CN112552490A - 一种核酸接枝半导体聚合物、核酸探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸接枝半导体聚合物、核酸探针及其制备方法和应用，所述核酸接枝半导体聚合物包括如式I所示结构的重复单元，具有两亲性，能够在水溶液中自组装，形成表面密集排布有单链DNA的核酸组装体，该核酸组装体能够作为一个高效的能量传递平台用于核酸的成像和检测中。包含上述核酸组装体的核酸探针中，染料修饰DNA单链与核酸组装体表面的DNA进行杂交，发生高效的从半导体聚合物到染料的能量传递，形成荧光能量共振转移。所述核酸探针用于靶标核酸的检测时，由于核酸分子的杂交替换，荧光能量共振转移的荧光比率发生变化，通过荧光比率和靶标核酸浓度的关系，实现了靶标核酸的高灵敏度和高特异性的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种核酸接枝半导体聚合物、核酸探针及其制备方法和应用。
背景技术
核酸是一种具有标志性的生物分子。通过检测核酸，可以精准地诊断出特定疾病。因此，人们需要灵敏度好、特异性高的核酸检测方法。当前普遍使用的核酸检测方法是依靠生物扩增，例如使用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)来扩增靶标核酸的数量，该方法需要训练有素的人员和专业的实验室，而且耗时较长，检测成本很高。针对这一问题，基于荧光的生物传感显示出独特的优势，包括高的灵敏度、高的时间分辨率。其中，荧光信号的放大是提高检测体系灵敏度的一个重要策略，而半导体聚合物(Semiconducting polymer，SP)就是符合上述要求的功能材料。
SP是含有π-共轭结构单元主链的大分子。由于电子离域，SP至少具有两个优点：(1)与小分子类似物相比，SP具有很强的光收集能力；(2)激子能有效地沿着聚合物主链迁移，从而促进了向低能量受体或荧光猝灭剂的高效能量转移，这一过程也被称之为“分子导线”效应。与合适的能量受体匹配，可以实现高效的能量传递，这可以提高检测的灵敏度。将SP应用于生物传感体系需要先解决其水溶性的问题，解决这一问题的方法分为两类：其一是给SP引入带电侧链，例如阳离子季铵盐或阴离子磺酸盐；其二是将SP通过纳米沉淀法制备成聚合物点。
目前已有很多研究人员致力于荧光传感的核酸检测，其中一种思路是采用带阳离子侧链的SP进行核酸检测，其基本原理为，带阳离子侧链的SP能够与带负电荷的核酸通过静电相互作用形成复合物，用荧光素标记的中性肽核酸 (PNA，一种具有中性骨架的合成DNA模仿物)作为探针，其可以和互补的靶标单链DNA(ssDNA)形成复合双链体。起初，溶液中的探针和阳离子SP不存在静电相互作用，因此无法发生荧光能量共振转移(FRET)；添加互补的 ssDNA时，由于分子杂交而产生了带负电荷的ssDNA/探针复合双链体，其进一步与阳离子SP通过静电相互作用形成SP/ssDNA/探针的三元复合物。这种复合拉近了SP和探针的距离，另外SP和探针上的荧光素的光谱也能有效重叠，使它们之间发生高效的FRET，从而增强了荧光素的发射。当添加非互补的ssDNA 时，静电相互作用仅发生在SP和ssDNA之间，但SP和探针之间的距离仍然太大而难以发生FRET，因此只能检测到微弱的荧光素信号(“DNAdetection using water-soluble conjugated polymers and peptide nucleic acidprobes”，Brent S. Gaylord等，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，2002，99，17，10954)。该方法能够检测出靶标ssDNA，但其中的阳离子SP和带负电的DNA之间通过非特异的静电相互作用进行结合，如果检测体系里有存在其他带电大分子参与静电相互作用，就会影响体系的特异性和灵敏度。
另外一种基于荧光传感的核酸检测方法通过半导体聚合点(SP dots)进行，代表性的方法为：在SP dots表面修饰DNA，以PicoGreen(PG)染料为受体， SP的发射光谱和PG的吸收光谱有很好的重叠，PG能够嵌在DNA双链里，而不能嵌在单链DNA里。因此，在初始阶段，由于没有互补双链DNA的形成，溶液中的PG染料和SP dots的距离很远，不能发生FRET；当溶液中存在靶标 DNA，并与SP dots表面修饰的DNA互补形成双链时，溶液中的PG染料就会嵌到DNA双链中，此时，PG和SP dots的距离被拉近而发生了FRET，使PG 的信号被放大(“Conjugated Polymer Nanoparticles for Label-Free and Bioconjugate -Recognized DNA Sensing in Serum”，Bao Biqing等，Advanced Science，2015， 2，3，1400009)。该方法虽然能够实现靶标ssDNA的检测，但SP dots表面接枝DNA的效率不高、表面DNA的数量不够，使靶标DNA与SP dots表面DNA 的杂交效率较低；而且，半导体聚合物点表面DNA的密度不够不仅会降低SP dots的稳定性，而且会导致表面能够捕获的PG染料数量少，因此导致FRET效率不高，灵敏度受限。
因此，开发一种灵敏度高、特异性好、检测结果可靠的核酸探针材料以及检测方法，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸接枝半导体聚合物、核酸探针及其制备方法和应用，所述核酸接枝半导体聚合物具有两亲性，单链DNA通过稳定的化学键与半导体聚合物的侧链相互连接，能够在水相中发生自组装，形成表面具有密集排布的单链DNA的核酸组装体，可以作为高效的能量传递平台用于核酸的检测和成像。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种核酸接枝半导体聚合物，所述核酸接枝半导体聚合物包括如式I所示结构的重复单元：
式I中，R1、R2各自独立地选自C2～C10直链或支链亚烷基。
所述C2～C10直链或支链亚烷基可以为C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、 C9或C10的直链或支链亚烷基；示例性地包括但不限于：
其中，虚线代表基团的连接位点，m选自2～10的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9 或10。
式I中，L1、L2各自独立地选自单键、CH＝CH或C≡C；所述L1为单键，意指芴环与Ar直接以单键相连；所述L2为单键，意指Ar直接与另一个重复单元以单键相连。
式I中，Ar选自取代或未取代的C6～C20亚芳基、取代或未取代的C2～C20 亚杂芳基；Ar中所述取代的取代基选自C1～C10直链或支链烷基、C1～C10直链或支链烷氧基。
所述C6～C20亚芳基可以为C6、C9、C10、C12、C14、C16、C18或C20 等的亚芳基，示例性地包括但不限于：亚苯基、亚联苯基、亚萘基、亚蒽基、亚菲基、亚芴基或亚茚基等。
所述C2～C20亚杂芳基可以为C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C10、C1、 C14、C16、C18或C20等的亚杂芳基，示例性地包括但不限于：亚呋喃基、亚噻吩基、亚苯并二噻吩基、亚苯并二呋喃基、亚苯并噻二唑基或亚苯并恶二唑基等。
所述C1～C10直链或支链烷基可以为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、 C9或C10的直链或支链烷基，示例性地包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基等。
所述C1～C10直链或支链烷氧基可以为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、 C8、C9或C10的直链或支链烷氧基，示例性地包括但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基等。
式I中，S1为单链DNA。
本发明提供的核酸接枝半导体聚合物中包含如式I所示结构的重复单元，核酸S1与半导体聚合物的侧链通过稳定的化学键(三唑)进行连接；所述核酸接枝半导体聚合物具有两亲性，可以在水溶液中发生自组装，形成球形的核酸组装体，该核酸组装体的表面密集排布有单链DNA，其基于半导体聚合物的“分子导线”性质，能够作为一个高效的能量传递平台，用于核酸的成像和检测中。
优选地，所述R1、R2各自独立地选自C4～C8直链或支链亚烷基，进一步优选为C4～C8直链亚烷基；即所述R1、R2各自独立地选自
其中，m为 4、5、6、7或8。
优选地，所述R1、R2为相同的基团。
优选地，所述L1、L2各自独立地选自单键或CH＝CH。
优选地，所述L1、L2为相同的基团。
优选地，所述Ar选自如下基团中的任意一种：
其中，虚线代表基团的连接位点。
RA1、RA2、RA3、RA4各自独立地选自氢、C1～C10(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10)直链或支链烷基、C1～C10(例如C1、C2、C3、 C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10)直链或支链烷氧基。
优选地，所述核酸接枝半导体聚合物包括如下重复单元A1～A6中的任意一种或至少两种的组合：
优选地，所述单链DNA的碱基数量为5～15个，例如5个、6个、7个、8 个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个。
优选地，所述S1的核酸序列为：5'-TAGCTTATCAGACTG-3'(SEQ ID NO.1)、 5'-TCCCTGAGACCCTAA-3'(SEQ ID NO.2)或5'-TGAGGTAGTAGGTTG-3'(SEQ ID NO.3)。
另一方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸接枝半导体聚合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)含有重复单元B的半导体聚合物、亚铜催化剂与负载有炔基修饰核酸的孔玻璃珠在溶剂中进行反应，得到产物，所述产物负载于孔玻璃珠上；反应式如下：
其中，R1、R2、L1、L2、Ar、S1、n各自独立地具有与式I中相同的限定范围；
(2)步骤(1)得到的产物在碱液的作用下与孔玻璃珠分离，得到所述核酸接枝半导体聚合物。
本发明提供的制备方法中，含有重复单元B的半导体聚合物与炔基修饰核酸在亚铜催化剂的作用下发生点击化学反应(click反应)，使核酸(S1)高效地接枝于半导体聚合物的侧链上，得到两亲性的核酸接枝半导体聚合物。
优选地，步骤(1)所述重复单元B与炔基修饰核酸的摩尔比为(1～10):1，例如1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、 7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1等。
优选地，步骤(1)所述亚铜催化剂包括CuI和/或CuBr。
优选地，步骤(1)所述炔基修饰核酸与亚铜催化剂的摩尔比为1:(0.1～1) 例如可以为1:0.15、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:0.95 等。
优选地，步骤(1)所述反应的原料还包括稳定剂。
优选地，所述稳定剂与炔基修饰核酸的摩尔比为(0.1～1):1，例如0.15:1、 0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1或0.95:1等。
优选地，所述催化剂为CuBr，所述稳定剂为三((1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4- 基)甲基)胺(TBTA)。
优选地，步骤(1)所述溶剂包括二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF) 和二甲基亚砜(DMSO)的混合物。
优选地，以所述炔基修饰核酸的用量为1μmol计，所述溶剂的用量为0.5～2 mL，例如0.6mL、0.8mL、1mL、1.1mL、1.3mL、1.5mL、1.7mL或1.9mL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(1)所述反应在搅拌条件下进行。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为30～50℃，例如31℃、33℃、35℃、 37℃、39℃、40℃、41℃、43℃、45℃、47℃或49℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为5～24h，例如6h、8h、10h、12h、 14h、16h、18h、20h、22h或24h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(1)所述反应完成后还包括洗涤的步骤。
优选地，所述洗涤的试剂包括二氯甲烷、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述碱液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水。
优选地，步骤(2)所述作用的温度为50～60℃，例如可以为51℃、52℃、 53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃或59℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(2)所述作用的时间为5～24h，例如可以为6h、8h、10h、 12h、13h、14h、16h、18h、20h、21h或23h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(2)所述分离后还包括纯化和干燥的步骤。
优选地，所述纯化通过离心过滤器进行。
优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)含有重复单元B的半导体聚合物、亚铜催化剂、稳定剂与负载有炔基修饰核酸的孔玻璃珠在溶剂中30～50℃搅拌反应5～24h，得到产物，所述产物负载于孔玻璃珠上；所述重复单元B与炔基修饰核酸的摩尔比为(1～10):1；以所述炔基修饰核酸的用量为1μmol计，所述亚铜催化剂的用量为0.1～1μmol，所述稳定剂的用量为0.1～1μmol；
(2)步骤(1)得到的产物与碱液混合，50～60℃条件下处理5～24h，使所述产物与孔玻璃珠分离，经纯化和干燥后，得到所述核酸接枝半导体聚合物。
另一方面，本发明提供一种核酸组装体，所述核酸组装体通过如第一方面所述的核酸接枝半导体聚合物自组装而成。
所述核酸组装体通过如前所述的核酸接枝半导体聚合物在水溶液中基于疏水作用力和π-π堆积力组装而成，空间形态为球形纳米粒子，纳米粒子的表面密集排布有DNA，具有“球形核酸”特征。所述核酸组装体作为一个高效的能量传递平台，能够以高的灵敏度和特异性用于靶标核酸的检测。
另一方面，本发明提供一种核酸探针，所述核酸探针包括核酸组装体，以及杂交于所述核酸组装体上的染料修饰DNA单链S2；所述核酸组装体通过如第一方面所述的核酸接枝半导体聚合物自组装而成。
本发明所述核酸探针中，核酸组装体由如上所述的核酸接枝半导体聚合物自组装而成，核酸组装体的表面密集排布有单链DNA(S1)，能够与染料修饰DNA单链(S2)进行分子杂交，拉近了半导体聚合物和染料的距离，从而可以发生高效的从半导体聚合物到染料的能量传递，形成荧光能量共振转移 (FRET)，能够实现靶标核酸的高特异性和高灵敏度的定量检测。
优选地，所述核酸组装体为球形纳米粒子。
优选地，所述核酸组装体的水合半径为20～100nm，例如22nm、25nm、 28nm、30nm、32nm、35nm、38nm、40nm、42nm、45nm、48nm、50nm、 52nm、55nm、58nm、60nm、62nm、65nm、68nm、70nm、72nm、75nm、 78nm、80nm、82nm、85nm、88nm、90nm、92nm、95nm或98nm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述核酸组装体上的核酸与染料修饰DNA单链S2的摩尔比为 1:(0.1～0.2)，例如可以为1:0.11、1:0.12、1:0.13、1:0.14、1:0.15、1:0.16、1:0.17、 1:0.18或1:0.19等。
优选地，所述DNA单链S2的碱基数量为20～25个，例如可以为20个、21 个、22个、23个、24个或25个。
优选地，所述DNA单链S2的核酸序列为： 5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'(SEQ IDNO.4)。
优选地，所述染料包括花氰染料，进一步优选为Cy3、Cy5或Cy7。
优选地，所述染料的吸收光谱与核酸接枝半导体聚合物的发射光谱重叠。
另一方面，本发明提供一种如上所述的核酸探针的制备方法，所述制备方法包括：如第一方面所述的核酸接枝半导体聚合物在水溶液中自组装，得到核酸组装体；所述核酸组装体与染料修饰DNA单链S2进行杂交，得到所述核酸探针。
优选地，所述核酸接枝半导体聚合物在水溶液中的浓度为0.1～10μg/mL，例如可以为0.2μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、 2.5μg/mL、3.0μg/mL、3.5μg/mL、4.0μg/mL、4.5μg/mL、5.0μg/mL、5.5μg/mL、 6.0μg/mL、6.5μg/mL、7.0μg/mL、7.5μg/mL、8.0μg/mL、8.5μg/mL、9.0μg/mL 或9.5μg/mL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述核酸组装体的表面核酸与染料修饰DNA单链S2的摩尔比为 1:(0.1～0.2)，例如可以为1:0.11、1:0.12、1:0.13、1:0.14、1:0.15、1:0.16、1:0.17、 1:0.18或1:0.19等。
另一方面，本发明提供一种如上所述的核酸探针在生物传感、生物成像或核酸检测中的应用。
优选地，所述核酸检测的方法包括如下步骤：
(A)向所述核酸探针的溶液中加入靶标核酸进行杂交替换，得到待测溶液；
(B)对步骤(A)得到的待测溶液进行荧光测试，根据荧光能量共振转移的荧光比率实现靶标核酸的定量检测。
所述核酸检测的方法中，向核酸探针的溶液中加入靶标核酸后，由于核酸分子的竞争杂交替换，靶标核酸与核酸探针上的染料修饰DNA单链S2形成双链复合物而分散于溶液中，此时，能量受体染料与核酸组装体的距离拉大，FRET 消失；随着靶标核酸的增多，更多的染料修饰DNA单链S2脱离核酸组装体，因而总体的FRET效率继续变低；通过计算FERT效率和靶标核酸浓度的关系，可以靶标核酸的高灵敏度定量检测。
优选地，所述溶液的溶剂为缓冲液，进一步优选为PBS缓冲液。
优选地，所述靶标核酸包括DNA、信使RNA或MicroRNA。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的核酸接枝半导体聚合物中包含如式I所示结构的重复单元，核酸S1与半导体聚合物的侧链通过稳定的化学键进行连接；所述核酸接枝半导体聚合物具有两亲性，在水溶液中发生自组装，形成表面密集排布有单链 DNA的核酸组装体，该核酸组装体基于半导体聚合物的分子导线性质，能够作为一个高效的能量传递平台用于核酸的成像和检测中。
(2)包含上述核酸组装体的核酸探针中，染料修饰DNA单链与核酸组装体表面的DNA进行分子杂交，拉近半导体聚合物和染料的距离，从而发生高效的从半导体聚合物到染料的能量传递，形成荧光能量共振转移。所述核酸探针用于靶标核酸的检测时，由于核酸分子的杂交替换，荧光能量共振转移的荧光比率发生变化，通过荧光比率和靶标核酸浓度的关系，实现了靶标核酸的高灵敏度和高特异性的定量检测。
附图说明
图1为实施例1提供的核酸接枝半导体聚合物的琼脂糖凝胶电泳分析结果图；
图2为实施例1提供的核酸接枝半导体聚合物的自组装示意图；
图3为实施例2中核酸组装体的透射电镜图；
图4为实施例2中核酸组装体的粒径分布图；
图5为实施例3中核酸探针的荧光光谱图；
图6为实施例4中核酸探针用于核酸检测的原理示意图；
图7为实施例4中核酸检测的荧光光谱图；
图8为实施例4中核酸检测的荧光比率与靶标核酸浓度的关系图；
图9为实施例4中核酸检测的特异性表征图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种核酸接枝半导体聚合物(SP-g-DNA)，包含如下所示的重复单元A1：
其中，S1的核酸序列为SEQ ID NO.1：5'-TAGCTTATCAGACTG-3'。
该核酸接枝半导体聚合物的制备方法如下：
(1)将叠氮修饰的半导体聚合物azide-functionalized poly((9,9-bis(6-bromohexyl)-2,7-diyl)-co-(1,4-benzo-(2,1',3)-thiadazole)SP-N3 (重复单元
的摩尔量为5μmol，SP-N3的分子量为4341Da)、CuBr(1.0μmol)、三((1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺(TBTA， 1.0μmol)、负载有炔基修饰S1的孔玻璃珠CPG(50mg，1.5μmol)和磁力搅拌棒依次置于烧瓶中，脱气三次后通过注射器加入DCM、DMF和DMSO(体积比为1:1:1)的混合溶液(共1mL)后，将混合物在40℃下搅拌12h。反应完成后，收集负载有产物的CPG珠，并用DCM和DMSO洗涤以除去未反应的 SP和其他杂质；
(2)在55℃下用浓氨水溶液(28％的NH3)处理步骤(1)得到的CPG珠 16h后，通过真空除去氨直至氨气的气味消失；通过离心过滤器纯化所得的SP-g-DNA粗产物，以去除未结合的游离DNA；将纯化后的SP-g-DNA冻干，得到黄色粉末。
本实施例提供的SP-g-DNA的纯度通过琼脂糖凝胶电泳分析确定，其琼脂糖凝胶电泳分析结果图如图1所示。
实施例2
一种核酸组装体(S-SNA)，通过实施例1提供的核酸接枝半导体聚合物 (SP-g-DNA)自组装而成，制备方法如下：
将实施例1提供的SP-g-DNA与水混合，得到浓度为10μg/mL的水溶液(黄色水溶液)，SP-g-DNA由于疏水相互作用力和π-π堆积力自组装成球形的纳米粒子，即所述核酸组装体，纳米粒子表面密集排有DNA(S1)，自组装示意图如图2所示。
通过透射电子显微镜(TEM，Hitachi HT7700)对本实施例中的S-SNA进行形貌测试，得到的透射电镜图如图3所示。
通过动态光散射粒度仪(DLS，Brookhaven Instruments Corporation，USA 测试本实施例中S-SNA的粒径，得到的粒径分布图如图4所示，从图4中可知，所述S-SNA的水合半径约为28nm。
实施例3
一种核酸探针，包括核酸组装体，以及杂交于所述核酸组装体上的染料Cy5 修饰DNA单链S2(Cy5-cDNA)，S2的核酸序列为SEQ ID NO.4： 5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'；核酸组装体通过实施例1提供的 SP-g-DNA自组装而成(同实施例2)；制备方法如下：
将实施例1提供的SP-g-DNA与水混合，得到浓度为10μg/mL的水溶液， SP-g-DNA由于疏水相互作用力和π-π堆积力自组装成球形的纳米粒子，纳米粒子表面密集排有DNA(S1)，即实施例2中的S-SNA；取1μg/mL的S-SNA溶液，向溶液中分别加入1nM、2nM、5nM、8nM、10nM的Cy5-cDNA，使S-SNA 与Cy5-cDNA进行分子杂交，得到核酸探针。
通过荧光分光光度计(Agilent Cary Eclipse，激发波长为450nm)对本实施例中的核酸探针进行荧光检测，以不加入Cy5-cDNA(即0nM)作为对照，得到的荧光光谱图如图5所示，从图5中可知，通过核酸的杂交互补，拉近了SP 与Cy5的距离，S-SNA的能量可以高效地传递给受体Cy5-cDNA，形成荧光能量共振转移(FERT)；同时，随着Cy5-cDNA浓度的增加，荧光能量共振转移效率逐渐提高，670nm处的荧光强度增大。
实施例4
一种核酸检测的方法，包括如下步骤：
向核酸探针(实施例3，受体Cy5-cDNA浓度为10nM)的PBS溶液中分别加入浓度为2nM、5nM、8nM、9nM、10nM的靶标核酸(MicroRNA-21，序列为SEQ ID NO.5：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3')，得到待测溶液，以不加入靶标核酸(即0nM)为对照组；将待测溶液进行荧光检测(荧光分光光度计Agilent Cary Eclipse，激发波长为450nm)，得到的荧光光谱图如图 7所示。
本实施例提供的核酸检测中，由于核酸分子的竞争杂交替换，靶标核酸与Cy5-cDNA形成双链复合物而分散于溶液中，使能量受体Cy5与S-SNA的距离拉大，FRET消失，该检测过程的原理示意图如图6所示，荧光光谱图如图7所示，以荧光比率(荧光比率为670nm处的荧光强度与550nm处的荧光强度的比值，I670/I550)为纵坐标、靶标核酸的浓度为横坐标制图，得到的荧光比率与靶标核酸浓度的关系图如图8所示。
结合图7和图8可知，靶标核酸与核酸探针发生核酸分子的杂交替换，靶标核酸与Cy5-cDNA形成双链复合物，使Cy5与S-SNA的距离增大，FRET消失，荧光强度降低；随着靶标核酸浓度的增大，更多的Cy5-cDNA脱离S-SNA，总体的FRET效率继续变低。荧光比率与靶标核酸的浓度之间具有良好的线性关系，通过计算FERT效率(荧光比率)和靶标核酸浓度的关系，可以灵敏地检测靶标核酸。
采用本实施例中的检测方法对microRNA21系列的靶标核酸进行特异性表征，具体方法为：将相同浓度的miR21A和miR21B进行上述同样的检测。它们的序列分别为5'-UAGCUUAUCAGACUGAGGUUGA-3'(miR21A，SEQ ID NO.6)、5'-UAGCUUAUGAGACUGAUGUUGA-3'(miR21B，SEQ ID NO.7)，得到的特异性表征图如图9所示，从图9中可知，miR21A和miR21B均无法响应核酸探针，而miR21(序列为SEQ ID NO.5： 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3')可以很好的响应，表明了该核酸探针优异的序列特异性。
实施例5
一种核酸接枝半导体聚合物(PFPV-g-DNA)，包含如下所示的重复单元A4：
其中，S1的核酸序列为SEQ ID NO.2：5'-TCCCTGAGACCCTAA-3'。
该核酸接枝半导体聚合物的制备方法如下：
(1)将叠氮修饰的半导体聚合物azide-functionalized poly((9,9-bis(6-bromohexyl)-2,7-diyl)-co-(2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-ph enyene))PFPV-N3(重复单元
的摩尔量为 5μmol，PFPV-N3的分子量为6765Da)、CuBr(1.0μmol)、TBTA(1.0μmol)、负载有炔基修饰S1的孔玻璃珠CPG(50mg，1.5μmol)和磁力搅拌棒依次置于烧瓶中，脱气三次后通过注射器加入DCM、DMF和DMSO(体积比为1:1:1) 的混合溶液(共1mL)后，将混合物在40℃下搅拌12h。反应完成后，收集负载有产物的CPG珠，并用DCM和DMSO洗涤以除去未反应的PFPV和其他杂质；
(2)在50℃下用浓氨水溶液(28％的NH3)处理步骤(1)得到的CPG珠 16h后，通过真空除去氨直至氨气的气味消失；通过离心过滤器纯化所得的 PFPV-g-DNA粗产物，以去除未结合的游离DNA；将纯化后的PFPV-g-DNA冻干，得到绿色粉末。
将本实施例提供的PFPV-g-DNA与水混合，得到浓度为10μg/mL的水溶液， PFPV-g-DNA由于疏水相互作用力和π-π堆积力自组装成球形的纳米粒子，即核酸组装体，纳米粒子表面密集排有DNA(S1：5'-TCCCTGAGACCCTAA-3')。
通过透射电子显微镜(TEM，Hitachi HT7700)对本实施例中的S-SNA进行形貌确认测试；通过动态光散射粒度仪(DLS，Brookhaven Instruments Corporation)测试本实施例中S-SNA的粒径，其水合半径约为35nm。
该核酸组装体能够与荧光染料Cy3修饰DNA单链S2(Cy3-cDNA)杂交，形成核酸探针。
实施例6
一种核酸接枝半导体聚合物(PFO-g-DNA)，包含如下所示的重复单元A6：
其中，S1的核酸序列为SEQ ID NO.3：5'-TGAGGTAGTAGGTTG-3'。
该核酸接枝半导体聚合物的制备方法如下：
(1)将叠氮修饰的半导体聚合物azide-functionalized poly(9,9-dihexylfluorenyl-2,7-diyl)PFO-N3(重复单元
的摩尔量为5μmol，PFO-N3的分子量为8634Da)、CuBr(1.0μmol)、TBTA(1.0μmol)、负载有炔基修饰S1的孔玻璃珠CPG(50mg，1.5μmol)和磁力搅拌棒依次置于烧瓶中，脱气三次后通过注射器加入DCM、DMF和DMSO(体积比为1:1:1) 的混合溶液(共1mL)后，将混合物在42℃下搅拌12h。反应完成后，收集负载有产物的CPG珠，并用DCM和DMSO洗涤以除去未反应的PFO和其他杂质；
(2)在60℃下用浓氨水溶液(28％的NH3)处理步骤(1)得到的CPG珠 15h后，通过真空除去氨直至氨气的气味消失；通过离心过滤器纯化所得的 PFO-g-DNA粗产物，以去除未结合的游离DNA；将纯化后的PFO-g-DNA冻干，得到粉末。
将本实施例提供的PFO-g-DNA与水混合，得到浓度为10μg/mL的水溶液， PFO-g-DNA由于疏水相互作用力和π-π堆积力自组装成球形的纳米粒子，即核酸组装体，纳米粒子表面密集排有DNA(S1：5'-TGAGGTAGTAGGTTG-3')。
通过透射电子显微镜(TEM，Hitachi HT7700)对本实施例中的S-SNA进行形貌确认测试；通过动态光散射粒度仪(DLS，Brookhaven Instruments Corporation)测试本实施例中S-SNA的粒径，其水合半径约为48nm。
该核酸组装体能够与荧光染料Alexa 430修饰DNA单链S2(Alexa 430-cDNA)杂交，形成核酸探针。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种核酸接枝半导体聚合物、核酸探针及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种核酸接枝半导体聚合物，其特征在于，所述核酸接枝半导体聚合物包括如式I所示结构的重复单元：
其中，R1、R2各自独立地选自C2～C10直链或支链亚烷基；
L1、L2各自独立地选自单键、CH＝CH或C≡C；
Ar选自取代或未取代的C6～C20亚芳基、取代或未取代的C2～C20亚杂芳基；Ar中所述取代的取代基选自C1～C10直链或支链烷基、C1～C10直链或支链烷氧基；
S1为单链DNA；
n为0或1。
2.根据权利要求1所述的核酸接枝半导体聚合物，其特征在于，所述R1、R2各自独立地选自C4～C8直链或支链亚烷基，优选为C4～C8直链亚烷基；
优选地，所述R1、R2为相同的基团；
优选地，所述L1、L2各自独立地选自单键或CH＝CH；
优选地，所述L1、L2为相同的基团；
优选地，所述Ar选自如下基团中的任意一种：
其中，虚线代表基团的连接位点；
RA1、RA2、RA3、RA4各自独立地选自氢、C1～C10直链或支链烷基、C1～C10直链或支链烷氧基。
3.根据权利要求1或2所述的核酸接枝半导体聚合物，其特征在于，所述核酸接枝半导体聚合物包括如下重复单元A1～A6中的任意一种或至少两种的组合：
优选地，所述单链DNA的碱基数量为5～15个；
优选地，所述S1的核酸序列为：5'-TAGCTTATCAGACTG-3'、5'-TCCCTGAGACCCTAA-3'或5'-TGAGGTAGTAGGTTG-3'。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的核酸接枝半导体聚合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)含有重复单元B的半导体聚合物、亚铜催化剂与负载有炔基修饰核酸的孔玻璃珠在溶剂中进行反应，得到产物，所述产物负载于孔玻璃珠上；反应式如下：
其中，R1、R2、L1、L2、Ar、S1、n各自独立地具有与式I中相同的限定范围；
(2)步骤(1)得到的产物在碱液的作用下与孔玻璃珠分离，得到所述核酸接枝半导体聚合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述重复单元B与炔基修饰核酸的摩尔比为(1～10):1；
优选地，步骤(1)所述亚铜催化剂包括CuI和/或CuBr；
优选地，步骤(1)所述炔基修饰核酸与亚铜催化剂的摩尔比为1:(0.1～1)；
优选地，步骤(1)所述反应的原料还包括稳定剂；
优选地，所述稳定剂与炔基修饰核酸的摩尔比为(0.1～1):1；
优选地，所述催化剂为CuBr，所述稳定剂为三((1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺；
优选地，步骤(1)所述溶剂包括二氯甲烷、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的混合物；
优选地，以所述炔基修饰核酸的用量为1μmol计，所述溶剂的用量为0.5～2mL；
优选地，步骤(1)所述反应在搅拌条件下进行；
优选地，步骤(1)所述反应的温度为30～50℃；
优选地，步骤(1)所述反应的时间为5～24h；
优选地，步骤(1)所述反应完成后还包括洗涤的步骤；
优选地，所述洗涤的试剂包括二氯甲烷、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述碱液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水；
优选地，步骤(2)所述作用的温度为50～60℃；
优选地，步骤(2)所述作用的时间为5～24h；
优选地，步骤(2)所述分离后还包括纯化和干燥的步骤；
优选地，所述纯化通过离心过滤器进行。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)含有重复单元B的半导体聚合物、亚铜催化剂、稳定剂与负载有炔基修饰核酸的孔玻璃珠在溶剂中30～50℃搅拌反应5～24h，得到产物，所述产物负载于孔玻璃珠上；所述重复单元B与炔基修饰核酸的摩尔比为(1～10):1；以所述炔基修饰核酸的用量为1μmol计，所述亚铜催化剂的用量为0.1～1μmol，所述稳定剂的用量为0.1～1μmol；
(2)步骤(1)得到的产物与碱液混合，50～60℃条件下处理5～24h，使所述产物与孔玻璃珠分离，经纯化和干燥后，得到所述核酸接枝半导体聚合物。
7.一种核酸探针，其特征在于，所述核酸探针包括核酸组装体，以及杂交于所述核酸组装体上的染料修饰DNA单链S2；所述核酸组装体通过如权利要求1～3任一项所述的核酸接枝半导体聚合物自组装而成。
8.根据权利要求7所述的核酸探针，其特征在于，所述核酸组装体为球形纳米粒子；
优选地，所述核酸组装体的水合半径为20～100nm；
优选地，所述核酸组装体上的核酸与染料修饰DNA单链S2的摩尔比为1:(0.1～0.2)；
优选地，所述DNA单链S2的碱基数量为20～25个；
优选地，所述DNA单链S2的核酸序列为：5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'；
优选地，所述染料包括花氰染料，进一步优选为Cy3、Cy5或Cy7；
优选地，所述染料的吸收光谱与核酸接枝半导体聚合物的发射光谱重叠。
9.一种如权利要求7或8所述的核酸探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：如权利要求1～3任一项所述的核酸接枝半导体聚合物在水溶液中自组装，得到核酸组装体；所述核酸组装体与染料修饰DNA单链S2进行杂交，得到所述核酸探针；
优选地，所述核酸接枝半导体聚合物在水溶液中的浓度为0.1～10μg/mL。
10.一种如权利要求7或8所述的核酸探针在生物传感、生物成像或核酸检测中的应用；
优选地，所述核酸检测的方法包括如下步骤：
(A)向所述核酸探针的溶液中加入靶标核酸进行杂交替换，得到待测溶液；
(B)对步骤(A)得到的待测溶液进行荧光测试，根据荧光能量共振转移的荧光比率实现靶标核酸的定量检测；
优选地，所述靶标核酸包括DNA、信使RNA或MicroRNA。
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