CN112592955A

CN112592955A - 一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法

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Publication number: CN112592955A
Application number: CN202110109950.8A
Authority: CN
Inventors: 章高森; 刘阳; 张威; 陈拓; 刘光琇
Original assignee: Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2021-04-02

Abstract

本发明涉及一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法，该方法是指：首先将待测菌株活化并液体摇瓶培养，然后在液体培养基中培养至对数生长期前中期，并制成OD₆₀₀=1的菌悬液；然后将菌悬液分为两部分，其中：一部分作为对照组，采用液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后培养；另一部分作为处理组，与浓度为3mM的双氧水混合，恒温振荡培养处理，得到处理后的菌液，该处理后的菌液采用液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后培养；最后，分别统计对照组和处理组的菌落数量并计算存活率，若处理组的存活率高于对照组的存活率，则该待测菌株具有较强的抗电离辐射能力。本发明操作简单、效率高。

Description

一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法。

背景技术

电离辐射是指波长短、频率高、能量高的射线，可通过与物质的相互作用能够直接或间接地使物质的原子、分子电离的辐射。从来源上划分，人类主要接收的电离辐射包括天然辐射和人造辐射。其中，天然辐射主要来源于太阳、宇宙射线和在地壳中存在的放射性核素；人造辐射主要来源于医用设备(例如医学及影像设备)、研究及教学机构、核反应堆及其辅助设施等。从类型上划分，电离辐射分为电磁辐射（X射线、γ射线等电磁波）和粒子辐射（包括α粒子、β粒子、质子、碳离子等带电粒子，和中子等不带电粒子）。当电离辐射作用于生物时，可以通过能量传递直接作用于生物大分子，也可以通过与水分子作用产生活性氧自由基进而对生物大分子造成损伤，从而引发一系列生物学效应。当中高剂量的电离辐射作用于人时，可造成急性、迟发性或慢性的机体组织损害，导致头晕、乏力、慢性皮肤损伤、造血障碍、白内障、脑损伤、肾损伤、肺纤维样变性、白血病、癌症等症状或疾病。

辐射损伤防治药物是救治与防护电离辐射损伤最为有效和直接的手段之一。从抗电离辐射微生物中开发新型辐射损伤防护药具有显著优势和潜力，但目前研究较少。目前辐射损伤防治药物主要来源于抗辐射能力并不强的动植物，而微生物源性的辐射损伤防护药物的研究却很少。在地球上抗电离辐射能力最强的生物是一些细菌。人类一次全身照射的半致死剂量约5Gy，如果剂量达到10Gy以上，受照者在一二个月内100%死亡。而抗辐射奇异球菌在γ射线辐射剂量为10000Gy时，存活率仍在10%以上。除奇异球菌属外，在其它菌属中也有发现耐辐射微生物的报道，如耐辐射红色杆菌等一些抗辐射能力强的细菌。这些特殊细菌可以通过调节基因表达来应对电离辐射，它们或具有很强活性氧自由基清除能力，或具有特殊的DNA双链断裂修复机制，或能产生类菌胞素氨基酸、伪枝藻素、四氢嘧啶、菌红素、Deinoxanthin等特殊代谢产物来保护其免受电离辐射损伤。

因此，筛选抗电离辐射能力强的微生物，是开发微生物源性辐射损伤防护药物的前提条件。然而，开展电离辐射实验需要有专门的仪器设备，对安全的要求也比较高，很多实验室受此限制无法开展相关实验。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、效率高的抗电离辐射微生物的快速筛选方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法，其特征在于：首先将待测菌株活化并液体摇瓶培养，然后按1：200的体积比在液体培养基中于20~30℃培养16~48h至对数生长期前中期，并制成OD₆₀₀ = 1的菌悬液；然后将所述菌悬液分为两部分，其中：一部分作为对照组，采用所述液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后，于20~30℃培养1~14天；另一部分作为处理组，与浓度为3mM的双氧水按1：1的体积比混合，于20~30℃恒温振荡培养处理40min，得到处理后的菌液，该处理后的菌液采用所述液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后，于20~30℃培养1~14天；最后，分别统计所述对照组和所述处理组的菌落数量并计算存活率，若所述处理组的存活率高于所述对照组的存活率，则该待测菌株具有较强的抗电离辐射能力。

所述培养基是指LB 液体培养基、R₂A液体培养基、TSB液体培养基中的一种。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过对待测菌株采用双氧水进行处理、培养，即可获得具有较强的抗电离辐射能力，不但操作简单，效率高，而且筛选结果好。

2、本发明实验平台要求低，可以在没有电离辐射实验条件的实验室中开展抗电离辐射微生物的快速筛选工作，因此，具有很好的推广使用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明中不同浓度双氧水处理后菌落数量的变化。

图2为本发明中菌株经10kGy γ射线辐照后的菌种存活率（%）。

图3为本发明双氧水中的存活率与抗电离辐射能力的相关性分析图。

具体实施方式

一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法：首先将待测菌株活化并液体摇瓶培养，然后按1：200的体积比在液体培养基中于20~30℃培养16~48h至对数生长期前中期，并制成OD₆₀₀ = 1的菌悬液；然后将菌悬液分为两部分，其中：一部分作为对照组，采用液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后，于20~30℃培养1~14天；另一部分作为处理组，与浓度为3mM的双氧水按1：1的体积比混合，于20~30℃恒温振荡培养处理40min，得到处理后的菌液，该处理后的菌液采用液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后，于20~30℃培养1~14天；最后，分别统计对照组和处理组的菌落数量并计算存活率，若处理组的存活率高于对照组的存活率，则该待测菌株具有较强的抗电离辐射能力。

其中：培养基是指LB 液体培养基、R₂A液体培养基、TSB液体培养基中的一种。

LB 液体培养基是指将氯化钠10 g、酵母提取物5 g、蛋白胨10 g混合，加入1000mL蒸馏水，于121℃、102KPa灭菌20min制得。

R₂A液体培养基是指将葡萄糖0.50 g、酪蛋白氨基酸0.50 g、酵母提取物 0.50 g、䏡蛋白胨0.50 g、丙酮酸盐0.30 g、磷酸氢二钾0.30 g、可溶性淀粉0.50 g混合，加入1000.00 mL蒸馏水，并采用1M氢氧化钠或l M盐酸调节pH为7，于121℃、102KPa灭菌20min制得。

TSB液体培养基是指将胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化钠5 g混合，加入1000ml蒸馏水，并采用1M氢氧化钠或l M盐酸调节pH为7，于121℃、102KPa灭菌20min制得。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法。为了保证的实施例的可重复性，实验菌株都可在菌种保藏中心获得。保藏编号如表1：

表1

实施例

一、模式菌株在不同浓度双氧水中的存活率测定：

（1）复苏冻存的菌株，将复苏后的菌株划线接种到与菌株相匹配的固体培养基中培养24~72h，取部分单菌落于20 mL与菌株相匹配的液体培养基中培养至对数期，再吸取菌液100 μL于20 mL 相同液体培养基中，摇瓶培养16~48h到达对数生长期。

（2）吸取1mL对数生长期的菌液，测定OD₆₀₀值后将菌液稀释至OD₆₀₀ = 1；将浓度为OD₆₀₀ = 1的部分菌液梯度稀释后用三角涂布棒（浸泡于异丙醇并火烧灭菌），涂于平板进行培养，作为未进行氧化胁迫的对照组。

（3）将30%的过氧化氢溶液进行稀释，制作H₂O₂稀释液，浓度梯度设置为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1，2，3，5，8，10，20，30，40，60，80, 100mM。对于每个浓度的H₂O₂稀释液，在试管中加入1mL菌液和1mL H₂O₂稀释液，对照组加入1mL去离子水代替H₂O₂稀释液，恒温振荡培养处理40分钟。每个处理组做3个平行实验。

（4）对于氧化胁迫培养好的细菌进行离心，离心条件为6000rpm，10min离心管离心取沉淀，弃上清液；然后用2mL PBS冲洗菌体，6000 rpm，10 min再离心，取上清取沉淀，重复三次。最后加入2mL LB液体培养基，彻底混合菌体。

（5）吸取1mL系列菌液梯度稀释后用三角涂布棒（浸泡于异丙醇并火烧灭菌）涂于平板，室温下静置10分钟。每个稀释液和对照组做三个重复；在室温下培养2~4天。记录菌落数在30~300个之间平板中的菌落数。

（6）对氧化胁迫后的平板长出的菌落计数后，再对照未经过氧化胁迫的菌株计数结果，计算并制作菌株存活率曲线图，如图1所示。

由图1可知，对数生长期的菌悬液经双氧水处理40分钟后，在平板上形成的菌落数量比未经双氧水处理的对照组要少，处理时用的双氧水浓度越大，菌落数量越少。未经双氧水处理和经过1mM、5mM双氧水处理后稀释相同浓度并涂布培养的平板，可明显看到双氧水处理后细菌菌落数量的减少，通过菌落数量的百分比可以计算双氧水处理后的存活率。

二、模式菌株抗电离辐射能力的验证：

1、模式菌株摇瓶培养：

按前述方法获得的对数生长期的菌液。

2、电离辐射后的存活率测定：

（1）将OD₆₀₀ = 1的菌液中各取3mL至无菌的5mL EP管中，做好标记。

（2）将菌液样本在57 Co/Rh源 Wissel伽马射线仪上进行10KGy辐照剂量的γ射线辐照。

（3）将辐照完的菌液进行梯度稀释10000倍后在与菌株相匹配的固体培养基上涂平板，然后恒温培养1~14天，待菌落完全生长进行计数。以上所有实验都进行三平行对照。

对数生长期的菌液经剂量为10kGy的γ射线辐照后，按平板菌落计数的办法计算该菌株的存活率，在图2中可以看出，Deinococcus radiodurans的存活率最高（13%），而Escherichia coli最低（0%），其他模式菌株的存活率处于此二者之间。

3、双氧水中的存活率和抗电离辐射强度相关性分析：

将不同浓度双氧水中处理后和γ射线辐照后各个菌株的存活率数据进行线性回归分析，验证二者之间的线性相关关系。

如图3所示，以双氧水中的存活率为纵轴，以γ射线辐照后的存活率为横轴，对15个模式菌株的实验结果作图并做相关性分析发现：菌株在经过浓度为0.1~10 mM双氧水处理后的存活率与受到电离辐射（10kGy γ射线辐照）后的存活率呈线性相关关系，综合考虑实验结果的稳定性、回归直线对观测值的拟合程度等因素后，本发明将3 mM的双氧水确定为最终使用浓度。

4、结论：在双氧水中存活率高的菌株，其抗电离辐射能力也更强。综合一致性和筛选有效性等因素，最终确定筛选强抗氧化能力的菌株是双氧水浓度在3mM左右比较合适。

备注：以上案例实施过程在500多株好氧细菌中重复过，未发现不适用此快速检测方法的例子。

Claims

1.一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法，其特征在于：首先将待测菌株活化并液体摇瓶培养，然后按1：200的体积比在液体培养基中于20~30℃培养16~48h至对数生长期前中期，并制成OD₆₀₀ = 1的菌悬液；然后将所述菌悬液分为两部分，其中：一部分作为对照组，采用所述液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后，于20~30℃培养1~14天；另一部分作为处理组，与浓度为3mM的双氧水按1：1的体积比混合，于20~30℃恒温振荡培养处理40min，得到处理后的菌液，该处理后的菌液采用所述液体培养基进行梯度稀释，稀释菌液浓度至10000倍后，于20~30℃培养1~14天；最后，分别统计所述对照组和所述处理组的菌落数量并计算存活率，若所述处理组的存活率高于所述对照组的存活率，则该待测菌株具有较强的抗电离辐射能力。

2.如权利要求1所述的一种抗电离辐射微生物的快速筛选方法，其特征在于：所述培养基是指LB 液体培养基、R₂A液体培养基、TSB液体培养基中的一种。