CN112574280A - 一种双酶体系探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核医学领域，涉及一种双酶体系探针及其应用。该探针具有式I所示结构，其中，QD为荧光基团或药物基团；L为linker，具有式II所示结构；T为PSMA特异性靶向基团；Z为H、核素螯合基团、放射性核素或螯合有放射性核素的核素螯合基团。本发明基于前列腺特异性膜抗原PSMA靶向和Caspase‑3识别策略来递送药物分子的双酶体系核医学探针，可以靶向前列腺癌进行放疗增敏治疗，有助于解决去势抗性前列腺癌患者放疗抵抗和靶向核素治疗抗性等难题，并有望实现前列腺癌术中导航。为肿瘤治疗的检测和治疗提供更多高效的工具，具有广阔的应用前景。
Figure DDA0002849339060000011

Description

一种双酶体系探针及其应用
技术领域
本发明属于核医学领域，具体地，涉及一种双酶体系探针及其应用。
背景技术
前列腺癌作为男性致死率排名第二的恶性肿瘤，在西方发达国家的癌症发病率中占据首位。随着我国经济社会的不断发展，人口老龄化问题突出，城镇化和工业化进程的不断加快，不健康生活方式和慢性感染因素的逐渐累积，前列腺癌的发病率和死亡率呈现每年递增的态势。对于前列腺癌病灶可以采用放疗和手术的方式进行治疗，中晚期前列腺癌内分泌治疗也可以取得非常良好的疗效，但是去势抗性前列腺癌(Castration resistantprostate cancer，CRPC)对内分泌治疗及放疗均不敏感，且预后很差；核素靶向治疗在针对晚期去势抗性前列癌的靶向治疗方面表现出了高达80％的有效控制率，但缓慢的治疗周期会导致肿瘤细胞突变，进而产生抗性。因此，如何解决去势抗性前列癌患者的放疗抵抗难题，提高放射生物学效应，增加对肿瘤细胞的杀伤能力，是解决该类患者临床需求的关键。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种II跨膜糖蛋白，可以将与之结合的抑制剂由胞膜转运至胞内，同时PSMA仅高表达于前列腺癌以及多种癌症的新生血管中，在正常组织中只有少量表达。这使得PSMA成为前列腺癌核素成像和靶向治疗的理想生物标志物，近年来，基于PSMA靶向的小分子试剂在前列腺癌诊疗领域取得了长足的进步。
Caspase-3是一种半胱氨酸蛋白酶，存在于胞质中，其表达量与细胞凋亡密切相关，放疗介导的细胞凋亡会致使Caspase-3表达量升高，目前基于此的靶向放射诱导的肿瘤细胞凋亡药物递送策略取得了良好的成果。因此基于前列腺特异性膜抗原PSMA靶向和Caspase-3识别功能分子递送(药物和荧光染料)的双酶体系核医学探针，可以达到放疗和靶向核素治疗增效的目的，有助于解决去势抗性前列腺癌患者放疗抵抗和靶向核素治疗抗性等难题，并有望实现前列腺癌术中导航。
如能开发具有良好的靶点亲和力和体内代谢能力的前列腺特异性膜抗原PSMA靶向和Caspase-3识别的核素成像/治疗试剂，特别是68Ga、18F、99mTc和177Lu等核素标记的试剂，将为肿瘤治疗的检测和治疗提供更多高效的工具，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种前列腺特异性膜抗原PSMA靶向和Caspase-3识别功能分子(药物或光学染料)递送的双酶体系探针。
具体地，本发明提供一种双酶体系探针，该探针具有式I所示结构，
Figure BDA0002849339040000021
其中，
QD为荧光基团或药物基团；
L为linker，具有式II所示结构：
Figure BDA0002849339040000022
R1为C5-C8的亚环烷基或亚芳基；R2为取代或未取代的芳基；n为1-6的整数；
T为PSMA特异性靶向基团；
Z为H、核素螯合基团、放射性核素或螯合有放射性核素的核素螯合基团。
根据本发明，优选地，式II所示结构中，R1为亚苯基或亚环己基；a为1、2、3或4；R2为取代或未取代的苯基或萘基，取代的基团为卤素、羟基、氨基、羧基或C1-C4烷基；所述取代优选为单取代。
进一步优选地，R2为对位取代的苯基或萘基，优选为对位卤素取代的苯基或萘基；所述卤素优选为氯、溴、碘。
根据本发明，所述PSMA特异性靶向基团可以为本领域已知的任何特异性靶向PSMA的基团，优选地，所述PSMA特异性靶向基团如式III所示或式IV所示：
Figure BDA0002849339040000031
本发明中，DEVD为已知的Caspase-3识别位点，QD基团并不影响Caspase-3对DEVD的识别，因此从识别Caspase-3实现递送的角度，QD可以为常规的任意荧光基团或药物基团，特别是小分子药物基团。
本发明中，“荧光基团”或“药物基团”的含义为本领域技术人员公知，是指衍生自荧光化合物或药物的基团，通常由荧光化合物或药物反应脱除原结构中的一部分后得到。
具体地，所述荧光化合物选自7-(乙氨基)-4,6-二甲基香豆素、7-氨基-4-三氟甲基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素、香豆素307、7-氨基香豆素、3-氨基香豆素、6-氨基香豆素、7-氨基-4-氯甲基香豆素、3-氨基-7-羟基香豆素、7-氨基-4-羧甲基香豆素、7-氨基-4-甲基-3-香豆素醋酸、7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素、7-氨基-4-氯-3-甲氧基异香豆素、4-氨基-苯并吡喃-2-酮、罗丹明123、二氢罗丹明123、6-氨基四甲基罗丹明、5-氨基四甲基罗丹明、(E)-2-(2-(6-氨基-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基)乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓、(E)-2-(2-(6-氨基-6,3-二氢-1H-噻吨-4-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓、(E)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4H-铬-4-亚甲基)丙二腈、吲哚菁绿-氨基、新吲哚菁绿-氨基、氨基亚甲蓝、5-氨基酮戊酸、5-FITC尸毒素。所述药物基团衍生自药物，所述药物选自蟾酥、紫杉醇、长春瑞宾、多西他塞、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、吉西他宾、阿糖胞苷、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、达卡巴嗪、6-巯基嘌呤、羟基脲、美法仑、柔红霉素去甲氧柔红霉素、氨吖啶、米托蒽醌、依托泊甙、替尼泊苷、三尖杉酯碱、芦卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利。
根据本发明一种具体实施方式，QD为R1、R2、R3或R4所示基团：
Figure BDA0002849339040000041
本发明中，Z取代基的位置可以连接核素，也可以不连接核素。连接的核素可以为诊断用核素，也可以为治疗用核素。当连接治疗用核素时，本发明的双酶体系探针为一种内源性探针，当不连接核素或连接诊断用核素时，本发明的双酶体系探针为一种外源性探针，可配合放疗使用。
当连接核素时，可直接连接，也可以通过核素螯合基团连接，所述核素螯合基团为双功能螯合剂形成的基团，所述双功能螯合剂选自DOTA、NOTA、NODA、NODAGA、DOTP、TETA、ATSM、PTSM、EDTA、EC、HBEDCC、DTPA、SBAD、BAPEN、Df、DFO、TACN、NO2A/NOTAM、CB-DO2A、Cyclen、NOTA-AA、DO3A、DO3AP、HYNIC、MAS3、MAG3或异腈。
上述双功能螯合剂的结构为本领域技术人员公知，例如，DOTA和NOTA结构分别如下所示：
Figure BDA0002849339040000042
根据本发明一种优选实施方式，所述双酶体系探针为Probe B、Probe C、Probe D、Probe E、Probe G，或它们标记放射性核素后形成的核素探针：
Figure BDA0002849339040000043
Figure BDA0002849339040000051
Figure BDA0002849339040000061
根据本发明，所述放射性核素可以为诊断用放射性核素，也可以为治疗用放射性核素；所述诊断用放射性核素优选为68Ga、64Cu、18F、86Y、90Y、89Zr、111In、99mTc、11C、123I、125I和124I中的至少一种；所述治疗用放射性核素优选为177Lu、125I、131I、211At、111In、153Sm、186Re、188Re、67Cu、212Pb、225Ac、213Bi、212Bi和212Pb中的至少一种。本领域技术人员可根据具体需要选择合适的核素。
本发明的双酶体系探针可用于制备影像试剂或治疗剂。
本发明基于前列腺特异性膜抗原PSMA靶向和Caspase-3识别策略来递送药物分子的双酶体系核医学探针，可以靶向前列腺癌进行放疗增敏治疗，有助于解决去势抗性前列腺癌患者放疗抵抗和靶向核素治疗抗性等难题，并有望实现前列腺癌术中导航。为肿瘤治疗的检测和治疗提供更多高效的工具，具有广阔的应用前景。
术语解释
尽管本发明中采用了具体术语，但它们仅以一般的和描述性的意义，而非以限制的目的使用。除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与目前描述的主题所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
如本文使用的，术语“被取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，以及取代基，指的是将分子上的一种官能团改变为另一种官能团的能力，条件是所有原子的化合价被保持。当任何给定结构中的多于一个位置可以被选自指定组的多于一个取代基取代时，取代基在每个位置处可以是相同的或不同的。取代基还可以进一步被取代。如本文使用的，C1-C4烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基。术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的部分指的是衍生自烷基基团的直链或支链的二价脂肪族烃基团；“亚芳基”本身或作为另一取代基的部分指的是衍生自芳香基团的直链或支链的二价芳香族烃基团。除非另外所述，否则术语“芳基”意指芳香族取代基，其可以是单环或稠合多环。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了本发明的双酶体系探针的设计思路，方框中基团仅为示例。
图2示出了Probe A-D的结构。
图3示出了Probe A-D的制备总路线。
图4-8分别为化合物2、Probe A、Probe B、Probe C、Probe D的质谱图。
图9A和图9B示出了Probe A与caspase-3蛋白共孵育的结果。图9A中示出了100μM的Probe A与0U、0.25U、0.5U、1U、2U和4U的人源Caspase-3共孵育后在荧光照射下的照片；图9B为100μM Probe A与caspase-3蛋白共孵育荧光强度变化曲线。
图10为68Ga标记的Probe A-D的荷瘤小鼠PET图。
图11示出了Probe E和Probe F结构式。
图12示出了Probe E和Probe F的制备总路线。
图13为化合物7的质谱图。
图14、15、16分别为化合物8的1H NMR图、1C NMR图、质谱图。
图17-18分别示出了Probe E和Probe F的质谱图。
图19A和19B示出了Caspase-3与Probe E和Probe F的蛋白孵育结果。图19A中示出了100μM的Probe E(DEVD)和100μM Probe F(D-DEVD)与0U,0.25U,0.5U,1U,2U和4U人源Caspase-3孵育后在荧光照射下的照片；图19B为100μM Probe E和100μM Probe F蛋白孵育荧光强度变化曲线。
图20示出了Probe E分别与22RV1(PSMA高表达)细胞和PC-3(PSMA低表达)细胞孵育的结果。其中，图A对应22RV1细胞：细胞核染色(control组)；100μM的Probe E与22RV1细胞孵育，并对细胞核染色(Probe E组)；8GyX射线照射48h后与100μM的Probe E共孵育12h，并对细胞核染色(Probe E+RT组)。图B对应PC-3细胞：细胞核染色(control组)；100μM的Probe E与PC-3细胞进行孵育，并对细胞核染色(Probe E组)；8GyX射线照射48h后与100μM的Probe E共孵育12h，并对细胞核染色(Probe E+RT组)。
图21示出了68Ga标记的Probe E的荷瘤小鼠PET图。
图22示出了Probe E的荷瘤小鼠活体荧光显像图。其中，图A所示为22RV1细胞株的异体移植瘤模型的荷瘤小鼠，尾静脉注射200nmol Probe E，在1h、4h、12h、24h和48h分别对其荧光显像(Before RT)；同批次小鼠放疗10Gy，48h后注射200nmol Probe E，在1h、4h、12h、24h和48h分别对其荧光显像(After RT)；图B所示为放疗前后肿瘤组织荧光强度1h、4h、12h、24h和48h变化图。
图23示出了Probe E的22RV1荷瘤小鼠活体SPECT/CT显像图。A：尾静脉注射500uCi177Lu标记的Probe E，注射后1h、4h、8h、12h和24h的SPECT显像；B：尾静脉共注射500uCi177Lu标记的Probe E和未经核素标记的Probe E200nmol；C：两种注射方式不同时间点肿瘤对177Lu Probe E的摄取；D：两种注射方式不同时间点肝脏对177Lu Probe E的摄取。
图24示出了177Lu Probe E的22RV1荷瘤小鼠活体荧光显像图。A：尾静脉注射500uCi 177Lu标记的Probe E 24h荧光活体显像；B：尾静脉注射500uCi 177Lu标记的Probe E24h后，注射200nmol Probe E 24h活体荧光显像；C：尾静脉共注射500uCi 177Lu标记的Probe E和未经核素标记的Probe E 200nmol 24h荧光活体显像；D：尾静脉共注射500uCi177Lu标记的Probe E和未经核素标记的Probe E 200nmol 48h荧光活体显像。
图25示出了Probe E和Probe F结构式。
图26示出了Probe E和Probe F的制备总路线。
图27、28分别为化合物13、化合物14的质谱图。
图29、30、31分别为化合物16的1H NMR图、1C NMR图、质谱图。
图32为化合物Probe G的质谱图。
图33示出了22RV1细胞存活率。A：Probe G(Venenum bufonis-linker-PSMA)、化合物14(Venenum bufonis-linker)和蟾酥(Venenum bufonis)对22RV1细胞存活率；B：X射线照射10Gy，Probe G(Venenum bufonis-linker-PSMA)、化合物14(Venenum bufonis-linker)和蟾酥(Venenum bufonis)对22RV1细胞存活率。
图34示出了Probe G的22RV1荷瘤小鼠活体肿瘤抑制实验结果。A：肿瘤生长曲线；B：老鼠体重变化曲线。尾静脉注射给药200nmol Probe G(Drugs组)；放射治疗剂量为10Gy(RT组)；放射治疗10Gy，48h后尾静脉注射200nmol Probe G(RT+Drugs组)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
探针Probe A、Probe B、Probe C和Probe D的制备
Probe A-D的具体结构如图2所示。合成步骤如图3所示。氨基酸的偶连依照标准的Fmoc固相合成法进行。
图3示出了Probe A-D的制备总路线。反应条件：(a)Fmoc-L-天门冬氨酸4-叔丁酯，HATU和DIPEA的DCM溶液；(b)TFA的DCM溶液；(c)2-氯三苯基氯树脂和DIPEA的DMF/DCM溶液；(d)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-L-缬氨酸、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；(e)20％哌啶的DMF溶液，N-Fmoc-L-谷氨酸-5-叔丁酯、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；(f)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-L-天门冬氨酸4-叔丁酯、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(g)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-L-苯丙氨酸、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(h)20％哌啶的DMF溶液，N-Fmoc-N'-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基]-D-赖氨酸、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(i)20％哌啶的DMF溶液，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(j)2％水合肼的DMF溶液，Fmoc-a-OH、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(k)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-b-OH、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(l)20％哌啶的DMF溶液，(S)-5-(tert-butoxy)-4-(3-((S)-1,5-di-tert-butoxy-1,5-dioxopentan-2-yl)ureido)-5-oxopentanoic acid、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(h)三氟乙酸，水和三异丙基硅烷。其中，步骤(j)、(k)根据Probe A-D结构不同选择性存在。
化合物2的合成：取7-氨基-4-甲基香豆素(1，200.00mg，1.14mmol)，HATU(560.88mg，1.37mmol)和Fmoc-L-天门冬氨酸4-叔丁酯(560.88mg，1.37mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL DCM使之溶解，加入DIPEA(394.12mg,2.28mmol),室温电磁搅拌，反应4小时后停止。减压除去二氯甲烷，粗产品未经处理直接进行下一步反应，加入10mL DCM使之溶解，加入5mL三氟乙酸，室温搅拌1h，减压除去二氯甲烷，产物经硅胶柱纯化后得白色固体2。
树脂3的合成：将2-氯三苯基氯树脂(1.00g)于固相合成管中，加入2mL二氯甲烷(DCM)溶胀，重复三次，每次5分钟，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，每次5分钟。将化合物2(256.26mg，0.50mmol)溶于DCM和DMF的混合溶剂中，加入DIPEA(130mg，1.00mmol)，将以上混合物加入到固相合成管中，室温电磁搅拌，反应2小时后停止；2mL二氯甲烷(DCM)洗涤，重复三次，每次5分钟；使用混合溶剂7mL(DCM:MeOH:DIPEA＝10mL:10mL:1mL)对树脂进行封闭，重复三次，每次5分钟；使用2mL二氯甲烷(DCM)洗涤，重复三次，每次5分钟，减压除去溶剂得到黄色树脂3。
Probe A-D的制备：取一定质量的树脂3(0.05mmol)于10mL固相合成管，加入2mL二氯甲烷(DCM)溶胀，重复三次，每次5分钟，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，每次5分钟。使用含20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱去氨基保护基Fmoc，具体操作为2mL 20％哌啶的DMF溶液反应2分钟、10分钟、10分钟，随后使用2mL DMF洗涤3-5次，每次2分钟。相对于树脂(0.02mmol)，3倍化学量的Fmoc氨基酸在7.2倍化学量的DIPEA存在下，经3.6倍化学量的HBTU活化后加入到合成管中，电磁搅拌下反应1小时。保护基Dde脱去使用含2％联氨的DMF溶液(v/v)，每次3分钟，重复两次，随后使用DMF洗涤3-5次，每次2分钟。配体从树脂上解离和叔丁酯的脱去使用5mL三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95:2.5:2.5，v/v/v)搅拌2小时完成，并用2mL三氟乙酸清洗树脂，收集所有滤液，经减压除去三氟乙酸后，粗产物经HPLC反向制备，冻干后得到目标配体Probe A-D。配体结构经高分辨质谱鉴定。
图4-8分别为化合物2、Probe A、Probe B、Probe C、Probe D的质谱图。
Caspase-3蛋白孵育
为验证化合物分子设计的合理性，将Probe A与活化的人源重组Caspase-3蛋白进行孵育，验证分子结构中DEVD能否被识别切断，促使荧光基团释放，荧光信号增强。
称取一定质量的Probe A，溶于含有50mM NaCl，10mM EDTA，5％甘油，10mM DTT的50mM的HEPES缓冲液中，加入不同酶活力的人源Caspase-3重组蛋白0U、0.25U、0.5U、1U、2U和4U，在37℃下孵育8h。在图9A和图9B中，可以非常直观的发现随着蛋白酶活力的增加，荧光信号明显增强，证实了Caspase-3可以识别分子结构中的DEVD结构片段，并对其进行切割，促使荧光基团的释放。由此证实了分子设计的合理性，人源Caspase-3蛋白可以识别本发明探针分子结构中的特异性基团，并对其进行切割。
标记与质控
标记：
68Ga：精确称取一定质量配体于样品中，加入20μL DMSO(二甲基亚砜)使之溶解，随后加入纯水将配体浓度稀释至1nmol/μL。吸取30μL配体溶液和65μL NaOAc溶液(1mol/L)于西林瓶中，加入1mL新淋洗得到的68Ga3+离子溶液(溶剂为0.05mol/L的盐酸溶液，放射活度为10-17mCi)，摇匀后密封，在85℃下反应10分钟。反应液冷却至室温后经HPLC分析质控。
质控：
68Ga配合物的放射化学纯度使用HPLC(高效液相色谱)测定，流动相为含20％乙腈的水溶液(含0.1％TFA)，所有配合物的放射化学纯度均大于90％，未经纯化即进行下一步研究。
68Ga标记产物的显像
取0.1mL新制备的68Ga标记配合物(5.6MBq-7.4MBq)经尾静脉注射到雄性荷22RV1肿瘤的Balb/c裸鼠体内(肿瘤直径为1cm左右)，1.0h后用异氟烷麻醉，进行小动物PET(SUPER-NOVA，平生科技，中国)显像，对感兴趣区域进行标准摄取值SUV的勾画。
如图10和表1所示，68Ga标记的Probe A在肿瘤区域有所浓聚，但在肿瘤的摄入量仅为0.14±0.03，效果并不理想，而引入脂溶性基团的Probe B、Probe C和Probe D在肿瘤组织的摄入得到了明显提升，其中，Probe B、Probe C在肿瘤组织的摄入分别为0.43±0.06和0.40±0.09，Probe D在肿瘤区域明显浓集，肿瘤摄入最优，其在肿瘤内的摄取量为0.85±0.35，与PSMA-11摄入量0.89±0.01基本相当；在肌肉和肾脏的摄入量分别为0.11±0.03和9.52±2.42，略优于PSMA-11肌肉和肾脏的摄入量0.15±0.07和10.18±3.46。可见，ProbeD是一种非常有潜力的68Ga标记PSMA靶向分子探针。
表1配合物在肿瘤、肌肉、肝脏和肾脏中SUVmax值及其比值(mean±SD,n＝4)
Figure BDA0002849339040000121
以上实验从蛋白孵育以及活体PET显像两个层面验证了本发明双酶体系分子设计的合理性。
探针Probe E和Probe F的制备
Probe E和Probe F的具体结构如图11所示。合成步骤如图12所示。氨基酸的偶连依照标准的Fmoc固相合成法进行。
图12示出了Probe E和Probe F的制备总路线。反应条件：(a)间硝基苯酚，碳酸钾的乙睛溶液；(b)SnCl2，HCl的甲醇溶液；(c)Fmoc-L-天门冬氨酸4-叔丁酯，HATU和DIPEA的DCM溶液；(d)TFA的DCM溶液；(e)2-氯三苯基氯树脂和DIPEA的DMF/DCM溶液；(f)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-缬氨酸、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；(g)20％哌啶的DMF溶液，N-Fmoc-谷氨酸-5-叔丁酯、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；(h)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-天门冬氨酸4-叔丁酯、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(i)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-L-苯丙氨酸、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(j)20％哌啶的DMF溶液，N-Fmoc-N'-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基]-D-赖氨酸、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(k)20％哌啶的DMF溶液，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(l)2％水合肼的DMF溶液，Fmoc-a-OH、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(m)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-b-OH、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(n)20％哌啶的DMF溶液，(S)-5-(tert-butoxy)-4-(3-((S)-1,5-di-tert-butoxy-1,5-dioxopentan-2-yl)ureido)-5-oxopentanoic acid、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(o)三氟乙酸，水和三异丙基硅烷。
化合物7的合成：取IR-775氯化物(6，200.00mg，0.38mmol)，间硝基苯酚(133.88mg，0.96mmol)和碳酸钾(132.81mg，0.96mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL乙睛使之溶解，室温电磁搅拌，反应4小时后停止。减压除去乙睛，使用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，有机相减压蒸馏，粗产品未经处理直接进行下一步反应；将无水SnCl2(1.44g,7.60mmol)和浓盐酸(4mL)加入到50mL圆底烧瓶中，使用20mL甲醇将粗产品溶解，加入到圆底烧瓶中，80℃回流12h，冷却至室温，50mL DCM稀释反应体系，抽滤，二氯甲烷萃取。产物经硅胶柱纯化后得绿色固体7。
化合物8的合成：取化合物7(437.20mg，1.14mmol)，HATU(560.88mg，1.37mmol)和Fmoc-L-天门冬氨酸4-叔丁酯(560.88mg，1.37mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL DCM使之溶解，加入DIPEA(394.12mg,2.28mmol),室温电磁搅拌，反应4小时后停止。减压除去二氯甲烷，粗产品未经处理直接进行下一步反应，加入10ml DCM使之溶解，加入5mL三氟乙酸，室温搅拌1h，减压除去二氯甲烷，产物经硅胶柱纯化后得蓝色固体8。
树脂9的合成：将2-氯三苯基氯树脂(1.00g)于固相合成管中，加入2mL二氯甲烷(DCM)溶胀，重复三次，每次5分钟，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，每次5分钟。将化合物8(360.42mg，0.50mmol)溶于DCM和DMF的混合溶剂中，加入DIPEA(130mg，1.00mmol)，将以上混合物加入到固相合成管中，室温电磁搅拌，反应2小时后停止；2mL二氯甲烷(DCM)洗涤，重复三次，每次5分钟；使用混合溶剂7mL(DCM:MeOH:DIPEA＝10mL:10mL:1mL)对树脂进行封闭，重复三次，每次5分钟；使用2mL二氯甲烷(DCM)洗涤，重复三次，每次5分钟，减压除去溶剂得到黄色树脂9。
Probe E-F的合成：取一定质量的树脂9(0.05mmol)于10mL固相合成管，加入2mL二氯甲烷(DCM)溶胀，重复三次，每次5分钟，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，每次5分钟。使用含20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱去氨基保护基Fmoc，具体操作为2mL 20％哌啶的DMF溶液反应2分钟、10分钟、10分钟，随后使用2mL DMF洗涤3-5次，每次2分钟。相对于树脂(0.02mmol)，3倍化学量的Fmoc氨基酸在7.2倍化学量的DIPEA存在下，经3.6倍化学量的HBTU活化后加入到合成管中，电磁搅拌下反应1小时。保护基Dde脱去使用含2％联氨的DMF溶液(v/v)，每次3分钟，重复两次，随后使用DMF洗涤3-5次，每次2分钟。配体从树脂上解离和叔丁酯的脱去使用5mL三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95:2.5:2.5，v/v/v)搅拌2小时完成，并用2mL三氟乙酸清洗树脂，收集所有滤液，经减压除去三氟乙酸后，粗产物经HPLC反向制备，冻干后得到目标配体Probe E、F。配体结构经高分辨质谱鉴定。
图13为化合物7的质谱图。图14、15、16分别为化合物8的1H NMR图、1C NMR图、质谱图。图17-18分别示出了Probe E和Probe F的质谱图。
Caspase-3蛋白孵育
为验证该系列化合物对于Caspase-3的特异性，设计了Probe E(DEVD)，其DEVD序列中，氨基酸都为L构型，可以被Caspase-3正常识别和切割；以及Probe F(D-DEVD)，其DEVD序列中，只有一个天冬氨酸为L构型，其余三个氨基酸为D构型，无法被Caspase-3正常识别。
称取一定质量的Probe E和Probe F，溶于含有50mM NaCl，10mM EDTA，5％甘油，10mM DTT的50mM的HEPES缓冲液中，加入不同酶活力的人源Caspase-3重组蛋白0U、0.25U、0.5U、1U、2U和4U，在37℃下孵育8h。结果如图19A和19B所示，可以发现在Probe E(DEVD)实验组中，随着蛋白酶活力的增加，荧光信号出现了明显增强；在Probe F(D-DEVD)对照组中，随着蛋白酶活力的增加，其荧光强度没有变化。证实了Probe E实验组中荧光信号的增强是由于Caspase-3对分子结构中的DEVD结构片段切割所导致，进一步证实了caspase-3对该系列化合物的特异性识别与切割。
细胞放疗
对前列腺特异性膜抗原PSMA高表达的22RV1细胞以及低表达的PC-3细胞，进行X射线放疗照射，剂量为8Gy，继续培养细胞48h后加入100μM的Probe E，共孵育12h后在激光共聚焦显微镜下检测。结果如图20所示，在710nm荧光信号通道下，22RV1细胞中，放疗实验组(图20的A中Probe E+RT组)相较于对照组(图20的A中Control组和图20的A中Probe E组)，有着明显荧光信号的提升。证实了Probe E经由PSMA转运至胞质，并由X射线诱导上调的Caspase-3对分子中的DEVD结构进行切割，释放荧光基团，荧光信号提升。另外，在只经Probe E孵育，未经X射线照射的22RV1细胞中，发现了少量的荧光信号，该信号是由于ProbeE经PSMA转运，但是未经Caspase-3切割的自身本底信号所导致。在PC-3细胞中，由于其细胞表面PSMA低表达，不能将探针转运至细胞质中，因此无法在细胞质中检测到荧光信号以及荧光信号的上调，这一结论体现在PC-3细胞Probe E孵育放疗实验组(图20的B中Probe E+RT组)以及Probe E孵育组(图20的B中Probe E组)中没有观察到荧光信号。进一步证实了，化合物Probe E可以在活细胞中由前列腺特异性膜抗原PSMA转运，并由X射线介导的表达量上调的细胞凋亡相关蛋白酶Caspase-3进行特异性识别并切割，进而达到在活细胞中荧光显像的目的。从而实现了在活体细胞中双酶体系下的特异性功能分子的递送。
68Ga标记Probe E产物的显像
如图21和表2所示，68Ga配合物Probe E能在肿瘤区域明显浓集，在肿瘤内的摄取量为0.56±0.10；在肌肉和肾脏的摄入量分别为0.28±0.05和4.25±1.06，Probe E虽然在尾部静脉注射1h在肿瘤的摄入略弱于Probe D的摄入，但是可以发现其在血池中依然含有部分化合物，依然可以增加肿瘤的持续摄入；同时也关注到Probe E在肾脏的摄入4.25±1.06优于Probe D肾脏的摄入9.52±2.42。因此，Probe E有望发展成为低肾脏代谢的68Ga标记PSMA靶向分子探针。此外，Probe E中的荧光基团为在710nm处的甲川菁类似物的近红外染料，相比Probe D中的荧光片段AMC(发射波长为450nm)，更利于在活体中的荧光显像及手术导航。
表2Probe E的配合物在肿瘤、肌肉、肝脏和肾脏中SUVmax值及其比值
Figure BDA0002849339040000151
放疗介导的活体显像
为进一步验证Probe E在活体内的性质，是否能够实现活体显像，进行前列腺癌手术导航。采用尾静脉注射的方式，对22RV1的荷瘤小鼠注入200nmol的Probe E，并对其进行荧光显像。首先在放疗前，在注射探针后不同时间点1h、4h、12h、24h和48h，对小鼠进行近红外荧光成像，在肿瘤部位并没有检测到荧光信号的增强(图22的A-B中Before RT)。随后对同批次荷瘤小鼠的肿瘤部位进行10GyX射线照射，48h后经过尾静脉注射的方式，注射200nmol Probe E，在注射后不同时间点1h、4h、12h、24h和48h对其进行荧光显像，可以发现在肿瘤部位有明显的荧光信号，相较于放疗前有显著的荧光信号的增强(图22的A-B中After RT)。证实了Probe E可以在荷瘤小鼠体内由前列腺特异性膜抗原PSMA转运，并由X射线介导的表达量上调的细胞凋亡相关蛋白酶Caspase-3进行特异性识别并切割，进而达到在活体中荧光显像的目的，实现双酶体系下的特异性功能分子的递送。
以上实验证明了肿瘤细胞Caspase-3表达量与荧光信号强度正相关，具备较高的时间和空间分辨率。为直观地了解放疗后肿瘤细胞凋亡通路中Caspase-3的活性奠定了基础。
177Lu标记产物的显像
为进一步验证Probe E作为靶向PSMA的核医学治疗试剂在活体内的性质，采用尾静脉注射的方式，对22RV1的荷瘤小鼠进行了Probe E的SPECT显像。如图23所示，177LuProbe E注射1h之后在肿瘤区域明显浓集，并且，在4h、8h、12h和24h时间点，并没有信号强度降低(图23的A)，进一步证实了Probe E可以在较长时间内留存在动物体内，可以作为一种靶向PSMA的核医学治疗探针使用。
在图23的B中，采用177Lu标记的Probe E和未经核素标记的Probe E共注射的方式来弥补Probe E化学剂量不足的问题，可以发现177Lu Probe E注射1h之后在肿瘤区域明显浓集，并且，在4h、8h、12h和24h时间点，并没有信号强度的明显降低。同时在两种注射方式下，肿瘤对于177Lu Probe E的摄取没有明显差异；肿瘤和肝脏并没有由于Probe E剂量的提升，表现出对177Lu Probe E摄入量的抑制(图23的C和图23的D)。进一步说明了Probe E的活体显像可以采用共注射的方式进行，有助于增加患者依从性。
核素靶向介导的活体显像
为进一步证实177Lu Probe E是否可以上调肿瘤细胞Capase-3的表达量，进而实现功能分子的递送。进行了177Lu标记的Probe E在荷瘤小鼠体内活体荧光显像实验。将177LuProbe E注射至荷瘤小鼠体内，以及177Lu Probe E与200nmol的Probe E采用共注射的方式注射至荷瘤小鼠体内，24h之后对其进行荧光显像(图24中A和B)，可以看出，由于Probe E化学剂量所致，单独注射177Lu Probe E在肿瘤组织内，并没有荧光信号(图24中A)；而在共注射组有着明显的荧光信号的增强(图24中B)。随后对只进行177Lu Probe E注射的实验组，再注射200nmol Probe E。经过24h之后，对两组小鼠分别进行活体荧光显像，发现在肿瘤组织都有着明显的荧光信号的增强(图24中C和D)。说明177Lu标记的Probe E作为核医学治疗试剂可以诱导上调肿瘤细胞Capase-3的表达量，进而实现功能分子的递送，实现活体荧光显像，检测肿瘤细胞凋亡过程中Caspase-3表达量以及实现前列腺癌手术导航。综上，177Lu标记的Probe E可以作为一种靶向PSMA的核医学治疗探针使用。
探针Probe G和Probe H的制备
Probe G-H的具体结构如图25所示。合成步骤如图26所示。氨基酸的偶连依照标准的Fmoc固相合成法进行。
图26示出了Probe G-H的制备总路线。反应条件：(a)对硝基苯基氯甲酸酯，三乙胺的DCM溶液；(b)丙二胺的DCM溶液；(c)芴甲氧羰基-天冬氨酸-β苄脂，HATU和DIPEA的DCM溶液；(d)H2,Pd/C，甲醇溶液(e)2-氯三苯基氯树脂和DIPEA的DMF/DCM溶液；(f)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-缬氨酸、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；(g)20％哌啶的DMF溶液，N-Fmoc-谷氨酸-5-叔丁酯、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；(h)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-天门冬氨酸4-叔丁酯、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(i)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-L-苯丙氨酸、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(j)20％哌啶的DMF溶液，N-Fmoc-N'-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基]-D-赖氨酸、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(k)20％哌啶的DMF溶液，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸三叔丁酯、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(l)2％水合肼的DMF溶液，Fmoc-a-OH、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(m)20％哌啶的DMF溶液，Fmoc-b-OH、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(n)20％哌啶的DMF溶液，(S)-5-(tert-butoxy)-4-(3-((S)-1,5-di-tert-butoxy-1,5-dioxopentan-2-yl)ureido)-5-oxopentanoic acid、HBTU、HOBt和EIPEA的DMF溶液；(o)三氟乙酸，水和三异丙基硅烷；(p)化合物13，三乙胺的DMSO溶液。
化合物13的合成：取蟾酥(12，146.88mg，0.38mmol)，对硝基苯基氯甲酸酯(193.50mg，0.96mmol)和三乙胺(97.14mg，0.96mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL DCM使之溶解，室温电磁搅拌，反应4小时后停止。减压除去DCM。产物经硅胶柱纯化后得白色固体13。
化合物14的合成：取化合物13(209.62mg，0.38mmol)，丙二胺(56.33mg，0.96mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL DCM使之溶解，室温电磁搅拌，反应4小时后停止。减压除去DCM。产物经硅胶柱纯化后得白色固体14。
化合物16的合成：取化合物15(198.63mg，1.14mmol)，HATU(560.88mg，1.37mmol)和芴甲氧羰基-天冬氨酸-β苄脂(610.29mg，1.37mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL DCM使之溶解，加入DIPEA(394.12mg，2.28mmol),室温电磁搅拌，反应4小时后停止。减压除去二氯甲烷，粗产品未经处理直接进行下一步反应，加入10mL无水甲醇使之溶解，加入质量分数为10％的Pd/C，通入氢气，室温搅拌12h，减压除去二氯甲烷，产物经硅胶柱纯化后得白色固体16。
树脂17的合成：将2-氯三苯基氯树脂(1.00g)于固相合成管中，加入2mL二氯甲烷(DCM)溶胀，重复三次，每次5分钟，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，每次5分钟。将化合物16(255.78mg，0.50mmol)溶于DCM和DMF的混合溶剂中，加入DIPEA(130mg，1.00mmol)，将以上混合物加入到固相合成管中，室温电磁搅拌，反应2小时后停止；2mL二氯甲烷(DCM)洗涤，重复三次，每次5分钟；使用混合溶剂7mL(DCM:MeOH:DIPEA＝10mL:10mL:1mL)对树脂进行封闭，重复三次，每次5分钟；使用2mL二氯甲烷(DCM)洗涤，重复三次，每次5分钟，减压除去溶剂得到黄色树脂17。
Probe G-H的合成：取一定质量的树脂17(0.05mmol)于10mL固相合成管，加入2mL二氯甲烷(DCM)溶胀，重复三次，每次5分钟，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤三次，每次5分钟。使用含20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱去氨基保护基Fmoc，具体操作为2mL 20％哌啶的DMF溶液反应2分钟、10分钟、10分钟，随后使用2mL DMF洗涤3-5次，每次2分钟。相对于树脂(0.02mmol)，3倍化学量的Fmoc氨基酸在7.2倍化学量的DIPEA存在下，经3.6倍化学量的HBTU活化后加入到合成管中，电磁搅拌下反应1小时。保护基Dde脱去使用含2％联氨的DMF溶液(v/v)，每次3分钟，重复两次，随后使用DMF洗涤3-5次，每次2分钟。配体从树脂上解离和叔丁酯的脱去使用5mL三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(95:2.5:2.5，v/v/v)搅拌2小时完成，并用2mL三氟乙酸清洗树脂，收集所有滤液，经减压除去三氟乙酸后，粗产物经HPLC反向制备，冻干后得到化合物19。将化合物19(40.00mg，0.02mmol)和化合物13(10.67mg，0.03mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入3mL DMSO使之溶解，加入DIPEA(5.2mg,0.04mmol),室温电磁搅拌，反应12小时后停止。粗产物经HPLC反向制备，冻干后得到目标配体Probe G、H。配体结构经质谱鉴定。
图27、28分别为化合物13、化合物14的质谱图。图29、30、31分别为化合物16的1HNMR图、1C NMR图、质谱图。图32为化合物Probe G的质谱图。
细胞存活率
首先测定Probe G、化合物14和蟾酥对于22RV1细胞的存活率实验，结果如图33所示。对照组(Control，图33的A)中，随着Probe G药物浓度从0nM增加至80nM，其对于22RV1的细胞毒性并不明显，安全性较为理想；而化合物14和蟾酥则随着浓度的增加，出现了细胞存活率的明显下降，说明蟾酥以及衍生物对前列腺癌细胞具有较高的杀伤作用。在RT组(图33的B)中，化合物14和蟾酥的变化趋势与对照组相似，但Probe G药物随着浓度增加，其对于22RV1的细胞毒性逐渐增强。进一步说明了化合物14可以作为一种细胞毒性药物，对肿瘤细胞进行杀伤。Probe G可以作为一种靶向前列腺特异性膜抗原PSMA，Caspase-3介导化合物14杀伤肿瘤细胞的核医学探针。
Probe G的放疗增敏治疗实验
对Probe G进行放疗增敏实验研究，即对22RV1细胞株的异体移植瘤模型进行了药效研究。首先第0天对放疗组(RT组)和放疗药物组(RT+Drugs组)进行放疗，剂量为10Gy；第2天和第5天通过尾静脉注射的方式对药物组(Drugs组)和放疗药物组(RT+Drugs组)，注射200nmol Probe G。随后对不同组别荷瘤小鼠进行肿瘤大小以及小鼠体重的监测。结果如图34所示，在放疗药物实验组中(RT+Drugs组)，可以发现其肿瘤的体积明显小于对照药物组以及放疗组，抑瘤效果明显(图34的A)。同时在小鼠体重方面，放疗药物实验组的小鼠体重也优于单纯的放疗组(图34的B)。实验结果表明，Probe G作为前列腺癌放疗增敏以及靶向核素治疗增敏的双功能试剂，疗效显著，且副作用较小。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种双酶体系探针，其特征在于，该探针具有式I所示结构，
Figure FDA0002849339030000011
其中，
QD为荧光基团或药物基团；
L为linker，具有式II所示结构：
Figure FDA0002849339030000012
R1为C5-C8的亚环烷基或亚芳基；R2为取代或未取代的芳基；n为1-6的整数；
T为PSMA特异性靶向基团；
Z为H、核素螯合基团、放射性核素或螯合有放射性核素的核素螯合基团。
2.根据权利要求1所述的双酶体系探针，其中，式II所示结构中，R1为亚苯基或亚环己基；a为1、2、3或4；R2为取代或未取代的苯基或萘基，取代的基团为卤素、羟基、氨基、羧基或C1-C4烷基；所述取代优选为单取代。
3.根据权利要求2所述的双酶体系探针，其中，R2为对位取代的苯基或萘基，优选为对位卤素取代的苯基或萘基；所述卤素优选为氯、溴、碘。
4.根据权利要求1所述的双酶体系探针，其中，所述PSMA特异性靶向基团如式III所示或式IV所示：
Figure FDA0002849339030000021
5.根据权利要求1所述的双酶体系探针，其中，所述荧光基团衍生自荧光化合物，所述荧光化合物选自7-(乙氨基)-4,6-二甲基香豆素、7-氨基-4-三氟甲基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素、香豆素307、7-氨基香豆素、3-氨基香豆素、6-氨基香豆素、7-氨基-4-氯甲基香豆素、3-氨基-7-羟基香豆素、7-氨基-4-羧甲基香豆素、7-氨基-4-甲基-3-香豆素醋酸、7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素、7-氨基-4-氯-3-甲氧基异香豆素、4-氨基-苯并吡喃-2-酮、罗丹明123、二氢罗丹明123、6-氨基四甲基罗丹明、5-氨基四甲基罗丹明、(E)-2-(2-(6-氨基-2,3-二氢-1H-黄嘌呤-4-基)乙烯基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓、(E)-2-(2-(6-氨基-6,3-二氢-1H-噻吨-4-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓、(E)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4H-铬-4-亚甲基)丙二腈、吲哚菁绿-氨基、新吲哚菁绿-氨基、氨基亚甲蓝、5-氨基酮戊酸、5-FITC尸毒素；
所述药物基团衍生自药物，所述药物选自蟾酥、紫杉醇、长春瑞宾、多西他塞、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、吉西他宾、阿糖胞苷、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、达卡巴嗪、6-巯基嘌呤、羟基脲、美法仑、柔红霉素去甲氧柔红霉素、氨吖啶、米托蒽醌、依托泊甙、替尼泊苷、三尖杉酯碱、芦卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利。
6.根据权利要求5所述的双酶体系探针，其中，QD为R1、R2、R3或R4所示基团：
Figure FDA0002849339030000031
7.根据权利要求1所述的双酶体系探针，其中，所述核素螯合基团为双功能螯合剂形成的基团，所述双功能螯合剂选自DOTA、NOTA、NODA、NODAGA、DOTP、TETA、ATSM、PTSM、EDTA、EC、HBEDCC、DTPA、SBAD、BAPEN、Df、DFO、TACN、NO2A/NOTAM、CB-DO2A、Cyclen、NOTA-AA、DO3A、DO3AP、HYNIC、MAS3、MAG3或异腈。
8.根据权利要求1所述的双酶体系探针，其中，所述双酶体系探针为Probe B、Probe C、Probe D、Probe E、Probe G，或它们标记放射性核素后形成的核素探针：
Figure FDA0002849339030000041
Figure FDA0002849339030000051
Figure FDA0002849339030000061
9.根据权利要求1或8所述的双酶体系探针，其中，所述放射性核素为诊断用放射性核素或治疗用放射性核素；所述诊断用放射性核素优选为68Ga、64Cu、18F、86Y、90Y、89Zr、111In、99mTc、11C、123I、125I和124I中的至少一种；所述治疗用放射性核素优选为177Lu、125I、131I、211At、111In、153Sm、186Re、188Re、67Cu、212Pb、225Ac、213Bi、212Bi和212Pb中的至少一种。
10.权利要求1-9中任意一项所述的双酶体系探针在制备影像试剂或治疗剂中的用途。
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