CN112557422A - 用于低温电子显微镜的样品制备方法和装置 - Google Patents

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Abstract

用于低温电子显微镜的样品制备方法和装置。提供了各种方法和装置来寻找用于低温电子显微镜的样品的最佳样品条件。可使用样品检查装置筛选具有不同样品条件的多个样品。所述样品检查装置包括形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的至少一个室，其用于固持所述样品。所述室内布置有多个柱。所述样品检查装置包括覆盖所述多个柱中的至少一个的窗口。

Description

用于低温电子显微镜的样品制备方法和装置
背景技术
本说明书总体上涉及用于制备用于单粒子分析的样品的方法和装置，并且更具体地，涉及基于低温电子显微镜成像优化用于单粒子分析的样品质量。
基于低温电子显微镜（cryo-EM）图像的单粒子分析可在近原子分辨率下解析生物大分子的结构。样品制备为获得大分子的高质量cryo-EM图像的关键步骤。作为一个实例，为了解析蛋白质结构，通过将蛋白质与一种或多种缓冲溶液混合来制备蛋白质样品。需要优化样品构建体以及缓冲液条件（包括PH水平、盐浓度、表面活性剂浓度和去污剂浓度），以溶解和稳定蛋白质，从而获得最佳cryo-EM结果。然而，制备和成像具有不同样品条件的玻璃化蛋白质样品需要进行大量的试验和误差测试，并且会变得非常耗时。
发明内容
在一个实施例中，样品检查装置用于筛选样品条件。样品检查装置包含：形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的一个或多个室，其用于固持第一样品；第一室内的多个柱，多个柱中的每个柱从顶部电子透明层延伸到底部电子透明层；和形成有顶部电子透明层与底部电子透明层中的至少一个的一部分的窗口，其用于检查第一室中的第一样品，所述窗口覆盖多个柱中的至少一个。以这种方式，具有多个样品条件的样品可在同一样品检查装置内玻璃化和成像。
在另一个实施例中，一种用于使用样品检查装置检查样品的方法包含：使第一样品流入样品检查装置的第一室中，其中第一室形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间，多个柱布置在第一室内，并且多个柱中的每个柱从顶部电子透明层延伸到底部电子透明层；将带电粒子束引向样品检查装置的窗口，其中所述窗口形成有顶部电子透明层与底部电子透明层中的至少一个的一部分，并且所述窗口覆盖多个柱中的至少一个；以及基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成第一样品的第一图像。
应当理解，提供以上概述是为了以简化的形式介绍在详细描述中进一步描述的一些概念。这并不意味着标识所要求保护的主题的关键或必要特征，所要求保护的主题的范围由详细描述之后的权利要求唯一地限定此外，所要求保护的主题不限于解决上文提到或本公开的任一部分中的任何缺点的实施方案。
附图说明
图1图示了低温电子显微镜系统。
图2A、2B和2C示出了具有一个室的示例样品检查装置。
图3A、3B和3C示出了具有两个断开的室的示例样品检查装置。
图4示出了具有四个断开的室的示例样品检查装置。
图5A示出了具有两个连接的室的示例样品检查装置。
图5B示出了图5A的样品检查装置中的变化的样品条件分布。
图6为用于制造样品检查装置的方法。
图7图示了用于根据图6的方法制造样品检查装置的程序。
图8示出了用于使用具有断开的室的样品检查装置来筛选样品条件的示例方法。
图9示出了用于使用具有连接的室的样品检查装置来筛选样品条件的示例方法。
图10示出了用于使用具有断开的室的样品检查装置和具有连接的室的样品检查装置两者来筛选样品条件的示例方法。
贯穿附图的若干个视图，相似的附图标记指代对应的部分。
具体实施方式
以下描述涉及用于基于低温电子显微镜（cryo-EM）的单粒子分析筛选样品的系统和方法。cryo-EM成像可使用图1所示的成像系统来执行。
为了执行单粒子分析，样品在用cryo-EM成像系统成像之前，要经历多个样品制备步骤，以达到最佳样品条件。样品条件可包括缓冲液类型和PH值、盐和去污剂类型和浓度以及表面活性剂浓度。样品条件还可包括纳米盘大小、脂质与蛋白质的比率以及临界胶束浓度。
样品制备步骤可包括纯化样品，将纯化的样品与缓冲液混合，并且使混合物玻璃化。样品制备步骤中的一个是将样品（如蛋白质）与一种或多种缓冲液混合，以溶解和稳定样品。举例来说，蛋白质可通过添加如纳米盘、交联剂和/或支架的构建体来稳定。通过将样品与一种或多种缓冲液混合，将样品的缓冲系统从纯化过程和/或样品存储期间使用的缓冲系统更换为适合于cryo-EM成像的缓冲系统。
用于单粒子分析的样品质量可基于样品的cryo-EM图像来确定。样品质量可包括粒子质量、样品格栅质量和cryo-EM图像质量。粒子质量可包括三级和四级结构、聚集状态、稳定性、粒子结合、粒子大小和粒子相似性中的一种或多种。样品格栅质量可包括格栅上的冰形成、粒子分布和粒子取向中的一种或多种。图像质量可包括对比度和分辨率中的一项或多项。
尽管可使用多种技术来筛选样品以进行蛋白质表达和纯化，而无需进行cryo-EM成像，但用于单粒子分析的样品质量只能基于玻璃化样品的cryo-EM图像准确而可靠地确定。结果，样品条件只能基于cryo-EM图像准确而可靠地评估。由于难以基于已知的其它样品的最佳样品条件来预测新样品的样品条件，因此必须执行样品制备和cryo-EM成像的多次迭代来寻找新样品的最佳样品条件。
为了解决此问题，提出了样品检查装置以及使用样品检查装置来筛选样品条件的方法的各种实例，以加速对最佳样品条件的寻找。样品检查装置可具有形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的一个室（图2A-2C）、多个流体断开的室（图3A-3C和图4）或多个流体连接的室（图5A）。可将具有不同样品条件的样品装载到一个或多个室中，并且通过由电子透明层的至少一部分通过窗口形式成像来检查。室中布置有多个柱。窗口覆盖柱中的至少一个。每个柱的一端与顶部电子透明层结合，而另一端与底部电子透明层结合。样品可在柱周围流动。柱为窗口提供机械强度和坚固性。更重要的是，通过将柱与电子透明层结合，可防止样品装载和装置玻璃化期间的鼓胀。
对于具有断开的室的样品检查装置，可对离散的样品条件进行成像和分析。对于具有流体连接的室的样品检查装置，可在混合区域中形成样品条件的梯度，并且可对连续变化的样品条件进行成像和分析。图5B示出了图5A中装置的混合区域中的示例样品条件。通过提供覆盖多个样品或具有不同样品条件的样品的窗口，样品和/或多个样品的多个位置可用成像束或样品的最小平移来成像。此外，大的窗口面积提供了具有均匀厚度和热容量的大面积，这可便于在玻璃化期间建造高质量的冰。
样品检查装置的内表面可被预处理以便于样品进入室中。内表面可在制造样品检查装置期间被预处理。内表面可替代地或另外地在将样品装载到装置中之前被预处理。
图2A-2C、3A-3C、4和5A示出了具有各个部件的相对位置的样品检查装置的示例配置。这些数字未按比例绘制。如果示出为彼此直接接触或直接联接，则这类元件可分别被称为直接接触或直接联接。类似地，示出为彼此相邻或邻近的元件可分别彼此相邻或邻近。作为另一个实例，在至少一个实例中，彼此间隔开定位且在其间仅具有空间而没有其它部件的元件可被称为如此。此外，如图所示，在至少一个实例中，z轴线上的最上面的元件或元件的点可被称为部件的“顶部”，并且z轴线上的最下面的元件或元件的点可被称为部件的“底部”。如本文所用，顶部/底部、上部/下部、上方/下方可相对于z轴线，并且用来描述附图中的元件相对于彼此的定位。
图6示出了用于制造样品检查装置的示例方法。图7图示了用于根据图6的方法制造样品检查装置的程序。样品检查装置可由各自沉积有一层电子透明材料的两个硅晶片制成。两个沉积的晶片通过图案化层结合在一起。图案化层形成多个柱和结合层。
如图8所示，具有多个断开的室的样品检查装置可单独用于筛选离散的样品条件。如图9所示，具有多个连接的室的样品检查装置可用于筛选连续变化的样品条件。如图10所示，具有连接的室的样品检查装置可与具有断开的室的样品检查装置一起使用，用于快速地识别出最佳样品条件。样品条件的最佳范围可首先使用具有连接的室的装置来识别。然后，最佳范围内的最佳样品条件可使用具有断开的室的装置来识别。
转向图1，示出了根据本公开的实施例的cryo-EM成像系统。cryo-EM系统可包括用于对玻璃化的样品成像的透射电子显微镜（TEM）系统100。TEM系统100包括沿发射轴线110（如电子束11）朝向柱12发射带电粒子的电子源10。电子源10可生成高能电子，即，典型能量介于约10 keV与1,000 keV之间的的电子。在一些实施例中，柱12可包括如聚光器透镜120和121等一个或多个聚光器透镜，以及如孔径122等一个或多个孔径。柱12使从电子源10生成的电子准直，并且将电子束引导到样品检查装置14上。样品检查装置14可由样品固持器13固持。样品检查装置可为本文所描述的任何样品检查装置。样品固持器13可通过倾斜和/或平移样品来调整样品位置。样品固持器可保持在远低于零度的温度下以进行低温成像。聚光器孔径15可任选地插入到束路径中，以允许电子束仅照射样品的选定区域。
TEM系统100可用于获取样品的衍射图案和EM图像两者。在衍射成像模式中，散射的电子可透射通过样品检查装置14，并且在依次行进通过物镜123、中间透镜126和投影仪透镜127之后被检测器25收集，如实线所示。未散射的束可被束霖止器17阻挡。所收集的散射电子用来形成电子衍射图案，如选定区域电子衍射（SAED）图案。在EM成像模式中，从束路径中移除束霖止器17。从样品检查装置14透射的电子依次通过物镜123、中间透镜126和投影仪透镜127，并且在检测器25上形成样品的TEM图像，如虚线所示。
检测器25可检测接收到的电子并将信号发送到图像处理器24以形成图像。检测器25可包括用于在将信号发送到图像处理器24之前放大信号的放大器。在一个实例中，检测器25可为CCD摄相机或CMOS摄相机。在一些实施例中，不同的检测器可用于检测由电子与样品的相互作用生成的信号。举例来说，检测器可检测X射线和/或光子。
控制器30可响应于操作员指令手动地或者根据存储在控制器30的非暂时性存储器（或计算机可读介质）32中的计算机可读指令自动地控制TEM系统100的操作。控制器30可包括处理器24，并且被配置为执行存储在存储器32中的计算机可读指令，并且控制TEM系统100的各种部件，以便实施本文所描述的任何方法。举例来说，控制器可通过调整选定区域孔径15和物镜124的位置来调整成像模式以获取衍射图案或EM图像。控制器30可通过调整电流密度来调整朝着样品照射的电子束的剂量。举例来说，电流密度可通过调整聚光器光学器件（如聚光器透镜120和121）来调整。控制器30可通过调整在柱12中的一个或多个孔径和/或透镜来调整入射束的轮廓。控制器30可通过调整样品固持器13来调整样品相对于入射束的位置和/或取向。控制器30可被配置为自动获取样品检查装置14的一个位置或多个位置处的图像。控制器30还可联接到显示器31，以显示通知和/或样品的图像。控制器30可从用户输入装置33接收用户输入。用户输入装置33可包括键盘、鼠标或触摸屏。
尽管以示例方式描述了TEM系统，但应当理解，衍射图案和EM图像可用其它显微镜系统获取。作为一个实例，衍射图案可通过基于光学的显微镜系统获取。作为一个实例，衍射图案可为从X射线衍射系统获取的X射线衍射图案。作为另一个实例，EM图像可从扫描透射电子显微镜（STEM）系统获取。TEM系统的本论述仅被提供作为一种合适的成像模态的实例。
图2A-2C示出了具有单个室的样品检查装置200的实例。入口和出口与室流体连接。样品可经由入口流入室中，并且通过覆盖室的至少一部分的窗口进行检查。
图2A为样品检查装置200的俯视图。样品检查装置200可为矩形的。举例来说，样品检查装置可为10 × 3.3 mm2。窗口201、入口203和出口204形成在样品检查装置的顶层211中。窗口201、入口203和出口204可通过分别在顶层211中产生锥形凹部202、205和206来形成。x-y平面中的凹部（202、205和206）的开口随着开口接近室231而减小。凹部（202、205和206）的深度与顶层211的厚度相同。在一个实例中，凹部（202、205和206）通过蚀刻硅晶片而产生。顶层211的厚度可为300 um。窗口201在x-y平面中的最小尺寸可大于100 um。大的窗口面积提供了具有均匀厚度和热容量的大面积，这可便于在玻璃化期间建造高质量的冰。在一个实例中，窗口201为周长大于100 um的正方形。在另一个实例中，窗口201为周长约200 um的正方形。在其它实例中，窗口201可为其它形状，如矩形或圆形。在一个实例中，入口203和出口204为周长在80-180 um之间的正方形。在其它实例中，入口203和出口204可具有其它形状，如矩形或圆形。窗口201覆盖室231的至少一部分。入口203和出口204与室231流体连接。样品可从入口203经由通道209流入室231中，并且从室231经由通道210流动到出口204。可经由窗口201检查室内的样品。
图2B为样品检查装置200沿图2A的A-A'在x-z平面中的的截面图。两个电子透明层217和218位于顶层211与底层215之间。顶部电子透明层217与顶层211直接接触，并且底部电子透明层218与底层215直接接触。顶部电子透明层217和底部电子透明层218通过结合层232和一个或多个柱212结合。电子透明层217和218的厚度可为20 nm。锥形凹部242形成在底层215中并与凹部202对准，使得带电粒子（如电子）可通过窗口201透射通过样品检查装置。类似于凹部202，x-y平面中的凹部242的开口随着开口接近室231而减小。凹部242的高度与底层215的厚度252相同。顶层211的厚度251可与底层215的厚度252相同。
窗口201包括两个电子透明层217和218中的至少一个的一部分。形成窗口202的电子透明层217的部分具有连续材料。室231形成在电子透明层217和218之间。两个电子透明层之间的距离（或室的高度）可为50-100 nm。多个柱212布置在两个电子透明层217和218之间，从而允许样品在柱周围流动。柱212中的每一个柱从顶部电子透明层217延伸到底部电子透明层218。柱212中的每一个柱的一端结合到顶部电子透明层217，并且另一端结合到底部电子透明层218。通过将柱的每一端结合到两个电子透明层中的一个，样品检查装置可在样品装载、样品玻璃化和样品成像的过程期间保持形状。在一个实例中，在x-y截面中的柱的形状可为圆形、椭圆形或矩形。窗口201覆盖柱212中的至少一个。x-y平面中每个柱的横截面积可为3 um2 – 350 um2。柱（212、213）和结合层232可在相同的工艺步骤中并由相同的材料制造。带电粒子可透射通过柱212的间隙之间的窗口201，使得围绕柱的样品可被成像。换句话说，窗口201至少具有允许带电粒子透射通过的区域和至少带电粒子被柱阻挡的区域。通过在由窗口覆盖的室内布置柱，可增加窗口的面积。在用带电粒子成像系统检查样品的同时，增加的窗口面积允许更大的成像面积并减少载物台移动距离。此外，大的窗口面积便于玻璃化期间均匀的样品冷却。此外，柱为窗口提供了机械支撑并增加了样品检查装置的坚固性。
通道209和210形成在底层215中，以分别将入口203和出口204与室231连接。通道可通过蚀刻到底层215中而产生。通道209和210的高度255可为0.1-10 um。在一些实施例中，多个柱213可任选地布置在室中，其一端结合到顶部电子透明层217。在一个实施例中，室231被抽空。入口203和出口204被薄膜气密密封。在一个实例中，入口203和出口204被顶部电子透明层217密封，如图2B所示。在另一个实施例中，样品检查装置仅具有入口而没有出口。入口可用薄膜气密密封。通过戳破和打破薄膜，样品可流入室中。
缓冲室207和208分别布置在入口203与室231之间以及室231与出口204之间。样品经由缓冲室207从入口流到室231中由窗口201覆盖的区域。在一些实施例中，缓冲室可为室231的一部分，如图2B-2C所示。缓冲室207和208位于两个电子透明层217和218之间。没有柱布置在缓冲室中。在其它实施例中，缓冲室可为通道209和210的一部分。无柱缓冲室可避免样品从室231向入口203回流。
图2C为样品检查装置200沿图2B的B-B′在x-y平面中的截面图。室231的一部分由窗口201覆盖。窗口的边缘由虚线230描绘。缓冲室207和208分别将由窗口覆盖的室区域与入口203和出口204流体连接。窗口201覆盖多个柱212。换句话说，窗口201由多个柱212支撑。样品可经由通道209和缓冲室207从入口203依次流到室231中由窗口201覆盖的区域。如果样品检查装置包括出口204，则样品可经由缓冲室208和通道210从室231中由窗口201覆盖的区域排出到出口。
在一些实施例中，样品检查装置可为圆形的。举例来说，样品检查装置可为直径为3 mm的圆形。
图3A-3C示出了具有两个断开的室的样品检查装置300的实例。每个室具有与室流体连接的入口。在此实例中，样品检查装置300不包括出口。两个室中的样品均可经由窗口检查。在一些实例中，一个或多个室可连接到一个或多个出口。
图3A为样品检查装置300的俯视图。窗口301、第一入口303和第二入口304通过分别在顶层311中产生锥形凹部302、305和306而形成。窗口301覆盖第一室331的一部分和第二室332的一部分。第一室331和第二室332没有流体连接。在由窗口301覆盖的区域内，第一室331和第二室332被壁360分隔。第一入口303通过通道309与第一室331流体连接。第二入口304通过通道310与第二室332流体连接。
顶层311的厚度可为300 um。窗口301在x-y平面中的最小尺寸可大于100 um。在一个实例中，窗口301为周长大于100 um的正方形。在另一个实例中，窗口301为周长约200 um的正方形。在其它实例中，窗口301可具有其它形状，如矩形或圆形。在一个实例中，入口303和入口304为周长在80-180 um之间的正方形。在其它实例中，入口303和入口304可具有其它形状，如矩形或圆形。
图3B为样品检查装置300沿图3A的C-C′在xz平面中的截面图。两个电子透明层317和318位于顶层311与底层315之间。顶部电子透明层317与顶层311直接接触，并且底部电子透明层318与底层315直接接触。顶部电子透明层317和底部电子透明层318通过结合层311和柱312结合。柱（312、313和373）和结合层311可在相同的工艺步骤中并由相同的材料制造。电子透明层317和318的厚度可为20 nm。锥形凹部305、302和306的开口减小，并且所述开口接近顶部电子透明层317。锥形凹部的深度与顶层311的厚度351相同。
锥形凹部342形成在底层315中并与凹部302对准，使得带电粒子（如电子）可通过窗口301透射通过样品检查装置。x-y平面中的凹部342的开口随着开口接近底部电子透明层318而减小。凹部342的高度与底层315的厚度352相同。顶层211的厚度351可与底层315的厚度352相同。
通道309和310形成在底层315中，以分别将第一入口303与第一室331连接，并且将第二入口304与第二室332连接。通道可通过蚀刻到底层315中而产生。通道309的高度355和通道310的高度356可为0.1-10 um。柱313和373可任选地定位在通道309和/或通道310中。柱313和373可结合到顶部电子透明层317。在一些实施例中，第一入口303和第二入口304分别由薄膜与第一室331和第二室332气密密封。在一个实例中，如图3B所示，薄膜由顶部电子透明层317形成。第一室331和第二室332可被抽空。液体样品可通过戳破或打破薄膜而流入室中。
图3C为样品检查装置300沿图3B的D-D′在x-y平面中的截面图。窗口301覆盖第一室331的一部分和第二室332的一部分。窗口的边缘由虚线330描绘。缓冲室307将第一室中由窗口301覆盖的区域与入口303流体连接。缓冲室308将第二室中由窗口301覆盖的区域与入口304流体连接。窗口301覆盖多个柱312。换句话说，窗口301由多个柱312支撑。第一样品可经由通道309和缓冲室307从第一入口303依次流到室331中由窗口301覆盖的区域。第二样品可经由通道310和缓冲室308从第二入口304依次流到室332中由窗口301覆盖的区域。
图4为样品检查装置400的一部分的截面图，所述样品检查装置具有形成在通过结合层402结合的两个电子透明层之间的四个断开的室451、452、453和454。窗口401覆盖每个室的至少一部分。窗口的边缘470用虚线描绘。x-y平面中由窗口401覆盖的区域由窗口边缘470内的对角线表示。窗口401包括连续顶部电子透明层的至少一部分。窗口401在x-y平面中的最小尺寸可大于100 um。类似于图3A-3C的样品检查装置，样品检查装置可不具有出口，并且入口由薄膜密封。四个不同的样品可被转移到样品检查装置的不同室中，并且通过窗口401成像。
第一室411和第三室431通过壁403与第二室421和第四室441分隔。第一室411和第二室421通过壁404与第三室431和第四室441分隔。每个室可包括布置有多个柱的区域和没有柱的区域。没有柱的区域在此也被称为缓冲室。举例来说，第一室411包括布置有多个柱412和无柱缓冲室410的区域。第二室421包括布置有多个柱422和无柱缓冲室420的区域。第三室431包括布置有多个柱432和无柱缓冲室430的区域。第四室441包括布置有多个柱442和无柱缓冲室440的区域。窗口401覆盖每个室中的至少一个柱。换句话说，x-y平面中的至少一个柱的整体由x-y平面中的窗口401覆盖。在此，柱在x-y平面中以体育场形状示出。柱的横截面可具有其它形状，如矩形或圆形。在一些实施例中，在一个样品检查装置中，柱可具有不同的形状。
每个室经由通道（451、452、453或454）与不同的入口（未示出）流体连接。多个柱（461、462、463和464）可任选地布置在通道内。
在一个实施例中，缓冲室可包括在通道中，而不是包括在室中。在一些实施例中，样品检查装置的室的数量可为任何整数，如16、32或64。
图5A为示例样品检查装置500的一部分的截面图。样品检查装置500包括形成在通过结合层502结合的两个电子透明层之间的连接的室。第一室521和第二室522分别从不同的入口（未示出）接收第一样品和第二样品，如箭头551和522所示。第一室521和第二室522通过壁506在装置的上游（即，与x轴线箭头方向相反的方向）流体分隔，并且在装置的下游流体连接。第一样品和第二样品在样品检查装置的混合区域591中向下游（即，x轴线的箭头方向）混合。第一样品和第二样品的部分的流动方向分别如箭头553和554所示。
第一样品、第二样品和样品的混合物可通过由两个电子透明层的至少一部分形成的窗口来检查。窗口覆盖x-y平面中的区域501。区域501被电子透明层（如顶部电子透明层）的连续部分覆盖。虚线510描绘了窗口覆盖区域501的边缘。窗口覆盖区域501包括混合区域591，在所述混合区域中样品被混合。窗口也可覆盖壁506的一部分。窗口覆盖区域501包括布置在两个电子透明层之间的多个柱511中的至少一个柱。在此，柱511在x-y平面上为圆形的。在其它实例中，柱511的横截面可为其它形状，如体育场形或矩形。
样品检查装置500的每个室（521和522）可包括窗口覆盖区域501的区域上游的无柱缓冲室（531和532）。在一些实施例中，样品检查装置可包括用于混合两个以上样品的两个以上连接的室。窗口可覆盖样品混合的区域。
第一样品和第二样品可同时转移到样品检查装置。从将样品转移到样品检查装置的那一刻起，可为每个样品建立层流的、静止的流动。样品混合发生在混合区域中这两个平行流的界面处。样品条件的梯度可在混合区域中形成。在一个实例中，如果从将样品转移到样品检查装置到玻璃化时间仍保持静止的样品流，则样品条件为混合区域中的样品位置的函数。在另一个实例中，样品条件可为样品位置以及从转移样品到玻璃化时间的等待时间的函数。可在不同时间点在混合区域的不同位置处观察到不同的样品条件，如采样比。混合区域591中的采样比的空间分布随时间变化。
图5B示出了沿穿过图5A的混合区域591的线590的样品2与样品1之间的比率。在一个实例中，如果从将样品转移到样品检查装置到玻璃化时间，两个样品均维持层流和静止的流，则采样比581不随时间变化。采样比581随着从壁506的端部到x轴线的距离增加而减小。在另一个实例中，在T1将样品转移到样品检查装置中之后，采样比581随时间变化。举例来说，在时间T2，晚于时间T1，采样比582从T1处的采样比581增加。
图2A-2C、图3A-3C、图4和图5A中所示的样品检查装置包括由单个窗口覆盖的一个或多个室。单个窗口包括连续电子透明层的一部分。窗口覆盖并由结合在两个电子透明层之间的至少一个柱支撑。柱可具有单个形状或多个形状的横截面。在一些实例中，可对样品检查装置的内表面（即，在样品装载和成像期间与样品直接接触的表面）的全部或部分进行预处理以便于样品装载。预处理可在室温下进行。
表面预处理可经由不同的实验方法进行。在一个实例中，表面可在室温下通过表面活化方法进行预处理。样品检查装置的内表面可用化学溶液处理，以实现适当的表面润湿，便于样品进入装置中，并且便于样品粘附到室中。样品检查装置的表面可通过在表面上培养溶液或使溶液流过表面来处理。举例来说，在将样品转移或装载到装置中以修饰装置的内表面之前，可使具有最佳浓度的去污剂或亲水性防污化合物（如不干扰目标蛋白质的结构和功能性的PEG）缓冲液流过样品检查装置。在一些实例中，化学品可共价结合到装置的内表面。
在另一个实例中，样品检查装置的内表面可通过等离子体清洁来处理。举例来说，经由自由基反应在高电压下施加带电空气，以增加表面的亲水性。
在又一个实例中，样品检查装置的内表面可通过用如紫外线照射（UV）的辐射来照射内表面而被预处理。内表面暴露于紫外光下以改变表面张力和表面自由能，从而增加表面的可润湿性。
图6为用于制造样品检查装置的示例方法600。图7图示了用于制造图2A-2C中的样品检查装置的方法600的程序。
在602，制备两个硅晶片。在一个实例中，x-y平面中每个晶片的直径可为4英寸。晶片的厚度可为300 um。
在604，氮化硅层沉积在每个晶片的一个表面上。氮化硅层的厚度可为20 nm。在一个实例中，氮化硅层通过低压化学气相沉积（LPCVD）来沉积。图7的绘图701示出了沉积有电子透明氮化硅层712的第一晶片711的x-z截面。
在606，将图案化层沉积在第一晶片的氮化硅层上方。图案化层的厚度可为50-100nm。图案化层可为硼磷硅玻璃（BPSG）。在一个实例中，图案化层通过等离子体增强气相沉积（PECVD）来沉积。图7的绘图702示出了沉积在氮化硅层712上方的图案化层724。图案化层724可形成室（如图2A-2C的室231）中的柱721、通道（如图2A-2C的通道209）中的柱722中的一个或多个以及结合层（如图2A-2C的结合层232）。
在608，在第二晶片中蚀刻通道。通道可通过蚀刻穿过沉积在第二晶片上的氮化硅层来形成。通道的深度可为0.1-10 um。绘图703示出了蚀刻到沉积有氮化硅层732的第二晶片731中的通道733。通道733的深度735可为0.1-10 um。
在610，可将来自步骤606的第一晶片和来自步骤608的第二晶片对准，并且通过直接或熔融结合在真空或低压惰性气体下结合。绘图704示出了对准并结合在一起的绘图702的处理过的第一晶片和绘图703的处理过的第二晶片。
在612，蚀刻结合的晶片。可蚀刻结合的晶片以暴露氮化硅层。图7的绘图705示出了凹部751、752、753和754被蚀刻到结合的晶片上以暴露氮化硅层712和732。由此，窗口、入口和出口中的一个或多个可形成在结合的晶片上。
在614，可将蚀刻的晶片切割成多个单独的装置。
样品检查装置的内表面可被预处理。在一个实例中，在步骤610对准和结合晶片之前，可对样品检查装置的内表面进行预处理。内表面可用辐射、等离子清洁或加热来照射。内表面可通过将装置的内表面的部分或全部依次浸入一种或多种化学溶液中来预处理。内表面可通过使溶液在内表面上方依次流动而被预处理。溶液可为具有最佳浓度的去污剂或防污化学品（如PEG）的缓冲液。在另一个实例中，在步骤612蚀刻结合的晶片之后，可通过加热装置来预处理样品检查装置的内表面。在又一个实例中，在步骤610对准和结合晶片之后，可通过使溶液流过装置来预处理内表面。
图8示出了用于使用具有断开的室的样品检查装置，如图3A-3C和图4的样品检查装置，来筛选多个样品的样品条件的方法800。具有不同样品条件的样品可被转移到样品检查装置的不同室中并成像。最佳样品条件可基于样品的cryo-EM图像来选择。
在802，制备具有不同样品条件的多个样品。举例来说，可将纯化的蛋白质溶液与多种缓冲溶液混合，以获得具有不同样品条件的样品。样品可具有不同的蛋白质与缓冲液比率、不同的蛋白质浓度或不同的缓冲液浓度。
在803，可在将样品转移或装载到装置中之前对样品检查装置任选地进行预处理。样品检查装置可通过等离子体清洁或使溶液流过所述装置来预处理。举例来说，在将样品转移到装置中以修饰内表面之前，可使具有最佳浓度的去污剂或防污化学品（如PEG）的缓冲液依次流过检查装置。在一些实例中，样品检查装置的入口和/或出口是否被密封。在对样品检查装置进行预处理之前，首先要打破密封。
在804，将制备好的样品的每个样品转移到样品检查装置的一个室中。样品可同时或依次转移到样品检查装置。举例来说，可将少量样品放置在样品检查装置的入口的凹部中。然后，将密封入口的薄膜戳破并打破，使得少量样品可流入并填充由窗口覆盖的室的部分。
在806，将转移到样品检查装置的样品玻璃化。举例来说，可通过急速冷冻对装载有多个样品的样品检查装置进行玻璃化。
在808，例如，使用图1的cryo-EM成像系统，从样品检查装置的每个室中获取样品图像。为了对室中的样品成像，可将带电粒子束引导到窗口上的位置，并且朝向围绕由窗口覆盖的柱中的一个的样品。样品的图像可基于透射通过样品检查装置透射的带电粒子来形成。可在室的不同位置处拍摄样品的多个图像，其中在不同位置处的样品具有相同的样品条件。
在810，提供最佳样品质量的最佳样品条件可基于从每个室获取的样品图像来确定。每个样品的样品质量可基于在808获取的每个样品的图像来评估。对应于最佳样品质量的最佳样品条件可被识别出并用于单粒子分析中的样品制备。
以这种方式，可将具有不同样品条件的样品玻璃化，并且在单个装置中成像。可评估离散样品条件。在一些实例中，可将具有多种构建体的多个样品装载到一个样品检查装置的多个室中，以确定用于蛋白质的最佳稳定化方法，而不是将具有不同样品条件的一种类型的蛋白质装载到装置室中。在其它实例中，可使用一个样品检查装置装载和检查目标蛋白质与各种配体或化合物的不同蛋白质复合物。在一些实例中，可使用一个样品检查装置装载和检查处于不同状态（如打开/关闭或旋转）的不同蛋白质或蛋白质复合物的多种版本。
图9示出了用于使用具有连接的室的样品检查装置，如图5的样品检查装置，来筛选多个样品的样品条件的方法900。样品被转移到样品检查装置并在装置中混合。可在由样品检查装置的窗口覆盖的混合区域的不同位置处拍摄图像。样品条件的最佳范围可基于图像和对应的成像位置来确定。
在902，制备多个样品。举例来说，第一样品为纯化的蛋白质溶液，并且第二样品为缓冲液。
在903，可在将样品转移或装载到装置中之前对样品检查装置任选地进行预处理。样品检查装置可通过等离子体清洁或使溶液流过所述装置来处理。举例来说，在将样品转移到装置中以修饰内表面之前，可使具有最佳浓度的去污剂或防污化学品（如PEG）的缓冲液流过检查装置。
在904，将样品在具有连接的室的样品检查装置中混合。混合样品包括通过使每个样品流入装置的一个入口中而将样品转移到样品检查装置。举例来说，可将少量样品放置在样品检查装置的入口的凹部中。然后，打破密封入口的薄膜，使得少量样品可流入室中由窗口覆盖的区域中。样品可同时流入装置中，并且在由窗口覆盖的混合区域中在装置的下游混合。
在906，在从使样品流入样品检查装置中的等待时间之后，使样品检查装置内的样品玻璃化。等待时间可为预定的。混合区域中样品条件的空间分布可随着等待时间而变化。样品检查装置中的样品可通过急速冷冻而玻璃化。
在908，例如使用图1的cryo-EM成像系统，从样品检查装置的混合区域中的多个位置获取样品图像。混合区域中的每个位置可具有不同的样品条件。在一个实例中，可在预定位置处拍摄图像。
在910，评估获取的样品图像的样品质量，并且可识别出图像具有良好样品质量的位置。
在912，确定样品条件的最佳范围。确定样品条件的最佳范围可包括从910确定已识别位置处的样品条件。在一些实例中，样品条件的灵敏度可通过基于来自908的图像识别出多个位置之间的差异来确定。基于已识别位置处的样品条件，可确定样品条件的最佳范围。
在一个实例中，在914，可通过实验地确定在每个已识别位置处的样品条件。可提取并分析每个已识别位置处的混合样品，以获得样品条件。举例来说，可通过使用聚焦离子束系统打破样品检查装置来提取混合样品。
在另一个实例中，在916，样品条件可基于已识别位置和校准的样品条件分布来确定。校准的样品条件分布可经由基于参数的模拟而理论上生成，所述参数包括样品的属性中的一种或多种、当将样品转移到样品检查装置时的等待时间、温度和流速。替代地，可通过在样品检查装置中测量校准样品的样品条件来实验地生成校准样品条件分布。
以这种方式，可在单个装置中将样品混合、玻璃化和成像。可获得并评估混合样品的连续范围的样品条件。
图10示出了用于使用具有连接的室的样品检查装置和具有断开的室的样品检查装置来筛选样品状态的方法1000。样品条件的最佳范围可首先通过使用具有连接的室的样品检查装置筛选样品条件的大变化来确定。然后，样品条件在最佳范围内的多个样品可使用具有断开的室的样品检查装置单独筛选，以确定最佳样品条件。
在1002，使用图9的方法900确定样品条件的最佳范围。举例来说，可将蛋白质溶液和一种或多种缓冲液转移到具有连接的室的样品检查装置中。基于cryo-EM图像，确定可产生最佳样品质量的样品条件。因为使用具有连接的室的样品检查装置可获得宽范围的样品条件，所以使用方法900进行的缓冲液筛选提供了最佳范围的全局寻找。然而，由于混合区域中样品条件的空间分布的连续变化，每个样品图像内的样品条件可发生变化。此外，在特定样品条件下可成像的混合样品的数量有限。由此，方法900可提供包括最佳样品条件的最佳样品条件范围，但不提供特定的最佳样品条件。
在1004，制备样品条件在1002确定的最佳范围内的多个样品。可使用图8的方法800来筛选样品，以确定最佳范围内的最佳样品条件。可获得具有特定样品条件的样品的多个图像，其中每个图像可在室的不同位置处拍摄。由此，可准确而可靠地评估样品质量。
在一些实施例中，可重复步骤1002和1004中的每一个步骤，以筛选不同的缓冲液和/或准确地识别出最佳样品条件。
以这种方式，首先使用具有连接的室的样品检查装置执行全局样品条件筛选，以识别出最佳范围。在最佳范围内执行局部样品条件筛选，以识别出最佳条件。多尺度筛选策略可显著减少样品条件筛选时间，并且便于为单个粒子分析定位全局最佳样品条件。
提供覆盖多个柱中的至少一个柱以进行样品检查的窗口的技术效果是提供样品检查装置的窗口覆盖区域的机械强度。将柱结合到两个电子透明层的技术效果是防止样品装载和玻璃化期间鼓胀。在室内对多个样品成像的技术效果是可更好地控制样品质量以进行玻璃化和成像。在样品检查装置中混合多个样品的技术效果是可获得样品条件的连续分布。控制样品流入样品检查装置中与样品玻璃化之间的等待时间的技术效果是可调整混合区域中样品条件的分布。
在一个实施例中，一种样品检查装置包括：形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的第一室，其用于固持第一样品；第一室内的多个柱，多个柱中的每个柱从顶部电子透明层延伸到底部电子透明层；形成有顶部电子透明层与底部电子透明层中的至少一个的一部分的窗口，其用于检查第一室中的第一样品，所述窗口覆盖多个柱中的至少一个。在装置的第一实例中，窗口允许检查围绕由窗口覆盖的多个柱中的至少一个的第一样品。所述方法的第二实例任选地包括第一实例，并且还包括：形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的第二室，其用于固持第二样品；并且其中窗口覆盖第二室的一部分，用于检查第二室中的第二样品。所述方法的第三实例任选地包括第一至第二实例中的一个或多个，并且还包括其中多个柱布置在第二室中的顶部电子透明层与底部电子透明层之间。所述方法的第四实例任选地包括第一至第三实例中的一个或多个，并且还包括其中第一室和第二室在由窗口覆盖的区域中流体连接。所述方法的第五实例任选地包括第一至第四实例中的一个或多个，并且还包括其中多个柱中的每个柱的一端结合到顶部电子透明层，并且柱的另一端结合到底部电子透明层。所述方法的第六实例任选地包括第一至第五实例中的一个或多个，并且还包括入口和缓冲室，其中入口经由缓冲室流体连接到第一室，并且没有柱布置在缓冲室中。所述方法的第七实例任选地包括第一至第六实例中的一个或多个，并且还包括其中与第一样品接触的顶部电子透明层和/或底部电子透明层的至少一部分被预处理，以便于将第一样品转移到第一室中。所述方法的第八实例任选地包括第一至第七实例中的一个或多个，并且还包括其中窗口的不覆盖多个柱中的至少一个的区域允许带电粒子束透射通过样品检查装置。所述方法的第九实例任选地包括第一至第八实例中的一个或多个，并且还包括其中两个电子透明层之间的距离小于100 nm。
在另一个实施例中，一种使用样品检查装置检查样品的方法包括：使第一样品流入样品检查装置的第一室中，其中第一室形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间，多个柱布置在第一室内，并且多个柱中的每个柱从顶部电子透明层延伸到底部电子透明层；将带电粒子束引向样品检查装置的窗口，其中所述窗口形成有顶部电子透明层与底部电子透明层中的至少一个的一部分，并且所述窗口覆盖多个柱中的至少一个；以及基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成第一样品的第一图像。在所述方法的第一实例中，所述方法还包括在使第一样品流入第一室中之前处理检查装置的内表面。所述方法的第二实例任选地包括第一实例，并且还包括其中将带电粒子束引向窗口包括将所述束引向窗口的不覆盖多个柱中的至少一个的位置。所述方法的第三实例任选地包括第一至第二实例中的一个或多个，并且还包括在使第一样品流入第一室中之后并且在将带电粒子束引向样品检查装置的窗口之前，使样品检查装置中的第一样品玻璃化。所述方法的第四实例任选地包括第一至第三实例中的一个或多个，并且还包括其中将带电粒子束引向样品检查装置的窗口并基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成第一样品的第一图像包括：将带电粒子束引向第一室的第一位置，并且基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成第一样品的第一图像。所述方法的第五实例任选地包括第一至第四实例中的一个或多个，并且还包括使第二样品流入样品检查装置的第二室中，第二室形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间，第二室与第一室流体分隔，窗口覆盖第二室的至少一部分；将带电粒子束引向第二室中的第二位置；以及基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成第二样品的第二图像。所述方法的第六实例任选地包括第一至第五实例中的一个或多个，并且还包括其中第一样品和第二样品具有不同的样品条件，并且所述方法还包含通过比较第一图像和第二图像来确定最佳样品条件。所述方法的第七实例任选地包括第一至第六实例中的一个或多个，并且还包括在使第一样品流入第一室中的同时，使第二样品流入形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的第二室中，并且在窗口覆盖的样品检查装置的混合区域中混合第一样品和第二样品；并且其中将带电粒子束引向窗口包括将带电粒子束引向混合区域内的多个位置，其中多个位置处的第一样品与第二样品之间的比率不同。所述方法的第八实例任选地包括第一至第七实例中的一个或多个，并且还包括其中基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成图像包括基于透射通过样品检查装置的带电粒子形成多个位置中的每一个位置的图像；并且所述方法还包含比较多个图像以确定最佳样品条件。所述方法的第九实例任选地包括第一至第八实例中的一个或多个，并且还包括在将带电粒子束引向窗口之前，使样品检查装置中的第一样品、第二样品以及第一样品和第二样品的混合物玻璃化；以及基于使第一样品和第二样品流入样品检查装置和玻璃化的持续时间，确定多个位置处的第一样品和第二样品的比率。

Claims (20)

1.一种样品检查装置，其包含：
形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间的第一室，其用于固持第一样品；
所述第一室内的多个柱，所述多个柱中的每个柱从所述顶部电子透明层延伸到所述底部电子透明层；和
形成有所述顶部电子透明层与所述底部电子透明层中的至少一个的一部分的窗口，其用于检查所述第一室中的所述第一样品，所述窗口覆盖所述多个柱中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的样品检查装置，其中所述窗口允许检查围绕由所述窗口覆盖的所述多个柱中的所述至少一个的所述第一样品。
3.根据权利要求1所述的样品检查装置，其还包含：形成在所述顶部电子透明层与所述底部电子透明层之间的第二室，其用于固持第二样品；并且其中所述窗口覆盖所述第二室的一部分，用于检查所述第二室中的所述第二样品。
4.根据权利要求3所述的样品检查装置，其中所述多个柱布置在所述第二室中的所述顶部电子透明层与所述底部电子透明层之间。
5.根据权利要求3所述的样品检查装置，其中所述第一室和所述第二室在由所述窗口覆盖的区域中流体连接。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的样品检查装置，其中所述多个柱中的每个柱的一端结合到所述顶部电子透明层，并且所述柱的另一端结合到所述底部电子透明层。
7.根据权利要求1到5中任一项所述的样品检查装置，其还包含入口和缓冲室，其中所述入口经由所述缓冲室流体连接到所述第一室，并且没有柱布置在所述缓冲室中。
8.根据权利要求1到5中任一项所述的样品检查装置，其中与所述第一样品接触的所述顶部电子透明层和/或所述底部电子透明层的至少一部分被预处理，以便于将所述第一样品转移到所述第一室中。
9.根据权利要求1到5中任一项所述的样品检查装置，其中所述窗口的不覆盖所述多个柱中的所述至少一个的区域允许带电粒子束透射通过所述样品检查装置。
10. 根据权利要求1到5中任一项所述的样品检查装置，其中所述两个电子透明层之间的距离小于100 nm。
11.一种使用样品检查装置检查样品的方法，其包含：
使第一样品流入所述样品检查装置的第一室中，其中所述第一室形成在顶部电子透明层与底部电子透明层之间，在所述第一室中布置有多个柱，并且所述多个柱中的每个柱从所述顶部电子透明层延伸到所述底部电子透明层；
将带电粒子束引向所述样品检查装置的窗口，其中所述窗口形成有所述顶部电子透明层与所述底部电子透明层中的至少一个的一部分，并且所述窗口覆盖所述多个柱中的至少一个；和
基于透射通过所述样品检查装置的带电粒子形成所述第一样品的第一图像。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包含在使所述第一样品流入所述第一室中之前处理所述检查装置的内表面。
13.根据权利要求11所述的方法，其中将所述带电粒子束引向所述窗口包括将所述束引向所述窗口的不覆盖所述多个柱中的所述至少一个的位置。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其还包含在使所述第一样品流入所述第一室中之后并且在将所述带电粒子束引向所述样品检查装置的所述窗口之前，使所述样品检查装置中的所述第一样品玻璃化。
15.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其中将所述带电粒子束引向所述样品检查装置的所述窗口并基于透射通过所述样品检查装置的所述带电粒子形成所述第一样品的所述第一图像包括：将所述带电粒子束引向所述第一室的第一位置，并且基于透射通过所述样品检查装置的所述带电粒子形成所述第一样品的所述第一图像。
16.根据权利要求15所述的方法，其还包含：
使第二样品流入所述样品检查装置的第二室中，所述第二室形成在所述顶部电子透明层与所述底部电子透明层之间，所述第二室与所述第一室流体分隔，所述窗口覆盖所述第二室的至少一部分；
将所述带电粒子束引向所述第二室中的第二位置；和
基于透射通过所述样品检查装置的带电粒子形成所述第二样品的第二图像。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品具有不同的样品条件，并且所述方法还包含通过比较所述第一图像和所述第二图像来确定最佳样品条件。
18.根据权利要求11所述的方法，其还包含：
在使所述第一样品流入所述第一室中的同时，使第二样品流入形成在所述顶部电子透明层与所述底部电子透明层之间的第二室中，并且在所述窗口覆盖的所述样品检查装置的混合区域中混合所述第一样品和所述第二样品；并且其中将所述带电粒子束引向所述窗口包括将所述带电粒子束引向所述混合区域内的多个位置，其中所述多个位置处的所述第一样品与所述第二样品之间的比率不同。
19.根据权利要求18所述的方法，其中基于透射通过所述样品检查装置的带电粒子形成所述图像包括基于透射通过所述样品检查装置的所述带电粒子形成所述多个位置中的每一个位置的图像；并且所述方法还包括比较所述多个图像以确定最佳样品条件。
20.根据权利要求18所述的方法，其还包括在将所述带电粒子束引向所述窗口之前，使所述样品检查装置中的所述第一样品、所述第二样品以及所述第一样品和所述第二样品的混合物玻璃化；以及基于使所述第一样品和所述第二样品流入所述样品检查装置和所述玻璃化的持续时间，确定所述多个位置处的所述第一样品和所述第二样品的所述比率。
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