CN112595769A - 利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用PEI‑Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，本发明利用PEI‑Fc做还原剂和保护剂，原位还原HAuCl4和AgNO3，制备金纳米粒子、银纳米粒子；包括以下步骤：PEI‑Fc@AuNPs、PEI‑Fc@AgNP,PEI‑Fc@AuNPs‑D‑Trp/PEI‑Fc@AgNPs‑D‑Trp/GC和PEI‑Fc@AuNPs‑D‑Trp/PEI‑Fc@AgNPs/L‑Trp/GC电极的制备以及电化学识别色氨酸对映体。本发明的有益效果为：修饰电极的制备过程简单，环保，且该修饰电极对色氨酸对映体具有明显的识别效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的制备方法，属于电化学分析和生物技术领域。
背景技术
自然界中的大部分物质都是具有手性的，就像具有手性的氨基酸，基本上只有一种构型对人类的生活会产生有利影响，另一种对人类无益或者产生毒副作用。众所周知，Trp被认为是神经递质血清素的前体；L-Trp的含量与肝病密切相关；肽类抗生素和免疫抑制剂的制备需要D-Trp作为中间体。所以识别手性氨基酸对人类生活来说具有重要的研究意义。电化学分析方法具有操作简便、响应时间快、反应灵敏等优点，在手性识别氨基酸时具有较好的应用前景。
在现有技术中，涉及纳米金、纳米银在识别手性色氨酸的应用，但大多涉及比色法识别手性氨基酸。而在电化学手性识别色氨酸中的应用不多。其中在“CN201910958326.8一种分子印迹Au纳米粒子手性界面的构建方法”中涉及修饰电极的制备以及电化学性能测试，但该修饰电极用于Trp对映体的电化学对映选择性识别效果不佳。
因此如何基于简单快速纳米金、纳米银制备得到电化学识别手性氨基酸效果好的电极以及识别方法，是本发明所研究的重点。
发明内容
为了解决背景技术中的问题，本发明涉及一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，本发明利用PEI-Fc分别与HAuCl4、AgNO3原位生成金纳米粒子、银纳米粒子。由于纳米粒子与D-Trp结合的能力大于与L-Trp结合，另一方面铜离子与D-Trp的结合能力大于与L-Trp的结合能力，因此银纳米粒子与D-Trp作用强于其与L-Trp作用，铜离子的加入可作为桥梁，使得更多的D-Trp通过铜离子连接形成聚集体而组装到电极表面，这样有更多的银纳米粒子组装到电极表面，通过跟踪纳米银的氧化峰电流大小来间接区分Trp对映体，从而起到了放大识别色氨酸对映体的目的。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的制备方法，其中包括用于识别色氨酸对映体的修饰电极的制备，电极制备方法包括为：
a、PEI-Fc@AuNPs的制备：将5-15mMHAuCl4溶液缓慢的加入0.5-2mg/mLPEI-Fc溶液中反应一段时间，得到PEI-Fc@AuNPs；
b、PEI-Fc@AgNPs的制备：将60-100mMAgNO3溶液逐滴加入0.5-2mg/mL PEI-Fc溶液中反应一段时间，得到PEI-Fc@AgNPs。
c、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极的制备：取0.05–10mMD-Trp溶液逐滴加入步骤a制备的PEI-Fc@AuNPs溶液中反应一段时间后，然后将玻碳电极浸泡在溶液中一段时间，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极。
d、PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液的制备：取0.05–10mMD-Trp溶液逐滴加入步骤b中制备的PEI-Fc@AgNPs溶液中反应一段时间后，加入5-15mM铜离子溶液反应一段时间，得到PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液。
e、PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液的制备:取0.05-10mML-Trp逐滴加入步骤b制备的PEI-Fc@AgNPs溶液中反应一段时间后，再加入5-15mM铜离子溶液反应一段时间后，得到PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液。
f、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC电极的制备：将步骤c中制备的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC修饰电极分别浸泡在步骤d制备的PEI-Fc@AgNPs-D-Trp溶液中一段时间即可得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC电极。
g、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC电极的制备：将步骤c中制备的修饰电极分别浸泡在步骤e制备的溶液中一段时间即可得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC电极。
进一步，步骤a中PEI-Fc溶液和HAuCl4溶液的体积比为3～5:1，反应时间为10-30min。
进一步，步骤b中PEI-Fc溶液和AgNO3溶液的体积比为30～50:1，反应时间为10-30min。
进一步，步骤c中反应时间为5-15min，浸泡时间为10-50min。
进一步，步骤d中反应时间为5-15min，浸泡时间为10-50min，加入的铜离子溶液的浓度为5-15mM，加入铜离子后反应时间为10-40min。
进一步，步骤e中反应时间为5-15min，铜离子溶液浓度5-15mM，加入铜离子后反应时间为10-40min。
进一步，步骤f中浸泡时间为10-50min。
进一步，步骤g中浸泡时间为10-50min。
将上述制备得到的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC电极、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC电极用于识别色氨酸对映体，具体识别方法为：
电化学识别手性色氨酸：步骤f、g中制备的修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将该三电极体系同时浸入配制的缓冲溶液中，一段时间后，使用差分脉冲伏安法以一定的扫描速率进行测试，通过跟踪电极的纳米银的氧化峰电流大小来间接区分Trp对映体，起到放大识别色氨酸对映体的目的。
缓冲溶液为溶液浓度0.01-1M的磷酸缓冲盐溶液，结合时间为1-5min，富集电位为0.4-1V。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明
图1为各修饰电极的阻抗谱图；
图2为手性界面对Trp对映体选择性识别的DPV图；
图3为不同浓度的的铜离子对手性界面电化学识别Trp对映体的影响。
具体实施方式
现在结合具体实施对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
其中PEI-Fc参考现有技术中的常规方法进行自制，如采用“基于二茂铁的电刺激响应层状多层膜的研究”中方法制备PEI-Fc。
实施例一：
a、制备PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC修饰电极：
(1)PEI-Fc@AuNPs的制备：将1mL 10mM HAuCl4缓慢的加入3mL 1mg/mL PEI-Fc溶液中，反应15min，得到PEI-Fc@AuNPs。
(2)PEI-Fc@AgNPs的制备：将75μL 80mMAgNO3溶液逐滴加入3mL1mg/mLPEI-Fc溶液中反应15min，得到PEI-Fc@AgNPs；
(3)PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极的制备：取1μL 5mM D-Trp溶液逐滴加入1mL步骤(1)制备的PEI-Fc@AuNPs溶液中反应10min，然后将玻碳电极浸泡在溶液中30min，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极。
(4)PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液的制备：取1μL 5mMD-Trp溶液逐滴加入1mL步骤(2)中制备的PEI-Fc@AgNPs溶液中，反应10min后，加入100μL10mM铜离子溶液(硫酸铜溶液)，反应20min，得到PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液；
(5)PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC电极的制备：将步骤(3)中制备的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC修饰电极浸泡在步骤(4)制备的PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液中15min，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC修饰电极。
b、制备PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC修饰电极：
(1)PEI-Fc@AuNPs的制备：将1mL 10mM HAuCl4缓慢的加入3mL 1mg/mL PEI-Fc溶液中，反应15min，得到PEI-Fc@AuNPs；
(2)PEI-Fc@AgNPs的制备：将75μL 80mMAgNO3溶液逐滴加入3mL1mg/mLPEI-Fc溶液中反应15min，得到PEI-Fc@AgNPs；
(3)PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极的制备：取1μL 5mM D-Trp溶液逐滴加入1mL步骤(1)制备的PEI-Fc@AuNPs溶液中反应10min，然后将玻碳电极浸泡在溶液中30min，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极；
(4)PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液制备：取1μL 5mML-Trp逐滴加入1mL步骤b中制备的PEI-Fc@AgNPs溶液中，反应10min后，加入100μL10mM铜离子溶液(硫酸铜溶液)，反应15min，得到PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液。
(5)PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC电极的制备：将步骤(3)中制备的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC修饰电极浸泡在步骤(4)制备的PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液中15min，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC修饰电极。
将上述制备的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC修饰电极(a)、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC修饰电极(b)用于电化学识别色氨酸对映体，具体为：
以修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将该三电极体系同时浸入配制的0.1M的磷酸缓冲盐溶液中，1min后，使用差分脉冲伏安法以一定的扫描速率进行测试(电位范围为-0.3-0.4V、电位增幅0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，采样宽度0.0167s，脉冲周期0.5s)，比较a、b电极的电流差别。
(1)其中，由图2可知：在0.056V处出现了纳米银的氧化峰，PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GCE(a)的峰电流明显比PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GCE(b)峰电流大，a/b的比值为7.14。
PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GCE修饰电极中是以PEI-Fc@AuNPs-D-Trp作为基底，通过铜离子与D-Trp的氨基、羧基相互作用形成稳定的配合物，而铜离子与L-Trp的氨基、羧基作用力弱，形成的配合物不稳定，因此PEI-Fc@AgNPs-D-Trp能形成聚体，而PEI-Fc@AgNPs-L-Trp很难形成聚集体，电化学检测Trp对映体上也会有明显的差别。
上述对比后说明PEI-Fc@AgNPs-D-Trp通过铜离子作为桥梁更多的富集在电极表面，从而导致更多的纳米银固定在电极表面，因此纳米银的氧化峰电流明显增加，可以明显提高传感器对Trp对映体的识别效率。
(2)图1是分别以PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GCE修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将该三电极体系同时浸入配制的铁氰化钾溶液进行阻抗测试。
由图1可知：PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GCE在铁氰化钾溶液中的阻抗小于PEI-Fc@AuNPs-D-Trp-PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GCE的阻抗，说明PEI-Fc@AgNPs-L-Trp通过与铜离子相互作用，成功组装到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GCE上，聚合物在电极表面组装，阻碍了铁氰化钾到达电极表面；PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GCE的阻抗大于PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GCE的阻抗,说明PEI-Fc@AgNPs-D-Trp与铜离子结合组装到电极表面的量大于PEI-Fc@AgNPs-L-Trp与铜离子结合组装到电极表面的量。
(3)研究不同浓度的的铜离子对手性界面电化学识别Trp对映体的影响在制备PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC和PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC电极过程中加入不同体积的铜离子(浓度为5-15mM)，使得铜离子在混合溶液中浓度在0-3mM内，将得到的电极作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将该三电极体系同时浸入配制的0.1M的磷酸缓冲盐溶液中，1min后，使用差分脉冲伏安法以一定的扫描速率进行测试，比较电流差别。
由图3可知：其他条件相同，只改变加入铜离子的体积，使其在混合液中浓度在0-1mM范围内随着铜离子的浓度增加，峰电流逐渐增加，当混合液中的铜离子浓度大于1mM时峰电流开始下降，可能是(PEI-Fc@AuNPs-D-Trp-Cu2+-PEI-Fc@AuNPs-D-Trp)聚集体太大，很难通过铜离子作为桥梁与PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GCE相互作用，结合到电极表面，只有合适的聚集体能过通过铜离子作为桥梁与PEI-Fc@AuNPs-D-Trp相互作用结合到电极表面。所以在一定范围能随着铜离子的量增加，峰电流增加，浓度过高，电流比反而下降。
Claims (8)
1.一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于，步骤如下：
a、PEI-Fc@AuNPs的制备：将HAuCl4缓慢加入PEI-Fc中反应一段时间，得到PEI-Fc@AuNPs；
b、PEI-Fc@AgNPs的制备：将AgNO3溶液逐滴加入PEI-Fc溶液中反应一段时间，得到PEI-Fc@AgNPs；
c、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC电极的制备：取D-Trp溶液逐滴加入步骤a制备的PEI-Fc@AuNPs溶液中反应一段时间，然后将玻碳电极浸泡在反应后的溶液中一段时间，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC；
d、PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液制备：取D-Trp溶液逐滴加入步骤b中制备的PEI-Fc@AgNPs溶液中反应一段时间后，加入铜离子溶液反应一段时间，得到PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液；
e、PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液制备:取L-Trp溶液逐滴加入步骤b制备的PEI-Fc@AgNPs溶液中反应一段时间后，加入铜离子溶液反应一段时间，得到PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液；
f、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC电极的制备：将步骤c中制备的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC修饰电极浸泡在步骤d制备的PEI-Fc@AgNPs-D-Trp聚集溶液中一段时间，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-D-Trp/GC电极；
g、PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@-AgNPs/L-Trp/GC电极的制备：将步骤c中制备的PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/GC修饰电极浸泡在步骤e制备的PEI-Fc@AgNPs-L-Trp聚集溶液中一段时间，得到PEI-Fc@AuNPs-D-Trp/PEI-Fc@AgNPs-L-Trp/GC电极。
h、电化学识别手性色氨酸：步骤f、g中制备的修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将该三电极体系同时浸入配制的缓冲溶液中，一段时间后，使用差分脉冲伏安法进行扫描测试，识别手性色氨酸。
2.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤a中聚乙烯亚胺接枝二茂铁(PEI-Fc)的浓度为0.5-2mg/mL，反应时间为10-30min。
3.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤b中AgNO3浓度为60-100mg/mL，反应时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤c中D-Trp溶液的浓度均为0.05-10mM，浸泡时间为10-50min。
5.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤d中D-Trp溶液浓度均为0.05-10mM，反应时间为5-15min，铜离子溶液的浓度为5-15mM，反应时间为10-40min。
6.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤e中L-Trp溶液的浓度均为0.05-10mM，反应时间为5-15min，铜离子溶液的浓度5-15mM，反应时间为10-40min。
7.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤f中浸泡时间为10-50min：所述步骤g中浸泡时间为10-50min。
8.根据权利要求1所述一种利用PEI-Fc原位生成纳米银用于放大识别色氨酸对映体的方法，其特征在于：所述步骤h中缓冲溶液浓度0.01-1M，结合时间1-5min，富集电位为0.4-1.0V。
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| CN109813785A (zh) * | 2019-02-21 | 2019-05-28 | 济南大学 | 一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体传感器 |
| CN110231388A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-09-13 | 常州大学 | 一种壳聚糖/脱氧核糖核酸修饰电极的制备及其用于电化学识别色氨酸对映体的方法 |
| CN110243897A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-17 | 常州大学 | 一种聚乙烯亚胺/手性肽修饰玻碳电极的制备及其在色氨酸对映体选择性识别中的应用 |
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