CN112553317B - 一种检测nkg2c基因型的试剂盒与应用 - Google Patents

一种检测nkg2c基因型的试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测NKG2C基因型的试剂盒与应用。本发明公开的检测NKG2C基因型的试剂盒由检测NKG2C基因型的成套试剂、SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix(Bio‑rad公司)、TE缓冲液以及作为标准品的Hela细胞基因组DNA、293T细胞基因组DNA和K562细胞基因组DNA组成，检测NKG2C基因型的成套试剂由名称分别为P1、P2、P3和P4的四条单链DNA组成，P1、P2、P3和P4的序列分别为序列表中序列1‑4。本发明的成套试剂和试剂盒在检测NKG2C基因型时，反应体系稳定，检测方便，准确率高。

Description

一种检测NKG2C基因型的试剂盒与应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，一种检测NKG2C基因型的试剂盒与应用。
背景技术
NK细胞受体是许多种表达在细胞表面的分子结构，调节NK细胞介导的杀伤。其中活化性受体NKG2C属于NKG2受体家族(Ⅱ型C凝集素样整合膜蛋白)，是NK细胞表面的功能性受体，其与DAP-12(二硫键衔接蛋白12)单倍体以非共价键结合，DAP-12携带ITAM(免疫受体酪氨酸依赖性活化基序)，与配体HLA-E结合后活化NK细胞，发挥杀伤靶细胞功能。
NKG2C的表达与NKG2C的基因型相关，NKG2C的基因型有三种，即NKG2Cwt/wt基因型、NKG2Cwt/del基因型和NKG2Cdel/del基因型，NKG2Cwt/wt基因型细胞中两条染色体的NKG2C基因均未发生突变，NKG2Cwt/del基因型细胞中一条染色体的NKG2C基因未发生突变而另一条染色体的NKG2C基因发生突变，NKG2Cdel/del基因型细胞中两条染色体的NKG2C基因均发生了突变。基因型为NKG2Cwt/wt的健康个体NKG2C+NK细胞(即表达NKG2C的NK细胞)占NK细胞的比例远高于其他两种基因型的健康个体，NKG2Cwt/del基因型的健康个体NKG2C+NK细胞占NK细胞的比例低于基因型为NKG2Cwt/wt的健康个体，而NKG2Cdel/del基因型的健康个体几乎没有NKG2C+NK细胞。研究显示，相对于HCMV(人巨细胞病毒)血清反应阴性的健康供者，HCMV血清反应阳性的健康供者中NKG2C+NK细胞占NK细胞的比例更高。此外，在接受造血干细胞或实体器官移植的患者中，HCMV感染后NKG2C+NK细胞显著增加并持续数月。因此，快捷准确的鉴定造血干细胞移植供者NKG2C基因型，可为研究供者NKG2C基因型与HCMV发生的关系和其他相关研究及临床试验提供极大便利。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快捷准确的鉴定造血干细胞移植供者NKG2C基因型。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测NKG2C基因型的成套试剂和SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix；
所述成套试剂，由名称分别为P1、P2、P3和P4的四条单链DNA组成，所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的序列分别为序列表中序列1-4。
所述成套试剂中的各单链DNA可独立包装，也可包装在一起。所述成套试剂中所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的摩尔比可为4:4:1:1。
所述SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix可为Bio-rad公司产品，货号可为1725271。
所述NKG2C基因型可为NKG2Cwt/wt基因型、NKG2Cwt/del基因型和/或NKG2Cdel/del基因型。
所述试剂盒还可包括TE缓冲液；所述TE缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1MTris-HCl(PH 8)，所述溶质及其在所述TE缓冲液的浓度为0.5M EDTA；
所述1M Tris-HCl(PH 8)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为Tris和用于调节PH的HCl，Tris在1M Tris-HCl(PH 8)中的浓度为1M，HCl的含量满足使1M Tris-HCl(PH 8)的PH为8。
所述试剂盒还可包括标准细胞或标准细胞的基因组，所述标准细胞可为Hela细胞、293T细胞和K562细胞，所述标准细胞的基因组由Hela细胞基因组DNA、293T细胞基因组DNA和K562细胞基因组DNA组成。
所述试剂盒可由所述成套试剂和所述SsoAdvancedTM Universal SYBR GreenSupermix组成，还可由所述成套试剂、所述SsoAdvancedTM Universal SYBR GreenSupermix与所述TE缓冲液组成，也可以由所述成套试剂、所述SsoAdvancedTM UniversalSYBR Green Supermix、所述TE缓冲液与所述标准细胞组成，也可以由所述成套试剂、所述SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix、所述TE缓冲液与所述标准细胞的基因组组成。
所述试剂盒的用途可为下述任一种：
Y1)在制备检测NKG2C基因型产品中的应用；
Y2)在检测NKG2C基因型中的应用；
Y3)在制备检测NKG2C基因表达量产品中的应用；
Y4)在检测NKG2C基因表达量中的应用；
Y5)在制备检测NKG2C+NK细胞比例产品中的应用；
Y6)在检测NKG2C+NK细胞比例中的应用。
所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
Y1)在制备检测NKG2C基因型产品中的应用；
Y2)在检测NKG2C基因型中的应用；
Y3)在制备检测NKG2C基因表达量产品中的应用；
Y4)在检测NKG2C基因表达量中的应用；
Y5)在制备检测NKG2C+NK细胞比例产品中的应用；
Y6)在检测NKG2C+NK细胞比例中的应用。
所述NKG2C基因型可为NKG2Cwt/wt基因型、NKG2Cwt/del基因型和/或NKG2Cdel/del基因型。
本发明还提供了NKG2C基因型的检测方法，所述NKG2C基因型为NKG2Cwt/wt基因型、NKG2Cwt/del基因型和/或NKG2Cdel/del基因型，所述方法包括：利用所述试剂盒对待测对象的基因组DNA进行PCR扩增，根据PCR产物的大小确定待测对象的NKG2C基因型：
如果PCR产物中含有201bp的DNA片段且不含411bp的DNA片段，则待测对象的NKG2C基因型为NKG2Cwt/wt；如果PCR产物中含有201bp和411bp的两条DNA片段，则待测对象的NKG2C基因型为NKG2Cwt/del；PCR产物中不含有201bp的DNA片段且含有411bp的DNA片段，则待测对象的NKG2C基因型为NKG2Cdel/del。
所述PCR扩增的反应体系中所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的浓度分别可为1μM、1μM、0.25μM和0.25μM。
所述PCR扩增的反应体系可为：所述SsoAdvancedTM Universal SYBR GreenSupermix 10μl，所述P1，所述P2，所述P3，所述P4，所述待测对象基因组DNA，水补至20μl。
所述P1、所述P2、所述P3和所述P4可先用所述TE缓冲液溶解。
所述PCR扩增的反应条件可为：95℃2分钟；(95℃10秒，60℃20秒，72℃30秒)循环10次；(95℃10秒，56℃20秒，72℃30秒)循环20次。
本发明还提供了检测NKG2C基因表达量的方法，所述方法包括：按照所述NKG2C基因型的检测方法检测待测对象的NKG2C基因型，NKG2Cwt/wt基因型待测对象的NKG2C基因表达量分别高于NKG2Cwt/del基因型和NKG2Cdel/del基因型的待测对象，NKG2Cwt/del基因型待测对象的NKG2C基因表达量高于NKG2Cdel/del基因型待测对象。
本发明还提供了检测NKG2C+NK细胞比例的方法，所述NKG2C+NK细胞为表达NKG2C的NK细胞，所述方法包括：按照所述NKG2C基因型的检测方法检测待测对象的NKG2C基因型，NKG2Cwt/wt基因型待测对象的NKG2C+NK细胞比例分别高于NKG2Cwt/del基因型和NKG2Cdel/del基因型的待测对象，NKG2Cwt/del基因型待测对象的NKG2C+NK细胞比例高于NKG2Cdel/del基因型待测对象。
本发明中，所述NKG2C+NK细胞比例为所述NKG2C+NK细胞占总NK细胞的比例。
本发明中，所述NKG2Cwt/wt基因型细胞的两条染色体的NKG2C基因中均含有序列表中序列5所示的DNA片段且均不含有序列6所示DNA片段；
所述NKG2Cwt/del基因型细胞的一条染色体的NKG2C基因中含有序列表中序列5所示的DNA片段且不含有序列6所示DNA片段，另一条染色体的NKG2C基因中含有序列表中序列6所示的DNA片段且不含有序列5所示DNA片段；
所述NKG2Cdel/del基因型细胞的两条染色体的NKG2C基因中均含有序列表中序列6所示的DNA片段且均不含有序列5所示DNA片段。
本发明中，所述待测对象可为造血干细胞移植供者。
本发明利用检测NKG2C基因型的成套试剂和试剂盒检测NKG2C基因型，反应体系稳定，检测方便，准确率高。此外，本发明的试剂盒中还含有作为标准品的Hela细胞基因组DNA、293T细胞基因组DNA和K562细胞基因组DNA，为NKG2C基因型的检测提供对照，确保了鉴定结果的准确性。本发明的成套试剂和试剂盒可短时间内便捷的确定人NKG2C基因型，为造血干细胞移植中供者NKG2C基因型鉴定提供便利。
附图说明
图1为造血干细胞移植供者NKG2C基因型的检测结果。左侧起第一个泳道为DNA分子量标准。
图2为三例造血干细胞移植供者外周血标记流式细胞术抗体的结果。
图3为利用不同PCR试剂扩增标准品的电泳检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的Hela细胞(钱鑫.辐射损伤对HRAD17基因转染不同类型细胞的影响[J].中华放射医学与防护杂志,2006,26(1):3-5.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的293T细胞(Gao D,Hu H,Wang Y,et al.CMTM8 inhibits thecarcinogenesis and progression of bladder cancer.Oncol Rep.2015；34(6):2853–2863.doi:10.3892/or.2015.4310)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的K562细胞(Yu XX,Han TT,Xu LL,Chang YJ,Huang XJ,ZhaoXY.Effect of the in vivo application of granulocyte colony-stimulating factoron NK cells in bone marrow and peripheral blood.Journal of Cellular andMolecular Medicine 2018 Jun；22(6):3025-3034.doi:10.1111/jcmm.13539.Epub 2018Mar 25.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、检测NKG2C基因型的成套试剂和试剂盒的制备
本实施例提供的检测NKG2C基因型的成套试剂由名称分别为P1、P2、P3和P4的四条单链DNA组成，P1、P2、P3和P4的序列分别为序列表中序列1-4。
该成套试剂中，各单链DNA均独立包装，P1、P2、P3和P4的摩尔比为4:4:1:1。
检测NKG2C基因型的试剂盒由检测NKG2C基因型的成套试剂、SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix(Bio-rad公司，货号为1725271)、TE缓冲液以及作为标准品的Hela细胞基因组DNA、293T细胞基因组DNA和K562细胞基因组DNA组成。其中，TE缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为1M Tris-HCl(PH 8)，溶质及其在TE缓冲液的浓度为0.5M EDTA。1M Tris-HCl(PH 8)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Tris和用于调节PH的HCl，Tris在1M Tris-HCl(PH 8)中的浓度为1M，HCl的含量满足使1M Tris-HCl(PH 8)的PH为8。
该试剂盒中各试剂均独立包装。
实施例2、利用实施例1的试剂盒检测造血干细胞移植供者NKG2C基因型
经三例造血干细胞移植供者知情同意后，提取各供者的外周血，检测NKG2C基因型，利用Hela细胞基因组DNA、293T细胞基因组DNA和K562细胞基因组DNA作为标准品，Hela细胞、293T细胞和K562细胞的NKG2C基因型分别为NKG2Cwt/wt、NKG2Cwt/del、NKG2Cdel/del。步骤如下：
1、提取各供者外周血及三例标准品的基因组DNA，调整基因组DNA浓度至100ng/μl。
2、反应体系的配制：
反应体系体积为20μl，每个反应体系由如下物质组成：SsoAdvancedTM UniversalSYBR Green Supermix 10μl，P1工作液1μl，P2工作液1μl，P3工作液0.25μl，P4工作液0.25μl，基因组DNA 1μl，余量为水。P1工作液，P2工作液，P3工作液和P4工作液分别由TE缓冲液溶解P1、P2、P3和P4得到，引物浓度均为20μM。P1、P2、P3和P4在反应体系中的浓度分别为1μM、1μM、0.25μM和0.25μM，每个反应体系一种基因组DNA。
3、PCR反应
将步骤2制备好的反应体系在如下条件下进行PCR反应：
95℃2分钟；(95℃10秒，60℃20秒，72℃30秒)循环10次；(95℃10秒，56℃20秒，72℃30秒)循环20次；最后降温至4℃保存。
4、电泳检测
步骤3完成后，将得到的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序，电泳结果如图1所示。供者一和Hela细胞均含有201bp的DNA片段且不含411bp的DNA片段，表明，供者一的NKG2C基因型和Hela细胞相同，均为NKG2Cwt/wt；供者二和293T细胞均含有201bp和411bp的两条DNA片段，表明，供者二的NKG2C基因型和293T细胞相同，均为NKG2Cwt/del；供者三和K562细胞均不含有201bp的DNA片段且均含有411bp的DNA片段，表明，供者三的NKG2C基因型和K562细胞相同，均为NKG2Cdel/del。其中，201bp的DNA片段的序列均为序列表中序列5，411bp的DNA片段的序列均为序列表中序列6。
对三例造血干细胞移植供者外周血标记流式细胞术抗体：CD3 Bv510(BD公司，货号563109)，CD56 Buv737(BD公司，货号564447)，NKG2A PE-Cy7(Miltenyi公司，货号130105647)，NKG2C PE(Miltenyi公司，货号130103635),三例供者NKG2C表达如图2所示。供者一中NKG2C+NK细胞占NK细胞的比例为24.78％，供者二中NKG2C+NK细胞占NK细胞的比例为8.48％，供者三中NKG2C+NK细胞占NK细胞的比例为0.082％。该结果与上述结果相符。
实施例3、利用实施例1的试剂盒检测造血干细胞移植供者NKG2C基因型
待测对象为402例造血干细胞移植供者，均经知情同意，编号为1-402号。利用Hela细胞、293T细胞和K562细胞作为对照。
1、提取各供者外周血及三例标准品的基因组DNA，调整基因组DNA浓度至100ng/μl。
2、按照实施例2步骤2配制反应体系。
3、按照实施例2步骤3的反应条件进行PCR反应。
4、将步骤3得到的反应产物进行电泳和测序，根据DNA片段大小确定供者的NKG2C基因型：如PCR产物含有201bp的DNA片段且不含411bp的DNA片段，该供者的NKG2C基因型为NKG2Cwt/wt；如PCR产物含有201bp和411bp的两条DNA片段，供者的NKG2C基因型为NKG2Cwt/del；如PCR产物不含有201bp的DNA片段且含有411bp的DNA片段，供者的NKG2C基因型为NKG2Cdel /del。
结果显示，402例造血干细胞移植供者中，基因型为NKG2Cwt/wt的供者有240例，基因型为NKG2Cwt/del的供者有151例，基因型为NKG2Cdel/del的供者有11例。
对比例1、
1、准备三例标准品(Hela细胞、293T细胞和K562细胞)的基因组DNA。
2、反应体系的配制：
反应体系体积均为20μl。
反应体系一至三均由如下物质组成：SsoAdvancedTM Universal SYBR GreenSupermix 10μl，P1工作液1μl，P2工作液1μl，P3工作液0.25μl，P4工作液0.25μl，标准品基因组DNA 1μl，余量为水。反应体系一至三的基因组DNA分别为Hela细胞、293T细胞和K562细胞的基因组DNA。
反应体系四至六均由如下物质组成：KT201-Taq PCR Mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号KT190109)10μl，P1工作液1μl，P2工作液1μl，P3工作液0.25μl，P4工作液0.25μl，标准品基因组DNA 1μl，余量为水。反应体系四至六的基因组DNA分别为Hela细胞、293T细胞和K562细胞的基因组DNA。
反应体系七至九均由如下物质组成：PowerUp SYBR Green Master Mix
(appliedbiosystems，货号为A25742)10μl，P1工作液1μl，P2工作液1μl，P3工作液0.25μl，P4工作液0.25μl，标准品基因组DNA 1μl，余量为水。反应体七至九的基因组DNA分别为Hela细胞、293T细胞和K562细胞的基因组DNA。
P1工作液，P2工作液，P3工作液和P4工作液分别由TE缓冲液溶解P1、P2、P3和P4得到，引物浓度均为20μM。P1、P2、P3和P4在各反应体系中的浓度均分别为1μM、1μM、0.25μM和0.25μM，每个反应体系一种基因组DNA。
3、PCR反应
将步骤2制备好的反应体系在如下条件下进行PCR反应：
95℃2分钟；(95℃10秒，60℃20秒，72℃30秒)循环10次；(95℃10秒，56℃20秒，72℃30秒)循环20次；最后降温至4℃保存。
4、电泳检测
步骤3完成后，将得到的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序，电泳结果如图3所示。反应体系一至三(即图中反应一至三)中，Hela细胞、K562细胞、293T细胞基因组DNA条带位置清晰，反应体系四至九(即图中反应四至九)中Hela细胞、K562细胞、293T细胞基因组DNA条带位置与文献不符，或者没有目的条带，表明，利用SsoAdvancedTM Universal SYBRGreen Supermix可以取得最佳效果。
<110> 北京大学人民医院（北京大学第二临床医学院）
<120> 一种检测NKG2C基因型的试剂盒与应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
actcggattt ctatttgatg c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
acaagtgatg tataagaaaa ag 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
cagtgtggat cttcaatg 18
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
tttagtaatt gtgtgcatcc ta 22
<210> 5
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
tttagtaatt gtgtgcatcc tatttcaata attgatttag aatttttgta tcagagcaaa 60
taacataatt cattttcaga tttatgcaat cataatattt ctattttaag aaatataaaa 120
tgtatctgat gcactgcaaa cgcaaatgct ttacttctaa agcttatgct tacaatgata 180
tatcattgaa gatccacact g 201
<210> 6
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
actcggattt ctatttgatg cactgcgttt ggtaatgagt atgaattttc tatttcatat 60
agacattaaa atgtaatgaa aatacagttt tattgccact aaataactgt aaagaccatc 120
aatggtattg ccatgtttaa tctagacaat aggccagttg tggaggctca agcctataat 180
cccagcactt tgggaggcat cattgtgcct ggccgttacc aattttttaa aatgttaaat 240
ttattatttt tgtggatacg ttagtaggtg tatattttta gtagtcgttc atcaaatttt 300
aaaagcattt tcaatgaaaa tacctttggc cttgctgttc tctctattgt aacattattc 360
tttatcgtga ttttttactg tttattcatc tttttcttat acatcacttg t 411

Claims (2)

1.一种试剂盒，包括用于检测NKG2C基因型的成套试剂、SsoAdvancedTM UniversalSYBR Green Supermix、TE缓冲液、Hela细胞、293T细胞和K562细胞；
所述成套试剂，由名称分别为P1、P2、P3和P4的四条单链DNA组成，所述P1、所述P2、所述P3和所述P4的序列分别为序列表中SEQ ID No.1-4；
所述TE缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1M Tris-HCl PH 8，所述溶质及其在所述TE缓冲液的浓度为0.5M EDTA；
所述1MTris-HCl PH 8 由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为Tris和用于调节PH的HCl，Tris在1MTris-HCl PH 8 中的浓度为1M，HCl的含量满足使1MTris-HCl的PH为8。
2.权利要求1所述的试剂盒的下述任一应用：
Y1）在制备检测NKG2C基因型产品中的应用；
Y2）在制备检测NKG2C基因表达量产品中的应用；
Y3）在制备检测NKG2C+ NK细胞比例产品中的应用。
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