CN112552363B - 一种偶联抗坏血酸的核苷酸探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种核苷酸探针及其制备方法和应用。一种偶联抗坏血酸的核苷酸探针，该探针具有如下结构式：
Figure DDA0002856424200000011
本发明的偶联抗坏血酸的核苷酸探针在DNA聚合酶和碱性磷酸酶的用下，结合化学发光体系用于检测目标DNA。本发明的核苷酸探针可以实现对目标DNA高灵敏度，低检测限的定性定量分析。

Description

一种偶联抗坏血酸的核苷酸探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种核苷酸探针及其制备方法和应用。
背景技术
DNA检测在生物学和医学中有广泛的应用，例如病原分析、遗传病诊断和法医鉴定等，也越来越受关注。基于聚合酶链反应(PCR)和DNA微阵列是目前比较传统的检测方法。
DNA聚合酶对底物dNTPs有很强的包容性。DNA测序技术所用的核苷酸试剂都是对dNTPs结构的修饰改造，例如，测序公司Illumina所用的测序试剂是在dNTPs的碱基上连接荧光基团；另一个测序公司Pacific Biosciences用的试剂是将荧光基团链接在dNTPs三磷酸基团的末端；同时，Eric T的课题组合成的核苷酸类似物实现了对目标化合物的灵敏度检测，实验中验证了该类似物是DNA聚合酶的良好底物；Jin课题组利用核苷酸类似物实现了对短序列的检测。
这些方法虽然具有高灵敏度和高效率，但价格昂贵，需要精密的仪器和操作。另外，使用核苷酸连接荧光基团的方法，有机荧光基团大多存在着分离困难、易光漂白、光稳定性差等不可避免的缺点。
抗坏血酸(AA)，又称维生素C，是一种常见的水溶性有机化合物，参与许多生物过程和代谢。而且作为一种必需的微量营养素，AA在人和动物的代谢过程中起着必不可少的作用，并作为抗氧化剂添加到食品、饮料和药物制剂中。由此可见Vc是对生物体比较友好的化合物。到目前为止，抗坏血酸的检测和定量分析技术主要有，荧光分析,色谱分析,光谱分析,比色法,电化学。虽然这些方法灵敏度较高，但是成本比较高，耗时长，预处理和仪器操作比较复杂，因此应用比较局限。与此相比较，化学发光的检测手段具有良好的应用前景，例如，因为不需要外在激发光源的条件，可以有效的避免光漂白和光毒性的问题。同时，利用luminol进行化学发光检测是比较成熟的方法。
发明内容
针对现有的DNA检测技术中存在的问题，本发明提供一种偶联抗坏血酸的核苷酸探针，该探针可以有效地避免目前检测探针中使用有毒的DNA嵌入染料以及荧光检测技术存在光污染和光毒性等问题，结合Luminol-H2O2-CoOOH化学发光检测方法，可以实现对目标化合物高灵敏度，低检测限的定性定量分析。
本发明解决其技术问题采用的一种技术方案是：一种偶联抗坏血酸的核苷酸探针，具有如下结构式：
Figure BDA0002856424180000021
其中，R为
Figure BDA0002856424180000022
本发明还提供了上述偶联抗坏血酸的核苷酸探针的制备方法，该方法包括：
1)在反应容器中，依次加入无水DMF、三丁胺型dNTPs、N,N'-羰基二咪唑，室温搅拌反应5h；三丁胺型dNTPs、N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为1:4～6，无水DMF的量为1～2mL；
2)反应器中加入50～100μL无水甲醇，猝灭反应，然后油泵抽真空除去该溶剂；
3)反应器中依次加入无水DMF、Vc、无水氯化镁，Vc、无水氯化镁投入量的摩尔比为1～2:1；室温搅拌反应72h；纯化回收产物。
本发明进一步提供了上述偶联抗坏血酸的核苷酸探针的用途，该偶联抗坏血酸的核苷酸探针在DNA聚合酶和碱性磷酸酶的用下，结合化学发光体系用于检测目标DNA。
本发明更进一步提供一种DNA检测方法，包括以下步骤：
在反应体系中加入偶联抗坏血酸的核苷酸探针，代替相应的dNTPs参与扩增反应；所述反应体系中含有DNA模板、引物、DNA聚合酶及其他三种dNTPs；
扩增反应完成后，向反应体系中加入碱性磷酸酶；
取反应液，采用Luminol-H2O2-CoOOH化学发光体系进行发光检测。
进一步优选，20uL反应体系中碱性磷酸酶的加入量为0.5U。
本发明提供的偶联抗坏血酸的核苷酸探针，利用化学发光原理实现DNA检测，它可以有效地避免目前检测中使用有毒DNA嵌入染料以及荧光检测技术存在光污染和光毒性等问题，应用Luminol-H2O2-CoOOH可以实现对目标DNA高灵敏度，低检测限的定性定量分析。
附图说明
图1为实施例1中制备的dAppppVc核苷酸探针的核磁共振谱，其中(a)氢谱；(b)磷谱；
图2为实施例2中dAppppVc核苷酸探针检测目标DNA的可行性验证的结果，其中(a)为实验组和对照组发光强度曲线；(b)为实验组和对照组发光强度柱状图；
图3为实施例3中dAppppVc核苷酸探针与碱性磷酸酶的适配性及碱性磷酸酶活性检测结果，其中(a)为4个实验组的发光强度曲线；(b)为4个实验组的发光强度柱状图；
图4为本发明实施例4中dAppppVc核苷酸探针的特异性检测结果，其中(a)为4个实验组的发光强度曲线；(b)为4个实验组的发光强度柱状图；
图5为实施例5中不同浓度DNA与发光强度线性关系图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
本发明实施例中涉及到的试剂及生物样品均通过商业途径获得，或采用常规方法制备、配置。例如：实施例中使用的化学发光试剂采用制备的CoOOH纳米片配置而成，CoOOH纳米片的制备方法为现有技术，实施例中不再赘述。
实施例1本发明提供的探针化合物，是在四种脱氧核苷酸上偶联抗坏血酸Vc，分别为：dAppppVc、dGppppVc、dCppppVc和dTppppVc。
该探针化合物的结构通式为：
Figure BDA0002856424180000041
上述四种偶联抗坏血酸的核苷酸探针化合物，分别通过以下方法制备而成：
1、化合物转型：
(1)脱氧核糖腺苷三磷酸、脱氧核糖胸苷三磷酸、脱氧核糖胞苷三磷酸溶解，过Dowex-50W离子交换柱，转化为H型化合物，收集流出液，四丁基氢氧化铵调pH＝7左右，旋干至体积为
Figure BDA0002856424180000042
左右，冻干为白色粉末。
(2)脱氧核糖鸟苷一磷酸溶解，过Dowex-50W离子交换柱，转化为吡啶型化合物，将流出液收集到盛乙醇和三丁胺的容器中，旋干至体积为
Figure BDA0002856424180000043
左右，冻干为白色粉末。
2、dAppppVc核苷酸探针的制备
(1)31.5mg(40μmol)三丁胺型脱氧腺苷三磷酸溶于1mL无水DMF，加入25.8mg(约160μmol)N,N'-羰基二咪唑,室温反应5h；
(2)反应器中加入50μL无水甲醇，猝灭反应，然后油泵抽真空除去该溶剂；
(3)0.078mmol Vc溶于1mL无水DMF，加入5mg(约0.15mmol)无水氯化镁，加入步骤(2)的反应器中，室温反应72h；
(4)冻干，纯化，得白色固体，收率45％。
3、dGppppVc核苷酸探针的制备
(1)32.17mg(40μmol)三丁胺型脱氧鸟苷三磷酸溶于1mL无水DMF，加入25.8mg(约160μmol)N,N'-羰基二咪唑,室温反应5h。
(2)反应器中加入50μL无水甲醇，猝灭反应，然后油泵抽真空除去该溶剂
(3)0.078mmol Vc溶于1mL无水DMF，加入5mg(约0.15mmol)无水氯化镁，加入步骤(2)的反应器中，室温反应72h。
(4)冻干，纯化，得白色固体，收率50％。
4、dCppppVc核苷酸探针的制备
(1)30.57mg(40μmol)四丁基氢氧化铵型脱氧胞苷三磷酸溶于1mL无水DMF，加入25.8mg(约160μmol)N,N'-羰基二咪唑,室温反应5h；
(2)反应器中加入50μL无水甲醇，猝灭反应，然后油泵抽真空除去该溶剂；
(3)0.078mmol Vc溶于1mL无水DMF，加入5mg(约0.15mmol)无水氯化镁，加入步骤(2)的反应器中，室温反应72h；
(4)冻干，纯化，得白色固体，收率45％。
5、dTppppVc核苷酸探针的制备
(1)31.17mg(40μmol)三丁胺型脱氧胸苷三磷酸溶于1mL无水DMF，加入25.8mg(约160μmol)N,N'-羰基二咪唑,室温反应5h；
(2)反应器中加入50μL无水甲醇，猝灭反应，然后油泵抽真空除去该溶剂；
(3)0.078mmol Vc溶于1mL无水DMF，加入5mg(约0.15mmol)无水氯化镁，加入步骤(2)的反应器中，室温反应72h；
(4)冻干，纯化，得白色固体，收率50％。
上述合成的dAppppVc的氢谱和磷谱如图1中(a)和(b)所示，表征如下：
1H NMR(600MHz,D2O)δ8.52(s,1H),8.26(s,1H),6.63–6.36(m,2H),4.61–4.55(m,1H),4.34–4.29(m,1H),4.29–4.23(m,1H),4.17(dd,J＝8.0,3.5Hz,1H),4.03(s,1H),3.73(ddd,J＝17.0,11.6,6.6Hz,1H),3.07(dt,J＝10.7,5.8Hz,1H),2.88(dd,J＝13.4,5.8Hz,1H),2.64–2.55(m,1H).
31P NMR(243MHz,D2O)δ-11.48(d,J＝11.7Hz),-13.50(d,J＝17.4Hz),-23.18(m).
HRMS:calculated for C16H23N5O20P4(M-H)-727.9814，found 727.9784.
利用本发明中合成的核苷酸探针dNppppVc检测DNA序列的原理为：dNppppVc在DNA聚合酶作用下分解为Vcppp和dNTPs，dNTPs参与到DNA序列的合成中，而释放出的Vcppp又在rSAP剪切作用下，产生Vc分子，与Luminol-H2O2-CoOOH化学发光体系发生反应，使CoOOH还原为Co2+,抑制H2O2转化为活化中间体从而抑制化学发光。理论上DNA链越长，消耗的核苷酸探针dNppppVc越多，产生的Vc分子就越多，对发光强度的抑制越强，由此可以对DNA链进行灵敏检测。化学反应方程式如下：
Figure BDA0002856424180000061
为了验证本发明提供的偶联抗坏血酸的核苷酸探针化合物dNppppVc的功能，本发明提供了如下实验数据。
实施例2本实施例验证利用探针化合物dNppppVc检测目标DNA的可行性
引物primer 1：5’-CATAATCTATATCTG-3’；
模板T20：3’-GTATTAGATATAGAC(T)20-5’。
取一定浓度的模板T20、primer 1混合，80℃5min，然后冷却至室温。在20μL的反应体系中加入100nM T20/primer 1混合物，2μM dAppppVc和0.25U/μL klenow fragmentexo-。然后，37℃温育90分钟。再加入0.5U的rSAP,37℃，10分钟。
泵A，H2O2,10-2mol/L,225μL/s；泵B,luminol,10-4mol/L,225μL/s。
实验结果如图2中(a)和(b)所示，通过实验数据可知，实验组加入T20/primer1的化学发光强度比没有加入模板链的对照组低1.9倍，由此证明，本发明中合成的探针化合物在DNA聚合酶和碱性磷酸酶共同作用下可以产生发光抑制化学物Vc,同时也可以证明该探针化合物可以对体系中的目标序列进行检测。
实施例3本实施例验证探针化合物dNppppVc是否为碱性磷酸酶的良好底物
本发明的探针化合物dNppppVc若要产生最后的发光抑制效果，必须得是碱性磷酸酶的不良底物，也就是说在其没有经DNA聚合酶酶切处理时，dNppppVc中的磷酸键不能被碱性磷酸酶识别。反之，碱性磷酸酶只能识别被DNA聚合酶处理后中间体Vcppp中的磷酸键，由此才能证明该探针化合物可以检测体系中的目标DNA序列。
基于此，本实施例设计了四组对照实验，来验证该化合物能否被碱性磷酸酶识别以及碱性磷酸酶在该体系中能否有良好的活性。
四个实验组分别为：
T20 control组：反应体系中不添加模板T20；
dATP-Vc control组：反应体系中不添加dAppppVc；
Vc-P组：反应体系中加入Vc-P；
Vc组：反应体系中加入Vc。
Vc-P和Vc均购自sigma公司。
各组反应体系中，除了控制物，其他成分按照实施例2中反应体系的组成进行相应调整。按照实施例2中的实验方法进行四个组的对照实验。
结果如图3中(a)和(b)所示，T20 control组的反应体系中虽然存在dAppppVc化合物，但是其发光强度和dATP-Vc control组不添加dAppppVc基本一样强，原因在于，T20control组中由于没有模板T20，DNA聚合酶没有活性，导致dAppppVc化合物不能被DNA聚合酶酶切处理。由此证明未经DNA聚合酶酶切处理的dAppppVc化合物不能被碱性磷酸酶识别。
Vc组和Vc-P组发光强度基本一样，是由于Vc-P在碱性磷酸酶的作用下释放出Vc，与Vc组具有同样量的光抑制物质。由此证明，该体系中碱性磷酸酶具有较强的活性。
实施例4采用本发明提供的探针化合物dAppppVc检测小片段HBV DNA序列
本实施例进行了四个组的对照实验，分别是：加入HBV模板/primer 2、不加primer2、不加HBV模板以及加入HBV-3’-错配模板/primer 2，旨在通过四组实验来测试该探针化合物检测目标DNA的特异性。
本实施例通过磁珠上修饰的链酶亲和素和引物链上修饰的生物素之间的特异性结合，将扩增后的模板链和引物链吸附出来，便于后续发光检测的进行。
首先，将0.5μM HBV模板/primer 2在NEB buffer 2中杂交，室温30分钟。将10μL(10mg/ml)的链霉亲和素标记的MBs用PBS缓冲液洗涤3次，然后在20μL的PBS缓冲液中再分散，加入到上述杂交液中。室温震荡1小时。磁铁吸附HBV/primer 2，用PBS缓冲液清洗两次，蒸馏水清洗三次。之后进行聚合酶扩增反应，在20μL的反应体系中加入6μM dATP-Vcp,1μMdTTP,1μM dGTP和0.5μM dCTP，0.25U/μL klenow fragment exo-以及1×NEB buffer 2，37℃温育90分钟。磁铁吸附分离磁珠，保留上清液，再加入0.5U的rSAP,37℃，10min。
取5μL反应液加入到3μL Tris-HCl(100mM)和2μL CoOOH(2.5×10-7g/m)中混合，室温反应5min。加入到384孔板中，酶标仪以225μL/s流速分别加入10μL luminol,10-4mol/L和H2O2,10-2mol/L，记录5min化学发光信号记录化学发光信号。
其他实验组按照上述反应体系，加入相应控制物，重复上述实验操作。
primer 2 5’-Biotin-AAAAAAAAAAAATAAATGTATACCC-3’；
HBV 5’-AATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTA-3’；
3’错配模板：5’-AATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATAAT-3’。
实验结果如图4中(a)和(b)所示，在不加primer 2、不加HBV模板以及加入3’错配模板的实验组中，发光数值基本相同，只有加入对应模板和引物的一组实验中，发光数值具有明显的减小。由此可知，该探针化合物可以实现体系中目标DNA序列的特异性检测。
实施例5本实施例对探针化合物dAppppVc检测DNA时发光强度与DNA浓度之间的关系进行实验研究
取不同浓度的HBV DNA序列：0.5pM,5pM,15pM,50pM,150pM,500pM,2.5nM,5nM)，分别与5nM primer 2在1μL NEB buffer 2中杂交，室温30min。将7.5μL(10mg/ml)的氨基改性MBs用PBS缓冲液洗涤3次，然后在20μL的PBS缓冲液中再分散，分别加入到上述杂交液中，室温震荡1h。磁铁吸附HBV模板/primer 2，用PBS缓冲液清洗两次，蒸馏水清洗三次。之后进行聚合酶扩增反应，在20μL的反应体系中加入60nM dAppppVc,10nM dTTP,10nM dGTP和5nMdCTP，0.25U/μL klenow fragment exo-以及1×NEB buffer 2，37℃温育90分钟。磁铁吸附分离磁珠，保留上清液，加入0.5U的rSAP,37℃，10min。
取5μL反应液加入到3μL Tris-HCl(100mM)和2μL CoOOH(2.5×10-7g/m)中混合，室温反应5min。加入到384孔板中，酶标仪以225μL/s流速分别加入10μL luminol,10-4mol/L和H2O2,10-2mol/L，记录5min化学发光信号记录化学发光信号。
实验结果如图5所示，在1pM-1000pM浓度范围内，发光强度与目标DNA序列之间具有良好的线性关系，证明，该探针化合物可以在一定的浓度范围内实现目标DNA的定量检测。
实施例6本发明提供的DNA检测方法的检测限
依据实施例5中得到的发光强度与目标DNA浓度之间的线性关系数据，计算检测限。检测限(LOD)的计算采用了以往的传统方法和典型方法。用3个平行试验对空白样品进行HBV CL测定，平均CL强度(yB)为18264a.u，标准偏差(SB)为66.46。计算LOD时，信噪比(k1)为3，可计算出最小的可检测信号为yL＝yB+k1SB＝18463.40，根据线性回归方程y＝-2099.88x-9288.4，计算出本发明提供的方法的检测限是22.46fM。
综上所述，本发明提供的dNppppVc核苷酸探针，能够应用于DNA片段的检测，并且，利用该探针化合物检测目标DNA，具有较高的特异性和灵敏度。由于该探针化合物无需使用荧光发光剂，避免了光污染和光毒性等问题。
本发明提供的探针化合物及其用途，为使用化学发光手段实现DNA片段检测奠定了理论和物质基础，具有广阔的应用前景。

Claims (5)

1.一种偶联抗坏血酸的核苷酸探针，其特征在于，具有如下结构式：
Figure FDA0003441638960000011
其中，R为
Figure FDA0003441638960000012
2.一种如权利要求1所述的偶联抗坏血酸的核苷酸探针的制备方法，其特征在于，包括：
(1)在反应容器中，依次加入无水DMF、三丁胺型dNTPs、N,N'-羰基二咪唑，室温搅拌反应5h；三丁胺型dNTPs、N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为1:4～6，无水DMF的量为1～2mL；
(2)加入50～100μL无水甲醇，猝灭反应，然后油泵抽真空除去该溶剂；
(3)反应器中依次加入无水DMF、Vc、无水氯化镁，Vc、无水氯化镁投入量的摩尔比为1～2:1；室温搅拌反应72h；纯化回收产物。
3.一种如权利要求1所述的偶联抗坏血酸的核苷酸探针的用途，其特征在于，该偶联抗坏血酸的核苷酸探针在DNA聚合酶和碱性磷酸酶的作用下，结合化学发光体系用于非治疗和诊断疾病目的的目标DNA检测。
4.一种非治疗和诊断疾病目的的DNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
反应体系中加入偶联抗坏血酸的核苷酸探针，代替相应的dNTPs参与扩增反应；所述反应体系中含有DNA模板、引物、DNA聚合酶及其他三种dNTPs；
扩增反应完成后，向反应体系中加入碱性磷酸酶；
取反应液，采用Luminol-H2O2-CoOOH化学发光体系进行发光检测。
5.根据权利要 求4所述的DNA检测方法，其特征在于，20μL反应体系中碱性磷酸酶的加入量为0.5U。
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