CN112557536A - 检测7种类胡萝卜素的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及分析化学技术领域，提供了一种检测7种类胡萝卜素的方法，同时对岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素7种不同的类胡萝卜素进行检测，首先提供了7种类胡萝卜素的标准品的标准曲线，再提供少量的样品进行检测，根据待测样品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值即可确定各中类胡萝卜素的种类，并根据定量离子对的质谱峰面积及标准曲线即可计算得到各类胡萝卜素的含量。该检测方法所需样品量少，检测快速、高效、灵敏度高，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，可实现快速、准确的大通量检测。

Description

检测7种类胡萝卜素的方法
技术领域
本申请属于分析化学技术领域，尤其涉及一种检测7种类胡萝卜素的方法。
背景技术
类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类的黄色、橙红色或红色的色素之中。类胡萝卜素是体内维生素A的主要来源，同时还具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老等功效。
目前，发现的天然类胡萝卜素已达700多种，根据化学结构的不同可以将其分为两类，一类是胡萝卜素(只含碳氢两种元素，不含氧元素，如B2胡萝卜素和番茄红素)；另一类是叶黄素(有羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团，如叶黄素和虾青素等)。由于类胡萝卜素种类多，结构相似，在检测过程中难以完全分离，存在检测困难。
目前，类胡萝卜素的定性定量检测主要使用高效液相(HPLC)色谱光谱技术，受限于HPLC相对较低的分离效能，结构相似的多种色素保留时间相近或重叠，定性准确度偏低，同时UV检测器较低的灵敏度使得痕量目标成分的定量准确度也偏低。往往在检测过程中，需要复杂的前处理过程，耗费大量的样品、试剂和时间才能达到检测目的，因此无法满足大通量检测的需求。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测7种类胡萝卜素的方法，旨在解决现有技术中无法快速、准确地检测7种及以上类胡萝卜素的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种检测7种类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
配制岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品、新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，并制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程；
配制待测样品，将所述待测样品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行超高效液相色谱质谱检测，获得所述待测样品的质谱图；
根据所述待测品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值确定岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的种类，并根据各种类的定量离子对的质谱峰面积计算得到所述待测品中岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的含量。
本申请第一方面提供的检测7种类胡萝卜素的方法，该方法采用了超高效液相色谱质谱方法，同时对岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素7种不同的类胡萝卜素进行检测，首先提供了7种类胡萝卜素的标准品的标准曲线，再提供少量的样品进行检测，根据待测样品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值即可确定各中类胡萝卜素的种类，并根据定量离子对的质谱峰面积及标准曲线即可计算得到各类胡萝卜素的含量。该检测方法所需样品量少，仅需0.2mg甚至更少的样品即可进行精确分析；其次，由于本方法在复杂背景中具有高选择性，因此样品的前处理过程可大大简化，只需要采用溶剂进行简单提取即可直接检测，无需萃取、浓缩和复溶等步骤，减少了实验误差与目标成分损失，提高了检测的准确度；再者，通过优化超高效液相色谱质谱方法的各参数，进而达到检测快速、高效、灵敏度高，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，使岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素7种类胡萝卜素都可以达到较的定性定量分析，可实现快速、准确的大通量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例1提供的岩藻黄醇标准品的MRM模式总离子图。
图2是本申请实施例1提供的岩藻黄素标准品的MRM模式总离子图。
图3是本申请实施例1提供的硅甲藻黄素标准品的MRM模式总离子图。
图4是本申请实施例1提供的硅藻黄素标准品的MRM模式总离子图。
图5是本申请实施例1提供的新黄素标准品的MRM模式总离子图。
图6是本申请实施例1提供的玉米黄素标准品的MRM模式总离子图。
图7是本申请实施例1提供的紫黄素标准品的MRM模式总离子图。
图8是本申请实施例2提供的待测样品得到的岩藻黄醇的MRM模式定量离子对图。
图9是本申请实施例2提供的待测样品得到的新黄素的MRM模式定量离子对图。
图10是本申请实施例2提供的待测样品得到的岩藻黄素的MRM模式定量离子对图。
图11是本申请实施例2提供的待测样品得到的紫黄素的MRM模式定量离子对图。
图12是本申请实施例2提供的待测样品得到的硅甲藻黄素的MRM模式定量离子对图。
图13是本申请实施例2提供的待测样品得到的硅藻黄素的MRM模式定量离子对图。
图14是本申请实施例2提供的待测样品得到的玉米黄素的MRM模式定量离子对图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
本申请实施例第一方面提供一种检测7种类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
S01.配制岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品、新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品的混合标准溶液，将混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，并制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程；
S02.配制待测样品，将待测样品在与混合标准溶液相同的检测条件下进行超高效液相色谱质谱检测，获得待测样品的质谱图；
S03.根据待测品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值确定岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的种类，并根据各种类的定量离子对的质谱峰面积计算得到待测品中岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的含量。
该检测方法所需样品量少，仅需0.2mg甚至更少的样品即可进行精确分析；其次，由于本方法在复杂背景中具有高选择性，因此样品的前处理过程可大大简化，只需要采用溶剂进行简单提取即可直接检测，无需萃取、浓缩和复溶等步骤，减少了实验误差与目标成分损失，提高了检测的准确度；再者，通过优化超高效液相色谱质谱方法的各参数，进而达到检测快速、高效、灵敏度高，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，使岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素7种类胡萝卜素都可以达到较的定性定量分析，可实现快速、准确的大通量检测。
在步骤S01中，配制岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品、新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品的混合标准溶液，将混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，并制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程。
优选的，岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品、新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品均购自sigma-Aldrich公司。
优选的，混合标准溶液中，岩藻黄醇标准品的浓度为500ng/mL、岩藻黄素标准品的浓度为500ng/mL、硅甲藻黄素标准品的浓度为500ng/mL、硅藻黄素标准品的浓度为500ng/mL、新黄素标准品的浓度为100ng/mL、玉米黄素标准品的浓度为100ng/mL、紫黄素标准品的浓度为100ng/mL。
在本发明优选实施例中，混合标准溶液的配制方法如下：
分别将1.0mg 7个不同的类胡萝卜素标准品溶解于1mL甲醇中，得到7种单个浓度为1mg/mL的标准品溶液；分别精密量取单个标准品溶液，用甲醇稀释后得到7种浓度为10μg/mL的标准工作液；分别精密量取单个标准品工作液进行进一步稀释，得到各相应浓度的单标准品工作液，混合得到混合标准溶液
优选的，将混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，并制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程的步骤中，将混合标准溶液进行逐级稀释，配制至少7种不同浓度的混合标准溶液稀释液，将不同浓度的混合标准溶液稀释液进行超高效液相色谱质谱检测并得到标准图谱，通过标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程。
优选的，岩藻黄醇标准品的标准曲线的线性范围为1～250ng/mL；岩藻黄素标准品的标准曲线的线性范围为1～500ng/mL；硅甲藻黄素标准品的标准曲线的线性范围为5～500ng/mL；硅藻黄素标准品的标准曲线的线性范围为5～500ng/mL；新黄素标准品的标准曲线的线性范围为2.5～100ng/mL；玉米黄素标准品的标准曲线的线性范围为2.5～100ng/mL；紫黄素标准品的标准曲线的线性范围为2.5～100ng/mL。由于提供的7种类胡萝卜素的性质不同，不同的类胡萝卜素的标准曲线的线性范围也不同，为了保证检测得到的产品可直接采用标准曲线计算各化合物的含量，因此，制备标准曲线的时候首先确定了各化合物的线性范围，若超过各化合物的线性范围，则得到的标准曲线不具有线性关系，无法直接判断各化合物的含量。
进一步优选的，岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品的标准溶液稀释液的浓度包括500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL；新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品的标准溶液稀释液的浓度包括100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL。
进一步优选的，对配制得到的7种类胡萝卜素的不同浓度的标准溶液稀释液进行过滤处理，除去标准溶液稀释液中的杂质，保证标准溶液稀释液中纯度较高。在本发明优选实施例中，进行过滤处理的步骤中，用0.45μm滤膜进行过滤，保证具有较好的除杂效果。
进一步优选的，对过滤处理得到的7种不同类胡萝卜素的不同浓度的标准溶液稀释液进行脱气处理，保证溶液中没有多余的空气，确保不会影响检测结果，同时对色谱柱进行保护。在本发明优选实施例中，脱气处理选自但不限于超声脱气的方法。
进一步的，将混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测，可得到标准图谱。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，所述超高效液相色谱检测采用超高效液相色谱仪ACQUITY Ultra Performance LC H-Class进行检测，其中，超高效液相色谱仪ACQUITY Ultra Performance LC H-Class是由美国WATERS的设备，其包括了四元溶剂管理器、自动进样器、柱温箱。提供该超高效液相色谱可以保证对所需要检测的7种类胡萝卜素进行分离检测。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，色谱柱为BEH C18或HSS T3；BEH C18和HSST3柱都是通用性色谱柱，均可进行使用。进一步优选的，基于目前要进行测定的7种类胡萝卜素，在相同条件下，7种类胡萝卜素在HSS T3柱上的保留性、峰形更好，且所有成分都可以达到基线分离，均优于BEH C18柱，可以保证精准的定量需求，提高准确性。
在本发明优选实施例中，色谱柱选自HSS T3，规格为2.1mm*100mm，1.8μm，选择上述柱规格的HSS T3色谱柱，保证色谱柱的具有较好的分析速度、分离能力和检测能力。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，流动相第一溶液为乙腈，流动相第二溶液为甲醇，流动相第三溶液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；选择乙腈/甲醇/0.1％甲酸的流动相，可以保证对7种类胡萝卜素进行准确地分离，提高试验的精确度；同时选择该流动相，可以保证洗脱速度适中，缩短洗脱时间，提高检测速率。
进一步的，添加质量浓度为0.1％的甲酸水溶液，目的是为了提高待测样品在质谱过程中的离子化效率，改善峰形，增强质谱响应信号。若添加的甲酸质量浓度过高，则会引起离子抑制作用，影响检测的准确性；若添加量过低，则会影响组分在质谱中的相应信号，不利于分析实验结果。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，洗脱流速为0.1～0.5mL/min；洗脱流速的快慢会影响样品的保留时间，进而影响实验的准确性。若洗脱流速过快，则保留时间缩短，导致组分之间的分离效果不好；若洗脱流速过慢，则保留时间增加，导致色谱峰扩散严重，无法准确定量，均会造成实验结果不准确。
进一步优选的，洗脱流速为0.35mL/min，按照上述流速进行洗脱处理，能够保证保留时间准确，检测结果可信。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，柱温为30～40℃；保持上述条件的柱温，能够较好地对7种不同的类胡萝卜素同时进行定性和定量，提高检测结果的准确性，通过控制柱温的高低，能够控制不同组分的保留值，改变分离效果，达到缩短分析时间、提高检测效率的效果。在检测过程中，柱温的变化会影响样品的出峰时间及峰型，若柱温过高，出峰越快，保留时间变小，进而造成保留时间的重现性不好，从而影响样品组分的定性结果，同时柱温过高，会导致半峰宽变窄，峰高变高，进而影响样品组分的定量；若柱温过低，出峰越慢，保留时间变长，进而造成保留时间的重现性不好，从而影响样品组分的定性结果，同时柱温过低，会导致半峰宽变宽，峰高变低，进而影响样品组分的定量。
进一步优选的，柱温为35℃，在35℃的柱温条件下，能够保证7种不同的类胡萝卜素的出峰时间稳定、峰面积大小适中，保证了实验的精确度。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，进样量为1～1.5μL；保持上述条件的进样量，能够较好地对7种不同的类胡萝卜素进行准确地分离，保证实验的精确度，提高检测结果的准确性。若进样量过大，则各物质的峰面积过大，则有可能导致两个样品峰无法分离，影响后续分析；若进样量过小，则各物质的峰面积过小，过小的峰面积则无法准确进行定量分析，影响实验的精确度。
进一步优选的，进样量为1μL；保持上述条件的进样量，能够对7种类胡萝卜素进行准确地分离，保证实验的精确度，提高检测结果的准确性，同时，能够保证在提供微量样品的情况下，仍可实现检测，表明了该检测方法的优异。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，洗脱时间为10～15min；洗脱时间是根据洗脱的过程确定的，在上述洗脱时间下，7个不同的类胡萝卜素均可进行分离并检测，检测速度迅速。进一步优选的，洗脱时间为10min，通过提供的洗脱程序，于10分钟内即可完成检测。
优选的，洗脱方式为梯度洗脱。采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱由于流动相的洗脱能力在逐渐增强，可以在较短时间内实现较好的分离效果。
进一步优选的，梯度洗脱的程序为：
S011.提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液和质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于0～4分钟进行第一梯度洗脱；
S012.提供质量百分含量为92％的流动相第一溶液和质量百分含量为8％流动相第二溶液的混合溶液于4～8分钟进行第二梯度洗脱；
S013.提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液、质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于8～10分钟进行第三梯度洗脱。
根据梯度洗脱的程序进一步确定梯度洗脱的过程，采用该梯度洗脱的程序能够保证7种不同的类胡萝卜素在10分钟内进行分离检测，大大加快了检测速度。
优选的，超高效液相色谱质谱检测中，质谱检测的设备选择的三重四极杆质谱仪为美国WATERS Xevo TQ-XS，包括有ESI、APCI离子源，使用Masslynx4.2软件控制液质联用仪。
优选的，质谱检测中，质谱离子源为电喷雾电离离子源；质谱离子化模式为电喷雾电离正离子模式；选择的电喷雾电离正离子模式能够保证7种类胡萝卜素的质谱响应强度更好。
优选的，质谱检测中，毛细管电压为3～3.5kv；脱溶剂温度为400～420℃；脱溶剂气流量为800～850L/hr；锥孔气流量为150～200L/hr；碰撞气流量为0.16～0.20mL/min；离子源温度为150～180℃；检测模式为MRM模式。通过控制质谱检测中，信号最高响应值参数(毛细管电压、脱溶剂温度、脱溶剂气流量、碰撞气流量等)以及目标成分定性和定量参数(离子对及对应锥孔电压、碰撞能量)，能够保证对7种不同的类胡萝卜素进行定量分析和定性分析，实现快速、同时地检测。
进一步优选的，质谱检测中，毛细管电压为3kv；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流量为800L/hr；锥孔气流量为150L/hr；碰撞气流量为0.16mL/min；离子源温度为150℃；检测模式为MRM模式。
进一步的，根据得到的标准图谱，制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程。
优选的，根据得到的标准图谱，通过标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；优选的，以各标准品的峰面积为纵坐标(Y)，以对应的各标准品的浓度为横坐标(X,ng/mL)，绘制标准曲线。
在步骤S02中，配制待测样品，将待测样品在与混合标准溶液相同的检测条件下进行超高效液相色谱质谱检测，获得待测样品的质谱图。
优选的，不同的生物样品均可采用该方法进行检测，而对于不同的同的生物样品，需要不同的前处理过程，但检测方法是可以通用的。
优选的，配制待测样品的步骤，包括如下方法：
S021.提供藻类原材料，将藻类原材料进行研磨处理，得到藻类原材料粉末；
S022.将藻类原材料粉末与有机溶剂进行混合并离心处理，得到藻类原材料上清液；
S023.将藻类原材料上清液进行过滤，得到待测样品。
在步骤S021中，藻类原材料选自新鲜藻类，藻粉，藻类提取物制成的压片、胶囊、固体饮料、液体饮料、凝胶糖果、化妆品中的至少一种。
进一步，将藻类原材料进行研磨处理的步骤，包括：提供陶瓷珠与藻类原材料混合，于25～30Hz的条件下进行研磨处理2～5分钟，保证研磨处理后得到材料的粉末，破坏原材料的组织，是采用提取可得到类胡萝卜素。
在步骤S022中，将藻类原材料粉末与有机溶剂进行混合并离心处理，得到藻类原材料上清液。优选的，有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种，且藻类原材料粉末与有机溶剂的质量比为1：(1～1.5)，采用有机溶剂进行提取，得到的上清液即可直接进行检测，无需萃取、浓缩和复溶等步骤，减少了实验误差与目标成分损失，增加了检测的准确度。
在步骤S023中，将藻类原材料上清液进行过滤，得到待测样品。优选的，采用0.22μm滤膜进行过滤处理，有利于7种不同种类的类胡萝卜素进行分离。
在本发明优选实施例中，取0.2mg藻粉或当量新鲜藻液于EP管中，加入2颗陶瓷珠，25Hz，组织研磨仪研磨2min，加入2mL甲醇，震荡离心取上清液，经0.22μm滤膜滤过后，得到制待测样品。
进一步的，将待测样品在与混合标准溶液相同的检测条件下进行超高效液相色谱质谱检测，获得待测样品的质谱图。
优选的，将待测样品进行超高效液相色谱质谱检测，超高效液相色谱质谱检测的试验条件如下：超高效液相色谱检测采用超高效液相色谱仪ACQUITY Ultra PerformanceLC H-Class进行检测，超高效液相色谱检测的条件为：色谱柱为BEH C18或HSS T3；流动相第一溶液为乙腈，流动相第二溶液为甲醇，流动相第三溶液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；洗脱流速为0.1～0.5mL/min；柱温为30～40℃；进样量为1～1.5μL；洗脱时间为10～15min；洗脱方式为梯度洗脱，其中，梯度洗脱的程序为：提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液和质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于0～4分钟进行第一梯度洗脱；提供质量百分含量为92％的流动相第一溶液和质量百分含量为8％流动相第二溶液的混合溶液于4～8分钟进行第二梯度洗脱；提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液、质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于8～10分钟进行第三梯度洗脱。
质谱检测的设备选择的三重四极杆质谱仪为美国WATERS Xevo TQ-XS，包括有ESI、APCI离子源，使用Masslynx 4.2软件控制液质联用仪。质谱检测中，质谱离子源为电喷雾电离离子源；质谱离子化模式为电喷雾电离正离子模式；毛细管电压为3～3.5kv；脱溶剂温度为400～420℃；脱溶剂气流量为800～850L/hr；锥孔气流量为150～200L/hr；碰撞气流量为0.16～0.20mL/min；离子源温度为150～180℃；检测模式为MRM模式。
在本发明优选实施例中，将待测样品进行超高效液相色谱质谱检测，超高效液相色谱质谱检测的试验条件如下：超高效液相色谱检测采用超高效液相色谱仪ACQUITYUltra Performance LC H-Class进行检测，超高效液相色谱检测的条件为：色谱柱为HSST3，其中，HSS T3的规格为2.1mm*100mm，1.8μm；流动相第一溶液为乙腈，流动相第二溶液为甲醇，流动相第三溶液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；洗脱流速为0.35mL/min；柱温为35℃；进样量为1μL；洗脱时间为10min；洗脱方式为梯度洗脱，其中，梯度洗脱的程序为：提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液和质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于0～4分钟进行第一梯度洗脱；提供质量百分含量为92％的流动相第一溶液和质量百分含量为8％流动相第二溶液的混合溶液于4～8分钟进行第二梯度洗脱；提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液、质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于8～10分钟进行第三梯度洗脱。
质谱检测的设备选择的三重四极杆质谱仪为美国WATERS Xevo TQ-XS，包括有ESI、APCI离子源，使用Masslynx 4.2软件控制液质联用仪。质谱检测中，质谱离子源为电喷雾电离离子源；质谱离子化模式为电喷雾电离正离子模式；毛细管电压为3kv；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流量为800L/hr；锥孔气流量为150L/hr；碰撞气流量为0.16mL/min；离子源温度为150℃；检测模式为MRM模式。
进一步的，进行超高效液相色谱质谱检测之后，获得待测样品的质谱图。
在步骤S03中，根据待测品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值确定岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的种类，并根据各种类的定量离子对的质谱峰面积计算得到所述待测品中岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的含量。
本申请对7种类胡萝卜素的定性定量检测的准确度和灵敏度有了较大提高，也大大提高了检测效率。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
制备标准品的标准曲线
配制岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品、新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品的混合标准溶液：分别将7种类胡萝卜素标准品(均为1.0mg)溶解于1mL甲醇中，得到7种单个浓度为1mg/mL的标准品母液；分别精密量取单个标准品母液，用甲醇稀释后得到7种浓度为10μg/mL的标准工作液；分别精密量取单个标准品工作液，混合得到混合标准溶液，其中，混合标准溶液中，岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素的浓度为500ng/mL，玉米黄素、新黄素、紫黄素的浓度为100ng/mL。
进一步，依次用甲醇稀释，其中，岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素以500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL绘制标准曲线，玉米黄素、新黄素、紫黄素以100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL绘制标准曲线。
将混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，超高效液相色谱质谱检测的试验条件如下：超高效液相色谱检测采用超高效液相色谱仪ACQUITY UltraPerformance LC H-Class进行检测，超高效液相色谱检测的条件为：色谱柱为HSS T3，其中，HSS T3的规格为2.1mm*100mm，1.8μm；流动相第一溶液为乙腈，流动相第二溶液为甲醇，流动相第三溶液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；洗脱流速为0.35mL/min；柱温为35℃；进样量为1μL；洗脱时间为10min；洗脱方式为梯度洗脱，其中，梯度洗脱的程序为：提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液和质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于0～4分钟进行第一梯度洗脱；提供质量百分含量为92％的流动相第一溶液和质量百分含量为8％流动相第二溶液的混合溶液于4～8分钟进行第二梯度洗脱；提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液、质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于8～10分钟进行第三梯度洗脱。质谱检测的设备选择的三重四极杆质谱仪为美国WATERS Xevo TQ-XS，包括有ESI、APCI离子源，使用Masslynx 4.2软件控制液质联用仪。质谱检测中，质谱离子源为电喷雾电离离子源；质谱离子化模式为电喷雾电离正离子模式；毛细管电压为3kv；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流量为800L/hr；锥孔气流量为150L/hr；碰撞气流量为0.16mL/min；离子源温度为150℃；检测模式为MRM模式。
制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程。
实施例2
新鲜藻类的7种类胡萝卜素的检测
配制待测样品：提供0.2mg藻类原材料，将藻类原材料加入2颗陶瓷珠，于25Hz的条件下进行研磨处理2分钟，得到藻类原材料粉末；将藻类原材料粉末与2mL甲醇溶液进行混合并离心处理，得到藻类原材料上清液；将藻类原材料上清液经0.22μm滤膜进行过滤，得到待测样品。
将待测样品进行超高效液相色谱质谱检测，超高效液相色谱质谱检测的试验条件如下：超高效液相色谱检测采用超高效液相色谱仪ACQUITY Ultra Performance LC H-Class进行检测，超高效液相色谱检测的条件为：色谱柱为HSS T3，其中，HSS T3的规格为2.1mm*100mm，1.8μm；流动相第一溶液为乙腈，流动相第二溶液为甲醇，流动相第三溶液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；洗脱流速为0.35mL/min；柱温为35℃；进样量为1μL；洗脱时间为10min；洗脱方式为梯度洗脱，其中，梯度洗脱的程序为：提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液和质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于0～4分钟进行第一梯度洗脱；提供质量百分含量为92％的流动相第一溶液和质量百分含量为8％流动相第二溶液的混合溶液于4～8分钟进行第二梯度洗脱；提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液、质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于8～10分钟进行第三梯度洗脱。质谱检测的设备选择的三重四极杆质谱仪为美国WATERS Xevo TQ-XS，包括有ESI、APCI离子源，使用Masslynx 4.2软件控制液质联用仪。质谱检测中，质谱离子源为电喷雾电离离子源；质谱离子化模式为电喷雾电离正离子模式；毛细管电压为3kv；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流量为800L/hr；锥孔气流量为150L/hr；碰撞气流量为0.16mL/min；离子源温度为150℃；检测模式为MRM模式。
根据获得待测样品的质谱图；根据待测品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值确定岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的种类，并根据各种类的定量离子对的质谱峰面积计算得到待测品中岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的含量。
结果分析：
实施例1结果分析
实施例1中，对混合标准溶液进行高效液相色谱检测得到MRM采集数据，可得到MRM模式总离子图，并一一分析得到岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素各标准品的标准曲线，以标准品浓度(ng/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。具体结果分析如下：
如表1所示，岩藻黄醇标准品的标准曲线的回归方程为y＝784.31x+5006.86，相关系数r2为0.991，线性范围为1～250ng/mL，仪器检出限(下文简称为LOD)为0.5ng/mL，定量限(下文简称为LOQ)为1ng/mL；如图1所示，图1为岩藻黄醇标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，岩藻黄醇的保留时间为2.58min，锥孔电压为28V，定量离子对为617.3mz＞109.0mz，碰撞能量为28eV；定性离子对为617.3mz＞599.4mz，碰撞能量为10eV。
如表1所示，岩藻黄素标准品的标准曲线的回归方程为y＝354.33x+1140.1，相关系数r2为0.993，线性范围为1～500ng/mL，LOD为0.5ng/mL，LOQ为1ng/mL；如图2所示，图2为岩藻黄素标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，岩藻黄素的保留时间为5.67min，锥孔电压为2V，定量离子对为659.7mz＞109.1mz，碰撞能量为22eV；定性离子对为659.7mz＞641.6mz，碰撞能量为8eV。
如表1所示，硅甲藻黄素标准品的标准曲线的回归方程为y＝44.65x+493.48，相关系数r2为0.996，线性范围为5～500ng/mL，LOD为1ng/mL，LOQ为2.5ng/mL；如图3所示，图3为硅甲藻黄素标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，硅甲藻黄素的保留时间为7.03min，锥孔电压为50V，定量离子对为583.7mz＞91.0mz，碰撞能量为70eV；定性离子对为583.7mz＞105.1mz，碰撞能量为60eV。
如表1所示，硅藻黄素标准品的标准曲线的回归方程为y＝227.68x+441.41，相关系数r2为0.993，线性范围为5～500ng/mL，LOD为1ng/mL，LOQ为2.5ng/mL；如图4所示，图4为硅藻黄素标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，硅藻黄素的保留时间为8.58min，锥孔电压为50V，定量离子对为566.7mz＞105.1mz，碰撞能量为54eV；定性离子对为566.7mz＞91.0mz，碰撞能量为70eV。
如表1所示，新黄素标准品的标准曲线的回归方程为y＝400.85x-145.74，相关系数r2为0.998，线性范围为2.5～100ng/mL，LOD为1ng/mL，LOQ为2.5ng/mL；如图5所示，图5为新黄素标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，新黄素的保留时间为5.19min，锥孔电压为8V，定量离子对为601.3mz＞104.9mz，碰撞能量为74eV；定性离子对为601.3mz＞90.9mz，碰撞能量为62eV。
如表1所示，玉米黄素标准品的标准曲线的回归方程为y＝161.26x-20.77，相关系数r2为0.993，线性范围为2.5～100ng/mL，LOD为1ng/mL，LOQ为2.5ng/mL；如图6所示，图6为玉米黄素标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，玉米黄素的保留时间为9.36min，锥孔电压为2V，定量离子对为568.7mz＞476.5mz，碰撞能量为16eV；定性离子对为568.7mz＞91.0mz，碰撞能量为70eV。
如表1所示，紫黄素标准品的标准曲线的回归方程为y＝197.30x-71.362，相关系数r2为0.998，线性范围为2.5～100ng/mL，LOD为1ng/mL，LOQ为2.5ng/mL；如图7所示，图7为紫黄素标准品的MRM模式总离子图，如表2所示，紫黄素的保留时间为6.28min，锥孔电压为52V，定量离子对为601.7mz＞105.1mz，碰撞能量为58eV；定性离子对为601.7mz＞221.2mz，碰撞能量为20eV。
综上，可以看出采用该检测方法分析7种类胡萝卜素中，仪器检出限为0.5～1ng/mL，定量限为1～2.5ng/mL，在1、2.5、5～500ng/mL的浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99，方法检测准确度分别为93.9-106.6％。
表1
Figure BDA0002808356440000171
表2
Figure BDA0002808356440000172
Figure BDA0002808356440000181
实施例2结果分析
根据获得待测样品的质谱图；可以检测得到4种类胡萝卜素的化合物，并分析得到其含量。根据待测品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值确定待测样品中含有岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素4种类胡萝卜素。
其中，根据图8所示的定量离子对质谱图，岩藻黄醇的保留时间为2.58min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的岩藻黄醇的回归方程，可以计算得到样品中岩藻黄醇的含量为32.7ng/mL。
根据图9所示的定量离子对质谱图，新黄素的保留时间为5.18min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的新黄素的回归方程，可以计算得到样品中新黄素的含量为26.1ng/mL。
根据图10所示的定量离子对质谱图，岩藻黄素的保留时间为5.66min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的岩藻黄素的回归方程，可以计算得到样品中岩藻黄素的含量为198.3ng/mL。
根据图11所示的定量离子对质谱图，紫黄素的保留时间为6.26min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的紫黄素的回归方程，可以计算得到样品中紫黄素的含量为23.4ng/mL。
根据图12所示的定量离子对质谱图，硅甲藻黄素的保留时间为7.02min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的硅甲藻黄素的回归方程，可以计算得到样品中硅甲藻黄素的含量为48.5ng/mL。
图13所示的定量离子对质谱图，硅藻黄素的保留时间为8.58min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的硅藻黄素的回归方程，可以计算得到样品中硅藻黄素的含量为30.2ng/mL。
图14所示的定量离子对质谱图，玉米黄素的保留时间为9.35min，如表3所示，根据峰面积并代入提供的玉米黄素的回归方程，可以计算得到样品中玉米黄素的含量为25.3ng/mL。
综上，该检测方法所需样品量少，仅需0.2mg甚至更少的样品即可进行精确分析；其次，由于本方法在复杂背景中具有高选择性，因此样品的前处理过程可大大简化，只需要采用溶剂进行简单提取即可直接检测，无需萃取、浓缩和复溶等步骤，减少了实验误差与目标成分损失，提高了检测的准确度；再者，通过优化超高效液相色谱质谱方法的各参数，进而达到检测快速、高效、灵敏度高，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，使岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素7种类胡萝卜素都可以达到较的定性定量分析，可实现快速、准确的大通量检测。
表3
Figure BDA0002808356440000191
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制岩藻黄醇标准品、岩藻黄素标准品、硅甲藻黄素标准品、硅藻黄素标准品、新黄素标准品、玉米黄素标准品、紫黄素标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，并制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程；
配制待测样品，将所述待测样品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行超高效液相色谱质谱检测，获得所述待测样品的质谱图；
根据所述待测品的质谱图的保留时间、定量离子对和定性离子对的数值确定岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的种类，并根据各种类的定量离子对的质谱峰面积计算得到所述待测品中岩藻黄醇、岩藻黄素、硅甲藻黄素、硅藻黄素、新黄素、玉米黄素、紫黄素的含量。
2.根据权利要求1所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱质谱检测中，所述超高效液相色谱的检测条件如下：
色谱柱为BEH C18或HSS T3；
流动相第一溶液为乙腈，流动相第二溶液为甲醇，流动相第三溶液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液；
洗脱流速为0.1～0.5mL/min；
柱温为30～40℃；
进样量为1～1.5μL；
洗脱时间为10～15min；
洗脱方式为梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液和质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于0～4分钟进行第一梯度洗脱；
提供质量百分含量为92％的流动相第一溶液和质量百分含量为8％流动相第二溶液的混合溶液于4～8分钟进行第二梯度洗脱；
提供质量百分含量为58％的流动相第一溶液、质量百分含量为27％流动相第二溶液、质量百分含量为15％的流动相第三溶液的混合溶液于8～10分钟进行第三梯度洗脱。
4.根据权利要求2所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述洗脱流速为0.35mL/min；
所述柱温为35℃；
所述进样量为1μL；
所述洗脱时间为10min。
5.根据权利要求1所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱质谱检测中，所述质谱的检测条件如下：
质谱离子源为电喷雾电离离子源；
质谱离子化模式为电喷雾电离正离子模式；
毛细管电压为3～3.5kv；
脱溶剂温度为400～420℃；
脱溶剂气流量为800～850L/hr；
锥孔气流量为150～200L/hr；
碰撞气流量为0.16～0.20mL/min；
离子源温度为150～180℃；
检测模式为MRM模式。
6.根据权利要求1～5任一所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述岩藻黄醇标准品的标准曲线的线性范围为1～250ng/mL；所述岩藻黄素标准品的标准曲线的线性范围为1～500ng/mL；所述硅甲藻黄素标准品的标准曲线的线性范围为5～500ng/mL；所述硅藻黄素标准品的标准曲线的线性范围为5～500ng/mL；所述新黄素标准品的标准曲线的线性范围为2.5～100ng/mL；所述玉米黄素标准品的标准曲线的线性范围为2.5～100ng/mL；所述紫黄素标准品的标准曲线的线性范围为2.5～100ng/mL。
7.根据权利要求1～5任一所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，配制待测样品的步骤，包括如下方法：
提供藻类原材料，将所述藻类原材料进行研磨处理，得到藻类原材料粉末；
将所述藻类原材料粉末与有机溶剂进行混合并离心处理，得到藻类原材料上清液；
将所述藻类原材料上清液进行过滤，得到待测样品。
8.根据权利要求7所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述藻类原材料选自新鲜藻类，藻粉，藻类提取物制成的压片、胶囊、固体饮料、液体饮料、凝胶糖果、化妆品中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，研磨处理的步骤，包括：提供陶瓷珠与所述藻类原材料混合，于25～30Hz的条件下进行研磨处理2～5分钟；和/或，
所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种，且所述藻类原材料粉末与所述有机溶剂的质量比为1：(1～1.5)。
10.根据权利要求1～5任一所述的检测7种类胡萝卜素的方法，其特征在于，将所述混合标准溶液进行超高效液相色谱质谱检测得到标准图谱，并制作各标准品的标准曲线，获取各标准品的回归方程的步骤中，将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制至少5种不同浓度的混合标准溶液稀释液，将所述不同浓度的混合标准溶液稀释液进行超高效液相色谱质谱检测并得到标准图谱，通过所述标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程。
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