种菌株的裂解质粒可以是相同质粒的拷贝。在一些实施方式中，每种细菌菌株的激活子质粒可以是相同质粒的拷贝。在一些实施方式中，每种细菌菌株的裂解质粒可以是不同质粒。在一些实施方式中，每种细菌菌株的激活子质粒可以是不同质粒。在一些实施方式中，两种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌菌株可在代谢上竞争。在一些实施方式中，细菌菌株可以选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。在一些实施方式中，与系统中的另一菌株相比，没有任何细菌菌株具有生长优势。
在包括一种以上细菌菌株的一些系统中，所有细菌菌株可编码额外的核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)。在包括一种以上细菌菌株的一些系统中，没有细菌菌株可编码额外的核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)。在包括一种以上细菌菌株的一些系统中，一些细菌菌株可编码额外的核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)，而另一些不能。在包括编码额外核酸和/或蛋白质(例如，异源核酸和/或蛋白质)的多种细菌菌株的系统中，独立地选择每种这样的细菌菌株编码的额外核酸和/或蛋白质(例如，所有这样的细菌菌株可以编码不同的额外核酸和/或蛋白质，所有这样的细菌菌株可以编码相同的额外核酸和/或蛋白质，或者一些这样的细菌菌株可以编码相同的额外核酸和/或蛋白质，另一些则编码一种或多种不同的额外核酸和/或蛋白质)。
多裂解系统可包括适当数量的菌株。一个三裂解系统可以包括三种菌株(这也可以被称为“石头剪刀布”(RPS)生态学)。在这样的系统中，每种菌株可以编码一对毒素/抗毒素和一第二抗毒素，使得该菌株可以在循环中杀死先前的菌株(例如，由先前菌株编码的第二抗毒素对该菌株的毒素无效，所述菌株编码的第二抗毒素对先前菌株的毒素有效)并在一个循环内被后一菌株杀死(例如，所述菌株编码的第二抗毒素对后一菌株的毒素无效，后续菌株编码的第二抗毒素对该菌株的第二毒素有效。示例性的三裂解系统示于图12B。
在一些实施方式中，多裂解系统可包括至少三种菌株(例如，至少四种、五种、六种或更多种菌株)。在一些实施方式中，多裂解系统可具有n种菌株，包括第一菌株、第二菌株和第n菌株。在一些这样的情况下，基于菌株编号，第二菌株到第n菌株可以各自具有先前的菌株(例如，第二菌株的先前菌株是第一菌株)。在一些这样的情况下，第二菌株到第n-1菌株中的每一种都具有后续菌株(例如，第n-1菌株的后续菌株是第n菌株)。在一些这样的情况下，第二菌株到第n菌株中的每一种都编码对先前菌株有效的第一毒素、对第一毒素的第一抗毒素，和对先前菌株产生的毒素的第二抗毒素。在一些这样的情况下，第一菌株编码对第n菌株有效的第一毒素、对第一毒素的第一抗毒素，和对第n菌株产生的毒素的第二抗毒素。n值可以是任何合适的值。在一些实施方式中，n可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。
本文也提供共培养至少三种(例如至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种)细菌菌株(例如本文所述的任意细菌菌株)的方法。在一些实施方式中，共培养可包括对一培养物最初以一接种比率接种至少两种(例如至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种)细菌菌株(例如本文所述的任意细菌菌株)。接种的比率可以是任何合适比率。在一些实施方式中，至少一种细菌菌株与至少一种其他细菌菌株的接种比率可为1:1(例如，对于三种菌株，比率可为1:1:1)。在一些实施方式中，至少一种细菌菌株与至少一种其他细菌菌株的接种比率可为1:2(例如，对于三种菌株，比率可为1:2:m,2:1:m,1:m:2,2:m:1,m:1:2,m:2:1)。在一些实施方式中，至少一种细菌菌株与至少一种其他细菌菌株的接种比率可为1:5(例如，对于三种菌株，比率可为1:5:m,5:1:m,1:m:5,5:m:1,m:1:5,m:5:1)。在一些实施方式中，至少一种细菌菌株与至少一种其他细菌菌株的接种比率可为1:10(例如，对于三种菌株，比率可为1:10:m,10:1:m,1:m:10,10:m:1,m:1:10,m:10:1)。m值可以是任何合适的值。例如，在一些实施方式中，m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
在一些实施方式中，共培养可依次包括开始与第一细菌菌株的培养，培养一段时间，添加第二细菌菌株，并培养一段时间。如本文所用，依次可包括培养两种或更多菌株的特定顺序。在一些实施方式中，依次可以包括完全重叠的时段(例如，生长期)、部分重叠的时段和/或不重叠的时段。在一些实施方式中，一个或多个生长期可以重叠，而相同系统中的其他生长期可以不重叠。在一些实施方式中，给定系统中的所有生长期可以重叠或不重叠。在一些实施方式中，一种或多种额外细菌菌株可以与第二细菌菌株相同的方式依次培养。这样，可以在部分重叠的生长期内进行依次共培养。在一些实施方式中，可将第一细菌菌株添加到含有第二细菌菌株的培养物中并培养一段时间，并且任选地以交替方式由第二细菌菌株和第一细菌菌株接替。这样，可以在部分重叠的生长期内进行交替共培养。细菌菌株的添加可以在任何适当的接种比率下进行，其中接种比率基于培养物中细胞的种群。例如，在一些实施方式中，接种比率可以是本文所述的任何接种比率。
在一些实施方式中，共培养可依次包括开始与第一细菌菌株的培养，培养一段时间，添加第二细菌菌株，并培养一段时间，添加第三细菌菌株，并培养一段时间。在一些实施方式中，一种或多种额外细菌菌株可以与第二细菌菌株相同的方式依次培养。这样，可以在部分重叠的生长期内进行依次共培养。在一些实施方式中，可通过将第一细菌菌株添加到含有第三细菌菌株(或一种或多种额外细菌菌株)的培养物中，培养一段时间，然后依次添加和培养第二细菌菌株、第三细菌菌株，以及一种或多种额外细菌菌株，其顺序与最初的相同，来执行具有部分重叠生长期的循环共培养。细菌菌株的添加可以在任何适当的接种比率下进行，其中接种比率基于培养物中细胞的数量。例如，在一些实施方式中，接种比率可以是本文所述的任何接种比率。
在一些实施方式中，添加到培养物中的细菌菌株可以减少或消除培养物中存在的一种或多种细菌菌株的种群。例如，在一些实施方式中，第二细菌菌株可以减少第一细菌培养物的种群或消除第一细菌培养物。
在一些实施方式中，本文所述的任一细菌菌株的培养时间段(例如生长期)可以为1小时至35天(例如1小时至30天、1小时至28天、1小时至26天、1小时至25天、1小时至24天、1小时至22天、1小时至20天、1小时至18天、1小时至16天、1小时至14天、1小时至12天、1小时至10天、1小时至8天、1小时至7天、1小时至6天、1小时至5天、1小时至4天、1小时至72小时、1小时至70小时、1小时至68小时、1小时至66小时1小时至64小时、1小时至62小时、1小时至60小时、1小时至58小时、1小时至56小时、1小时至54小时、1小时至52小时、1小时至50小时、1小时至48小时、1小时至46小时、1小时至44小时、1小时至40小时、1小时至38小时、1小时至36小时、1小时至34小时、1小时至32小时、1小时至30小时、1小时至28小时、1小时至26小时、1小时至24小时、1小时至22小时、1小时至20小时、1小时至18小时、1小时至16小时、1小时至14小时、1小时至12小时、1小时至10小时、1小时至8小时、1小时至6小时、1小时至4小时、1小时至2小时、2小时至35天、2小时至30天、2小时至28天、2小时至26天、2小时至25天、2小时至24天、2小时至22天、2小时至20天、2小时至18天、2小时至16天、2小时至14天、2小时至12天、2小时至10天、2小时至8天、2小时至7天、2小时至6天、2小时至5天、2小时至4天、2小时至72小时、2小时至70小时、2小时至68小时、2小时至66小时2小时至64小时、2小时至62小时、2小时至60小时、2小时至58小时、2小时至56小时、2小时至54小时、2小时至52小时、2小时至50小时、2小时至48小时、2小时至46小时、2小时至44小时、2小时至40小时、2小时至38小时、2小时至36小时、2小时至34小时、2小时至32小时、2小时至30小时、2小时至28小时、2小时至26小时、2小时至24小时、2小时至22小时、2小时至20小时、2小时至18小时、2小时至16小时、2小时至14小时、2小时至12小时、2小时至10小时、2小时至8小时、2小时至6小时、2小时至4小时、4小时至35天、4小时至30天、4小时至28天、4小时至26天、4小时至25天、4小时至24天、4小时至22天、4小时至20天、4小时至18天、4小时至16天、4小时至14天、4小时至12天、4小时至10天、4小时至8天、4小时至7天、4小时至6天、4小时至5天、4小时至4天、4小时至74小时、4小时至70小时、4小时至68小时、4小时至66小时4小时至64小时、4小时至64小时、4小时至60小时、4小时至58小时、4小时至56小时、4小时至54小时、4小时至54小时、4小时至50小时、4小时至48小时、4小时至46小时、4小时至44小时、4小时至40小时、4小时至38小时、4小时至36小时、4小时至34小时、4小时至34小时、4小时至30小时、4小时至28小时、4小时至26小时、4小时至24小时、4小时至24小时、4小时至20小时、4小时至18小时、4小时至16小时、4小时至14小时、4小时至14小时、4小时至10小时、4小时至8小时、4小时至6小时、6小时至35天、6小时至30天、6小时至28天、6小时至26天、6小时至25天、6小时至24天、6小时至22天、6小时至20天、6小时至18天、6小时至16天、6小时至14天、6小时至12天、6小时至10天、6小时至8天、6小时至7天、6小时至6天、6小时至5天、6小时至4天、6小时至76小时、6小时至70小时、6小时至68小时、6小时至66小时6小时至64小时、6小时至66小时、6小时至60小时、6小时至58小时、6小时至56小时、6小时至54小时、6小时至56小时、6小时至50小时、6小时至48小时、6小时至46小时、6小时至44小时、6小时至40小时、6小时至38小时、6小时至36小时、6小时至34小时、6小时至36小时、6小时至30小时、6小时至28小时、6小时至26小时、6小时至24小时、6小时至26小时、6小时至20小时、6小时至18小时、6小时至16小时、6小时至14小时、6小时至16小时、6小时至10小时、6小时至8小时、12小时至35天、12小时至30天、12小时至28天、12小时至26天、12小时至25天、12小时至24天、12小时至22天、12小时至20天、12小时至18天、12小时至16天、12小时至14天、12小时至12天、12小时至10天、12小时至8天、12小时至7天、12小时至6天、12小时至5天、12小时至4天、12小时至72小时、12小时至70小时、12小时至68小时、12小时至66小时12小时至64小时、12小时至62小时、12小时至60小时、12小时至58小时、12小时至56小时、12小时至54小时、12小时至512小时、12小时至50小时、12小时至48小时、12小时至46小时、12小时至44小时、12小时至40小时、12小时至38小时、12小时至36小时、12小时至34小时、12小时至312小时、12小时至30小时、12小时至28小时、12小时至26小时、12小时至24小时、12小时至22小时、12小时至20小时、12小时至18小时、12小时至16小时、12小时至14小时、1天至35天、1天至30天、1天至28天、1天至26天、1天至25天、1天至24天、1天至22天、1天至20天、1天至18天、1天至16天、1天至14天、1天至12天、1天至10天、1天至8天、1天至6天、1天至5天、1天至4天、1天至3天、1天至2天、2天至35天、2天至30天、2天至28天、2天至26天、2天至25天、2天至24天、2天至22天、2天至20天、2天至18天、2天至16天、2天至15天、2天至14天、2天至12天、2天至10天、2天至8天、2天至6天、2天至4天、2天至3天、4天至35天、4天至30天、4天至28天、4天至26天、4天至25天、4天至24天、4天至22天、4天至20天、4天至18天、4天至16天、4天至15天、4天至14天、4天至12天、4天至10天、4天至8天、4天至6天、7天至35天、7天至30天、7天至28天、7天至26天、7天至25天、7天至24天、7天至22天、7天至20天、7天至18天、7天至16天、7天至15天、7天至14天、7天至12天、7天至10天、7天至8天、14天至35天、14天至30天、14天至28天、14天至26天、14天至25天、14天至24天、14天至22天、14天至20天、14天至18天、14天至16天、14天至15天、21天至35天、21天至30天、21天至28天、21天至26天、21天至25天、21天至24天、21天至22天、28天至35天或28天至30天；1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、21天、22天、24天、25天、26天、28天、30天、32天、34天或35天)。
循环的长度可以用适当的方法来调节。例如，循环的长度可通过采用以不同的OD裂解的菌株来调节。细胞裂解也可通过调制群体感应组件的内部回路来调节，例如调制AHL降解、调制蛋白质降解的裂解、调制启动子以增加或减少参与群体感应回路的分子的表达。
可采用各种本领域已知方法来确定是否已到达群体阈值。例如，可采用常规蛋白质定量方法测定培养基中AHL的表达水平来测定群体阈值。群体阈值也可以采用由luxI启动子驱动的报告蛋白来测定。在一些实施方式中，报告蛋白是荧光蛋白、生物发光荧光素酶报告物、分泌的血液/血清或尿液报告物(例如分泌的碱性磷酸酶、可溶性肽、高斯荧光素酶)。
本领域已知各种方法来确定和/或测定细胞裂解。例如，细胞裂解可以用显微镜通过各种波长(包括600nm的光)的透射光和/或吸收的强度变化在表型上确定。在一些实施方式中，细菌细胞裂解是同步的。在其它实施方式中，细菌细胞裂解是不同步的。同步裂解可在读板仪或其它定量设备中通过600nm处的吸收光密度(OD600)来测定。
在本文所述的任一细菌菌株的一些实施方式中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸(例如siRNA、shRNA、miRNA或反义核酸)、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素(例如白喉毒素、白树毒素、炭疽毒素)、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。细胞因子的非限制性实例包括非格司亭、白细胞介素、干扰素(例如IFNb-1b)和转化生长因子β。酶的非限制性实例包括天冬酰胺酶、葡糖苷酶、β-葡萄糖脑苷酶、依洛硫酸酯酶(elosulfase)α、阿斯福酶(asfotase)α和塞贝脂酶(sebelipase)α。肽激素的非限制性实例包括美曲普汀(metreleptin)、甲状旁腺激素和胰岛素。融合蛋白的非限制性实例包括阿必鲁肽(Albiglutide)、度拉鲁肽、凝血因子IX Fc融合物和凝血因子VIII Fc融合物。凝血因子的非限制性实例包括凝血因子IX、凝血因子VIII和凝血因子XIII A亚单位。抗体或其抗原结合片段的非限制性实例包括贝利木单抗(belimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、贝拉西普(belatacept)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿柏西普(afilbercept)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、高利单抗(golimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、斯妥昔单抗(siltuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿达木单抗(adalimumab)、维多丽珠单抗(vedolizumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、尼韦单抗(nivolumab)、赛库克单抗(secukinumab)、定妥昔单抗(dinutuximab)，阿利罗单抗(alirocumab)、依伐单抗(evolocumab)、伊达鲁单抗(idarucizumab)、美泊利珠单抗(mepolizumab)、达拉图单抗(daratumumab)、奈西妥单抗(necitumumab)、埃洛妥单抗(elotuzumab,)、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、伊克珠单抗(ixekizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿替唑利珠单抗(atezolizumab)、达利珠单抗(daclizumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和依那西普(etanercept)。在一些实施方式中，治疗剂可以是C1酯酶抑制剂。在一些实施方式中，治疗剂可以是血管性血友病因子。
本文提供包含如本文所述的任何一种或多种细菌菌株的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物配制为用于原位药物递送。
本文也提供可包括共培养至少两种(例如至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种)本文所述细菌菌株的方法。
本文还提供了包含本文所述的一个或多个系统的药物系统。
本文还提供了包含本文所述的一个或多个系统的周期性药物系统。
本文还提供了包含本文所述的一种或多种细菌菌株的试剂盒。
本文还提供了包含本文所述的一种或系统的试剂盒。
本文提供治疗对象中的疾病(例如癌症、感染性疾病、自身免疫病、遗传疾病、代谢疾病)的方法。示例性方法包括向需要治疗的对象给予治疗有效量的本文所述细菌菌株中的任何一种或多种、或本文所述药物组合物中的任何一种或多种、或本文所述系统中的任何一种或多种，从而治疗对象中的疾病。例如，本文提供一种治疗对象疾病的方法，其包括向对象给予治疗有效量的n种细菌菌株中的每一种，所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株。第二菌株到第n菌株中的每一种都可以具有先前的细菌菌株。n值可以是至少3。n种菌株中的每一菌株可包括如本文所述的毒素系统。在某些情况下，第二到第n菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的菌株有效。第一菌株的毒素系统可产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n菌株有效。在一些实施方式中，n种菌株中的一种或多种可包括本文所述的裂解质粒和/或本文所述的激活子质粒。n值可以是任何合适的值。在一些实施方式中，n可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。
本文提供治疗对象中的疾病(例如癌症、感染性疾病、自身免疫病、遗传疾病、代谢疾病)的方法。示例性方法包括向需要治疗的对象给予治疗有效量的本文所述药物组合物，其包含本文所述细菌菌株中的任何一种或多种、或本文所述药物组合物中的任何一种或多种、或本文所述系统中的任何一种或多种，从而治疗对象中的疾病。例如，本文提供一种治疗对象疾病的方法，其包括向对象给予治疗有效量的m种药物组合物，其每一种包含n种细菌菌株中的一种或多种，所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株。第二菌株到第n菌株中的每一种都可以具有先前的细菌菌株。n值可以是至少3。m值可以是至少3。m的值可以等于n的值。n种菌株中的每种菌株可以包括如本文所述的毒素系统。在某些情况下，第二到第n菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的菌株有效。第一菌株的毒素系统可产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n菌株有效。在一些实施方式中，一种或多种n菌株可包括本文所述的裂解质粒和/或本文所述的激活子质粒。n值可以是任何合适的值。在一些实施方式中，n可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。m值可以是任何合适的值。在一些实施方式中，m可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。
给药可包括任何合适时间表。例如，给药可包括如本文所述对共培养有效的时间表。在一些实施方式中，如本文所述，给药可包括对包括部分重叠生长期的共培养有效的时间表。在本文所述的方法中，给药可包括向对象给予至少两种(例如，至少三种)细菌菌株。
本文还提供治疗对象的疾病(例如，癌症、传染病、自身免疫病、遗传疾病、代谢疾病)的方法，其包括在第一时间段内向需要治疗的对象给予治疗有效量的第一细菌菌株(例如，本文所述的任何细菌菌株)，在第二时间段内给予治疗有效量的第二细菌菌株(例如，本文所述的任何细菌菌株)，和在第三时间段内给予治疗有效量的第三细菌菌株(例如本文所述的任何细菌菌株)。
在本文所述的任一方法的一些实施方式中，n种细菌菌株(例如第一、第二和第三细菌菌株)是不同的细菌菌株，各自表达和/或分泌不同的治疗剂(例如本文所述的任意治疗剂)。在本文所述的任一方法的一些实施方式中，n种细菌菌株(例如第一、第二和第三细菌菌株)是不同的细菌菌株，各自表达和/或分泌相同的治疗剂(例如本文所述的任意治疗剂)。在本文所述的任何方法的一些实施方式中，n种细菌菌株(例如，第一、第二和第三细菌菌株)是不同的细菌菌株，它们可能或可能不各自表达和/或分泌相同或不同的治疗剂(例如，本文所述的任何治疗剂)(例如，两种菌株可以表达和/或分泌一种治疗剂，第三菌株可以表达和/或分泌不同的治疗剂)。n值可以是任何合适的值。在一些实施方式中，n可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。
在本文所述的任一方法的一些实施方式中，n种细菌菌株(例如第一、第二和第三细菌菌株)不表达或分泌治疗剂(例如本文所述的任意治疗剂)。在本文所述的任一方法的一些实施方式中，n种细菌菌株(例如第一、第二和第三细菌菌株)产生细菌素(例如本文所述的任意细菌素)。n值可以是任何合适的值。在一些实施方式中，n可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，给药包括治疗循环，并且治疗循环至少重复两次(例如，至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次，至少12次)。
在本文描述的任何方法的一些实施方式中，第一、第二和第三时间段可以是1小时到35天之间(例如，1小时到28天之间、1小时到21天之间、1小时到14天之间、1小时到7天之间、1小时到5天之间、1小时到3天之间、1小时到2天之间、1小时到2天之间、1小时到1天之间、1天到35天之间、1天到28天之间、1天到21天之间、1天到14天之间、1天到7天之间、1天到5天之间、1天到3天之间、1天到2天之间、7天到35天之间、7天到28天之间、7天到14天之间、7天到10天之间、14天到35天之间、14天到28天之间、14天到21天之间、21天到35天之间、21天到28天之间、21天到24天或28天到35天)。
在本文描述的任何方法的一些方面中，第一、第二和第三时间段在长度上相似，例如，相同的时间长度。
在本文描述的任何方法的一些方面中，第一、第二和第三时间段在长度上不相同。在某些方面，第一和第三时间段是相同的。在某些方面，第一和第三时间段是不同的。在某些方面，第一和第二时间段是相同的。在某些方面，第一和第二时间段是不同的。在某些方面，第二和第三时间段是相同的。在某些方面，第二和第三时间段是不同的。
在本文描述的任何方法的一些实施方式中，生长期可以是1小时到35天之间(例如，1小时到28天之间、1小时到21天之间、1小时到14天之间、1小时到7天之间、1小时到5天之间、1小时到3天之间、1小时到2天之间、1小时到2天之间、1小时到1天之间、1天到35天之间、1天到28天之间、1天到21天之间、1天到14天之间、1天到7天之间、1天到5天之间、1天到3天之间、1天到2天之间、7天到35天之间、7天到28天之间、7天到14天之间、7天到10天之间、14天到35天之间、14天到28天之间、14天到21天之间、21天到35天之间、21天到28天之间、21天到24天或28天到35天)。
在本文所描述的任何方法的一些方面中，n种细菌菌株中每一种的生长期大致相同。在本文所描述的任何方法的一些实施方式中，n种细菌菌株中的一种或多种的生长期不同于其他细菌菌株中的一种或多种。
本文所述的任何方法的一些实施方式中，给药包括将所述至少三种细菌菌株分别依次给予所述对象。在本文所述的任何方法的一些实施方式中，给药包括将n种细菌菌株中的每一种依次给予所述对象。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，给药包括同时给予所述至少三种细菌菌株的每一种。在本文所述的任何方法的一些实施方式中，给药包括同时给予所述n种细菌菌株的每一种。
在本文所述的任一方法的一些实施方式中，所述对象患有癌症或感染。
在所述对象患有癌症的一些实施方式中，所述癌症可以是例如原发性肿瘤或转移性肿瘤。
在一些实施方式中，所述癌症是非T细胞浸润性肿瘤。
在本文所述的任一方法的一些实施方式中，所述癌症选自下组：成胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌和前列腺癌。本发明考虑同时进行多个癌症种类的治疗，并且将其包含在本发明中。
在一些情况下，所述患有癌症的对象可以先前接受过癌症治疗(例如本文所述的任意癌症的治疗)。
在本文所述的任一方法的一些实施方式中，所述对象患有感染(例如感染性疾病)。在本文所述的任一方法的一些实施方式中，所述感染由选自下组的感染物引起：空肠弯曲菌(Camphylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和沙门氏菌(Salmonella)。
在一些实施方式中，首先将菌株A或第一菌株引入培养或定殖部位一段特定时间，以递送其有效负载的治疗性蛋白质。然后可以引入第二菌株，菌株B，产生毒素杀死并去除菌株A，然后菌株B可以在特定时间段内输送有效负载的治疗性蛋白。然后可以引入第三菌株，菌株C，杀死并去除菌株B，然后菌株C可以在特定时间段内输送有效负载的治疗性蛋白。然后可重新引入菌株A以重复循环。该系统不限于三种菌株系统，它可能由三种以上的菌株组成，其中每种菌株产生一种毒素，能够杀死系统中另一种没有抗毒素的菌株，从而形成一个循环系统(由四种、五种、六种或更多种菌株组成)。
给药可以每周进行例如至少一次(例如至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次或至少14次)。也考虑按月进行治疗，例如每月给药至少一次、持续至少1个月(例如至少两个月、三个月、四个月、五个月或六个月、或者更多个月，例如12个月或更多个月)，以及按年进行治疗(例如每年给药一次、持续一年或更多年)。给药可通过任何本领域已知的方式，例如静脉内、皮下、腹膜内、口服、局部、和/或直肠给药、或者已知给药方法的任意组合。
如本文所用，治疗包括“预防性治疗”，其是指在有疾病(例如癌症、感染)发展风险的对象中减少疾病(例如癌症、感染)的发病率或者防止疾病(例如癌症、感染)的迹象或症状(或减少其风险)。术语“治疗性治疗”是指减少疾病的迹象或症状，例如减少癌症进展、减少癌症的严重度和/或患有癌症的对象中的复发、减少对象中的炎症、减少对象中感染的传播。
本文所述的复发可用于癌症治疗。癌症的非限制性例子包括：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发源的癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经细胞瘤、纤维性组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌伴隐匿性原发性、涉及NUT基因的中线状癌、口癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体癌、胸膜肺胚细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴癌、畸形肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和威尔姆氏瘤。
例如，本文所述的任一方法可用于治疗选自下组的癌症：成胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌和前列腺癌。
术语“治疗剂”是指牵涉到给予对象已知可用于疾病(例如癌症、感染)治疗的治疗剂的治疗性治疗。例如，癌症治疗剂可减小肿瘤尺寸或肿瘤生长速率。在另一种情况下，癌症治疗剂可影响肿瘤微环境。
可在本文所述的任一细菌菌株中表达和/或分泌的治疗剂的非限制性例子包括：抑制性核酸(例如微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反义核酸)、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素(例如白喉毒素、白树毒素、炭疽毒素)、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，所述治疗剂是治疗性多肽。在一些情况下，所述治疗性多肽包括一个或多个(例如2、3、4、5或6个)多肽。在一些情况下，所述治疗性多肽通过接头(例如可切割接头、不可切割接头)与毒素、放射性同位素或药物偶联。
在一些情况下，所述治疗剂对靶细胞有细胞毒性或细胞抑制性。
短语“对靶细胞有细胞毒性”是指在靶细胞的死亡(例如坏死或凋亡)中直接或间接地起到诱导作用。例如，靶细胞可以是癌症细胞(例如癌细胞或肿瘤相关免疫细胞(如巨噬细胞)或被感染的细胞。
短语“对靶细胞有细胞抑制性”是指体内或体外的靶细胞增殖(细胞分裂)的直接或间接的减少。当治疗剂对靶细胞有细胞抑制性时，治疗剂可以例如直接或间接地导致靶细胞的细胞周期阻滞。在一些实施方式中，有细胞抑制性的治疗剂可减少细胞种群中处于S期的靶细胞的数量(相比于与治疗剂接触之间的细胞种群中处于S期的靶细胞的数量)。在一些情况下，有细胞抑制性的治疗剂可使处于S期的靶细胞的百分数相比于与治疗剂接触之间的细胞种群中处于S期的靶细胞的百分数减少至少(例如至少40％、至少60％、至少80％)。
本文也提供包含至少三种(例如3、4、5、6、7、8、9或10种)本文所述的任意细菌菌株的药物组合物，所述细菌菌株表达和/或分泌至少一种本文所述的任意治疗剂。
所述药物组合物可以本领域已知的任意方式配制。所述药物组合物配制为与其预期的给药途径(例如静脉内、皮下、腹膜内、直肠、局部或口服)相容。在一些实施方式中，所述药物组合物直接给药至疾病或患病组织的位点，例如给药至肿瘤、给药至被感染的组织。在一些实施方式中，给药是靶向性的，例如所述药物组合物包含靶向性部分(例如靶向性蛋白质或肽)。
在一些实施方式中，所述药物组合物可包含药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲生理盐水)。药物组合物可包括任何适当的额外试剂，例如赋形剂、填料、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂、增溶剂、填充剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂、佐剂等，如本领域所知。制剂可单次或多次给药，取决于例如：对象所需要并且可耐受的剂量(即每毫升的细菌细胞数量)和频率。有效治疗对象所需要的剂量、频率和时机可受到对象的年龄、对象的总体健康状况、疾病的严重度、先前的治疗、以及并存病(例如糖尿病、心血管疾病)的存在的影响。该制剂应提供足量的活性剂来有效地治疗、预防或缓解病症、疾病或症状。组合物的毒性和治疗功效可采用常规方法在细胞培养物、临床前模型(例如小鼠、大鼠或猴)和人中确定。由体外试验和临床前研究获得的数据可用来配制合适剂量的本文所述的任一组合物(例如本文所述的药物组合物)。
本文所述的任一组合物的功效可采用本领域已知的方法来确定，例如通过观察疾病的临床迹象(例如肿瘤尺寸、转移的存在)来确定。
本文也提供包含至少三种本文所述的任意细菌菌株的试剂盒，所述细菌菌株表达和/或分泌至少一种本文所述的任意治疗剂。在一些情况下，所述试剂盒可包含用于实施本文所述的任意方法的说明书。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含至少一剂本文所述的任意药物组合物。本文所述的试剂盒不限定于此；其它改变对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。
材料和方法
菌株和质粒。
分别含ColE1起始质粒和p15A起始质粒的质粒的菌株作为回路菌株在含有50μgml-1卡那霉素和34μg ml-1氯霉素的溶菌肉汤(LB)培养基中培养，加0.2％葡萄糖，或对于非裂解大肠杆菌素菌株，50μg ml-1大观霉素的培养基在37℃振荡培养箱中培养。示范性毒素显示于图4和图22。示范性菌株显示于图5和图23。该研究中使用的示范性质粒如图11和图21中所述。大肠杆菌素E3和E5基因采用基因区块重叠PCR(IDT)进行组装。大肠杆菌素V基因是从野生大肠杆菌素V大肠杆菌(从Joe Pogliano博士和Roberto Kolter博士那里获得)的PCR off产物中获得的。所有质粒均通过Gibson组装构建，然后转化为DH5α(Thermofisher)化学感受态的大肠杆菌。在转化到大肠杆菌MG1655菌株之前，通过Sanger测序验证质粒。
为了进行毒素共培养实验，将野生型MG1655大肠杆菌菌株从-80°甘油储液中接种到2ml LB中，并在37℃振荡培养箱中培养。在细胞达到0.2-0.4之间的OD600后，将5μl培养物添加到标准Falcon组织培养96孔平底板中的200μl新鲜培养基中。此外，向每个孔中添加5μl纯化的大肠杆菌素裂解物。培养物在37°振摇生长19小时，每5分钟用Tecan InfiniteM200 Pro测量600nm处吸光度所示的光密度。5分钟测量一次荧光，分别在485nm激发520nm发射，433nm激发475nm发射和590nm激发630nm发射下测量GFP、CFP和RFP。
微流体和显微镜
本研究中使用的微流体装置和实验制备方案与其他地方报道的类似(例如，见Prindle等，A sensing array of radically coupled genetic biopixels(一种由基因生物样品组成的传感阵列)Nature，481(7379)：39–442012)。所有的微流体实验都是在侧阱阵列装置中进行的，该装置的细菌生长室面积约为100x80μm，高度约为1.2μm。将适当的大肠杆菌菌株从-80°甘油原液中接种到5ml LB中，加入适当的抗生素。为了裂解菌株，向培养基中添加0.2％的葡萄糖。在振荡培养箱中37°生长8-12小时后，将培养物稀释100倍至25ml相同培养基中，置于50ml锥形烧瓶中，并生长至OD在0.4-0.6之间(使用Plastibrand 1.5mL试管)。一旦达到上述OD，5000g离心浓缩细胞1分钟，并将其重新悬浮在含有0.75％吐温-20和适当抗生素的10μl LB培养基中。该浓缩物液用于单应变试验的细胞真空上样。对于多菌株实验，在离心之前，首先将培养物标准化为相同的OD600，并在2菌株实验中以1:1、1:2、4:6或1:5的比率混合，或在真空上样前以1:1:1的比率混合用于3菌株实验。进入微流体装置的介质流控制是重力驱动的。芯片温度保持在37℃，用有机玻璃温箱容纳整个显微镜。
对于连续上样实验，按照2菌株实验所述制备两个初始菌株。将后继菌株从-80°甘油储液中接种到添加0.2％葡萄糖和适当的抗生素的5ml LB中。在振荡培养箱中37°生长8-12小时后，将培养物稀释100倍至100ml相同培养基中，置于500ml锥形烧瓶中，并生长至OD在0.1-0.4之间(使用Plastibrand 1.5mL试管)。一旦达到上述OD，5000g离心浓缩细胞5分钟，并将其重新悬浮在含有0.075％吐温-20和适当抗生素的1ml LB培养基中。然后将细胞加入微流体装置的第二或第三入口，并通过轻弹加样将其引入阱中。轻弹加样是通过轻弹通向微流体装置入口的Tygon管完成的，目的是干扰装置内的层流，使细胞被冲洗到微流体的阱中。微流体装置的介质流动控制是重力驱动的。在实验期间，使用含有34μg ml-1氯霉素的LB培养基。芯片温度保持在37℃，用有机玻璃温箱容纳整个显微镜。
使用带相差成像的尼康(Nikon)Eclipse TI落射荧光显微镜。图像采集是用Photometrics CoolSnap冷却CCD相机和Nikon Elements软件完成的。对于10倍放大实验，相差图像是在50-100μs曝光时间下拍摄的。分别对于gfp、rfp和cfp，荧光暴露时间分别为30％强度下100μs、30％强度下300μs和30％强度下100μs。在实验期间(1-4天)，每3分钟或每6分钟拍摄一次图像。对于60倍放大实验，相差图像是在20-50μs曝光时间下拍摄的。分别对于gfp、rfp和cfp，荧光暴露时间分别为30％强度下50μs、30％强度下200μs和30％强度下50μs。在实验期间(1-4天)，每3分钟或每6分钟拍摄一次图像。对于依次上样实验，菌株上样期间暂停拍摄。
RPS菌株的种群估计和生长速率。
共培养混合物中大种群份额的种群估计按以下方式进行。来自优势菌株的荧光通道图像堆栈在ImageJ中转换为8位(处理>二进制>生成二进制(make binary))。然后取细胞孵育区域的Z轴剖面图(图像>堆栈Z轴概貌图)，并通过除以最大值将值标准化为1。以优势菌株的荧光时间系列轨迹的最大值作为100％优势菌株单独培养物的累积荧光标准。通过从1中扣除标准化优势菌株值来估计易感菌株份额。然后将这些值标准化为对应于大约70％的优势菌株和30％的易感菌株的初始细胞份额。使用ImageJ细胞计数插件手动计算初始细胞份额。
为了进行生长速率实验，将适当的大肠杆菌菌株从-80°甘油储液中接种到2ml LB和适当的抗生素中，并在37℃振摇培养箱中培养。在细胞达到0.1的OD600后，将1ml培养物添加到含有25ml新鲜培养基和适当抗生素的125ml锥形瓶中，并在270rpm振摇。一旦样品达到0.1的OD600，每10分钟采集一次样品，并使用DU 740Life Science紫外/可见光分光光度计在OD600处进行测量。
传代和平板阅读器实验
为了进行传代实验，将适当的大肠杆菌菌株从-80°甘油储液中接种到含有0.2％葡萄糖和适当的抗生素的2ml LB中，并在37℃振摇培养箱中培养。在0.2OD600下，将10μl培养物添加到标准Falcon组织培养96孔平底板中的190μl新鲜培养基中。细胞在TecanInfinte M200 Pro中37°振摇培养，每次传代培养12小时，每10分钟测量一次600nm吸光度下的光密度。10分钟测量一次荧光，分别在485nm激发520nm发射，433nm激发475nm发射和590nm激发630nm发射下测量GFP、CFP和RFP。12小时后，将每个样品稀释到OD600 0.2，并将10μl的每个样品传代至新培养板中含有适当抗生素的190μl新鲜培养基中。对于循环菌株，如前所述，将适当的大肠杆菌菌株从-80°甘油储液中培养至OD600为0.2，然后立即传代，接着在进行测量之前，将10μl含有新菌株的培养物添加到适当传代中。每次传代结束时收集Sanger测序样本。为了分析，一个成功的裂解事件被定义为OD600生长曲线，该曲线有一个确定的峰值，随后OD下降。
平板阅读器荧光
为了孔-平板实验，将适当的大肠杆菌菌株从-80°甘油储液中接种到含有0.2％葡萄糖和适当的抗生素的2ml LB中，并在37℃振摇培养箱中培养。在细胞达到0.2-0.6之间的OD600后，将5μl培养物添加到标准Falcon组织培养96孔平底板中的含适当抗生素的200μl新鲜培养基中。细胞在37°振摇培养，每5分钟在Tecan Infite M200 Pro中成像一次。稀释物生长19小时，每5分钟测量一次600nm处吸光度的光密度。5分钟测量一次荧光，分别在485nm激发520nm发射，433nm激发475nm发射和590nm激发630nm发射下测量GFP、CFP和RFP。所得曲线用于估计每个菌株的裂解和生长动力学的OD600。
实施例1-二菌株系统
开发的第一个阶段包括工程化改造一种选择优势。初步研究了使一种菌株比其它菌株具有选择性优势的策略。
初步研究了使一种菌株比其它菌株具有选择性优势的策略。从可能的大肠杆菌素范围中，鉴定出两种(大肠杆菌素E3、大肠杆菌素E7)，它们通过DNA酶和rRNA酶活性是致死性的(见例如，图4和图22)。毒素效应在微流体和平板阅读器实验中得到验证(图5、图6)。为了描述这种效应，我们构建了一个p15A起始质粒，其中含有一个弱组成型启动子驱动的大肠杆菌素和Col E1裂解蛋白。此外，质粒包括一个组成型启动子，其驱动与荧光报告蛋白相连的免疫蛋白。第二相同的组成型启动子驱动第二免疫蛋白(图11和图21中示出了示例性质粒图谱)。每个质粒构建物在MG1655大肠杆菌中表达。最初的菌株称为“菌株A”和“菌株B”，分别产生大肠杆菌素E3+E3免疫+E7免疫+sfGFP和大肠杆菌素E7+E7免疫+mCherry(图1A)。为了研究我们的工程菌株的动力学，使用了包含尺寸为100μm x 80μm x 1μm的矩形阱的微流体装置。菌株B被命名为“弱势菌株”，最初被接种到微流体装置中，并能在阱中完全定殖。此时，被称为“优势菌株”的菌株A被引入微流体装置。引入菌株A后，观察到优势菌株呈指数增长，弱势菌株呈衰减(图1B)。这些实验表明，大肠杆菌素可以用来控制种群动力学。然而，由于长期暴露于低浓度的大肠杆菌素，本实验的一个可能结果可能是“弱势菌株”相对于优势菌株发生突变。
为了解决这一问题，推断同步释放大肠杆菌素可以同时释放更致死浓度的大肠杆菌素，同时也可以限制接触低浓度大肠杆菌素的时间。为了测试这一假设，构建了p15A起始质粒，其中在luxI启动子的控制下，去除初始Col E1裂解蛋白并用X174E裂解蛋白置换(图1C)。第二质粒来自他处报道的合成振荡菌株(Danino等人，A synchronized quorum ofgenetic clocks.(基因钟的同步群体)，Nature，463(7279)：326–330，2010)，包含由ColE1起始质粒上的天然双向启动子驱动的luxI和luxR(“激活子质粒”)。另外，第二lux启动子驱动荧光报告蛋白的产生。在这个双质粒架构中，利用费氏另类弧菌(Aliivbrio fischeri)的lux群体感应系统建立一个正反馈回路来驱动群体裂解。简而言之，LuxI催化可扩散群体感应分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的产生。该分子与组成型产生的luxR转录因子结合，形成一复合物，作为luxI启动子的转录激活子。当两个种群处于最低水平时，预计不同菌株会同步裂解，导致大肠杆菌素的同时释放(图1D)。为了验证这一想法，在先前所述的微流体装置中培养了含有这两种质粒的大肠杆菌。优势菌株和劣势菌株分别以1:5的比率上样，共同培养600分钟。据观察，与缺乏同步裂解的菌株相比，这两种菌株在每个室中同步裂解，并显著提高了菌株接管率(图1E)。这种基于合成大肠杆菌素的回路表明，当与工程化的选择优势相结合时，裂解介导的种群控制是控制种群的有力工具。
实施例2-三菌株系统
在开发的第二阶段，该系统扩大到三菌株。
由于二菌株的种群控制系统只能实现从一种菌株到另一种菌株的转换，将该设计扩展到三菌株系统，可以采用“石头剪刀布”法进行循环。为了探索这一点，第三毒素被鉴定为大肠杆菌素V，它通过破坏膜电位发挥作用。每种菌株包含图1C中描述的相同的双质粒架构，但具有正交的大肠杆菌素组。这三种菌株，现在称为菌株1、菌株2和菌株3，分别含有大肠杆菌素E3、大肠杆菌素E7和大肠杆菌素V。在该系统中，每种菌株产生一种对前一菌株致死的大肠杆菌素和两种免疫蛋白(图2A)。第一免疫蛋白保护当前菌株免受其自身的大肠杆菌素生产的毒性。此外，第二免疫蛋白保护当前菌株免受前一菌株产生的大肠杆菌素的毒性。
工程改造了三株大肠杆菌，每株大肠杆菌都含有一种独特的毒素和抗毒素系统(TA模块)。在单克隆种群中，TA模块有助于质粒的稳定，因为抗毒素的突变或丢失会导致细胞死亡，这是由于健康细菌产生的细胞外毒素的存在或通过产生毒素的mRNA的长时间持续存在而杀死新生的无质粒细胞(见K.Gerdes，Nature Biotechnology 6,1402(1988))。通过将TA模块的机制扩展到多菌株生态，每个TA模块赋予其宿主菌株额外的能力，以杀死任何其他没有相应抗毒素的菌株，从而实现对现有种群置换的外部控制(图12A)。通过在每种菌株中添加第二抗毒素，使每种菌株在一个循环中被随后的菌株杀死，从而创造了一个合成的“石头剪刀布”(RPS)生态(图12B)。该RPS系统可与任何感兴趣的回路耦合以增加稳定性。在这种组合系统中，在一种菌株中发生突变的回路可以被引入一批新的下一种携带RPS的菌株取代。因此，与其试图“打败达尔文”，不如开发一种工程化策略，实现对生态系统的进化和组成的外部控制。
由于多菌株竞争动力学通常由生长速率的差异决定，因此首先分别确定三菌株的动力学。通过荧光微量滴定板阅读器吸光度实验，比较了3株裂解菌株与野生型MG1655大肠杆菌的生长速率。在裂解事件发生之前，发现与野生型对照相比，添加工程化回路对生长几乎没有影响。记录三种菌株裂解时的OD600阈值(图2B)。
接下来，在微流体装置中探索裂解的OD600的差异对裂解期的影响。每种菌株装在到微流体装置中，每6分钟成像一次。尽管OD600的裂解阈值不同，三种菌株之间的裂解期相对一致(图2C)。
不希望受到理论约束，假设这可能是由于菌株1细胞的裂解后存活率低于菌株2和菌株3的存活细胞。三种菌株的裂解动力学存在表型差异。菌株1的裂解事件导致更具爆炸性的裂解事件，其留下存活细胞的较小份额并从阱中排出更多裂解物。或者，菌株3具有非常轻微的裂解事件，导致存活细胞的份额较高，并且在微流体阱中聚积更多的细胞裂解物(图7)。
在任何环境中，一旦工程化细胞发生突变，它们就无法恢复到未突变状态。它们必须被去除并被健康的细胞所取代。这种“系统重启”会中断环境中的动态回路功能。从理论上讲，多菌株RPS生态系统应该能够在不中断感兴趣的回路动力学的情况下去除突变或易突变的细胞。在验证了TA模块在RPS系统中扩展的功能后，测试了具有高选择性压力的遗传回路的稳定性RPS元件的实用性。选择了群体驱动同步裂解回路(SLC)，研究了SLC在体内的微生物治疗，例如对肿瘤给药(见例如M.O.Din,等,Nature 536,81(2016)；T.Danino,O.Mondragón-Palomino,L.Tsimring,J.Hasty,Nature 463,326(2010))。在SLC回路中，一种群体感应分子(AHL)在生长环境中逐渐积累，与种群密度成比率。当种群达到一密度阈值时，同步裂解可消除约90％的细菌，剩下约10％用于重新接种种群的生长。由此产生的细胞种群动力学是细胞生长和同步裂解的循环。然而，当在不能使用选择性培养基的体内环境中使用时，预期质粒丢失或突变会在长时间内导致功能丧失。
研究了RPS系统中质粒的成功稳定化是否会导致菌株接管，而不中断任何的振荡动力学(图13A)。将SLC和TA模块整合到双质粒系统中，其中一种质粒包含来自噬菌体ΦX174(X174E)的裂解基因E、TA模块、免疫蛋白和激活子报告质粒(图13B)。为了研究菌株的不同动力学如何影响它们之间的相互作用，每个菌株对在微流体装置中进行了测试。由于裂解阈值的差异，预计菌株1会在菌株2和菌株3之前裂解，从而导致菌株接管产生问题。开发了一个三菌株RPS系统，其中每种菌株都含有一不同的毒素-抗毒素对以及一种对其他菌株的第二抗毒素(图12C)。为了实现这一点，使用了使用过的大肠杆菌素，这是一种天然存在的毒素-抗毒素系统，对某些大肠杆菌菌株是致命的，并且是体内大肠杆菌种群中的有效拮抗剂(图16A-D)(见例如B.C.Kirkup,M.A.Riley,Nature 428,412(2004),A.E.Boyer,P.C.Tai,Journal of bacteriology 180,1662(1998)；E.Cascales,等Microbiology andmolecular biology reviews 71,158(2007)；M.M.Zambrano,D.A.Siegele,M.Almiron,A.Tormo,R.Kolter,Science 259,1757(1993))。
为了测试这一点，每个菌株对在微流体装置中以1:5的初始接种比率(优势对易感)进行共培养。通过荧光报告蛋白sfGFP、CFP和mKate2对三株菌株各自进行监测。荧光报告子的产生是由luxI启动子驱动的。菌株3含有产生大肠杆菌素E7和E7免疫蛋白和大肠杆菌素V免疫蛋白的质粒。菌株2含有产生大肠杆菌素E3和E3免疫蛋白和E7免疫蛋白的质粒。菌株1含有产生大肠杆菌素V和V免疫蛋白以及E3免疫蛋白的质粒。因此，每对菌株都有一“优势菌株”，对另一菌株产生的毒素免疫，还有一“易感菌株”，对另一菌株产生的毒素敏感。因此，报告蛋白仅在启动基于AHL群体的正反馈环路后产生。
由于微生物共培养物中的置换通常由生长速率的差异决定，因此测量了每种RPS菌株的生长速率(图12D)。以1:2的优势菌株对易感菌株的比率进行共培养，以确定微流体装置中工程化大肠杆菌素杀伤回路的效能。在每种情况下，观察到优势菌株的快速增加和易感菌株的衰退，证实优势菌株产生的大肠杆菌素对易感菌株有效，但反之亦然(图12E、12F)。
利用这种架构产生了三种菌株，其表现出同步裂解和恒定RPS竞争的同时循环(图13C)。每种RPS裂解菌株分别进行了表征(图17A-D)，每种菌株对在微流体装置中进行验证，初始接种比为优势菌对易感菌1:1和1:5。据观察，除了成功的菌株置换外，同步裂解回路的功能未受影响，因为所有菌株在每个室内同步裂解。在1:1的优势对易感菌比率下，每个菌株对100％的培养物(n＝35)都发生了接管，单个裂解事件足以完成菌株接管(图18A)。对于比率为1:5的三个配对(菌株1和3、3和2、2和1)，优势菌株接管分别发生在100％、100％和92％的培养物(n＝396)中(图2D、图18B)。对于由菌株1和菌株2组成的共培养物，菌株2的一小份额(<8％)能够竞争过菌株1而在阱中定殖。在所有情况下，菌株转换期间，SLC回路的功能均未中断(图13D-13F)。
在不希望受到理论约束的情况下，假设这可能是由菌株1的较低裂解阈值引起的。菌株1先于菌株2开始裂解。因此，释放的大肠杆菌素相对于目标菌株2的相对浓度较低。此外，虽然这两种菌株最初以1:5的优势对劣势比加载，但在大多数情况下，在第一次裂解事件时观察到的比率是不同的。
为了进一步研究这个问题，我们进行了一个微流体实验，两种菌株以1:1的比率加载。在大多数情况下，在第一次裂解事件发生之前，优势菌株已经完全接管了微流体阱。在少许情况下，阱中仍然存在两种菌株。然而，优势菌株具有较大的群体规模，导致单个裂解事件足以接管阱(参见例如图2E-2G、图13D-13F)。
单细胞分辨率下的显微镜检(60倍放大镜)目测证实弱势细胞在同步裂解前已开始死亡。在不受理论约束的情况下，这可能表明在指数生长阶段，裂解蛋白存在某种程度的“漏泄表达”，导致少量大肠杆菌素的释放。
实施例3-种群动力学
虽然优势-易感菌株对的共培养能够实现恒定的菌株置换，但由三种拮抗菌株组成的生态系统在同时培养时可能引入新显现的特性。开发了一个描述转换种群动力学的数学模型，并将其简化为一个离散时间图，该图允许对转换频率和间隔时间进行分析预测(见实施例5)。结果表明，当全部三种菌株同时存在时，三种菌株之间的种群优势循环是系统的一个突现特性。在假设系统不允许引入新鲜细胞的情况下，最初以较高浓度开始的菌株随后在阱中占优势(图19)。或者，在每种菌株的小恒定供给条件下，不管三种菌株之间的初始比率如何，三菌株系统的轨迹收敛到一个稳定的极限循环(图3E、图13G)。
为了测试这一突现特性，将所有三种菌株同时加载到一个微流体装置中。使用上述相同的实验设置来测试系统的理论稳健性。方案的唯一区别在于在微流体装置中细胞上样后使用高流速。该过程是为了将大多数细胞从阱中冲出，每个阱中只剩下大约1到10个细胞。使用这种方法，在不同的阱中获得三种菌株之间广泛的相对比率，允许测试广泛分布的初始浓度。
分析了四个单独的微流体实验总计1582个微流体阱。观察到三种不同的动力学。分析了四个独立微流体实验，共1582个单独的微流体培养区域，观察到系统在三菌株之间表现出循环行为，如菌株2到菌株1到菌株3(图20A-20B)。约75％的阱的动力学由在第一次裂解事件发生前竞争胜过其他菌株的一种菌株组成。在整个实验过程中，单一菌株占据了阱的优势地位。在第二种情况下(～20％)的阱在两菌株之间循环，例如菌株1到菌株2。在第三种情况下(～5％)阱在三菌株之间循环，例如菌株1到菌株2到菌株3。通过汇总四个实验中的所有转变事件，观察到实验结果与理论轨迹吻合良好(图3F)。正如模型所预测的，三菌株相互竞争，直到两种菌株被淘汰，一种菌株存活下来(图3F，图13H)。
在理想实验条件下，在循环中提供下一种菌株的恒定供给。然而，由于实验的限制，菌株循环依赖于细胞从上游阱和通道冲入阱。已证实在包含所有3种菌株和所有3种大肠杆菌素的可变条件下，菌株依次循环。然而，由于阱的几何形状，随着实验持续时间的增加，微流体阱中细胞裂解物的积聚阻止了新细胞在上游洗出，降低了菌株循环的持续能力。由于这些微流体实验的局限性，无法显示系统在一次运行中的完整循环。然而，展示了几个实例，其中菌株从菌株2循环到菌株1，然后循环到菌株3以及其他方案(图3D-3E、图13G)。然而，通过汇总四个实验和1600个微流体阱的数据，证明了系统初始条件的变化(即每种菌株的初始浓度)不会阻止三菌株系统之间的振荡达到稳定，一种菌株一次依次循环(图3C、图19A-19B、图9)。这证明了系统的稳健性，因为初始条件的变化不会扰动系统的稳态。对于体内应用，这意味着实现所需菌株循环对初始条件(例如，上样浓度、上样时间等)不会太敏感。
RPS生态系统与预期行为的一致收敛性支持工程化生态系统展现可预测和精确动力学的可行性。合成微生物群落在新生物技术应用中的潜力早已为人所知(见例如,B.Kerr,M.A.Riley,M.W.Feldman,B.J.Bohannan,Nature 418,171(2002)；L.R.Lynd,etal.,Nature biotechnology 26,169(2008)；T.Groβkopf,O.S.Soyer,Current opinion inmicrobiology 18,72(2014)；K.Zhou,K.Qiao,S.Edgar,G.Stephanopoulos,Naturebiotechnology 33,377(2015))。工程化生态系统表现出复杂的功能，很难将其工程改造成单一的种群。(见例如,J.Shong,M.R.J.Diaz,C.H.Collins,Current Opinion inBiotechnology 23,798(2012)；K.Brenner,L.You,F.H.Arnold,Trends in biotechnology26,483(2008))。
实施例4-质粒稳定性
RPS合成生态系统策略允许外部控制生态系统的进化和组成，通过手动输入，在不中断回路功能的情况下置换不需要的菌株。为了证明这一概念，并利用RPS系统延长SLC的功能稳定性，我们尝试在没有选择性抗生素(卡那霉素)的情况下进行动态表达。在这种情况下，针对SLC激活子质粒的选择性压力应导致迅速丧失功能。
调查了两种情况(图14A)。在第1种情况下，每种菌株在缺乏卡那霉素的LB培养基中单独培养。在缺乏选择性抗生素的情况下，回路功能的丧失是普遍的，并导致荧光表达和同步裂解动力学的丧失。记录同步裂解丧失前经过的时间(n＝16)，发现80％到90％的质粒丧失发生在32小时内，之后菌株生长不可控(图14B，14C，L.O.F.代表“功能丧失”)。在第2种方案下，实验开始于菌株2和菌株1的共培养，让菌株1接管阱。12小时后，添加菌株3以取代菌株1，30小时后重新引入菌株2以取代菌株3。因此，从菌株2开始，以一种可能无限期维持的方式完成一个完整的循环。通过在前一菌株突变之前手动添加后续菌株，可以在不中断回路功能的情况下延长回路稳定性的持续时间(图14D)。
为了进一步探索RPS系统对可突变遗传回路的影响，进行了一次分批传代实验，以比较两种方案(图15A)。在第一种方案下，用菌株1接种含有抗生素的培养基，每12小时将培养物传代到新鲜的生长培养基中。在第二种方案下，还用菌株1接种培养物，并且每12小时传代一次，但是每3代还添加RPS循环中的下一菌株。据观察，在第一种方案下，突变从第4代开始，一旦发生同步裂解丢失，就再也无法恢复。然而，在第二种方案下观察到，即使在先前传代中丢失了同步裂解，同步裂解丢失存在延迟并且裂解功能也会恢复(图15B)。对含有X174E裂解基因和Lux盒的1kb对区域进行Sanger测序显示，RPS策略在相同的持续时间内减少了突变的发生。通过这种方式，通过将消除单个突变细胞的挑战转移到消除整个种群，证明了RPS系统防止回路功能丧失的能力，无论是通过突变还是质粒丧失。
作为一个可扩展和模块化的平台以确保遗传稳定性，RPS系统提供了一层额外的控制，允许其与其他传统策略相结合来维持质粒的稳定性。这种方法可以使合成生物学家工程改造在没有选择性抗生素的情况下可以长期维持的系统，影响从治疗到生物修复、生产和传感技术的应用。这些应用将需要开发新的RPS菌株，这些菌株具有不同的天然或合成毒素-抗毒素系统，因为大肠杆菌素耐药性的流行可能会根据环境条件相对迅速地出现。在更广的范围内，利用工程化的“合成生态学”来控制遗传构建物的稳定性，通过独立的亚种群的程序化操作和相互作用，创造了应用动态合成生态系统的可能性。
实施例3-模型
这些观察结果被整合到一个计算模型中，以直观地显示这种三菌株的基于裂解的系统在各种参数下的行为。在假设每种菌株可以被另一种菌株完全杀死的情况下，发现三菌株中的每一种都会循环一次，并且最初以较高浓度开始的菌株将在阱中占优势(图3A)。所有三种菌株同时被加载到一个微流体装置中。所有三个菌株培养到同一接近的OD，然后混合在一起。然后将细胞混合物装入微流体装置。系统能够在三菌株之间循环，例如菌株2到菌株1到菌株3(图3B-C)。没有观察到菌株循环回到第一菌株以完成整个循环的情况。由于一种菌株对另一种菌株的致命影响，这三种菌株可以一直竞争到只剩下一个冠军。
假设为了在模型中实现持久性转换，添加一个小ε(epsilon)代表一个恒定的细胞接种物有助于避免任一菌株的完全消除(图3D)。该ε项表示系统中下一菌株的连续添加，以提供每种细胞类型的恒定供应。此外，三菌株系统的轨迹收敛到一个稳定的极限循环，该极限循环对于大范围的初始条件和系统参数是稳健的(图8)。
三种细菌菌株的密度为p、q、r，在没有大肠杆菌素的情况下，它们以相同的名义增长率呈指数增长，可以按比率缩放而不丧失通用性。这三种菌株产生三类大肠杆菌素。这些大肠杆菌素在细胞外培养基中的浓度分别为Cp，Cq，Cr。这些大肠杆菌素的作用是它们以循环的方式减缓彼此的生长：Cp减缓了q的生长，因此q以(1+Cp)-1的速率增长，Cq同样减缓了r，Cr减缓了p。此外，所有菌株都产生群体感应分子AHL，AHL的胞外浓度表示为A。细胞产生的大肠杆菌素与相应的细胞保持连接，在裂解事件中释放到胞外介质之前不会影响其他菌株。如果A大于或等于Ac，则所有菌株都发生裂解，在此期间大多数细胞被裂解，但一小部分δ存活下来。细胞外空间中的AHL以速率γA恒定稀释，而大肠杆菌素则以速率γc稀释。
假定在裂解事件i后紧接的时间ti所有7个浓度值是pi,qi,r1, Ai。注意，假设Ai＝Ac(裂解事件很短，AHL的浓度没有变化的机会)。这些动力学变量的后续演变由以下方程式控制：
在裂解事件i之后，p、q、r的浓度很小，并且由于稀释，AHL的浓度开始下降。但随着细菌总密度p+q+i的增得足够大，AHL的浓度开始回升。当A在时间ti+1再次达到Ac时，发生新的裂解事件。此时，分别等于Pi+1、Qi+1、Ri+1的三菌株浓度立即下降分数δ，
|pi+1＝δPi+1+∈ (8)
qi+1＝δQi+1+∈ (9)
ri+1＝δRi+1+∈ (10)
[注意：添加一个小ε以避免各菌株完全消除。看似微不足道但至关重要的持久性转换似乎离不开它]。同时，大肠杆菌素从裂解细胞释放到细胞外空间，并添加到以前在此存在的大肠杆菌素中：
这里是菌株p在紧接i+1次裂解事件之前的浓度，与Q和R相似。参数β表示细菌在裂解过程中释放大肠杆菌素的速率(假设全部三种菌株的释放速率相同)。
方程式(1)-(13)的模拟显示了在广泛的参数值范围内优势菌株密度稳健转换的动力学(图24A、24B、25A、25B、26A和26B)。
分析
裂解事件之间的大肠杆菌素动力学方程是线性的，所以它们可以简单地积分，
现在，由于大肠杆菌素浓度随时间的变化是已知的，因此可以对菌株浓度的方程式进行积分：
最后，裂解事件之间AHL的浓度计算成：
从超越方程中求出下一裂解事件的时间
或
从现在开始，假定AHL动力学比种群动力学快得多(即γA>>1)。然后AHL浓度跟踪室内的细胞总量，可简化A的表达，
因此下一个裂解事件条件变为
Pi+Qi+Ri＝γAAcα-1 (22)
如果大肠杆菌素降解速度足够快，那么在每个裂解周期结束时，它们有时间降解到可忽略的微小值，如图25A、25B、26A和26B所示，则值不依赖于前一个裂解循环中的大肠杆菌素浓度，并且根据等式(23)-(25)与Pi、Qi、Ri成正比：
在下一个裂解事件t＝ti+1时公式(15)-(17)中代入这些表达式和(8)-(10)，得到以下隐式映射
其中，符号Ti＝ti+1-ti用于第i次和(i+1)次裂解事件之间的时间间隔。映射仍然是隐式的，因为Ti值仍然不确定。如果δ＜＜1，即细胞密度在裂解事件之间显著增加，则可以通过减少1来简化方括号中的表达式：
现在可以通过将这些树方程相加并使用公式(22)来计算Ti：
最后，实现了Pi，Qi，Ri的如下显式三维映射：
/>
(36)
其中：
来自方程(32)的裂解事件之间的间隔如下：
不动点与Hopf分叉。
映射(33)-(33)的不动点，其中全部三种菌株相等，视Pi＝Qi＝Ri＝P0＝γAAc/3α。在该方案中，裂解事件之间的时间如下：
(45)
为了研究该不动点的稳定性，使其附近的映射线性化，
其中X0＝(δP0+ε)(1+βP0)-1/γc且
代入这些表达式，得到以下线性映射：
其中：
不动点的稳定性由以下特征矩阵的特征值决定：
该矩阵具有三个特征值：λ1＝0；λ2；3＝3A+3B/2+i3 sqrt(3)B/2。第一个特征值是0，对应于超级稳定性。第二和第三特征值是复特征值并且可对应于指数增长解，如果其绝对值|λ2，3|大于1，sqrt((3A+3B/2)2+27B2/4)＞1，或
A2+B2+AB＞1/9
这是该模型中Hopf分叉的条件。很容易看出，对于小Ac，左手侧很小，但其随着Ac单调地增加到大于1/9的渐近值，因此Hopf分叉总是发生在某个有限Ac处(见图8A)。在Hopf分叉处，其中|λ2，3|＝1，每个转换循环(周期的1/3)的裂解事件数为
图8B和8C显示了映射和基础完整模型的裂解脉冲数和分叉图。
强转换方案
远离Hopf分叉点，当一菌株在许多裂解周期内主导动力学，然后快速切换到下一菌株主导时，转换变为强烈非线性，以此类推(图25，26)。为了确定该方案的动力学特性，计算了裂解事件之间的时间间隔和转换循环的持续时间。
裂解间隔在一个转换循环内改变。当一菌株强烈主导时，它们在循环中间最小；当两菌株几乎相等时，它们在循环之间稍长一些。
最小裂解间隔
在每个转换循环的大部分时间内，其中菌株之一生长到高浓度，在该浓度下发生裂解，而另外两种菌株保持较小的浓度(假设ε＜＜γAA/α)。在这种情况下，映射几乎是一维的且很小(在不损失通用性的情况下，选择p作为优势菌株，假设Qi＝Ri＝0是：
Pi＝γAAcα-1＝PM， (56)
[假设我们假定ε＜＜δγAA/α。在该阶段裂解事件之间的间隔如预料的是
最大裂解间隔。最大裂解间隔出现在从一菌株优势转换到下一菌株的过程中。在这个转换过程中，两个浓度在一定的i＝k+1时短暂地变为相等(假设为了明确性，Pk+1＝Qk+1，Rk+1＝0)。很容易看出等式Pk+1＝Qk+1的条件是
(此处忽略了小ε)。对于足够尖锐的转换，幅值Pk仍然接近PM＝γAAc/α。这允许求解Rk，然后可以用它来找到Tk。如果βRk＞＞1(将随后验证)1可以忽略，方程可以显式求解，
由此可知，该表达式对γc～1的有效性条件为βγ4Acα＞＞1。然后显式计算最大裂解间隔：
平均裂解间隔Ta介于Tm和TM之间，但随着转换间隔变长而逐渐接近Tm。
转换间隔时长。为了估计一菌株占优势地位的转换循环的持续时间，观察到其由两个子间隔组成。在第一个子间隔中，其中一株菌株(特异性为p)占优势，在裂解事件发生前保持在PM附近，而另外两株菌株(q和r)较小。菌株其中之一(q)在整个子间隔内一直非常小(O(ε))，因为它的增长受到大p的强烈抑制，而其它菌株(r)不受抑制，从小的初始水平稳定地增长到O(PM)，最终达到与PM相当的振幅。一旦发生这种情况，第二个子间隔开始，在此期间，第一菌株(p)的振幅迅速减小到小(O(ε))，因为其增长现在被大r抑制。为了获得第一个子间隔的持续时间，考虑了Ri的映射，假设Qi≈0,Pi≈PM
根据方程式(32)，
使用方程式(31)中的表达式，得到以下1D映射
为了获得第一子间隔的持续时间，确定Ri从R0＝0开始达到PM数量级的迭代次数。这个子间隔本身可以分为两部分。当βRi<<1时，第二个括号被展开以获得以下二次映射
或引入新变量
其中a＝εβ/δγc，初始条件对于小a<<1，达到/>的迭代次数n很大，可以通过取连续极限并对以下方程式从/>到/>进行积分获得：
其中对于小a获得
当然，最后几次迭代违反了条件βRi<<1，但这个表达式仍然很好地估计了达到Rn＝β-1所需的迭代次数。接下来估计Ri从Rn＝β-1到PM的额外迭代次数。由于通过假设β>>ε/δ在该Ri范围内，后者从映射(63)中被忽略，并简化为
其中初始条件/>该映射的最初几次迭代如下：/> 等。对于γc＝O(1)，该序列随i迅速(超指数)增长，因此在i＝n+2之后，1在公式(68)的括号中被忽略，简单地写为
因此在N1迭代时，
将该表达式与PM相等，并召回n的表达式，得到以下N1的近似公式，
在第二子间隔期间，Ri的量级已经接近PM，因此P菌株的生长受到强烈抑制。这意味着在每个裂解事件中，其按因子δ减少，Pi+1＝δPi,这立即产生Pi达到“背景”水平O(ε)所需迭代次数的估值，
因此，单个转换循环内的裂解间隔总数由下式给出
图8D-8G显示裂解事件之间的间隔(最小值、最大值和平均值)以及每个转换间隔内裂解事件数，作为一些模型参数的函数，从精确模型、3D映射和分析近似值中获得。令人惊讶的是，分析近似值似乎比三维映射结果更准确。
参考文献
1.Marquardt，N.等。实验生态位演化改变了多样性-生产力关系的强度(Experimental niche evolution alters the strength of the diversity-productivity relationship).Nature 469,89–92(2011).
2.De Roy,K.等,环境条件和群落均匀性决定了生物入侵的结果(Environmentalconditions and community evenness determine the outcome of biologicalinvasion).Nature communications 4,1383(2013).
3.Tanouchi,Y.,Smith,R.P.&You,L.探索生态和进化动力学的工程微生物系统(Engineering microbial systems to explore ecological and evolutionarydynamics).Current opinion in biotechnology 23,791–797(2012).
4.Wintermute,E.H.&Silver,P.A.Emergent cooperation in microbialmetabolism.Molecular systems biology 6,407(2010).
5.Klitgord,N.&Segre,D.诱导合成微生物生态系统的环境(Environments thatinduce synthetic microbial ecosystems).PLoS Comput Biol 6,e1001002(2010).
6.Little,A.E.,Robinson,C.J.,Peterson,S.B.&Raffa,K.F.参与规则：调节微生物群落的种间相互作用(Rules of engagement:Interspecies interactions thatregulate microbial communities)31.In The Social Biology of MicrobialCommunities:Workshop Summary,vol.62,375–401(National Academies Press,2012).
7.De Roy,K.,Marzorati,M.,Van den Abbeele,P.,Van de Wiele,T.&Boon,N.合成微生物生态系统：了解和应用微生物群落的令人兴奋的工具(Synthetic microbialecosystems:an exciting tool to understand and apply microbialcommunities.Environmental microbiology)16,1472–1481(2014).
8.Gardner,T.S.,Cantor,C.R.&Collins,J.J.大肠杆菌基因开关的构建(Construction of a genetic toggle switch in escherichia coli).Nature 403,339–342(2000).
9.Elowitz,M.B.&Leibler,S.转录调节因子的合成振荡网络(A syntheticoscillatory network of transcriptional regulators).Nature 403,335–338(2000).
10.Hasty,J.,McMillen,D.&Collins,J.J.工程化基因回路(Engineered genecircuits).Nature 420,224–230(2002).
11.Endy,D.工程生物学基础(Foundations for engineering biology).Nature438,449–453(2005).
12.You,L.,Cox,R.S.,Weiss,R.&Arnold,F.H.通过细胞间通讯和调控性杀伤进行程序化种群控制(Programmed population control by cell–cell communication andregulated killing).Nature 428,868–871(2004).
13.Brenner,K.,Karig,D.K.,Weiss,R.&Arnold,F.H.工程化双向通信介导了微生物生物膜聚生体的共识(Engineered bidirectional communication mediates aconsensus in a microbial biofilm consortium).Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 104,17300–17304(2007).
14.Danino,T.,Mondragón-Palomino,O.,Tsimring,L.&Hasty,J.基因钟的同步群体(A synchronized quorum of genetic clocks).Nature 463,326–330(2010).
15.Chen,Y.,Kim,J.K.,Hirning,A.J.,Josic,K.&Bennett,M.R.合成微生物群落中的显现的遗传振荡(Emergent genetic oscillations in a synthetic microbialconsortium.Science)349,986–989(2015).
16.Din,M.O.等,体内给药细菌裂解的同步循环(Synchronized cycles ofbacterial lysis for in vivo delivery).Nature 536,81–85(2016).
其它实施方式
实施方式1为一种方法，其包括：
在生长环境中第一时间段内培养第一细菌菌株；
将第二细菌菌株添加到生长环境中并在第二时间段内培养第二细菌菌株；
将第三细菌菌株添加到生长环境中并在第三时间段内培养第三细菌菌株；
其中，所述第一、第二和第三菌株中的每一种包括毒素系统；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；
其中，所述第二细菌菌株的毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自所述第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
其中，所述第三细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自所述第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素；和
任选地其中，所述第一、第二和第三菌株中的每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活。
实施方式2是实施方式1的方法，其中群体感应分子在第一、第二和第三菌株中的每一种中是不同的。
实施方式3是实施方式2的方法，其中所述第一、第二和第三种菌株中每一种的群体感应分子各自对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。
实施方式4是实施方式1的方法，其中群体感应分子在第一、第二和第三菌株中的每一种中是相同的。
实施方式5是实施方式1-4中任一所述的方法，还包括在生长环境中培养或共培养一种或多种额外细菌菌株。
实施方式6是实施方式5的方法，其中一种或多种额外细菌菌株中的每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活。
实施方式7是实施方式6的方法，其中群体感应分子在第一、第二和第三以及一种或多种额外细菌菌株中的每一种中是不同的。
实施方式8是实施方式7的方法，其中所述第一、第二和第三种菌株以及一种或多种额外细菌菌株中每一种的群体感应分子各自对于生长环境中使用的另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。
实施方式9是实施方式6的方法，其中群体感应分子在第一、第二和第三以及一种或多种额外细菌菌株中的每一种中是相同的。
实施方式10是实施方式6-9任一所述的方法，其中一种或多种额外细菌菌株中的每一种包括毒素系统。
实施方式11是实施方式1-10任一所述的方法，其中所述第一菌株、第二菌株、第三菌株和一种或多种额外菌株中的每一种的毒素系统可以在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合上独立编码。
实施方式12是实施方式1-11中任一实施方式的方法，其中所述至少第一、第二和第三细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是相同质粒的拷贝。
实施方式13是实施方式1-11中任一实施方式的方法，其中所述至少第一、第二和第三细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是不同的质粒。
实施方式14是实施方式1-13中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株存在代谢竞争。
实施方式15是实施方式1-14中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。
实施方式16是实施方式1-15中任一实施方式的方法，其中至少所述第一、第二和第三细菌菌株中的每一种与生长环境中的另一菌株相比不具有生长优势。
实施方式17是实施方式1-16任一所述的方法，其中，在至少第一、第二和第三细菌菌株的每一种中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；和所述激活子质粒包含激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。
实施方式18是实施方式1-17中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株每一种中的所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
实施方式19是实施方式1-18中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株每一种中的可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，激活子基因是LuxI。
实施方式20是实施方式17所述的方法，其中，至少一种报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。
实施方式21是实施方式17所述的方法，其中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。
实施方式22是实施方式1-21中任一项所述的方法，其中，所述质粒中的至少一种整合到所述第一、第二和第三细菌菌株中的至少一种的基因组中。
实施方式23是实施方式1-22中任一项所述的方法，其中，所述培养在微流体装置中进行。
实施方式24是实施方式1-22中任一项所述的方法，其中，所述培养在生物反应器中进行。
实施方式25是实施方式1-22中任一项所述的方法，其中，所述培养在体内进行。
实施方式26是实施方式1-25中任一实施方式的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围为约12小时到约72小时。
实施方式27是实施方式1-25中任一项所述的方法，其中，第一、第二和第三时间段各自选自至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时。
实施方式28是实施方式1-25中任一项所述的方法，其中，第一、第二和第三时间段每一种选自12小时、24小时、48小时、72小时和96小时。
实施方式29是实施方式1-25中任一实施方式的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约72小时。
实施方式30是实施方式29的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约48小时。
实施方式31是实施方式29的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约24小时。
实施方式32是实施方式29的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约18小时。
实施方式33是实施方式29的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约12小时。
实施方式34是实施方式29的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约6小时。
实施方式35是实施方式29的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围独立地为约1小时到约3小时。
实施方式36是实施方式1-35中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三时间段依次发生。
实施方式37是实施方式1-36中任一实施方式的方法，其中第一和第二、第二和第三或第一和第三时间段部分或完全重叠。
实施方式38是实施方式1-37中任一实施方式的方法，其中第一、第二和第三细菌菌株中的一种或多种编码可操作地连接到启动子的异源核酸和/或异源蛋白质。
实施方式39是实施方式38所述的方法，其中，所述启动子是可激活启动子。
实施方式40是实施方式39的方法，其中启动子由群体感应分子激活。
实施方式41是实施方式38所述的方法，其中，所述启动子是组成型启动子。
实施方式42是实施方式38-41中任一实施方式的方法，其中异源核酸和/或异源蛋白质是治疗剂。
实施方式43是实施方式42所述的方法，其中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
实施方式44是实施方式43的方法，其中抑制性核酸为siRNA、shRNA、miRNA或反义。
实施方式45为一种方法，其包括：
提供n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
在生长环境中依次共培养每种菌株一段独立的时间；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都可以具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中n种菌株中每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式46是实施方式45所述的方法，其中，在n种菌株的每一种中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；并且所述激活子质粒包含激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。
实施方式47是实施方式45-46中任一项所述的方法，其中，所述n种细菌菌株中每一种中的裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
实施方式48是实施方式45-47中任一项所述的方法，其中，所述n种细菌菌株每一种中的可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，激活子基因是LuxI。
实施方式49是实施方式46所述的方法，其中，至少一种报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。
实施方式50是实施方式46所述的方法，其中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。
实施方式51是实施方式45-50中任一项所述的方法，其中，所述质粒中的至少一种整合到n种细菌菌株中的至少一种的基因组中。
实施方式52是实施方式45-51中任一实施方式的方法，其中所述群体感应分子在所述n种细菌菌株中的每一种中是不同的。
实施方式53是实施方式52的方法，其中所述n种菌株中每一种的群体感应分子各自对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。
实施方式54是实施方式45-51中任一实施方式的方法，其中所述群体感应分子在所述n种细菌菌株中的每一种中是相同的。
实施方式55是实施方式45-54中任一实施方式的方法，其中所述n种细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是相同质粒的拷贝。
实施方式56是实施方式45-54中任一实施方式的方法，其中所述n种细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是不同的质粒。
实施方式57是一种方法，其包括：
提供n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
在生长环境中依次共培养每种菌株一段独立的时间；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统可产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式58是实施方式44-57中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株具有代谢竞争性。
实施方式59是实施方式44-58中任一项所述的方法，其中，n种细菌菌株中的每一种选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。
实施方式60是实施方式44-59中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株中的每一种与生长环境中的另一菌株相比不具有生长优势。
实施方式61是实施方式44-60中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株的毒素系统在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
实施方式62是实施方式44-61中任一项所述的方法，其中，所述培养在微流体装置中进行。
实施方式63是实施方式44-61中任一项所述的方法，其中，所述培养在生物反应器中进行。
实施方式64是实施方式44-61中任一项所述的方法，其中，所述培养在体内进行。
实施方式65是实施方式44-64中任一实施方式的方法，其中每一独立时间段范围为约12小时到约72小时。
实施方式66是实施方式44-64中任一项所述的方法，其中，每个独立时间段选自至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时。
实施方式67是实施方式44-64中任一项所述的方法，其中，每个独立时间段选自12小时、24小时、48小时、72小时和96小时。
实施方式68是实施方式44-64中任一实施方式的方法，其中每一独立时间段范围独立地为约1小时到约72小时。
实施方式69是实施方式68的方法，其中每一时间段的范围独立地为约1小时到约48小时。
实施方式70是实施方式68的方法，其中每一时间段的范围独立地为约1小时到约24小时。
实施方式71是实施方式68的方法，其中每一时间段的范围独立地为约1小时到约18小时。
实施方式72是实施方式68的方法，其中每一时间段的范围独立地为约1小时到约12小时。
实施方式73是实施方式68的方法，其中每一时间段的范围独立地为约1小时到约6小时。
实施方式74是实施方式68的方法，其中每一时间段的范围独立地为约1小时到约3小时。
实施方式75是实施方式45-74中任一实施方式的方法，其中一个或多个时间段部分或完全重叠。
实施方式76是实施方式45-75中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株中的一种或多种编码可操作地连接到启动子的异源核酸和/或异源蛋白质。
实施方式77是实施方式76所述的方法，其中，所述启动子是可激活启动子。
实施方式78是实施方式77的方法，其中可激活启动子由群体感应分子激活。
实施方式79是实施方式76所述的方法，其中，所述启动子是组成型启动子。
实施方式80是实施方式76-79中任一实施方式的方法，其中异源核酸和/或异源蛋白质是治疗剂。
实施方式81是实施方式80所述的方法，其中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
实施方式82是实施方式81的方法，其中抑制性核酸为siRNA、shRNA、miRNA或反义。
实施方式83是实施方式45-82任一所述的方法，其中第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
实施方式84是一种细菌菌株，其包括裂解质粒和激活子质粒，其中裂解质粒包括裂解基因、可激活启动子和可选的报告基因，激活子质粒包括激活子基因、可选的降解标签和可选的报告基因，其中，所述细菌菌株还包括毒素系统，其中所述毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述细菌菌株不产生所述第二毒素。
实施方式85是实施方式84所述的细菌菌株，其中，所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
实施方式86是实施方式84-85中任一项所述的细菌菌株，其中，所述可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，并且所述激活子基因是LuxI。
实施方式87是实施方式84-86中任一实施方式的菌株，其中激活子基因编码直接或间接激活可激活启动子的分子。
实施方式88是实施方式87的细菌菌株，其中直接或间接激活可激活启动子的分子是群体感应分子。
实施方式89是实施方式84-88中任一实施方式的细菌菌株，其中裂解基因可操作地连接到可激活启动子。
实施方式90是实施方式84-89中任一实施方式的细菌菌株，其中裂解质粒上的报告基因可操作地连接到可激活启动子。
实施方式91是实施方式84-90中任一实施方式的细菌菌株，其中激活子质粒进一步包含可激活启动子。
实施方式92是实施方式91的细菌菌株，其中激活子质粒的可激活启动子是裂解质粒的可激活启动子的拷贝。
实施方式93是实施方式91-92中任一实施方式的细菌菌株，其中激活子基因可操作地连接到激活子质粒的可激活启动子。
实施方式94是实施方式91-93中任一实施方式的细菌菌株，其中激活子质粒上的报告基因可操作地连接到激活子质粒的可激活启动子。
实施方式95是实施方式91-94中任一实施方式的细菌菌株，其中降解标签可操作地连接到激活子质粒的可激活启动子。
实施方式96是实施方式84-95中任一实施方式的细菌菌株，其中毒素系统可操作地连接到裂解质粒的可激活启动子。
实施方式97是实施方式84-96任一所述的细菌菌株，其中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。
实施方式98是实施方式84-97中任一实施方式的细菌菌株，其中裂解质粒的报告基因、激活子质粒的报告基因或两者都是荧光蛋白。
实施方式99是实施方式84-97中任一实施方式的细菌菌株，其中裂解质粒的报告基因和激活子质粒的报告基因是不同基因。
实施方式100是包括毒素系统的细菌菌株，其中毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中细菌菌株不产生第二毒素。
实施方式101是实施方式84-100中任一实施方式的细菌菌株，其中细菌菌株编码可操作地连接到启动子的异源核酸和/或异源蛋白质。
实施方式102是实施方式101的细菌菌株，其中所述启动子是可激活启动子。
实施方式103是实施方式102的细菌菌株，其中可激活启动子由群体感应分子激活。
实施方式104是实施方式101的细菌菌株，其中所述启动子是组成型启动子。
实施方式105是实施方式101-104中任一所述的细菌菌株，其中异源核酸和/或异源蛋白质是治疗剂。
实施方式106是实施方式84-105中任一实施方式的细菌菌株，其中毒素系统在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
实施方式107是实施方式84-106中任一项所述的细菌菌株，其中，所述细菌菌株还包含编码治疗剂的核酸。
实施方式108是实施方式105或实施方式107所述的细菌菌株，其中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
实施方式109是实施方式105或实施方式107-108中任一项所述的细菌菌株，其中，所述治疗剂是治疗性多肽。
实施方式110是实施方式105或实施方式107-109中任一项所述的细菌菌株，其中，所述治疗剂对靶细胞有细胞毒性或细胞抑制性。
实施方式111是实施方式110的细菌菌株，其中靶细胞是癌细胞或感染细胞。
实施方式112是包含实施方式84-111的细菌菌株中的任何一种或多种的药物组合物。
实施方式113是实施方式112所述的药物组合物，其中，所述药物组合物配制为用于原位药物递送。
实施方式114是一种系统，其包含：
第一细菌菌株，包括第一裂解质粒和第一激活子质粒；其中，第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签，以及任选的第一报告基因；其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统；其中所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中所述第一细菌菌株不产生所述第三毒素；
第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒；其中，第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签，以及任选的第二报告基因；其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统；其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
第三细菌菌株，包括第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中，第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因；其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统；其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
实施方式115是一种系统，其包含：
包括第一毒素系统的第一细菌菌株；其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株任选地还包括第一裂解质粒以及第一激活子质粒；其中所述第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；所述第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；
包括第二毒素系统的第二细菌菌株；其中第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株任选地还包括第二裂解质粒以及第二激活子质粒；其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；和
包含第三毒素系统的第三细菌菌株产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第三细菌菌株不产生第二毒素，其中所述第三细菌菌株任选地进一步包含第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中所述第三裂解质粒包含第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；所述第三激活子质粒包含第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
实施方式116是实施方式114或实施方式115的系统，进一步包括一种或多种额外细菌菌株。
实施方式117是实施方式114-116中任一实施方式的系统，其中第一毒素系统、第二毒素系统和第三毒素系统在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
实施方式118是一种系统，其包含：
n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式119是一种系统，其包含：
n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中n种菌株中每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式120是实施方式118或119的系统，其中n是3。
实施方式121是实施方式118或119的系统，其中n是4、5、6、7、8、9或10。
实施方式122是实施方式118-121中任一实施方式的系统，其中毒素系统中的每一个在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
实施方式123是实施方式118-122任一所述的系统，其中第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
实施方式124是一种试剂盒，其包括：
第一药物组合物，其包含第一细菌菌株，包括第一裂解质粒和第一激活子质粒；其中，第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；第一激活子质粒包括第一激活子基因、第一降解标签，以及任选的第一报告基因；其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统；其中所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中所述第一细菌菌株不产生所述第三毒素；
第二药物组合物，其包含第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒；其中，第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；第二激活子质粒包括第二激活子基因、第二降解标签，以及任选的第二报告基因；其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统；其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
第三药物组合物，包含第三细菌菌株，包括第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中，第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；第三激活子质粒包括第三激活子基因、第三降解标签，以及任选的第三报告基因；其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统；其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
实施方式125是一种试剂盒，其包括：
第一药物组合物，其包含包括第一毒素系统的第一细菌菌株；其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株任选地还包括第一裂解质粒以及第一激活子质粒；其中所述第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；所述第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；
第二药物组合物，其包含包括第二毒素系统的第二细菌菌株；其中第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株任选地还包括第二裂解质粒以及第二激活子质粒；其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；和
第三药物组合物，其包含包括第三毒素系统的第三细菌菌株，其产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第三细菌菌株不产生第二毒素，其中所述第三细菌菌株任选地进一步包含第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中所述第三裂解质粒包含第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；所述第三激活子质粒包含第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
实施方式126是实施方式124-125中任一实施方式的试剂盒，其中第一毒素系统、第二毒素系统和第三毒素系统在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
实施方式127是实施方式124-125任一所述的试剂盒，还包括在第一、第二、第三和/或一种或多种额外药物组合物中的一种或多种额外细菌菌株。
实施方式128是一种试剂盒，其包括：
n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式129是一种试剂盒，其包括：
n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中n种菌株中每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中所述n种细菌菌株中的每一种的裂解质粒都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株裂解质粒的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的裂解质粒的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式130是实施方式128或129的试剂盒，其中n是3。
实施方式131是实施方式128或129的试剂盒，其中n是4、5、6、7、8、9或10。
实施方式132是包含实施方式114-123的系统或实施方式124-131的试剂盒的药物递送系统。
实施方式133是包含实施方式114-123的系统或实施方式124-131的试剂盒的周期性药物递送系统。
实施方式134是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
给予所述对象治疗有效量的以下每一种：
第一细菌菌株，包括第一裂解质粒和第一激活子质粒；其中，第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签，以及任选的第一报告基因；其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统；其中所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中所述第一细菌菌株不产生所述第三毒素；
第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒；其中，第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签，以及任选的第二报告基因；其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统；其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
第三细菌菌株，包括第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中，第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因；其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统；其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
实施方式135是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
给予所述对象治疗有效量的以下每一种：
第一药物，其包含第一细菌菌株，包括第一裂解质粒和第一激活子质粒；其中，第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签，以及任选的第一报告基因；其中所述第一细菌菌株还包括第一毒素系统；其中所述第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中所述第一细菌菌株不产生所述第三毒素；
第二药物，其包含第二细菌菌株，包括第二裂解质粒和第二激活子质粒；其中，第二裂解质粒包括第二裂解基因、任选的第二可激活启动子和任选的第二报告基因；第二激活子质粒包括第二激活子基因、第二降解标签，以及任选的第二报告基因；其中所述第二细菌菌株还包括第二毒素系统；其中所述第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
第三药物，包含第三细菌菌株，包括第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中，第三裂解质粒包括第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；第三激活子质粒包括第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因；其中所述第三细菌菌株还包括第三毒素系统；其中所述第三毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素。
实施方式136是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
给予所述对象治疗有效量的以下每一种：
包括第一毒素系统的第一细菌菌株；其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株任选地还包括第一裂解质粒以及第一激活子质粒；其中所述第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；所述第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；
包括第二毒素系统的第二细菌菌株；其中第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株任选地还包括第二裂解质粒以及第二激活子质粒；其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；和
包含第三毒素系统的第三细菌菌株，产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第三细菌菌株不产生第二毒素，其中所述第三细菌菌株任选地进一步包含第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中所述第三裂解质粒包含第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；所述第三激活子质粒包含第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
实施方式137是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
给予所述对象治疗有效量的以下每一种：
第一药物组合物，其包含包括第一毒素系统的第一细菌菌株；其中第一毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素，其中第一细菌菌株任选地还包括第一裂解质粒以及第一激活子质粒；其中所述第一裂解质粒包括第一裂解基因、第一可激活启动子和任选的第一报告基因；所述第一激活子质粒包括第一激活子基因、任选的第一降解标签和任选的第一报告基因；
第二药物组合物，其包含包括第二毒素系统的第二细菌菌株；其中第二毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中第二细菌菌株不产生第一毒素，其中第二细菌菌株任选地还包括第二裂解质粒以及第二激活子质粒；其中所述第二裂解质粒包括第二裂解基因、第二可激活启动子和任选的第二报告基因；所述第二激活子质粒包括第二激活子基因、任选的第二降解标签和任选的第二报告基因；和
第三药物组合物，其包含包括第三毒素系统的第三细菌菌株，其产生第三毒素/第三抗毒素对和来自第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第三细菌菌株不产生第二毒素，其中所述第三细菌菌株任选地进一步包含第三裂解质粒和第三激活子质粒；其中所述第三裂解质粒包含第三裂解基因、第三可激活启动子和任选的第三报告基因；所述第三激活子质粒包含第三激活子基因、任选的第三降解标签，以及任选的第三报告基因。
实施方式138是实施方式134-137中任一实施方式的方法，其中给药包括依次向对象给予第一、第二和第三细菌菌株或第一、第二和第三药物组合物中的每一种。
实施方式139是实施方式138的方法，其中给药包括同时给予所述第一、第二和第三药物组合物中的每一种，并且其中所述第一、第二和第三药物组合物中的每一种具有释放所述第一、第二和第三细菌菌株的不同释放曲线。
实施方式140是实施方式134-139中任一项所述的方法，其中，所述第一、第二和第三细菌菌株的每一种表达不同的治疗剂。
实施方式141是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
向对象给予治疗有效量的n种细菌菌株中的每一种，所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式142是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
向对象给予治疗有效量的n种细菌菌株中的每一种，所述n种细菌菌株包括至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中n种菌株中每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中所述n种细菌菌株中的每一种的裂解质粒都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株裂解质粒的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的裂解质粒的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式143是实施方式141或142的方法，其中n是3。
实施方式144是实施方式141或142的方法，其中n是4、5、6、7、8、9或10。
实施方式145是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
向对象给予治疗有效量的m种药物组合物中的每一种，每一种包含n种细菌菌株中的至少一种，其中n种细菌菌株包含至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统可产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式146是一种治疗有需要的对象的疾病的方法，包括：
向对象给予治疗有效量的m种药物组合物中的每一种，每一种包含n种细菌菌株中的至少一种，其中n种细菌菌株包含至少第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株；
其中n至少是3；
其中n种菌株中每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中所述n种细菌菌株中的每一种的裂解质粒都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株裂解质粒的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的裂解质粒的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
实施方式147是实施方式145或146的方法，其中n是3。
实施方式148是实施方式145或146的方法，其中n是4、5、6、7、8、9或10。
实施方式149是实施方式145-146任一所述的方法，其中m＝n。
实施方式150是实施方式141-149中任一实施方式的方法，其中毒素系统中的每一个在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
实施方式151是实施方式141-150任一所述的方法，其中第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
实施方式152是实施方式145-151中任一实施方式的方法，其中给药包括依次向对象给予n种细菌菌株或m种药物组合物中的每一种。
实施方式153是实施方式152的方法，其中给药包括同时给予m种药物组合物中的每一种，并且其中所述m种药物组合物中的每一种具有释放所述第一、第二和第三细菌菌株的不同释放曲线。
实施方式154是实施方式141-153中任一项所述的方法，其中，所述第一、第二和第三细菌菌株的每一种表达不同的治疗剂。
实施方式155是实施方式141-154中任一项所述的方法，其中，所述疾病是癌症或感染。
实施方式156是实施方式155所述的方法，其中，所述感染由选自下组的感染物引起：空肠弯曲菌(Camphylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和沙门氏菌(Salmonella)。
实施方式157是实施方式155所述的方法，其中，所述癌症选自下组：成胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌和前列腺癌。
实施方式158是实施方式1-83或134-157中任一实施方式的方法，实施方式84-111中任一实施方式的细菌菌株、实施方式112-113中任一实施方式的药物组合物，实施方式114-123、132或133中任一实施方式的系统或实施方式124-131中任一实施方式的试剂盒，其中一种或多种细菌菌株表达治疗剂。
实施方式159是实施方式1-83或134-157中任一实施方式的方法，实施方式84-111中任一实施方式的细菌菌株、实施方式112-113中任一实施方式的药物组合物，实施方式114-123、132或133中任一实施方式的系统或实施方式124-131中任一实施方式的试剂盒，其中一种或多种细菌菌株表达选自以下的治疗剂：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
实施方式160是一种方法，其包括：
在生长环境中第一时间段内培养第一细菌菌株；
将第二细菌菌株添加到生长环境中并在第二时间段内培养第二细菌菌株；
将第三细菌菌株添加到生长环境中并在第二时间段内培养第三细菌菌株；
其中，所述第一、第二和第三菌株中的每一种包括毒素系统；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；
其中，所述第二细菌菌株的毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自所述第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
其中，所述第三细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自所述第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素；和
其中所述毒素系统在质粒、多个质粒上编码，或整合入宿主基因组，或其组合。
实施方式161是实施方式160的方法，其中第一、第二和第三细菌菌株中的每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中群体感应分子在第一、第二和第三种细菌菌株的每一种中可以是相同或不同的；
其中所述第一、第二和第三种菌株中每一种的群体感应分子各自对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子可能有影响或没有影响。
实施方式162是实施方式161的方法，其中第一、第二和第三细菌菌株的每一裂解质粒是含有所述细菌菌株的毒素系统的质粒，或者其中所述第一、第二和第三细菌菌株的每一激活子质粒是含有所述细菌菌株毒素系统的质粒，或者其中每一种细菌菌株的毒素系统整合到基因组中。
实施方式163是培养n种细菌菌株的方法，包括：
在培养物中，在第一时间段内培养n种细菌菌株中的第一细菌菌株；
将n种细菌菌株的第二细菌菌株添加到生长环境中并在第二时间段内培养第二细菌菌株；
将n种细菌菌株的其它细菌菌株的每一种添加到生长环境中，并在一段时间内培养这些细菌菌株的每一种；
其中n是三或更大的整数，和
其中所述n种细菌菌株中的每一种的质粒包含毒素系统；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第n毒素/第n抗毒素对的第n抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第n毒素；
其中，每个第m质粒的毒素系统产生第m毒素/第m抗毒素对，和来自第(m-1)毒素/第(m-1)抗毒素对的第(m-1)抗毒素，其中m是n种细菌菌株中的其他菌株的集合{2，3，…，n}的元素。
实施方式164是实施方式163的方法，其中n种细菌菌株中的每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中群体感应分子在n种细菌菌株的每一种中可以是相同或不同的；
其中所述n种菌株中每一种的群体感应分子各自对于所述n种菌株中另一菌株的裂解基因的可激活启动子可能有影响或没有影响。
实施方式165是实施方式164的方法，其中n种菌株的每个裂解质粒是包含该菌株的毒素系统的质粒。
实施方式166是实施方式163-164中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株中的每一种产生有效载荷。
实施方式167是实施方式163-165中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株中的每一种产生不同有效载荷。
实施方式168是实施方式163-165中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株中的每一种产生相同有效载荷。
实施方式169是实施方式166-168中任一实施方式的方法，其中每个有效载荷是治疗性的。
实施方式170是实施方式167的方法，其中第m细菌菌株的有效载荷通过直接或间接作用于第(m-1)细菌菌株的底物产生第m底物，并且其中第一菌株的有效载荷作用于存在于培养n种细菌菌株的环境中的底物上。
实施方式171是实施方式163-170任一所述的方法，其中n是4。
实施方式172是实施方式163-170任一所述的方法，其中n是5。
实施方式173是实施方式163-170任一所述的方法，其中n是6。
实施方式174是实施方式160-162中任一所述的方法，还包括在培养物中培养或共培养一种或多种额外细菌菌株。
实施方式175是实施方式174的方法，其中一种或多种额外细菌菌株中的每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
群体感应分子在第一、第二和第三种细菌菌株以及一种或多种额外细菌菌株的每一种中是不同的；
其中所述第一、第二和第三种菌株以及一种或多种额外细菌菌株中每一种的群体感应分子各自对于培养物中使用的另一细菌菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响。
实施方式176是实施方式175所述的方法，其中一种或多种额外细菌菌株中的每一种的裂解质粒包括毒素系统。
实施方式177是实施方式160-162或174-176中任一实施方式的方法，其中所述至少第一、第二和第三细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是相同质粒。
实施方式178是实施方式160-162或174-176中任一实施方式的方法，其中所述至少第一、第二和第三细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是独立质粒。
实施方式179是实施方式160-162或174-178中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株存在代谢竞争。
实施方式180是实施方式160-162或174-179中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。
实施方式181是实施方式160-162或174-180中任一实施方式的方法，其中至少所述第一、第二和第三细菌菌株中的每一种与培养物中的另一菌株相比不具有生长优势。
实施方式182是实施方式160-162或174-181任一所述的方法，其中，在至少第一、第二和第三细菌菌株的每一种中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；和所述激活子质粒包含激活子基因、降解标签和任选的报告基因。
实施方式183是实施方式160-162或174-182中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株每一种中的所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
实施方式184是实施方式160-162或174-183中任一项所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株每一种中的可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，激活子基因是LuxI。
实施方式185是实施方式182所述的方法，其中，至少一种报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。
实施方式186是实施方式182所述的方法，其中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。
实施方式187是实施方式160-162或174-186中任一项所述的方法，其中，所述质粒中的至少一种整合到所述第一、第二和第三细菌菌株中的至少一种的基因组中。
实施方式188是实施方式160-162或174-187中任一项所述的方法，其中，所述培养在指定的生长环境中进行。
实施方式189是实施方式160-162或174-188中任一项所述的方法，其中，所述培养在微流体装置中进行。
实施方式190是实施方式160-162或174-188中任一项所述的方法，其中，所述培养在生物反应器中进行。
实施方式191是实施方式160-162或174-188中任一项所述的方法，其中，所述培养在体内进行。
实施方式192是实施方式160-191中任一实施方式的方法，其中每种细菌菌株产生治疗有效载荷，并且在需要治疗有效载荷的人类或动物患者中进行培养。
实施方式193是实施方式160-162或174-191中任一实施方式的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围为约12小时到约72小时。
实施方式194是实施方式160-162、174-191或193中任一实施方式的方法，其中第一、第二和第三时间段中的每一时间段范围为约1小时到约n小时。
实施方式195是实施方式160-162、174-191或193中任一项所述的方法，其中，第一、第二和第三时间段各自选自至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时。
实施方式196是实施方式163-173中任一实施方式的方法，其中n个时间段中每一个部分或完全重叠。
实施方式197是实施方式163-173或196中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株一起培养。
实施方式198是实施方式163-173、196或197中任一实施方式的方法，其中n种细菌菌株中的每一种依次添加到培养物中，使得每一种第m细菌菌株在第(m-1)时间段传代之后添加到培养物中。
实施方式199是实施方式160-162、174-191或193-195中任一项所述的方法，其中，第一、第二和第三时间段中每一种选自12小时、24小时、48小时、72小时和96小时。
实施方式200是维持共培养物的方法，所述方法包括：
共培养至少三种细菌菌株；
其中至少三种细菌菌株中的每一种包含裂解质粒，其具有可激活启动子控制下的裂解基因；和
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活；
其中所述群体感应分子在所述至少三种细菌菌株中的每一种中是不同的；
其中至少三种菌株中每一种的群体感应分子各自对于另一菌株的裂解基因的可激活启动子没有影响或基本没有影响；
其中裂解质粒包含毒素/抗毒素系统。
实施方式201是实施方式200的方法，其中毒素/抗毒素系统产生毒素/抗毒素对和另一菌株的不同抗毒素。
实施方式202是实施方式200或201的方法，其中所述至少三种菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是相同的质粒。
实施方式203是实施方式200-202中任一实施方式的方法，其中至少三种细菌菌株中的每一种的裂解质粒和激活子质粒是独立的质粒。
实施方式204是实施方式200-203中任一实施方式的方法，其中至少三种细菌菌株具有代谢竞争性。
实施方式205是实施方式200-204中任一项所述的方法，其中，至少三种细菌菌株选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或其细菌变体。
实施方式206是实施方式200-205中任一实施方式的方法，其中至少三种细菌菌株中的每一种与另一菌株相比不具有生长优势。
实施方式207是实施方式200-206任一所述的方法，其中，在至少三种细菌菌株的每一种中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和任选的报告基因；和所述激活子质粒包含激活子基因、任选的降解标签和任选的报告基因。
实施方式208是实施方式200-207中任一项所述的方法，其中，所述至少三种细菌菌株中的裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
实施方式209是实施方式200-208中任一项所述的细菌菌株，其中，所述可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，并且所述激活子基因是LuxI。
实施方式210是实施方式207所述的方法，其中，至少一种报告基因选自编码绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体的基因。
实施方式211是实施方式207所述的方法，其中，所述降解标签是ssrA-LAA降解标签。
实施方式212是实施方式200-211中任一实施方式的方法，其中以至少三种细菌菌株中的每种的1:1:1的比率接种所述共培养物。
实施方式213是实施方式200-212中任一项所述的方法，其中，所述质粒中的至少一种整合到至少三种细菌菌株中的至少一种的基因组中。
实施方式214是实施方式200-213中任一项所述的方法，其中，所述培养在微流体装置中进行。
实施方式215是实施方式200-214中任一项所述的方法，其中，所述一段时间是12至72小时。
实施方式216是实施方式200-214中任一项所述的方法，其中，所述一段时间选自至少24小时、至少48小时、至少72小时和至少96小时。
实施方式217是实施方式200-214中任一项所述的方法，其中，所述一段时间选自12小时、24小时、48小时、72小时和96小时。
实施方式218是实施方式200-217中任一项所述的方法，其中，至少三种菌株的共培养处于恒定裂解状态；其中所述恒定裂解状态的特征是所述至少三种细菌菌株的生长和裂解的稳态平衡。
应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。

Claims (33)

1.一种方法，其包括：
在生长环境中第一时间段内培养第一细菌菌株；
将第二细菌菌株添加到生长环境中并在第二时间段内培养第二细菌菌株；
将第三细菌菌株添加到生长环境中并在第三时间段内培养第三细菌菌株；
其中，所述第一、第二和第三菌株中的每一种包括毒素系统；
其中，所述第一细菌菌株的毒素系统产生第一毒素/第一抗毒素对和来自第三毒素/第三抗毒素对的第三抗毒素，其中第一细菌菌株不产生第三毒素；
其中，所述第二细菌菌株的毒素系统产生第二毒素/第二抗毒素对和来自所述第一毒素/第一抗毒素对的第一抗毒素，其中所述第二细菌菌株不产生所述第一毒素；和
其中，所述第三细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对和来自所述第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中所述第三细菌菌株不产生所述第二毒素；和
其中，所述第一、第二和第三细菌菌株中的每一种包括：
裂解质粒，其具有由可激活启动子控制的裂解基因；以及
激活子质粒，其具有激活子基因，该激活子基因的表达促进群体感应分子的积累；
其中所述裂解基因的可激活启动子和所述激活子基因的表达均由所述群体感应分子激活。
2.如权利要求1所述的方法，其中群体感应分子在第一、第二和第三细菌菌株中的每一种中是相同的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一菌株、第二菌株、第三细菌菌株和一种或多种额外细菌菌株中的每一种的毒素系统可以在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
4.如权利要求1所述的方法，其中，在至少第一、第二和第三细菌菌株的每一种中，所述裂解质粒包含裂解基因、可激活启动子和报告基因；和所述激活子质粒包含激活子基因、降解标签和报告基因。
5.如权利要求1所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株每一种中的所述裂解基因是来自噬菌体ΦX174的E。
6.如权利要求1所述的方法，其中，至少所述第一、第二和第三细菌菌株每一种中的可激活启动子是LuxR-AHL可激活luxI启动子，激活子基因是LuxI。
7.如权利要求1所述的方法，其中第一、第二和第三细菌菌株中的一种或多种编码可操作地连接到启动子的异源核酸和/或异源蛋白质。
8.如权利要求7所述的方法，其中异源核酸及/或异源蛋白质是治疗剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
10.一种方法，其包括：
提供n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
在生长环境中依次共培养每种细菌菌株一段或多段独立的时间；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株;
其中n至少是3;
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
11.如权利要求10所述的方法，其中n种细菌菌株的毒素系统在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
12.如权利要求10所述的方法，其中一个或多个时间段部分或完全重叠。
13.如权利要求10所述的方法，其中n种细菌菌株中的一种或多种编码可操作地连接到启动子的异源核酸和/或异源蛋白质。
14.如权利要求13所述的方法，其中异源核酸和/或异源蛋白质是治疗剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
16.如权利要求10所述的方法，其中第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
17.一种系统，其包括：
n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；
其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株;
其中n至少是3;
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
18.如权利要求17所述的系统，其中n是3。
19.如权利要求17所述的系统，其中n是4、5、6、7、8、9或10。
20.如权利要求17所述的系统，其中毒素系统在基因组中、质粒上、多个质粒上或其组合中编码。
21.如权利要求17所述的系统，其中，所述细菌菌株还包含编码治疗剂的核酸。
22.如权利要求21所述的系统，其中，所述治疗剂选自下组：抑制性核酸、细胞因子、酶、肽激素、融合蛋白、凝血因子、毒素、抗菌肽、和抗体或其抗原结合片段。
23.如权利要求21所述的系统，其中，所述治疗剂是治疗性多肽。
24.如权利要求21所述的系统，其中，所述治疗剂对靶细胞有细胞毒性或细胞抑制性。
25.一种药物组合物，其包含如权利要求17所述的系统。
26.权利要求17所述的系统的用途，其特征在于，用于制备在有此需要的对象中治疗疾病的药物，
所述系统包括n种细菌菌株，其至少包括第一细菌菌株、第二细菌菌株和第n细菌菌株；其中第二细菌菌株到第n细菌菌株中的每一种都具有先前的细菌菌株;
其中n至少是3;
其中所述n种细菌菌株中的每一种都包含毒素系统；
其中第二到第n细菌菌株中的每种菌株的毒素系统独立地产生第一毒素/第一抗毒素对，和来自先前的细菌菌株产生的第二毒素/第二抗毒素对的第二抗毒素，其中第一毒素对先前的细菌菌株有效；和
其中第一细菌菌株的毒素系统产生第三毒素/第三抗毒素对，和来自第n细菌菌株产生的第四毒素/抗毒素对的第四抗毒素，其中第三毒素对第n细菌菌株有效。
27.如权利要求26所述的用途，其中n是3。
28.如权利要求26所述的用途，其中n是4、5、6、7、8、9或10。
29.如权利要求26所述的用途，其中毒素系统中的每一个在基因组中、在质粒上、在多个质粒上或其组合中独立编码。
30.如权利要求26所述的用途，其中第二细菌菌株至第n细菌菌株中的每一种均不产生前一菌株的毒素系统的第二毒素，第一细菌菌株不产生第n细菌菌株的毒素系统的第四毒素。
31.如权利要求26所述的用途，其中，所述疾病是癌症或感染。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述感染由选自下组的感染物引起：空肠弯曲菌(Camphylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和沙门氏菌(Salmonella)。
33.如权利要求32所述的用途，其中，所述癌症选自下组：成胶质细胞瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌和前列腺癌。
CN201980053732.8A 2018-06-08 2019-06-07 多菌株种群控制系统和方法 Active CN112601536B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862682755P 2018-06-08 2018-06-08
US62/682,755 2018-06-08
PCT/US2019/036179 WO2019237083A1 (en) 2018-06-08 2019-06-07 Multistrain population control systems and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112601536A CN112601536A (zh) 2021-04-02
CN112601536B true CN112601536B (zh) 2024-01-09

Family

ID=68770625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980053732.8A Active CN112601536B (zh) 2018-06-08 2019-06-07 多菌株种群控制系统和方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11896626B2 (zh)
EP (1) EP3801582A4 (zh)
JP (1) JP2021526802A (zh)
CN (1) CN112601536B (zh)
CA (1) CA3102955A1 (zh)
WO (1) WO2019237083A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11174486B2 (en) 2015-04-09 2021-11-16 The Regents Of The University Of California Engineered bacteria for production and release of therapeutics
US20230044530A1 (en) * 2019-12-13 2023-02-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of using inducible signaling for tunable dyanmics in microbial communities
KR102562275B1 (ko) * 2023-03-07 2023-07-31 천준영 미세조류의 생화학적 봉쇄 방법 및 이를 적용한 유전자 조작된 미세조류 이용 하폐수 정화 방법
KR102575631B1 (ko) * 2023-03-07 2023-09-06 천준영 미세조류 생화학적 봉쇄 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103635571A (zh) * 2011-06-30 2014-03-12 艾克森美孚研究与工程公司 调控毒素和抗毒素基因用于生物防范
US9593339B1 (en) * 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
WO2017203533A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Mybiotics Pharma Ltd. Composition and methods for microbiota therapy

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196318A (en) 1990-06-26 1993-03-23 The Texas A&M University System Precisely regulated expression of deleterious genes
US6559176B1 (en) * 2000-05-10 2003-05-06 Princeton University Compounds and methods for regulating bacterial growth and pathogenesis
WO2006047517A2 (en) * 2004-10-26 2006-05-04 University Of Maryland Baltimore Live attenuated bacterial vaccine to reduce or inhibit carriage and shedding of enterohemorrhagic escherichia coli in cattle
EP1655370A1 (en) 2004-11-05 2006-05-10 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung Bacterial vector
US8372090B2 (en) 2006-10-05 2013-02-12 Covidien Lp Flexible endoscopic stitching devices
EP2114992A2 (en) * 2007-01-09 2009-11-11 Yissum Research Development Company, of The Hebrew University of Jerusalem Anti-bacterial peptides and methods of treating diseases using same
JP2012500027A (ja) * 2008-08-20 2012-01-05 ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ 新規の毒素−抗毒素系
EP2182068A1 (en) 2008-10-28 2010-05-05 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Use of bacteria for the sensing and killing of cancer cells
CN201362719Y (zh) 2009-01-15 2009-12-16 北京航空航天大学 一种实现细胞间振荡子同步的电路结构
JP5612269B2 (ja) * 2009-04-24 2014-10-22 花王株式会社 歯周病マーカー
WO2011150421A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
US8942321B2 (en) 2010-09-22 2015-01-27 Qualcomm Incorporated Efficient compressed sensing channel estimation for single-carrier communication systems
US9603877B2 (en) 2011-08-31 2017-03-28 Nanyang Technological University Isolated nucleotide molecule and method of sensing and killing of pathogenic microorganism
US9044020B2 (en) 2011-08-31 2015-06-02 Nanyang Technological University Isolated nucleotide molecule and method of sensing and killing of pathogenic microorganism
CA2884816A1 (en) * 2012-09-13 2014-03-20 Massachusetts Institute Of Technology Programmable drug delivery profiles of tumor-targeted bacteria
SE537235C2 (sv) 2012-09-21 2015-03-10 Valeas Recycling Ab Förfarande och arrangemang för återvinning av förångningsbara ämnen ur en slagg medelst plasmainducerad förångning
SG11201502658UA (en) 2012-12-21 2015-05-28 Univ Nanyang Tech Programmable synthetic lysis system for controlled release of macromolecules
KR20230165365A (ko) * 2014-04-15 2023-12-05 에이오바이오미 엘엘씨 암모니아-산화 니트로소모나스 유트로파 균주 d23
KR101647491B1 (ko) 2014-06-25 2016-08-11 전남대학교산학협력단 유도자 불요구성 자가세포농도 인식 자가 유도시스템 및 그의 용도
CN104131018A (zh) 2014-07-31 2014-11-05 厦门大学 一种细胞内蛋白自诱导表达的方法
US11174486B2 (en) 2015-04-09 2021-11-16 The Regents Of The University Of California Engineered bacteria for production and release of therapeutics
US20210284953A1 (en) 2017-05-19 2021-09-16 The Regents Of The University Of California Synthetic quorum-regulated lysis
US20230044530A1 (en) 2019-12-13 2023-02-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of using inducible signaling for tunable dyanmics in microbial communities

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103635571A (zh) * 2011-06-30 2014-03-12 艾克森美孚研究与工程公司 调控毒素和抗毒素基因用于生物防范
US9593339B1 (en) * 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
WO2017203533A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Mybiotics Pharma Ltd. Composition and methods for microbiota therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CA3102955A1 (en) 2019-12-12
WO2019237083A1 (en) 2019-12-12
US11896626B2 (en) 2024-02-13
US20210169941A1 (en) 2021-06-10
EP3801582A4 (en) 2022-07-06
JP2021526802A (ja) 2021-10-11
EP3801582A1 (en) 2021-04-14
CN112601536A (zh) 2021-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112601536B (zh) 多菌株种群控制系统和方法
JP6673936B2 (ja) 治療剤の製造および放出のための遺伝子操作された細菌
US20230126966A1 (en) Synthetic quorum-regulated lysis
EP3360967A1 (en) Polycistronic expression system for bacteria
Dwidar et al. Controlling Bdellovibrio bacteriovorus gene expression and predation using synthetic riboswitches
Halvorsen et al. Comparison of kill switch toxins in plant-beneficial Pseudomonas fluorescens reveals drivers of lethality, stability, and escape
US20230022575A1 (en) Bacterial conjugative system and therapeutic uses thereof
US20220259605A1 (en) Modified cell
WO2021119436A1 (en) Compositions and methods of using inducible signaling for tunable dyanmics in microbial communities
Din Engineered Synchrony of Bacterial Lysis and Its Applications
Zhang The Mechanism of Lysis-Lysogeny Decision-Making of Bacteriophage P1
Triassi Synthetic biology approaches for engineering bacteria as living therapeutics
ES2274663B1 (es) Metodo de contencion biologica basado en la expresion de los genes pertenecientes a las familias genicas zeta y epsilon.
Mok et al. Small Size, Big Impact: Bacterial Functional Nucleic Acids and Their Applications

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant