CN112574273A - 一类具有抗纤维化功能的三萜类化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类具有抗癌和抗纤维化功能的三萜类化合物及其制备方法，涉及生物医药技术领域，该类化合物的结构通式如(Ⅰ)所示，利用click反应对灵芝酸A进行结构修饰得三萜类化合物。该方法制备的三萜类化合物解决了生物利用度低的问题，提高了抗癌和抗纤维化作用。
Figure DDA0002860497800000011

Description

一类具有抗纤维化功能的三萜类化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一类具有抗纤维化功能的三萜类化合物及其制备方法。
背景技术
灵芝化学成分复杂，目前已有400多种化合物被鉴定，主要包括三萜、多糖、核苷、甾醇等化合物，其中有300多种均为三萜类化合物。灵芝三萜类化合物相对分子质量一般在4×105-6×105，结构复杂，多为高度氧化的羊毛甾烷型化合物，有抗肿瘤、保肝排毒、降低胆固醇、抗HIV病毒等活性，根据所接官能团和侧链结构的不同可分为灵芝酸类、醇类、醛类和内酯等几大类。灵芝酸A作为灵芝三萜中主要成分，含量较高，有抗肿瘤、肺纤维化及心肌保护作用，可作为十分有潜力的药物开发潜在资源。且天然化合物的结构修饰是获得一个理想活性化合物的有效手段，可扩大药物来源方式，灵芝酸类化合物上具有多种取代基，如羟基、羧基、乙酰基等，这些基团赋予了三萜类化合物多样的生物活性，同时也为其结构修饰提供了位点，可对其进行修饰得到更有效的活性化合物。
我国传统中药灵芝中的三萜成分能有效地保护小鼠急性肝损伤，降低血清天冬氨酸转氨酶(AST)以及肝脏的甘油三酯(TG)水平，以及抑制胆固醇的生物合成、抗脂质过氧化等，对肝纤维化起到保护作用，可以延缓多囊肾发病、减轻病况，在一定程度上也能有效治疗肺损伤。
文献(陈洁，史杨娟，罗琳等，灵芝三萜对大鼠肝纤维化的保护作用及其机制研究[J]，中国医院药学杂志，2008，028(009)：694-697)运用经典的四氯化碳模型，观察血清学指标，肝脏病理切片来了解灵芝三萜是否有抗纤维化作用，并初步探讨其抗纤维化的机制，但是未单独研究灵芝三萜中的灵芝酸A衍生物的抗纤维化机制。
与现有技术相比，本发明通过合成制备结构新颖的三萜类化合物，对灵芝酸A进行结构修饰，提高抗纤维化活性生物效应，抑制肝癌细胞活性，并应用于制备抗肝癌细胞、抗肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化的药物中。
发明内容
本发明通过合成制备结构新颖的三萜类化合物，对灵芝酸A进行改造，改善其抗纤维化功能，节约了天然植物资源，有利于可持续发展。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种三萜类化合物，所述三萜类化合物如下通式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002860497780000021
式中R选自通式(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的结构：
Figure BDA0002860497780000022
其中，n为1-10的整数；R1选自
Figure BDA0002860497780000023
Figure BDA0002860497780000024
R2为
Figure BDA0002860497780000025
X为卤素。
进一步地，所述n为3。
进一步地，所述X为Cl。
最优选地，本发明提供的三萜类化合物结构如下：
Figure BDA0002860497780000031
Figure BDA0002860497780000041
本发明还提供了上述的三萜类化合物的制备方法，化学反应式如下：
Figure BDA0002860497780000042
Figure BDA0002860497780000051
进一步地，具体包括以下步骤：
(1)称取灵芝酸A，依次加入胺类化合物、溶剂、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应得反应中间产物；
(2)将反应中间产物与炔、溶剂和Cu(I)混合均匀，室温下反应得三萜类化合物。
本发明所述灵芝酸A的结构为：
Figure BDA0002860497780000052
进一步地，所述步骤(1)中溶剂为二氯甲烷；所述步骤(2)中Cu(I)为2-噻吩甲酸铜。
进一步地，所述步骤(1)中灵芝酸A、胺类化合物、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)摩尔比为1:1-3:1-1.5:1.5-3，优选为1:2:1.2:2。
进一步地，所述步骤(2)中反应中间产物、炔和Cu(I)的摩尔比为1:1-1.5:0.1-0.5，优选为1:1.1:0.2。
进一步地，所述的三萜类化合物在制备用于抗癌和抗纤维化药物中的应用。
进一步地，所述抗癌为抗肝癌细胞，抗纤维化具体包括抗肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明通过合成制备结构新颖的三萜类化合物，对灵芝酸A进行结构修饰，提高抗纤维化活性生物效应，抑制肝癌细胞的活性。
2.对灵芝酸A进行改造，节约了天然植物资源，有利于可持续发展。
3.所得三萜类化合物可应用于制备抗肝癌细胞和抗肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化的药物中。
附图说明
图1-6为灵芝酸A衍生物B1-B6对肝癌肿瘤细胞株的体外细胞毒作用；
其中，*表示与Con组相比P<0.1，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。
图7为灵芝酸A衍生物B2的SPR筛查结果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
值得说明的是，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
灵芝酸A购自成都瑞芬思生物科技有限公司；
胺类化合物、炔丙基胺、2-噻吩甲酸铜、TBTU、DIPEA、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、购自北京伊诺凯科技有限公司；
靛红购自阿拉丁试剂有限公司；
3-溴丙炔、5-氯靛红、7-羟基香豆素购自北京偶合科技有限公司。
1-炔丙基-5-硝基吲哚的合成步骤：准确称取5-硝基吲哚300mg(1.85mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入20mL二甲基甲酰胺(DMF)，0℃以下加入88.8mg(3.7mmol)氢化钠，反应30min后加入3-溴丙炔，TLC检测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(4:1)，反应结束后加入乙酸乙酯萃取，振荡静置分液，取乙酸乙酯层旋干。以石油醚-乙酸乙酯(50:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得黄色固体78.1mg，收率为21.1％。1-炔丙基-5-硝基吲哚的1H NMR和13C NMR数据如下所示。
1H-NMR(300MHz,DMSO)δ:8.34(m,1H,H-4),7.45(d,J＝7.9,1H,H-6),7.21(d,J＝7.9,1H,H-7),7.12(d,J＝7.2,1H,H-2),6.56(d,J＝7.2,1H,H-3),4.59(s,2H,CH2),3.01(s,1H,C≡CH)。
13C-NMR(150MHz,DMSO)δ:137.7,128.9,127.2,125.9,123.0,111.4,101.6,77.1,74.0,35.9。
1-1-炔丙基-6硝基吲哚的合成步骤：准确称取6-硝基吲哚300mg(1.85mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入20mL二甲基甲酰胺(DMF)，0℃以下加入88.8mg(3.7mmol)氢化钠，反应30min后加入3-溴丙炔，TLC检测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(4:1)，反应结束后加入乙酸乙酯萃取，振荡静置分液，取乙酸乙酯层旋干。以石油醚-乙酸乙酯(50:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得黄色固体90.4mg，收率为24.4％。1-炔丙基-6-硝基吲哚的1H NMR和13C NMR数据如下所示。
1H-NMR(300MHz,DMSO)δ:8.62(m,1H,H-7),8.22(m,1H,H-4),7.96(m,1H,H-5),7.15(d,J＝7.2,1H,H-2),6.54(d,J＝7.2,1H,H-3),4.61(s,2H,CH2),3.03(s,1H,C≡CH)。
13C-NMR(150MHz,DMSO)δ:139.9,135.2,128.2,126.1,121.1,111.0,100.6,76.7,74.1,35.7。
1-1-炔丙基-靛红的合成步骤：准确称取靛红272mg(1.85mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入20mL二甲基甲酰胺(DMF)，0℃以下加入88.8mg(3.7mmol)氢化钠，反应30min后加入3-溴丙炔，TLC检测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(4:1)，反应结束后加入乙酸乙酯萃取，振荡静置分液，取乙酸乙酯层旋干。以石油醚-乙酸乙酯(50:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得橙红色固体195.5mg，收率为57.1％。1-炔丙基-靛红的1HNMR和13C NMR数据如下所示。
1H-NMR(300MHz,DMSO)δ:7.94-7.89(m,2H,H-6,7),7.49(m,1H,H-4),7.10(m,1H,H-5),4.55(s,2H,CH2),3.08(s,1H,C≡CH)。
13C-NMR(150MHz,DMSO)δ:181.9,166.2,150.5,134.7,129.3,122.7,115.2,114.3,73.8,72.2,35.1。
1-炔丙基-5-氯靛红的合成步骤：准确称取5-氯靛红336mg(1.85mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入20mL二甲基甲酰胺(DMF)，0℃以下加入88.8mg(3.7mmol)氢化钠，反应30min后加入3-溴丙炔，TLC检测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(4:1)，反应结束后加入乙酸乙酯萃取，振荡静置分液，取乙酸乙酯层旋干。以石油醚-乙酸乙酯(50:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得橙红色固体202.6mg，收率为49.9％。1-炔丙基-5-氯靛红的1H NMR和13C NMR数据如下所示。
5-chloro-1-(prop-2-yn-1-yl)indoline-2,3-dione:yellow solid,50％yield；1H-NMR(300MHz,DMSO)δ:8.02(m,1H,H-4),7.88(d,J＝8.6,1H,H-7),7.67(d,J＝8.6,1H,H-5),4.42(s,2H,CH2),3.05(s,1H,C≡CH)。
13C-NMR(150MHz,DMSO)δ:179.8,164.1,145.5,137.2,135.1,126.8,124.2,117.2,73.2,72.3,34.8。
8-炔丙基醚-2H-苯并吡喃-2-酮的合成步骤：准确称取7-羟基香豆素50mg(0.31mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入3mL二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸钾128.53mg(0.93mmol)，3-溴丙炔72.78uL(0.93mmol)，于60℃进行反应。TLC检测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(3:1)，反应结束后加入水、二氯甲烷萃取，振荡静置分液，取二氯甲烷层旋干。以石油醚-乙酸乙酯(6:11)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得白色固体58.7mg，收率为94.59％。8-炔丙基醚-2H-苯并吡喃-2-酮的1H NMR和13C NMR数据如下所示。
8-(prop-2-yn-1-yloxy)-2H-chromen-2-one:white solid,94.6％yield；1H-NMR(300MHz,DMSO)δ:7.94-7.88(m,2H,H-1,5),7.32(d,J＝7.6,1H,H-6),7.06(s,1H,H-5),6.55(d,J＝6.2 1H,H-2),4.66(s,2H,O-CH2),3.35(s,1H,C≡CH)。
13C-NMR(150MHz,DMSO)δ:162.4,154.6,145.3,143.2,119.5,128.7,114.1,113.9,110.5,78.6,76.5,58.3。
实施例1灵芝酸B1的合成
准确称取灵芝酸A100mg(0.194mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入2mL二氯甲烷，77.2μL(0.388mmol)1-氨基-11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷，74.8mg(0.233mmol)TBTU，64.1μL(0.388mmol)DIPEA，室温搅拌30min，TLC检测反应，展开剂为二氯甲烷-甲醇(10:1)，反应结束后加入饱和NaCl溶液，振荡静置分液，取下层溶液加入Na2SO4干燥，抽滤。以二氯乙烷-甲醇(20:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得122mg透明油状灵芝酸B1中间产物，收率为87.7％。取灵芝酸B1中间产物20mg(0.0279mmol)，室温条件下依次加入2mL二氯甲烷，6.14mg(0.0307mmol)6-nitro-1-(prop-2-yn-1-yl)-1H-indole(1-炔丙基-5-硝基吲哚)，1mg(0.0056mmol)2-噻吩甲酸铜，室温搅拌2.5h，TLC检测反应，反应结束后以二氯乙烷-甲醇(20:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得24.2mg黄色固体灵芝酸B1，收率为95％。灵芝酸B1的1H NMR和13C NMR数据如下所示。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.52(d,J＝2.2Hz,1H,Indole-H),8.04(dd,J＝9.0Hz,2.1Hz,1H,Indole-H),7.48(s,1H,Triazole-H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H,Indole-H),7.32(d,J＝3.2Hz,1H,Indole-H),6.65(dd,J＝3.2Hz,0.6Hz,1H,Indole-H),6.24(t,J＝5.5Hz,1H,CONH),5.42(s,2H,CH2-N(Indole)),4.68-4.67(m,1H,H-7),4.56-4.52(m,1H,H-15),4.43-4.42(m,2H,CH2-N(Triazole)),3.98-3.97(m,1H,OH-7),3.76-3.74(m,2H,OCH2CH2-N(Triazole)),3.48-3.39(m,10H,CH2(OCH2CH2O)2),3.37-3.35(m,1H,OH-15),3.33-3.30(m,1H,CONHCH2),1.21(s,3H,CH3),1.18(s,3H,CH3),1.05(d,J＝6.0Hz,3H,CH3),1.05(s,3H,CH3),1.03(s,3H,CH3),0.86(s,3H,CH3),0.77(d,J＝6.4Hz,3H,CH3)。
13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:216.2,208.5,198.6,174.6,158.3,142.1,140.7,139.1,137.6,130.1,128.9,128.8,127.0,122.3,117.3,116.5,108.6,103.6,71.3,69.4,69.3,69.2,69.1,68.7,68.2,67.8,52.9,50.7,49.4,48.9,47.7,47.1,46.1,45.7,45.6,41.3,38.1,36.9,35.2,34.9,34.5,33.3,31.6,27.9,26.3,19.7,18.7,18.5,18.4,17.0,16.2。
实施例2灵芝酸B2的合成
与实施例1的区别仅在于，加入6.75mg(0.0338mmol)6-nitro-1-(prop-2-yn-1-yl)indoline(1-炔丙基-6硝基吲哚)，灵芝酸B2的收率为92.4％。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.40(d,J＝2.0Hz,1H,Indole-H),8.01(dd,J＝8.7Hz,2.0Hz,1H,Indole-H),7.68-7.66(m,2H,Triazole-H,Indole-H),7.56(d,J＝3.2Hz,1H,Indole-H),6.64-6.63(m,1H,Indole-H),6.35(t,J＝5.5Hz,1H,CONH),5.52(s,2H,CH2-N(Indole)),4.76-4.75(m,1H,H-7),4.63-4.59(m,1H,H-15),4.52-4.50(m,2H,CH2-N(Triazole)),4.22-4.21(m,1H,OH-7),3.85-3.83(m,2H,OCH2CH2-N(Triazole)),3.62-3.89(m,1H,OH-15),3.57-3.48(m,10H,CH2(OCH2CH2O)2),3.40-3.37(m,1H,CONHCH2),1.27(s,3H,CH3),1.25(s,3H,CH3),1.12(d,J＝6.0Hz,3H,CH3),1.12(s,3H,CH3),1.09(s,3H,CH3),0.94(s,3H,CH3),0.84(d,J＝6.4Hz,3H,CH3)。
13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:217.3,209.5,199.7,175.7,159.5,143.0,142.9,140.1,134.4,133.9,133.7,123.4,121.1,115.2,106.4,103.1,72.3,70.5,70.4,70.3,70.1,69.7,69.3,68.8,53.9,51.7,50.5,50.0,48.7,48.2,47.1,46.7,46.6,42.0,39.2,37.9,36.2,35.9,35.5,34.3,32.7,29.7,28.9,27.4,20.7,19.7,19.5,19.4,18.1,17.2。
实施例3灵芝酸B3的合成
与实施例1的区别仅在于，加入6.25mg(0.0332mmol)1-(prop-2-yn-1-yl)indoline-2,3-dione(1-炔丙基-靛红)，灵芝酸B3的收率为96.4％。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.85(s,1H,Triazole-H),7.60-7.58(m,2H,Isatin-H),7.32-7.31(m,1H,Isatin-H),7.14-7.11(m,1H,Isatin-H),6.44(t,J＝5.4Hz,1H,CONH),5.06-5.00(s,2H,CH2-N(Isatin)),4.79-4.77(m,1H,H-7),4.64-4.60(m,1H,H-15),4.54-4.53(m,2H,CH2-N(Triazole)),4.11-4.10(m,1H,OH-7),3.87-3.85(m,2H,OCH2CH2-N(Triazole)),3.61-3.52(m,10H,CH2(OCH2CH2O)2),3.51-3.48(m,1H,OH-15),3.41-3.39(m,1H,CONHCH2),1.28(s,3H,CH3),1.25(s,3H,CH3),1.14(d,J＝7.1Hz,3H,CH3),1.12(s,3H,CH3),1.10(s,3H,CH3),0.96(s,3H,CH3),0.85(d,J＝6.5Hz,3H,CH3)。
13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:217.3,209.5,199.7,175.7,159.5,143.0,143.0,140.1,134.4,133.9,133.7,123.4,121.1,115.2,106.4,103.1,72.3,70.5,70.4,70.4,70.3,70.1,69.7,69.3,68.8,54.0,51.7,50.5,50.0,48.7,48.2,47.1,46.7,46.6,42.0,39.2,38.0,36.2,35.9,35.5,34.3,32.7,29.7,28.9,27.4,20.7,19.7,19.5,19.4,18.1,17.2。
实施例4灵芝酸B4的合成
与实施例1的区别仅在于，加入7.4mg(0.0371mmol)5-chloro-1-(prop-2-yn-1-yl)indoline-2,3-dione(1-炔丙基-5-氯靛红)，灵芝酸B4的收率为94.7％。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.79(s,1H,Triazole-H),7.50-7.48(m,2H,Isatin-H),7.27-7.26(m,1H,Isatin-H),6.33(t,J＝5.3Hz,1H,CONH),4.98-4.93(s,2H,CH2-N(Isatin)),4.71-4.70(m,1H,H-7),4.55-4.53(m,1H,H-15),4.48-4.46(m,2H,CH2-N(Triazole)),3.91-3.90(m,1H,OH-7),3.80-3.78(m,2H,OCH2CH2-N(Triazole)),3.55-3.46(m,10H,CH2(OCH2CH2O)2),3.35-3.32(m,1H,OH-15,CONHCH2),1.28(s,3H,CH3),1.21(s,3H,CH3),1.18(s,3H,CH3),1.07(d,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.05(s,3H,CH3),1.03(s,3H,CH3),0.89(s,3H,CH3),0.78(d,J＝6.4Hz,3H,CH3)。
13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:216.1,208.5,198.6,181.2,174.6,158.3,156.4,147.5,140.1,139.1,137.0,128.9,124.1,123.3,117.3,112.0,71.3,69.5,69.4,69.3,69.1,68.7,68.2,67.8,52.9,50.7,49.4,48.9,47.7,46.1,45.7,45.6,38.2,36.9,35.3,34.9,34.5,33.3,31.6,27.9,26.3,19.7,18.7,18.5,18.4,17.0,16.2。
实施例5灵芝酸B5的合成
与实施例1的区别仅在于，加入6.1mg(0.0305mmol)8-(prop-2-yn-1-yloxy)-2H-chromen-2-one(8-炔丙基醚-2H-苯并吡喃-2-酮)，灵芝酸B5的收率为93.8％。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.84(s,1H,Triazole-H),7.60(d,J＝9.5Hz,1H,CH＝CH),7.35-7.33(m,1H,Coumarin-H),6.90-6.88(m,2H,Coumarin-H),6.33(t,J＝5.4Hz,1H,CONH),6.20(d,J＝9.5Hz,1H,CH＝CH),5.20(s,2H,Coumarin-O-CH2),4.71-4.70(m,1H,H-7),4.56-4.51(m,3H,H-15,CH2-N(Triazole)),4.17-4.16(m,1H,OH-7),3.85-3.83(m,2H,OCH2CH2-N(Triazole)),3.58-3.43(m,11H,CH2(OCH2CH2O)2,OH-15),3.37-3.29(m,1H,CONHCH2),1.21(s,3H,CH3),1.18(s,3H,CH3),1.05(d,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.05(s,3H,CH3),1.03(s,3H,CH3),0.87(s,3H,CH3),0.78(d,J＝6.4Hz,3H,CH3)。
13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:216.2,208.5,198.6,174.6,160.3,160.3,158.5,154.6,142.5,141.6,139.0,128.0,123.5,112.3,111.9,111.9,101.0,71.2,69.5,69.4,69.3,69.1,68.7,68.3,67.8,61.2,52.9,50.7,49.4,48.9,47.7,47.1,46.2,45.7,45.6,38.1,36.9,35.2,34.9,34.5,33.3,31.6,27.9,26.3,19.7,18.7,18.5,18.3,17.0,16.2。
实施例6灵芝酸B6的合成
准确称取灵芝酸A90mg(0.174mmol)，加入到50mL圆底烧瓶中，室温条件下依次加入2mL二氯甲烷，22.31μL(0.348mmol)炔丙基胺，67.37mg(0.210mmol)TBTU，57.28μL(0.348mmol)DIPEA，室温搅拌30min，TLC检测反应，展开剂为二氯甲烷-甲醇(15:1)，反应结束后加入饱和NaCl溶液，振荡静置分液，取下层溶液加入Na2SO4干燥，抽滤。以二氯乙烷-甲醇(20:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得87mg透明油状灵芝酸B1中间产物，收率为90.3％。取灵芝酸B1中间产物20mg(0.0361mmol)，室温条件下依次加入2mL二氯甲烷，8.60mg(0.0396mmol)1-(2-azidoethyl)indoline-2,3-dione(1-(2-叠氮)乙基-靛红)，1.38mg(0.0072mmol)2-噻吩甲酸铜，室温搅拌1h，TLC检测反应，反应结束后以二氯乙烷-甲醇(20:1)进行柱层析，收集目标物，旋干溶剂，得26.3mg橙黄色固体灵芝酸B6，收率为94.6％。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.56(s,1H,Triazole-H),7.51-7.50(m,1H,Isatin-H),7.47-7.44(m,1H,Isatin-H),7.06-7.04(m,1H,Isatin-H),6.52-6.50(m,1H,Isatin-H),6.17(t,J＝5.5Hz,1H,CONH),4.72-4.11(m,1H,H-7),4.66-4.11(m,7H,CH2CH2-N(Isatin),CONHCH2,H-15),4.04-3.97(m,1H,OH-7),3.56-3.51(m,1H,OH-15),1.20(s,3H,CH3),1.19(s,3H,CH3),1.05(s,3H,CH3),1.04(d,J＝6.3Hz,3H,CH3),1.03(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH3),0.79(d,J＝6.5Hz,3H,CH3)。
13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:216.1,208.5,198.6,181.2,174.6,158.3,156.4,147.5,140.1,139.1,137.0,128.9,124.1,123.3,117.3,112.0,71.3,69.5,69.4,69.3,69.1,68.7,68.2,67.8,52.9,50.7,49.4,48.9,47.7,47.1,46.1,45.7,45.6,38.2,36.9,35.3,34.9,34.5,34.5,33.3,31.6,27.9,26.3,19.7,18.7,18.5,18.4,17.0,16.2。
药理实验
一、抗肝癌活性筛选
采用MTT法测试灵芝酸B1-B6对肝癌细胞HepaG2的体外抗肿瘤活性，以灵芝酸A(GAA)为阳性对照药，在1.5μmol·L-1、3μmol·L-1、6μmol·L-1、12μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol·L-1的浓度下，通过体外细胞学实验考察了灵芝酸A衍生物B1-B6对肝癌肿瘤细胞株的体外细胞毒作用，实验结果如图1-图6所示。
由图1-图6可知，样品液的浓度配制了50μmol·L-1、25μmol·L-1、12μmol·L-1、6μmol·L-1、3μmol·L-1和1.5μmol·L-1六个浓度梯度，其中灵芝酸B1和灵芝酸B2表现出了较好的抑制肝癌细胞的作用。
二、肺纤维化细胞活性筛选
取指数生长期的人肺成纤维细胞HFL1，调整细胞密度至5×104个/mL，接种于96孔细胞培养板中，100uL/孔，在37℃、5％CO2条件下孵育。待细胞接种贴壁24h后，弃上清，更换各化合物浓度梯度的培养液100uL/孔，每个浓度3个复孔，加药后继续培养48h。每孔加入10Ul CCK-8溶液，孵育2h之后，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度A值。根据所测A值计算每个化合物的细胞增殖抑制率。由表1可知，灵芝酸B1和灵芝酸B2的抗肺纤维化效果较好。
表1
实施例编号 IC50(mM) 实施例编号 IC50(mM)
B1 0.014 B4 0.095
B2 0.020 B5 0.100
B3 0.078 B6 0.240
三、肺纤维化蛋白ATX与化合物的相互作用
Autotaxin(ATX)是一种自分泌活性因子，具有溶血磷脂酶D(lysoPLD)活性，属于磷酸二酯酶家族(ENPP2)，能够催化溶血磷酰胆碱LPC水解为溶血磷脂酸LPA与胆碱。LPA是一种生物活性脂质，存在于很多体液中，通过与G蛋白偶联受体结合可诱导成纤维细胞和癌细胞的运动，进而产生一系列病理生理反应，如纤维化疾病、慢性炎症、代谢综合征、癌症等，因此ATX-PLA信号通路在疾病的产生与演变中扮演十分重要的角色，对衍生物进行SPR筛查，实验结果如图7所示。
由图7可知，灵芝酸A衍生物与ATX有一定相互作用，如对照药GLPG1690与ATX结合的KD值为2.52uM，灵芝酸B2与ATX结合的KD值为1.88uM，灵芝酸B2与ATX蛋白结合的情况与阳性药GLPG1690相当，值得深入研究。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种三萜类化合物，其特征在于，所述三萜类化合物结构如下通式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002860497770000011
式中R选自通式(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的结构，其中*表示取代基与母核连接的部位：
Figure FDA0002860497770000012
其中，n为1-10的整数；R1选自
Figure FDA0002860497770000013
Figure FDA0002860497770000014
R2为
Figure FDA0002860497770000015
X为卤素。
2.根据权利要求1所述的三萜类化合物，其特征在于，n为3。
3.根据权利要求2所述的三萜类化合物，其特征在于，X为Cl。
4.根据权利要求1-3任一项所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于，化学反应式如下：
Figure FDA0002860497770000021
5.根据权利要求4所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)称取灵芝酸A，依次加入胺类化合物、溶剂、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应得反应中间产物；
(2)将反应中间产物与炔、溶剂和Cu(I)混合均匀，室温下反应得三萜类化合物。
6.根据权利要求5所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为二氯甲烷；所述步骤(2)中Cu(I)为2-噻吩甲酸铜。
7.根据权利要求5所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中灵芝酸A、胺类化合物、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的摩尔比为1:1-3:1-1.5:1.5-3。
8.根据权利要求5所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应中间产物、炔和Cu(I)的摩尔比为1:1-1.5:0.1-0.5。
9.权利要求1-3任一项所述的三萜类化合物在制备用于抗癌和/或抗纤维化药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗癌为抗肝癌细胞，抗纤维化具体包括抗肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化。
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