CN112553290B - 微生物水泥基材料中的微生物活性分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物水泥基材料中的微生物活性分析方法，包括如下步骤：以菌粉、普通硅酸盐水泥成型微生物净浆试件，对该试件预破碎、研磨、过500～800目筛侯，溶于灭菌后的提取溶液中，依次经超声震荡、静置、转移、离心后完成微生物的提取；测试提取的微生物细胞的实际数量，与根据菌粉掺加量计算的微生物细胞理论数量进行比较，得出微生物净浆试件中的微生物活性变化情况。采用本发明的方法可充分提取出微生物水泥基材料中的微生物，获得的微生物实际数量准确，与微生物理论数量进行对比，可准确判断出微生物在一定时间内的活性变化，从而可根据实际情况及时调整、补充微生物使用，保证工程的长期安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物水泥基材料中的微生物活性分析方法，属于建筑材料技术领域。
背景技术
随着我国工程技术的不断提升，水泥基材料的用量和应用领域不断扩展，在高层建筑、水电工程与核电工程等关键部位水泥基材料的应用越来越普遍。水泥基材料在应用的过程中，由于自身的脆性和服役环境的不确定性，容易产生局部损伤或者内部的裂缝，如何高效进行水泥基材料裂缝修复的研究逐渐成为众多研究学者关注的重点，微生物自修复水泥基材料逐渐兴起。微生物自修复水泥基材料利用部分微生物自身具有的矿化沉积作用，能够在水泥基材料裂缝环境中通过矿化沉积产生具有胶结性的矿化产物，进行水泥基材料裂缝处的修补，进而提升水泥基材料自身的强度和抗渗水等性能。
水泥基材料自身具有成本低、耐久性较好、与不同基材匹配性好等特点，适用于进行多环境下建筑物墙体的装饰。作为装饰制品的水泥基材料存在较为突出的问题，水泥基材料泛碱严重影响水泥基装饰材料的表面效果。水泥基材料的泛碱现象也可称为析白或起霜，在建筑物墙面、雨篷与墙面连接处、屋面排水口等位置出现白色粉末、絮团。微生物在水泥基材料中的应用较为广泛，不仅仅可以用于微生物自修复混凝土的裂缝自修复，同时能够进行水泥基材料表面抗泛碱剂的开发。抑制水泥基材料出现泛碱现象的方式多种多样，但是从根源上解决水泥基材料泛碱问题的是在水泥基材料中加入微生物抗泛碱剂，可以有效避免水泥基装饰材料的破坏，并且提升建筑表面的质量。
但是，随着时间的发展，微生物在水泥基材料中会逐渐失活，从而失去作用，因此，研究微生物在水泥基材料中的活性变化、分布情况，对工程具有重要意义。但是，现有技术中对微生物水泥基材料中微生物活性的研究方法鲜有报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种微生物水泥基材料中的微生物活性分析方法。
技术方案：本发明所述的微生物水泥基材料中的微生物活性分析方法，包括如下步骤：
(1)模拟微生物水泥基材料，以菌粉、普通硅酸盐水泥成型微生物净浆试件；
(2)通过加载载荷的方式预破碎微生物净浆试件，当微生物净浆试件出现明显裂缝时，停止加载；
(3)将预破碎后的微生物净浆试件研磨成粉末，过500～800目筛；
(4)取筛分后的粉末置于无菌离心管中，加入灭菌后的提取溶液，然后超声震荡；
(5)将超声震荡后的无菌离心管取出，静置后，取上清液转移至另一无菌离心管；
(6)将存有上清液的无菌离心管置于离心机中进行低速离心，完成微生物的提取；
(7)测试提取的微生物细胞的实际数量，与根据菌粉掺加量计算的微生物细胞理论数量进行比较，得出微生物净浆试件中的微生物活性变化情况。
步骤(2)中，可将微生物净浆试件置于力学试验机中，以0.02～0.05MPa/s的速度连续而均匀地向其施加载荷。对试件进行预破碎，可方便后续的研磨。
步骤(3)中，将试件研磨成粉末后过500～800目的筛，可保证微生物不被破坏的同时充分溶出。当筛孔直径大于500目时，经过筛分的粉末颗粒直径较大，由于水泥基材料内部结构较为致密，阻碍了颗粒内部微生物的溶出；当筛孔直径小于800目时，过度的研磨会导致水泥基材料结构的破坏，大量直径处于1～4μm的微生物被破坏。
步骤(4)中，粉末与提取溶液的质量体积比优选为1:5～1:10，提取溶液的量低于该比例，微生物提取不完全，无法进行有效提取；高于该比例，微生物提取液稀释倍数大，会降低提取准确性。提取溶液可为浓度0.9％的生理盐水；生理盐水灭菌的具体操作可为：在容器中配制0.9％浓度的氯化钠溶液，封口后放置于高压灭菌锅在120℃条件下灭菌30min。
步骤(4)中，超声震荡的参数条件优选为：超声频率30～40kHz，超声震荡温度为20～60℃，超声震荡时间为20～30min。当超声频率超过40kHz时，无法有效将微生物从水泥基材料中分离出来；当超声频率低于30kHz时，由振动产生的空化泡较大，容易对微生物结构造成破坏。当超声温度高于60℃时，微生物活性受到破坏，低于20℃时，微生物活性受到抑制，处于孢子状态，影响微生物细胞计数的准确性。
步骤(5)中，超声震荡后，取出静置，使上清液和筛分粉末出现分层，静置的时间优选为20min。静置让筛分后的粉末能够沉积在容器底部，获得较为纯净的菌液。
步骤(6)中，低速离心的参数条件优选为：离心转速2000～3000rpm，离心时间2～5min。低速离心使得微生物能够在离心管底部聚集，便于后续进行细胞计数。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：本发明通过将微生物净浆试件预破碎、研磨、过筛处理后获得一定尺寸的微生物水泥基材料粉末，将该粉末溶于生理盐水后进行超声振荡、静置、转移、离心，最终可充分提取出微生物水泥基材料中的微生物，获得的微生物实际数量准确，与微生物理论数量进行对比，可准确判断出微生物在一定时间内的活性变化，从而可根据实际情况及时调整、补充微生物使用，保证工程的长期安全性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明的微生物水泥基材料中的微生物活性分析方法，包括如下步骤：
1)微生物的提取：
(1)模拟微生物水泥基材料，以菌粉、普通硅酸盐水泥成型微生物净浆试件；
(2)通过加载载荷的方式预破碎微生物净浆试件，当微生物净浆试件出现明显裂缝时，停止加载；
(3)将预破碎后的微生物净浆试件研磨成粉末，过500～800目筛；
(4)取筛分后的粉末置于无菌离心管中，加入灭菌后的提取溶液，然后超声震荡；
(5)将超声震荡后的无菌离心管取出，静置后，取上清液转移至另一无菌离心管；
(6)将存有上清液的无菌离心管置于离心机中进行低速离心，完成微生物的提取；
2)测试提取的微生物细胞的实际数量，与根据菌粉掺加量计算的微生物细胞理论数量进行比较，得出微生物净浆试件中的微生物活性变化情况。
实施例1
试样：微生物水泥基材料试件尺寸40mm×40mm×40mm，水灰比0.50，普通硅酸盐水泥81.0g，水40.5g，菌粉4.1g(100亿/克)以胶凝材料质量比5％掺入，24h脱模，标准条件下养护28d。
在试样养护7d、14d及28d时，分别取试样提取微生物。
微生物提取过程为：将标准养护条件下养护7d、14d或28d的微生物净浆试块取出，用万能试验机以0.02MPa/s的速度连续而均匀地加荷，当上压板与试件接近时，调整球座使接触均衡，当微生物净浆试块出现明显裂缝时，停止加载。将预破碎后的微生物净浆试件放置于玛瑙研钵中进行细致研磨，将研磨后获得的粉末用筛孔范围500目的标准筛筛分，称取1g筛分后的粉末装入10ml无菌离心管中，加入5ml经由高压灭菌锅120℃灭菌30min后浓度为0.9％的生理盐水，将无菌离心管密闭后放置于超声波清洗机中频率40kHz进行超声20～30min，将无菌离心管从超声波清洗机中取出，静置20min，用规格为200～1000μL移液枪将超声后无菌离心管中的上清液转移至另一个10ml无菌离心管，将存有上清液的无菌离心管放置于低速离心机中2000rpm，离心2min。
测试从微生物水泥基材料中提取的微生物细胞数量，结果如下：
养护7d的试样：将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为2.42×105cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为1.21×109cells/g。根据实际掺加菌粉计算得出的微生物数量为3.26×109cells/g，采用本发明的方法提取出的微生物实际数量与上述理论数量接近，符合实际掺加菌粉情况。这说明，本申请的方法能够充分提取出微生物水泥基材料中的微生物，准确获知微生物活性情况。
养护14d的试样：用流式细胞仪进行计数并计算得出，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为1.13×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况
养护28d的试样：用流式细胞仪进行计数并计算得出，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为1.09×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况。
比较养护7d、14d、28d的试样中的微生物细胞数量可以发现，随时间的发展，微生物的存活率逐渐降低，说明研究微生物在水泥基材料中的活性变化对工程具有重要意义。
实施例2
试样：微生物水泥基材料试件尺寸40mm×40mm×40mm，水灰比0.50，普通硅酸盐水泥81.0g，水40.5g，菌粉4.1g(100亿/克)以胶凝材料质量比5％掺入，24h脱模，标准条件下养护28d。
在试样养护7d、14d及28d时，分别取试样提取微生物。
微生物提取过程为：将标准养护条件下养护7d、14d或28d的微生物净浆试块取出，用万能试验机以0.02MPa/s的速度连续而均匀地加荷，当上压板与试件接近时，调整球座使接触均衡，当微生物净浆试块出现明显裂缝时，停止加载。将预破碎后的微生物净浆试件放置于玛瑙研钵中进行细致研磨，将研磨后获得的粉末用筛孔范围800目的标准筛筛分，称取1g筛分后的粉末装入10ml无菌离心管中，加入5ml经由高压灭菌锅120℃灭菌30min后浓度为0.9％的生理盐水，将无菌离心管密闭后放置于超声波清洗机中频率30kHz进行超声20～30min，将无菌离心管从超声波清洗机中取出，静置20min，用规格为200～1000μL移液枪将超声后无菌离心管中的上清液转移至另一个10ml无菌离心管，将存有上清液的无菌离心管放置于低速离心机中2000rpm，离心2min。
测试从微生物水泥基材料中提取的微生物细胞数量，结果如下：
养护7d的试样：将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为5.36×105cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为2.68×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况。
养护14d的试样：将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为4.64×105cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为2.32×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况。
养护28d的试样：用流式细胞仪进行计数并计算得出，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为1.98×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况。
比较养护7d、14d、28d的试样中的微生物细胞数量可以发现，随时间的发展，微生物的存活率逐渐降低。
实施例3
试样：微生物水泥基材料试件尺寸40mm×40mm×40mm，水灰比0.50，普通硅酸盐水泥81.0g，水40.5g，菌粉4.1g(100亿/克)以胶凝材料质量比5％掺入，24h脱模，标准条件下养护7d。
提取微生物：将标准养护条件下养护7d的微生物净浆试块取出，用万能试验机以0.02MPa/s的速度连续而均匀地加荷，当上压板与试件接近时，调整球座使接触均衡，当微生物净浆试块出现明显裂缝时，停止加载。将预破碎后的微生物净浆试件放置于玛瑙研钵中进行细致研磨，将研磨后获得的粉末用筛孔范围800目的标准筛筛分，称取1g筛分后的粉末装入10ml无菌离心管中，加入5ml经由高压灭菌锅120℃灭菌30min后浓度为0.9％的生理盐水，将无菌离心管密闭后放置于超声波清洗机中频率40kHz进行超声20～30min，将无菌离心管从超声波清洗机中取出，静置20min，用规格为200～1000μL移液枪将超声后无菌离心管中的上清液转移至另一个10ml无菌离心管，将存有上清液的无菌离心管放置于低速离心机中2000rpm，离心2min。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为2.84×105cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为1.42×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况。
实施例4
试样：微生物水泥基材料试件尺寸40mm×40mm×40mm，水灰比0.50，普通硅酸盐水泥81.0g，水40.5g，菌粉4.1g(100亿/克)以胶凝材料质量比5％掺入，24h脱模，标准条件下养护7d。
提取微生物：将标准养护条件下养护7d的微生物净浆试块取出，用万能试验机以0.02MPa/s的速度连续而均匀地加荷，当上压板与试件接近时，调整球座使接触均衡，当微生物净浆试块出现明显裂缝时，停止加载。将预破碎后的微生物净浆试件放置于玛瑙研钵中进行细致研磨，将研磨后获得的粉末用筛孔范围500目的标准筛筛分，称取1g筛分后的粉末装入10ml无菌离心管中，加入5ml经由高压灭菌锅120℃灭菌30min后浓度为0.9％的生理盐水，将无菌离心管密闭后放置于超声波清洗机中频率30kHz进行超声20～30min，将无菌离心管从超声波清洗机中取出，静置20min，用规格为200～1000μL移液枪将超声后无菌离心管中的上清液转移至另一个10ml无菌离心管，将存有上清液的无菌离心管放置于低速离心机中2000rpm，离心2min。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为4.38×105cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为2.19×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g相近，符合实际掺加菌粉情况。
实施例5
试样：微生物水泥基材料试件尺寸40mm×40mm×40mm，水灰比0.50，普通硅酸盐水泥81.0g，水40.5g，菌粉4.1g(100亿/克)以胶凝材料质量比5％掺入，24h脱模，标准条件下养护14d。
设备与测试条件：将标准养护条件下养护14d的微生物净浆试块取出，用万能试验机以0.02MPa/s的速度连续而均匀地加荷，当上压板与试件接近时，调整球座使接触均衡，当微生物净浆试块出现明显裂缝时，停止加载。将预破碎后的微生物净浆试件放置于玛瑙研钵中进行细致研磨，将研磨后获得的粉末用筛孔范围800目的标准筛筛分，称取1g筛分后的粉末装入15ml无菌离心管中，加入10ml经由高压灭菌锅120℃灭菌30min后浓度为0.9％的生理盐水，将无菌离心管密闭后放置于超声波清洗机中频率30kHz进行超声20～30min，将无菌离心管从超声波清洗机中取出，静置20min，用规格为200～1000μL移液枪将超声后无菌离心管中的上清液转移至另一个15ml无菌离心管，将存有上清液的无菌离心管放置于低速离心机中2000rpm，离心2min。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为2.68×105cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入10ml生理盐水相当于稀释10倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为2.68×109cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g接近，符合实际掺加菌粉情况。
对比例1
取实施例1制备的微生物净浆试件，参照实施例1的方法提取微生物，区别在于，预破碎后过200目的标准筛筛分。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为6.54×103cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为3.27×107cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g相差较远，不符合实际掺加菌粉情况。
对比例2
取实施例1制备的微生物净浆试件，参照实施例1的方法提取微生物，区别在于，预破碎后过1000目的标准筛筛分。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为1.12×104cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为5.62×107cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g相差较远，不符合实际掺加菌粉情况。
对比例3
取实施例1制备的微生物净浆试件，参照实施例1的方法提取微生物，区别在于，超声处理时，超声频率为20kHz。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为1.10×104cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为5.51×107cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g相差较远，不符合实际掺加菌粉情况。
对比例4
取实施例1制备的微生物净浆试件，参照实施例1的方法提取微生物，区别在于，超声处理时，超声频率为80kHz。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为1.55×104cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入5ml生理盐水相当于稀释5倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为7.74×107cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g相差较远，不符合实际掺加菌粉情况。
对比例5
取实施例1制备的微生物净浆试件，参照实施例1的方法提取微生物，区别在于，提取微生物时，粉末溶液提取比为1：20。
将从微生物水泥基材料中提取的微生物经过稀释1000倍后，用流式细胞仪进行计数可以发现，通过以上操作步骤收集的细胞数量为1.25×103cells/ml，由于在提取微生物过程中取样1g加入20ml生理盐水相当于稀释20倍，因此，原微生物水泥基试块中微生物细胞数量应为6.24×107cells/g，相比实际掺加菌粉计算得出的微生物数量3.26×109cells/g相差较远，不符合实际掺加菌粉情况。
Claims (5)
1.一种微生物水泥基材料中的微生物数量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)模拟微生物水泥基材料，以菌粉、普通硅酸盐水泥成型微生物净浆试件；
(2)通过加载载荷的方式预破碎微生物净浆试件，当微生物净浆试件出现明显裂缝时，停止加载；
(3)将预破碎后的微生物净浆试件研磨成粉末，过500～800目筛；
(4)取筛分后的粉末置于无菌离心管中，加入灭菌后的提取溶液，超声震荡；所述提取溶液为浓度0.9％的生理盐水；所述粉末与提取溶液的质量体积比为1:5～1:10；
(5)将超声震荡后的无菌离心管取出，静置后，取上清液转移至另一无菌离心管；
(6)将存有上清液的无菌离心管置于离心机中进行低速离心，完成微生物的提取；
(7)测试提取的微生物细胞的实际数量，与根据菌粉掺加量计算的微生物细胞理论数量进行比较，得出微生物净浆试件中的微生物数量变化情况。
2.根据权利要求1所述的微生物水泥基材料中的微生物数量分析方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加载载荷的方式为：将微生物净浆试件置于力学试验机中，以0.02～0.05MPa/s的速度连续而均匀地向其施加载荷。
3.根据权利要求1所述的微生物水泥基材料中的微生物数量分析方法，其特征在于，步骤(4)中，所述超声震荡的参数条件为：超声频率30～40kHz，超声震荡温度为20～60℃，超声震荡时间为20～30min。
4.根据权利要求1所述的微生物水泥基材料中的微生物数量分析方法，其特征在于，步骤(5)中，所述静置时间为20min。
5.根据权利要求1所述的微生物水泥基材料中的微生物数量分析方法，其特征在于，步骤(6)中，所述低速离心为：离心转速2000～3000rpm，离心时间2～5min。
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| WO2002031184A2 (fr) * | 2000-10-11 | 2002-04-18 | Universite De Liege | Procede d'extraction de micro-organismes intacts a partir de boues ou de biofilms |
| CN104261736A (zh) * | 2014-09-15 | 2015-01-07 | 东南大学 | 一种具有深层自修复功能的水泥基材料的制备方法 |
| CN108277256A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-07-13 | 合肥工业大学 | 一种表征微生物自愈合混凝土中细菌生存状况的方法 |
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2020
- 2020-12-11 CN CN202011440037.8A patent/CN112553290B/zh active Active
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