CN112534066A

CN112534066A - 诊断血液测试

Info

Publication number: CN112534066A
Application number: CN201880093537.3A
Authority: CN
Inventors: S·图姆普利斯; I·图姆普利斯
Original assignee: Er Niu Drug Therapy Co
Current assignee: Er Niu Drug Therapy Co
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2021-03-19
Also published as: JP2021530964A; WO2019219195A1; DK3794148T3; JP7437768B2; EP3794148B1; AU2018423766A1; PT3794148T; JP2024012341A; SI3794148T1; MX2020012161A; LT3794148T; RS63600B1; EP3794148A1; KR20210028149A; US20210102258A1; CA3100100A1; ES2931273T3; HUE059900T2

Abstract

本申请提供了一种用于测定受试者中细胞外基质(ECM)降解的体外方法，该方法包括测定从受试者分离的样品中选自由胶原V型α1链(COL5A1)、转化生长因子β‑1(TGFB1)、整合素亚基α4(ITGA4)、整合素亚基β1(ITGB1)、基质金属肽酶2(MMP2)、基质金属肽酶9(MMP9)和骨形态发生蛋白1(BMP1)组成的组中至少一种基因的表达产物水平，所述至少一种基因任选地与胶原XI型α1链(COL11A1)和胶原V型α2链(COL5A2)中的一者或两者组合测定，其中，当所述表达产物水平高于参考值时，这表明降解的ECM。还提供了用于诊断和预后癌症和动脉瘤的方法。此外，还提供了用于在上述诊断或预后方法中测定基因表达产物水平的试剂以及含有所述试剂的试剂盒。

Description

诊断血液测试

技术领域

本发明涉及诊断领域，特别是血液样品的诊断，更特别地用于通过检测细胞外基质的降解来诊断和预后癌症和动脉瘤。

背景技术

癌症代表常见的和日益增加的死亡原因。世界卫生组织估计，在接下来的20到30年期间，癌症将是世界范围内主要的死亡原因。对抗癌症死亡率增加的最有效的武器是早期诊断。如果在其早期阶段检测到，许多类型的癌症可以被有效地治疗。这种现实强调了需要开发一套简单、可靠和成本有效的分子标记物以用于检测癌发生初始阶段的癌症。有效对抗癌症的另一个重要策略是早期鉴定处于发生转移风险的患者，以便更频繁地对其进行随访，以及在该患者亚组中应用更积极的治疗干预。

最近的进展还突出了局部微环境或生态位的非细胞组分(特别是细胞外基质(ECM))在癌症进展期间的重要性。ECM是由支持细胞分泌的细胞外分子的混合物，其为周围细胞提供结构和生化支持。哺乳动物的ECM包括间隙基质和基底膜。间隙基质存在于各种哺乳动物细胞之间(即，在细胞间空间中)。多糖和纤维状蛋白的凝胶填充间隙空间，并用作压缩缓冲液对抗ECM上施加的拉伸应力。基底膜是ECM的片状沉积物，各种上皮细胞靠在其上。哺乳动物中的每种类型的结缔组织具有一种类型的ECM：胶原纤维和骨矿物质包含骨组织的ECM；网状纤维和基质包含疏松结缔组织的ECM；且血浆是血液的ECM。

尽管长期以来认为是在维持组织形态中起主要支持作用的稳定结构，ECM是驻留细胞环境的重要部分，其令人惊讶地是动态的和通用的，并且影响细胞生物学的基本方面。细胞粘附、细胞间通信和分化是ECM的常见功能。ECM功能的这种多效性方面取决于ECM的高度动态结构及其作为有效机制的重塑，由此可调节多种细胞行为。ECM生物学中的主要挑战是了解ECM在正常发育中的作用以及ECM动力学的破坏可如何导致疾病(如癌症)。

可能受ECM改变而高度影响的疾病的另一个示例是主动脉瘤。在主动脉瘤中，主动脉壁的ECM降解最初导致主动脉扩张，然后导致动脉瘤形成。

主动脉瘤代表重要的临床实体，其无症状地发展直到发生破裂或剥离。它是发达国家中重要的导致死亡的原因。主动脉瘤的破裂通常是第一症状，同时也是最后的症状，伴有死亡率为75％。据估计，由于普通人口的老龄化，在未来几年主动脉瘤的发病率将在世界范围内持续增加。导致动脉瘤形成的发病机理和分子机制正在研究中，并且目前还没有能够可靠地检测主动脉瘤的简单实验室测试。

鉴于上述流行病学数据，迫切需要提供用于癌症和主动脉瘤的早期诊断的简单且可靠的测试，以及用于有效随访患者以便早期鉴定处于发生转移或复发风险的患者的方法。此外，通常需要更好的策略来优化癌症和动脉瘤患者的治疗方案。

具体实施方式

本发明人惊讶地发现，通过测定外周血中某些基因的表达水平可准确地检测ECM的异常功能或降解。外周血中这些特定基因组的过表达揭示了促进ECM重塑的分子机制的活化水平，这与癌症和动脉瘤进展有关。

检测ECM降解或异常功能的指纹图包含表1所示基因。

表1.用于测定ECM降解的遗传指纹图。

名称	符号	NCBI参考序列
			胶原XI型α1链	COL11A1	NG_008033.1
胶原V型α2链	COL5A2	NG_011799.2
			胶原V型α1链	COL5A1	NG_008030.1
转化生长因子β-1	TGFB1	NG_013364.1
			整合素亚基α4	ITGA4	NG_050623.1
整合素亚基β1	ITGB1	NG_029012.1
			基质金属肽酶2	MMP2	NG_008989.1
基质金属肽酶9	MMP9	NG_011468.1
			骨形态发生蛋白1	BMP1	NG_029659.1

因此，本发明的第一方面提供了一种用于测定受试者的细胞外基质(ECM)降解的体外方法，该方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表1中所列基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，在表达产物水平高于参考值时，这表明紊乱/降解的ECM。

在本发明的意义上，表述“ECM的降解”也被理解为重建，导致紊乱的ECM或异常的ECM机械和动力学性质。

术语“诊断”是本领域技术人员已知的。如本文所用的“诊断”被理解为意识到特定的医学病症、并发症；确定病症的性质；或者将该病症与另一个病症区分开。它既指试图确定或鉴定可能病症的过程，也指该过程所达成的意见。在诊断程序的意义上，诊断可以被认为是将个体的病症分类成允许做出关于治疗和预后的医学决定的单独且不同类别的尝试。随后，通常根据病症来描述诊断意见。本文所用的“预后”是指预测疾病的可能进展和结果以及监测疾病进展。

在本发明中，术语基因的“表达产物”应被理解为包括mRNA产物、全长蛋白产物或其蛋白水解片段，这取决于所用的检测技术。因此，当测定“表达产物水平”时，它可以指mRNA的水平，或指编码的全长蛋白的水平或指其蛋白水解片段的水平。

在本发明的上下文中，术语“参考值”应被理解为样品或样品组中基因表达产物的预定水平。该值用作阈值以区分其中存在待分析病症的受试者与不存在这种病症的受试者。所述样品取自明确定义的对照受试者或不具有降解的ECM及其正常功能的对照受试者组，这也意味着所述对照受试者未患有与ECM的异常功能和/或降解相关的任何病症。本领域技术人员利用常识能够选择更适于获得参考值的受试者或受试者组。从所选受试者组中获得参考值的方法是本领域公知的。在本发明的一个实施方式中，参考值由未患有癌症或动脉瘤的受试者或受试者组确定。在特定实施方式中，参考值由健康受试者或健康受试者组确定。

在本发明的意义上，“高于参考值”表达应被理解为表达产物水平的任何增加，例如相对于参考值表达产物增加至少1.2倍或1.5倍。在特定的实施方式中，“高于参考值”应被理解为相对于参考值表达产物增加至少2倍。

在本发明方法的特定实施方式中，确定至少COL11A1和/或COL5A2的表达产物水平。在另一个特定实施方式中，该方法包括测定选自由COL5A1、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中至少一种基因的表达产物水平，任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或两者组合测定所述至少一种基因，其中，当所述表达产物水平高于参考值时，这表明ECM降解。在一个实施方式中，测定COL11A1和COL5A2两者的表达产物。

在一个实施方式中，通过测定表1中所公开的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种基因的表达产物水平进行ECM降解的检测。在一个特定的实施方式中，测定至少COL11A1、COL5A2和MMP2的表达产物。在其他特定实施方式中，测定至少以下基因的表达产物：COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、BMP4、MMP4、ITGB1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1和COL5A1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1、COL5A1和TGFB1。在另一个特定的实施方式中，测定九种基因的表达产物。

因此，本发明人已经发现上述基因组可以充分分析控制ECM重塑的分子机制。不希望受理论的束缚，本发明人假设次要原纤维形成胶原(胶原Vα-2、胶原Vα-1和胶原XIα-1)的表达和合成增加有助于主要原纤维形成胶原(胶原I和胶原III)的较小尺寸和直径的异型原纤维的形成。次要原纤维形成胶原能够通过其部分保留在最终蛋白质复合物中的大球状氨基末端结构域的空间位阻来抑制主要原纤维形成胶原的组装。此外，释放的大球状氨基末端结构域含有已充分表征的肝素结合结构域，其可与特定整合素受体相互作用，这反过来控制基质金属蛋白酶的表达和活性，所述基质金属蛋白酶负责ECM组分的降解。这种分子机制导致更薄、紊乱和降解的ECM，并因此对扩张和主动脉瘤形成以及癌症生长和转移更敏感。

本发明人进行的广泛研究也导致鉴定了可提供关于ECM降解的额外诊断信息的其他遗传标记物。这些基因列于表1bis中。因此，在本发明的一个特定的实施方式中，通过另外测定选自由表1bis中基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平进行ECM降解的检测。在一些实施方式中，通过测定选自表1bis中基因的至少一种基因以及表1中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物水平进行ECM降解的检测。

表1bis.用于测定ECM降解的遗传指纹图。

名称	符号	NCBI参考序列
			整合素亚基α3	ITGA3	NG_029107.2
整合素亚基α6	ITGA6	NG_008853.1
			基质金属肽酶的组织抑制剂1	TIMP1	NG_012533.1
胶原I型α1链	COL1A1	NG_007400.1
			胶原III型α1链	COL3A1	NG_007404.1
胶原I型α2链	COL1A2	NG_007405.1

从受试者分离的生物样品可以是任何组织或体液，如血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液或精液。然而，在本发明的一个优选实施方式中，生物样品是外周血。这是重要的，因为它大大加速和简化了检测方法，并且它是非侵入性的。确实令人惊奇的是，表1中所公开的基因组的差异表达可以在具有降解的ECM的受试者的外周血中发现。

在一个实施方式中，在本发明的上下文中确定的基因的表达产物是mRNA。在优选的实施方式中，定量所测试受试者的mRNA量并与参考值进行比较，所述参考值是对照受试者的相同mRNA量或对照受试者组的平均mRNA量。表2中公开了包含本发明指纹图的基因的已知mRNA序列，表2p中公开了相同基因的已知蛋白序列。注意到一些基因可能有几种转录物，例如COL11A1。然而，本发明的方法优选测定基因的所有可能的转录物，以便测定来自特定基因的所有转录的mRNA。

表2.表1和表1bis的基因的mRNA序列

表2p表1和表1bis的基因的蛋白序列

mRNA量的测定可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行，只要所述方法允许检测和定量生物样品中的mRNA。这些程序的示例包括PCR、实时定量PCR(QPCR)、多重PCR、NASBA、LCR、RT-PCR、RNA测序、阵列杂交或“Northern”转移或它们的组合。在上述大多数检测和定量RNA的方法中，在进行此程序之前，必须将RNA转换为互补DNA(cDNA)。这种转化通过本领域技术人员已知的技术(例如逆转录等)完成。

在本发明的一个特定实施方式中，通过逆转录，然后进行实时定量PCR来定量mRNA而测定基因表达产物的水平。对于该技术以及许多其他用于检测/定量基因表达的技术，需要使用扩增引物。在本发明的一个优选实施方式中，引物序列来源于表2中所公开的基因的转录物序列。在特定实施方式中，用于测定基因表达产物(即mRNA)水平的引物选自表3中所示的那些引物。通过逆转录，然后进行实时定量PCR来测定上述基因的mRNA水平将在以下示例中详细描述。

表3.用于测定表1和表1bis基因的mRNA的引物

本发明需要将基因表达产物的表达水平与参考值进行比较。如上所述，参考值是从对照受试者或对照受试者组获得的。技术人员可以使用任何可用的方法来建立所述比较。例如，作为相对定量的方法，可以采用Livak和Schmittgen的2^-ΔΔCt(Methods，2001第25卷，第4期，第402-408页)。

在另一个实施方式中，使用包括一种或多种探针的微阵列，所述探针对应于表2中所鉴定的一种或多种生物标记物。该方法导致在阵列表面上产生标记的靶标核酸的杂交模式。可以多种方式可视化或检测所得的标记核酸的杂交模式，其中，基于靶标核酸的特定标记选择特定的检测方式。代表性的检测方式包括闪烁计数、放射自显影、荧光测定、量热测定、发光测定、光散射等。

在其他实施方式中，在本发明的上下文中测定的基因的表达产物是由所述基因编码的全长蛋白或所述蛋白的片段。在本发明提供的方法的特定实施方式中，通过选自由免疫测试、生物发光、荧光、化学发光、电化学和质谱组成的组中的定量测试来测定蛋白标记物或其片段的水平。在一些实施方式中，待测定的蛋白是表2p中所示的那些蛋白。

在一个实施方式中，通过质谱法检测编码的蛋白或其片段的水平，例如通过鸟枪法液相色谱质谱法(LC-MS/MS)或多重反应监测(MRM)质谱法。

在一个可替代的实施方式中，通过免疫化学测定表达水平。

本文所用的术语“免疫化学”是指通过利用抗体特异性结合靶标蛋白的原理来检测样品中的抗原(在当前情况下为由上述基因编码的任何蛋白或其抗原片段)的多种技术。然后，可以多种方式实现抗体-抗原相互作用的可视化，通常通过将抗体缀合至可以催化产生颜色反应的酶(如过氧化物酶)或缀合至荧光团(如荧光素或罗丹明)。免疫化学技术可以是直接或间接的。

合适的免疫测定程序包括酶联免疫吸附测定(ELISA，如多重ELISA)、酶免疫斑点测定、凝集测定、抗体-抗原-抗体夹心测定、抗原-抗体-抗原夹心测定、免疫色谱或其他本领域技术人员公知的免疫测定形式(如放射免疫测定)以及蛋白质微阵列形式。在一个实施方式中，通过免疫测定来测定蛋白质的水平。在另一个实施方式中，通过ELISA测定蛋白质的表达水平。

术语“能够结合靶标蛋白的抗体或其片段”应被理解为在本发明的方面和实施方式中提及的能够选择性结合靶标蛋白的任何免疫球蛋白或其片段。它包括单克隆抗体和多克隆抗体。术语“其片段”包括具有适于结合靶标蛋白表位的大小和构象的抗体的任何部分。合适的片段包括F(ab)、F(ab')和Fv。“表位”是抗原被免疫系统(B细胞、T细胞或抗体)识别的部分。

本发明的另一方面涉及在如上定义的用于检测ECM降解的方法中用于测定选自由表1的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平的试剂(means)的用途。在一个特定的实施方式中，该试剂至少用于测定COL11A1和/或COL5A2的表达产物水平。在另一个特定的实施方式中，该试剂用于测定选自由COL5A1、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因(任选地与COL11A1和COL5A2之一或两者组合)的表达产物水平。优选地，该试剂用于COL11A1和COL5A2两者。在特定实施方式中，该试剂用于测定选自表1中所公开的基因的组的至少三种基因、至少四种基因、至少五种基因、至少六种基因、至少七种基因、至少八种或至少九种基因的表达产物水平。在其他特定的实施方式中，该试剂包括用于测定至少以下基因的表达产物水平的试剂：COL11A1、COL5A2和MMP2，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1和COL5A1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1、COL5A1和TGFB1。在另一个实施方式中，该试剂用于测定表1中所公开的所有基因的表达产物水平。在另一个实施方式中，该试剂用于测定表1bis中所公开的至少一种基因以及表1中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物水平。

在特定实施方式中，该试剂用于测定mRNA。在一个实施方式中，该试剂包含扩增引物。在特定实施方式中，引物在每种情况下是表3中所示的那些引物。

在其他实施方式中，该试剂是用于测定蛋白质或其片段的试剂。在特定实施方式中，该试剂是特异性结合靶标蛋白的抗体或其片段。

在另一个实施方式中，该试剂形成试剂盒的一部分。此外，本发明还提供了试剂盒的用途，所述试剂盒包含用于测定如上定义的表达产物水平的试剂以用于进行本文提供的任何方法。该试剂盒可包含所述试剂和它们用于在受试者内检测ECM降解的说明书。该说明书可包括关于用于测定ECM降解、这种降解的程度的阈值和/或参考值的信息。

本发明的另一方面提供了选自由表1的基因组成的组中至少一种基因的表达产物在检测受试者的ECM降解中的用途。在一些实施方式中，至少COL11A1和/或COL5A2是所选的生物标记物。在另一个实施方式中，选自由COL5A1、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因(任选地与COL11A1和COL5A2之一或二者组合)的表达产物作为检测受试者的ECM降解的体外生物标记物的用途。优选地，COL11A1和COL5A2两者均在所选的生物标记物中。

在一个实施方式中，用于检测受试者的ECM降解的生物标记物是表1中所公开的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种基因的表达产物。在特定实施方式中，选择至少COL11A1、COL5A2和MMP2。在其他特定的实施方式中，选择以下基因：COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、BMP4、MMP4、ITGB1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1和COL5A1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1、COL5A1和TGFB1。在另一个特定的实施方式中，选择了九种基因。在另一个实施方式中，用于检测受试者的ECM降解的生物标记物是表1bis中所公开的至少一种基因以及表1中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物。

已经发现ECM的降解与癌症相关，特别是与肿瘤的恶性发展和转移相关。还已经发现ECM的降解与动脉瘤的生长和破裂的风险密切相关。因此，本发明的另一个实施方式涉及如上定义的检测受试者的ECM降解的方法，其中，ECM的降解表明患者患有癌症、动脉瘤或癌症和动脉瘤两者。

癌症

如实施例1所示，本发明人非常惊奇地发现，当与参考值比较时，表1中所列的一些基因在癌症患者的外周血中显著上调，这使得可以快速和容易地诊断癌症。本发明人已经表明，可以以0.98的灵敏度(95％置信区间：0.89-1.00，P＜0.001)和1.00的特异性(95％置信区间：0.61-1.00，P＜0.001)区分患有非小细胞肺癌的患者和对照(无任何恶性肿瘤的受试者)。这些结果表明，本发明的方法可以以高特异性和灵敏度从外周血准确地诊断癌症。

用于诊断癌症的指纹图包含表4和表4bis所示的基因。

表4.用于诊断癌症的遗传指纹图。

名称	符号	NCBI参考序列
			胶原XI型α1链	COL11A1	NG_008033.1
胶原V型α2链	COL5A2	NG_011799.2
			胶原V型α1链	COL5A1	NG_008030.1
整合素亚基α4	ITGA4	NG_050623.1
			整合素亚基β1	ITGB1	NG_029012.1
基质金属肽酶2	MMP2	NG_008989.1
			基质金属肽酶9	MMP9	NG_011468.1
骨形态发生蛋白1	BMP1	NG_029659.1

表4bis.用于诊断癌症的遗传指纹图。

因此，本发明的另一方面涉及一种用于体外诊断受试者的癌症的方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表4中所列基因的组的至少一种基因的表达产物水平，其中在表达产物水平高于参考值时，这表明受试者患有癌症。

“参考值”和“高于参考值”如上所述理解。在本发明的与癌症相关的方面的优选实施方式中，参考值获自未患有任何癌症恶性肿瘤的受试者或受试者组。在本发明的与癌症相关的方面的优选实施方式中，“高于参照值”被理解为相对于参照值的每种基因表达产物的表达(过表达)水平增加以下倍数：

相对于COL11A1参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少2倍的过表达，

相对于COL5A1参考值至少2倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少5倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少7倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少2倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少1倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少2倍的过表达。

本发明人还已经发现，表4中所公开的基因的外周血中mRNA水平与癌症阶段之间存在直接相关性。

大多数类型的癌症都有4个阶段，从I到IV编号。I阶段通常意味着癌症的大小相对较小，并且含在其开始的器官中。II阶段通常意味着肿瘤大于I阶段，但癌症尚未开始扩散到周围组织中。有时II阶段意味着癌细胞已扩散到靠近肿瘤的淋巴结。这取决于特定的癌症类型。III阶段通常意味着癌症更大，其可能已经开始扩散到周围组织中，在该区域的淋巴结中存在癌细胞。IV阶段意味着癌症从其开始处扩散到另一远端组织或器官。

表4中基因的过表达与癌症阶段之间的相关性显示在实施例1中。尽管表4中的所有基因都是过表达的，当与参照组比较时，以mRNA水平来衡量，可以观察到基因的过表达在I阶段患有非小肺癌的患者中较低，虽然有统计学显著性，但在整个II、III和IV阶段稳定生长。本发明人已经证明，患有晚期转移性非小细胞肺癌(III和IV阶段)的患者可以以0.95的灵敏度(95％置信区间：0.78-0.99，P＜0.001)和0.96的特异性(95％置信区间：0.80-0.99，P＜0.001)与患有早期阶段非小细胞肺癌(I和II阶段)的患者区别诊断。

因此，本发明还涉及一种根据患者的癌症阶段对患者进行体外区别诊断的方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表4中所列基因的组的至少一种基因的表达产物水平。表达产物水平的增加与癌症阶段的增加相关。患有III阶段或IV阶段癌症的患者通常被称为患有晚期癌症的患者。特别是在表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少10倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A1参考值至少5倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少8倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少11倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少5倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少6倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达。

这表明该受试者患有III或IV阶段转移性癌症(晚期癌症)。

本发明的方法也用于患有晚期癌症的患者(III和IV阶段)和患有早期阶段癌症的患者(I和II阶段)的体外区别诊断，其中，在表达产物具有如上定义的水平时，这表明患者处于晚期癌症阶段，而在表达产物具有低于如上定义的阈值的水平时，这表明患者处于早期癌症阶段。

癌症的III和IV阶段也经常被认为意味着转移的高风险。在本发明的意义上，“转移”在本领域中通常被理解为癌细胞扩散到不同于原发癌部位的身体新区域(通常通过淋巴系统或血流)的过程。由已经扩散的细胞形成的肿瘤称为继发性肿瘤。癌症可能已经扩散到原发部位附近的区域(区域性转移)，或扩散到更远的身体部分(远端转移)。本发明的方法提供了一种用于鉴定处于发生转移的高风险或处于转移过程的早期阶段癌症患者的可靠测试。这对于癌症患者的临床管理是非常有利的，所述癌症患者可以根据其进展接受最合适的治疗，并且当转移风险高时，如果需要的话，可以进行严格的随访计划。

因此，本发明还提供了一种用于测定受试者内癌症转移风险的方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表4中所列基因的组的至少一种基因的表达产物水平。高水平的表达产物表明转移的高风险。特别是在表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少10倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A1参考值至少5倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少8倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少11倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少5倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少6倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达。

这表明受试者具有癌症转移的高风险。

根据上述所有内容，因此，通过使用本发明的方法，可以根据癌症患者的癌症阶段对癌症患者进行分类。因此，本发明的另一方面涉及一种根据癌症患者的癌症阶段对癌症患者进行分类的体外方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表4中所列基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与癌症阶段相关联。

本方法还可以提供关于已经治疗癌症并克服了该疾病的患者复发风险的早期信息。如本领域通常所理解的，“复发”是在暂时改善后某人的健康状态的恶化。这在临床方面是非常重要的，因为癌症患者中复发的早期检测和后续管理可以高度改善患有复发的患者的预后。

因此，本发明的另一方面涉及一种用于检测已经治疗癌症的受试者的复发的体外方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，在表达产物水平高于参考值时，这表明患者处于患有复发的高风险中。

因此，本发明的另一方面涉及一种用于癌症患者预后的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由表4中所列基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平。表达产物的高水平表明预后不良。特别是在表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少10倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A1参考值至少5倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少8倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少11倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少5倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少6倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达。

这表明预后不良。

本方法不限于特定类型的癌症。与ECM降解相关的癌症进展和扩散引起转移的总体机制在一定程度上对于几乎所有类型的癌症是普遍的。当与非小细胞肺癌患者对照比较时，在外周血中清楚地检测到在组织水平中发生的基因表达水平的变化，其灵敏度为98％，特异性为100％，当早期阶段(I和II阶段)肺癌患者与晚期转移阶段(III和IV阶段)患者比较时，其灵敏度为95％，特异性为96％。我们已经在患有乳腺癌诊断的女性患者中证实了类似的组织表达模式。因此，由于这些检测到的变化实际上反映了ECM中的变化，它们可以用于区分患有其他类型癌症的患者，特别是具有通过ECM降解转移的能力的那些患者。

在特定实施方式中，所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、小肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、肾癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、喉癌、口咽癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、阴道癌、尿道癌、睾丸癌、骨癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤等。在特定实施方式中，所述癌症是非小细胞肺癌或乳腺癌，例如非小细胞肺癌。

尽管提供了可靠的和早期的癌症诊断，包括根据患者疾病的进展和转移对患者进行分类，但是本诊断方法对临床医生是有用的，因为该方法使他/她能够做出最适当的决定来治疗患者。由于抗癌治疗方案可能高度依赖于癌症的阶段，特别是是否存在转移或转移的高风险，因此，临床医生可以根据如上所述进行的区分诊断来推荐最适当的(保守或积极的)抗癌疗法。

因此，另一方面，本发明涉及一种用于在受试者中推荐抗癌疗法的体外方法，所述方法包括：(a)通过如上定义的方法诊断所述受试者是否患有癌症或测定患有癌症的受试者的预后不良，并且(b)如果所述受试者被诊断患有癌症或癌症的预后不良，则推荐抗癌疗法。该方面也可以考虑作为用于治疗癌症患者的方法，所述方法包括(a)通过如上定义的方法诊断所述受试者是否患有癌症或测定患有癌症的受试者的预后不良，并且(b)如果所述受试者被诊断患有癌症或癌症的预后不良，则向患者给予抗癌疗法。如果患者未被诊断为患有癌症，临床医生可以推荐对受试者进行随访。

在一些实施方式中，所述方法用于当所述诊断表明受试者患有转移性癌症时，在受试者中推荐转移性癌症疗法。

抗癌疗法包括手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、靶向疗法和激素疗法。大多数癌症患者根据癌症类型和在诊断时其进展程度而采取组合治疗。优选地，抗癌治疗选自基于癌症类型和阶段、临床试验结果以及组织病理学发现的上述选项。治疗转移性癌症的治疗方案取决于原发癌症的类型、扩散部位、过去所用的治疗和患者的一般健康状况。在大多数情况下，治疗转移性癌症的治疗方案包含选自最积极形式的手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、靶向疗法和激素疗法的至少两种疗法的组合。尽管一些类型的转移性癌症可以用目前的治疗治愈，但大多数不能治愈。在大多数转移性癌症中，这些治疗的目标是停止或减缓癌症的生长或缓解症状(姑息疗法)，而在一些情况下，转移性癌症的治疗可以帮助延长生命。同样重要的是要提到，在大多数情况下，对转移性癌症的治疗干预包括具有显著副作用的化学疗法和/或放射疗法，其在治疗周期完成之前不能被相当数量的患者耐受，因此，突出的是即使在发生转移的情况下也需要早期诊断。

另外，根据本发明，可以监测接受特定治疗的癌症患者以便确保治疗干预的有效性或警告复发的早期或转移性疾病的发生。本方法允许方便的随访和改善的癌症患者管理，从而避免不必要的痛苦和/或使副作用最小化。成功的治疗干预将例如导致这些基因的表达水平接近对照，并且只要没有复发或转移性疾病，这种作用就应该保持。

因此，本发明的另一方面提供了一种用于测定癌症患者对抗癌疗法的反应的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，其中，所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段的降低表明良好的反应。

另一个方面可以定义为一种用于在癌症患者中推荐替代和/或补充疗法的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，其中，当所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段增加时，这表明推荐替代和/或补充疗法。这也可以配制成治疗对抗癌疗法无响应的癌症患者的方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，并且当所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段增加时，给予替代和/或补充疗法。有时，当所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段没有改变时，临床医生甚至可以推荐或给予替代和/或补充疗法。

在上述所有涉及癌症的方法中，优选地测定至少COL11A1和/或COL5A2的表达产物的水平。在特定实施方式中，该方法包括测定选自由COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中至少一种基因的表达产物水平，任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或两者组合测定所述至少一种基因，其中，当所述表达产物的水平高于参考值时，这表明受试者患有癌症。优选地，测定COL11A1和COL5A2两者的表达产物。在其他实施方式中，该方法包括测定表4中所公开的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因的表达产物水平。在一个特定的实施方式中，测定至少COL11A1、COL5A2和COL5A1的表达产物。在其他特定的实施方式中，测定至少以下基因的表达产物：COL11A1、COL5A2、COL5A1和MMP2，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1。在另一个特定的实施方式中，测定八种基因的表达产物。在本发明的其它实施方式中，另外测定选自表4bis中的基因的至少一种基因的表达产物水平。在一些实施方式中，涉及癌症的上述方法包括测定选自表4bis中基因的至少一种基因以及表4中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物水平。

如上已经公开的，从患者获得的生物样品可以是任何组织或体液，如血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液或精液，优选为外周血。基于外周血样品的诊断测试非常简单、侵入性较小并且对于普通人群的广泛应用是成本有效的。更具体地，进入三级诊疗中心受限的老年患者将能够利用简单且成本有效的血液测试来实现诊断和监测。在临床环境中，在治疗干预之后，在最初的两年中每六个月然后每年用计算机断层扫描监测癌症患者是公知的。类似地，本发明的诊断血液测试在治疗干预后具有可靠监测癌症患者的有希望的潜力。因为血液测试相对更简单、方便和成本有效，而没有串行计算机断层扫描所携带的辐射的不利影响，所以可以更频繁地使用。本发明的诊断测试可以每三个月使用一次，以便检测恶性肿瘤的早期复发，并且也在用计算机断层扫描来扫描患者之前，以这样的方式，如果它们显示与恶性肿瘤和转移性疾病相关的基因表达的低水平或正常水平，则当其对复发的潜在诊断的贡献可以被充分证明时，它们可能会决定将计算机断层扫描推迟到将来的某个时间点。

如上所述测定基因的表达产物水平。在一些实施方式中，表达产物是mRNA，并且优选地通过逆转录然后实时定量PCR来测定。扩增引物来源自表4和表4bis(如表2所示)中所公开的基因的转录物mRNA序列，并且用于扩增转录物序列的合适引物提供于表3中。在其他实施方式中，表达产物是编码的蛋白，并且如上所述通过质谱或免疫化学测定。

本发明的另一方面涉及在如上定义的与癌症相关的方法中用于测定选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平的试剂的用途。在一个特定的实施方式中，该试剂至少用于测定COL11A1和/或COL5A2的表达产物水平。在另一个特定的实施方式中，该试剂用于测定选自由COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因(任选地与COL11A1和COL5A2之一或两者组合)的表达产物水平。优选地，该试剂用于测定COL11A1和COL5A2两者。在特定实施方式中，该试剂用于测定选自表4中所公开的基因的组的至少三种基因、至少四种基因、至少五种基因、至少六种基因、至少七种基因或至少八种基因的表达产物水平。在其他特定的实施方式中，该试剂包括用于测定至少以下基因的表达产物水平的试剂：COL11A1、COL5A2和COL5A1，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1和MMP2，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1。在另一个实施方式中，该试剂用于测定表4中所公开的所有基因的表达产物水平。在另一个实施方式中，该试剂用于测定表4bis中所公开的至少一种基因以及表4中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物水平。

在特定实施方式中，该试剂用于测定mRNA。在一个实施方式中，该试剂包含扩增引物。在特定实施方式中，引物在每种情况下是表3中所示的那些引物。在其他实施方式中，该试剂用于测定蛋白质或其片段。在特定实施方式，中，该试剂是特异性结合靶标蛋白的抗体或其片段。

在另一个实施方式中，该试剂形成试剂盒的一部分。本发明的试剂盒可以包含所述用于测定表达产物水平的试剂和用于癌症诊断/预后/转移风险/根据如上定义阶段的分类的说明书。所述说明书可以包括关于测定癌症诊断/预后/转移风险/根据如上定义阶段的分类的阈值和/或参考值的信息。

另一方面，本发明还提供了选自由表4中所列基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外诊断受试者癌症中的用途。本发明还涉及所述生物标记物在根据癌症患者的癌症阶段对癌症患者进行体外区分诊断中的用途。一些实施方式涉及所述生物标记物在区分诊断III阶段或IV阶段患有癌症的癌症患者中的用途。其他实施方式涉及所述生物标记物在区分诊断患有晚期癌症(III和IV阶段)的患者和患有早期阶段癌症(I和II阶段)的患者中的用途。特定实施方式涉及所述生物标记物在诊断受试者癌症转移的高风险中的用途。另一方面提供了选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在诊断已经接受癌症治疗干预的患者的复发中的用途。

本发明的另一方面提供了选自由表4中所列基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在受试者癌症的体外预后中的用途。另一方面提供了选自由表4的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在向患有癌症的受试者推荐抗癌疗法中的用途。在一个实施方式中，该用途是用于向具有高转移风险的受试者推荐转移性癌症疗法。

另一个方面提供了选自由表4中所列基因组成的组中的一种基因的表达产物作为生物标记物在测定癌症患者对特定抗癌疗法的反应中的用途。

在上述方面的一些实施方式中，至少COL11A1和/或COL5A2是所选的生物标记物。另一个实施方式提供了选自由COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因(任选地与COL11A1和COL5A2之一或二者组合)的表达产物作为体外生物标记物的用途。优选地，COL11A1和COL5A2两者均在所选的生物标记物中。在其他实施方式中，所选的生物标记物是表4中所公开的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因的表达产物。在一个特定的实施方式中，选择至少COL11A1、COL5A2和COL5A1的表达产物。在其他特定的实施方式中，选择至少以下基因的表达产物：至少COL11A1、COL5A2、COL5A1和MMP2，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、COL5A1、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1。在另一个特定的实施方式中，选择了八种基因的表达产物。在其他实施方式中，该生物标记物是表4bis中所公开的至少一种基因以及表4中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物。

动脉瘤

还发现表1中所公开的一些基因的表达水平与动脉瘤密切相关。用于诊断动脉瘤的遗传指纹图包含表5和表5bis所示的基因。

如实施例2所示，本发明人非常惊讶地发现，当与参考值比较时，那些基因中的一些在患有胸主动脉瘤的患者的外周血中显著上调，这使得可以快速和容易地诊断这种病症。本发明人还已经表明，可以以0.95的灵敏度(95％置信区间：0.89-1.00，P＜0.001)和0.92的特异性(95％置信区间：0.78-1.00，P＜0.001)区分患有胸主动脉瘤的患者与对照(无胸主动脉瘤或癌症的受试者)。这些结果表明，本发明的方法可以从外周血样品准确地诊断动脉瘤。

表5.用于诊断动脉瘤的遗传指纹图。

名称	符号	参考
			胶原XI型α1链	COL11A1	NG_008033.1
胶原V型α2链	COL5A2	NG_011799.2
			转化生长因子β-1	TGFB1	NG_013364.1
整合素亚基α4	ITGA4	NG_050623.1
			整合素亚基β1	ITGB1	NG_029012.1
基质金属肽酶2	MMP2	NG_008989.1
			基质金属肽酶9	MMP9	NG_011468.1
骨形态发生蛋白1	BMP1	NG_029659.1

表5bis.用于诊断动脉瘤的遗传指纹图。

因此，本发明的另一方面涉及一种用于体外诊断受试者动脉瘤的方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表5中所公开基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，当表达产物水平高于参考值时，这表明受试者患有动脉瘤。

“参考值”和“高于参考值”如上所述理解。在本发明的与动脉瘤相关的方面的优选实施方式中，参考值获自未患有任何动脉瘤的受试者或受试者组。在本发明的与动脉瘤相关的方面的优选实施方式中，“高于参照值”被理解为相对于参照值的每种基因表达产物的表达(过表达)水平增加以下倍数：

相对于COL11A1参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少1.5倍的过表达，

相对于TGFB1参考值至少3倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少3倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少2.5倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少5倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少1.5倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少3倍的过表达。

此外，如实施例2的结果所示，本发明人已经发现表5所示基因的外周血中mRNA水平与胸主动脉瘤的大小之间存在直接相关性。

动脉瘤通常根据其大小和症状进行划分。通常将体内任何血管的动脉瘤定义为基于性别和年龄正常值，增加的外部血管直径大于健康个体正常直径的50％。成年人胸主动脉的正常直径为2-3cm。直径为4.5cm(与3cm相比增加50％)的胸主动脉被认为是主动脉瘤。据估计，当主动脉直径大于5cm时，胸主动脉瘤破裂或剥离的风险显著更高，并且在更大的直径中破裂的风险变得甚至更高。从临床的角度来看，直径在5cm到6cm之间的胸主动脉瘤应当被考虑进行干预。在较大的胸主动脉瘤(直径6-7cm)或甚至在非常大的胸主动脉瘤(直径＞7cm)中，对干预的需要分别被认为是紧迫的和紧急的。

表5中基因的过表达与主动脉瘤的大小之间的相关性显示在实施例2中。可以观察到，在具有较小主动脉瘤(即主动脉直径5-6cm与主动脉直径6-7cm与主动脉直径＞7cm)的患者中以mRNA表达水平衡量的基因的过表达较低，尽管具有统计学显著性。相反，在具有非常大的主动脉瘤(主动脉外径大于7cm)的患者中基因的过表达显著升高。本发明人已经证明，利用本发明的方法，具有相对较大的主动脉瘤(主动脉直径等于或大于6cm)的患者可以以0.95的灵敏度(95％置信区间：0.86-1.00，P＜0.001)和0.86的特异性(95％置信区间：0.71-1.00，P＜0.001)与具有相对较小的主动脉瘤(主动脉直径在4.5cm和6cm之间)的患者区别诊断。

因此，在本发明的方法的一个实施方式中是根据动脉瘤的大小来区分诊断患者，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表5中所列基因的组的至少一种基因的表达产物水平。表达产物水平的增加与动脉瘤大小的增加相关。在另一个实施方式中，该方法用于区分诊断患有较大动脉瘤的患者。在另一个实施方式中，该方法用于区分诊断具有较大动脉瘤的患者与具有较小动脉瘤的患者。特别是当表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少15倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于TGFB1参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少12倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少10倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少5倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达。

这表明患者具有较大动脉瘤，例如较大主动脉瘤(等于或大于6cm直径)。当表达产物水平高于参考值但低于这些阈值时，这表明患者的动脉瘤是相对较小的动脉瘤，特别是对于直径低于6cm的主动脉瘤。

动脉瘤(特别是较大直径的动脉瘤)被认为处于破裂的风险中。血管(如主动脉)的破裂导致大量内出血，并且除非立即治疗，否则可能发生休克和死亡。如果动脉瘤的大小达到特定直径(即，在升胸主动脉中直径大于5cm或在降胸主动脉中直径大于6cm)和/或其快速生长(每年大于0.5cm)，推荐手术以避免破裂。迄今为止，通过计算机断层扫描研究来进行最成本有效的筛选测试以确定患者是否具有处于破裂风险中的动脉瘤。本发明的方法构成了用于鉴定处于破裂风险中的患者的可靠、方便和更成本有效的测试。在简单的血液取样后，鉴于表5基因的表达模式，临床医生可以推荐适当的医学干预，如手术。另外，如果需要，可以对患者进行严格的随访。因此，本发明还涉及一种用于体外诊断受试者中动脉瘤破裂风险的方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表5基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平。表达产物的高水平表明破裂风险。特别是当表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少15倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于TGFB1参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少12倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少10倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少5倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达。

这表明动脉瘤破裂的高风险。

表5基因的过表达与动脉瘤的大小成正比。因此，通过使用本发明的方法，根据动脉瘤的大小或根据具有高破裂风险或低破裂风险可以对动脉瘤患者进行分类。因此，本发明的另一方面涉及一种根据动脉瘤的大小对动脉瘤患者进行分类的体外方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表5基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述水平与动脉瘤的大小和破裂风险相关。用于这种分类的合适阈值如上文所定义。

因此，本发明的另一方面涉及一种用于动脉瘤患者预后的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自表5基因的至少一种基因的表达产物水平，其中，所述表达产物水平与预后不良直接相关。因此，表达产物的高水平表明预后不良。特别地，当表达产物具有如上定义水平的破裂风险时，这表明预后不良。

本方法不限于特定类型的动脉瘤。与ECM降解相关的动脉瘤进展的总体机制对于所有动脉瘤是普遍的。在特定实施方式中，动脉瘤选自主动脉瘤，其可以是胸(升胸或弓或降胸主动脉瘤)或腹或胸腹主动脉瘤。其他在晚期阶段经历预后不良的动脉瘤疾病的血管是脑动脉血管、髂骨动脉和锁骨下动脉。在一个优选的实施方式中，所述动脉瘤是胸主动脉瘤。

尽管提供了可靠的和早期的动脉瘤诊断，包括根据患者疾病的进展和破裂风险对患者进行分类，但是本诊断方法对临床医生是有用的，因为该方法使他/她能够做出最适当的决定来治疗患者。由于治疗方案可能依赖于动脉瘤的大小，特别是是否存在破裂的危险，因此，临床医生可以根据如上所述进行的区分诊断来推荐最适当的疗法(包括手术干预)。在较小直径动脉瘤表现出本发明所提出的高水平的分子指标的情况下，即使在较小直径动脉瘤中也可以建议进行手术干预，考虑到以下事实，尽管很少见，但是存在易于破裂的较小动脉瘤，并且存在具有相对较小直径的破裂动脉瘤的偶发性病例。本发明的生物标记物总体上是关于动脉瘤破裂风险的预后的良好指标。因此，在偶发性病例中，较小动脉瘤可能导致所公开标记物的高水平表达产物，然而这将表明预后不良和高破裂风险，因此，为特定患者的临床管理提供非常有用的信息。

因此，另一方面，本发明涉及一种用于在受试者中推荐动脉瘤的治疗方案的体外方法，所述方法包括：(a)通过如上定义的方法诊断所述受试者是否患有动脉瘤或确定预后不良，并且(b)如果所述受试者被诊断患有动脉瘤或确定具有预后不良，则推荐动脉瘤的治疗方案。该方面也可以预期为用于治疗患有动脉瘤的患者的方法，其包括(a)通过如上定义的方法诊断所述受试者是否患有动脉瘤或确定预后不良，并且(b)如果所述方法表明受试者患有动脉瘤或预后不良，则向患者给予治疗动脉瘤的治疗方案。如果患者未被诊断为患有动脉瘤，临床医生可以推荐对受试者进行随访。

治疗动脉瘤的治疗方案包括通过合成移植物或血管内方法和支架移植手术替换动脉瘤以试图将血管的动脉瘤部分与血液循环隔离开。优选地，基于动脉瘤的解剖结构和位置(存在完全排除血管内途径可能性的某些解剖结构限制)以及患者的年龄和一般状况来选择治疗动脉瘤的方案。

在一些实施方式中，该方法用于在诊断表明存在血管破裂高风险的患者中推荐适当的治疗方案。通常，在这些情况下，适当的疗法是手术干预、开放式手术或以微创方法用支架移植物植入的血管内疗法。药理学干预的其他辅助治疗(但不是治疗性治疗)包括给予他汀类药物、β阻断剂和积极的抗高血压剂。

另外，根据本发明，可以监测接受特定治疗的动脉瘤患者以便确保治疗干预的有效性或警告早期患病血管破裂风险。本方法允许容易的随访和改善的动脉瘤患者的管理，从而避免不必要的痛苦和/或使副作用最小化。例如，成功的治疗干预将导致这些基因的表达水平接近对照。

因此，本发明的另一方面提供了一种用于测定患有动脉瘤的患者对动脉瘤治疗方案的反应的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由表5的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，其中，所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段的降低表明良好的反应。

另一个方面可以定义为一种用于在患有动脉瘤的患者中推荐替代和/或补充治疗方案的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由表5的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，其中，所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段增加表明需要替代和/或补充治疗方案。这也可以配制成用于治疗患有动脉瘤的患者的方法，所述患者不响应动脉瘤的治疗方案，尤其是在动脉瘤保留在体内的血管内途径的情况下，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自表5的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，并且当所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段增加时，给予替代和/或补充的动脉瘤治疗方案。有时，当所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段没有改变时，临床医生甚至可以推荐或给予替代和/或补充疗法。

本方法还可以提供关于已经治疗动脉瘤的患者复发风险的早期信息。成功的治疗干预将导致基因的表达水平接近对照。然而，一个已经患有主动脉瘤的患者仍然处于在天然主动脉的另一个部位患有另一个主动脉瘤的风险中。复发的早期检测和随后的管理可以高度改善患有动脉瘤的患者的预后。

因此，本发明的另一方面涉及一种用于检测已经治疗动脉瘤受试者的复发的体外方法，所述方法包括测定从受试者分离的样品中选自由表5的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，在表达产物水平高于参考值时，这表明受试者处于患有复发的高风险中。

在上述所有涉及动脉瘤方法中，优选地测定至少COL11A1和/或COL5A2的表达产物的水平。在特定实施方式中，该方法包含测定选自由TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中至少一种基因的表达产物水平，任选地与COL11A1和COL5A2之一或两者组合测定所述至少一种基因，其中，当所述表达产物的水平高于参考值时，这表明受试者患有动脉瘤。优选地，测定COL11A1和COL5A2两者的表达产物。在其他实施方式中，该方法包含测定表5中所公开的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因的表达产物水平。在一个特定实施方式中，测定至少COL11A1、COL5A2和MMP2的表达产物。在其他特定实施方式中，测定至少以下基因的表达产物：COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9，或至少COL11A1,COL5A2、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1和TGFB1。在另一个特定的实施方式中，测定八种基因的表达产物。在本发明的其它实施方式中，另外测定选自表5bis中的基因的至少一种基因的表达产物水平。在一些实施方式中，涉及动脉瘤的上述方法包含测定选自表5bis中基因的至少一种基因以及表5中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物水平。

如上已经公开的，从患者获得的生物样品可以是任何组织或体液，如血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液或精液。优选地，该样品是外周血。

在临床环境中，监测患有动脉瘤的患者(例如手术前每6个月用计算机断层扫描对主动脉瘤进行扫描(直到主动脉直径达到手术干预点)，并且在手术干预后的第一年每六个月和之后每年扫描一次)是公知的。类似地，本发明的诊断血液测试具有用于可靠地监测患有动脉瘤的患者的有希望的潜力，例如，在治疗干预之后的主动脉瘤(还包括血管内支架干预的情况)。在血管内干预的情况下，存在许多主动脉瘤的直径继续扩张的情况，尽管其与循环隔离开并且受到血压的影响，但仍导致破坏性的并发症(如支架迁移)。本发明的血液诊断测试也可能成为血管内手术并发症的良好预后指标。因为血液测试相对更方便和成本有效，而没有串行计算机断层扫描所携带的辐射的不利影响，所以可以更频繁地使用。本发明的血液诊断测试可以每三个月使用一次，以便检测主动脉直径的早期变化，并且也在用计算机断层扫描来扫描患者之前，使得如果它们显示与主动脉瘤扩张相关的基因表达的低水平或正常水平，则当其对较大的主动脉瘤的潜在诊断的贡献可以被充分证明时，它们可能会决定将计算机断层扫描推迟到将来的某个时间点。

如上述测定基因的表达产物水平。在一些实施方式中，表达产物是mRNA，并且优选地通过逆转录然后实时定量PCR来测定。扩增引物来源自表5和表5bis(如表2所示)中所公开的基因的转录物mRNA序列，并且用于扩增转录物序列的合适引物提供于表3中。在其他实施方式中，表达产物是编码的蛋白，并且如上所述通过质谱或免疫化学测定。

本发明的另一方面涉及在如上定义的动脉瘤相关的方法中用于测定选自由表5的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物水平的试剂的用途。在一个特定实施方式中，该试剂至少用于测定COL11A1和/或COL5A2的表达产物水平。在另一个特定的实施方式中，该试剂用于测定选自由TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因(任选地与COL11A1和COL5A2之一或两者组合)的表达产物水平。优选地，该试剂用于测定COL11A1和COL5A2两者。在特定实施方式中，该试剂用于测定选自表5中所公开的基因的组的至少三种基因、至少四种基因、至少五种基因、至少六种基因、至少七种基因或至少八种基因的表达产物水平。在一个特定的实施方式中，选择至少COL11A1、COL5A2和MMP2的表达产物。在其他特定的实施方式中，选择至少以下基因的表达产物：COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1和TGFB1。在另一个实施方式中，该试剂用于测定表5中所公开的所有基因的表达产物水平。在另一个实施方式中，该试剂用于测定表5bis中所公开的至少一种基因以及表5中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物水平。

在特定实施方式中，该试剂用于测定mRNA。在一个实施方式中，该试剂包含扩增引物。在特定实施方式中，引物在每种情况下是表3中所示的那些引物。在另一个实施方式中，该试剂形成试剂盒的一部分。本发明的试剂盒可以包含所述用于测定表达产物水平的试剂和用于动脉瘤诊断/预后/破裂风险/根据如上定义大小分类的说明书。所述说明书可以包括关于测定动脉瘤诊断/预后/破裂风险/根据如上定义大小分类的阈值和/或参考值的信息。

另一方面，本发明还提供了选自由表5的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外诊断受试者动脉瘤中的用途。在一些实施方式中，所述生物标记物用于根据患者动脉瘤的大小来区分诊断患者。在其他实施方式中，所述生物标记物用于区分诊断患有较大动脉瘤的患者，例如在主动脉瘤的情况下，具有大于6cm的大小。在另一个实施方式中，该方法用于诊断患有动脉瘤的患者处于破裂的风险中。在另一个实施方式中，该方法用于区分诊断患有较大动脉瘤的患者和患有较小或中等大小的动脉瘤的患者，例如对于主动脉瘤区分诊断患有直径大于6cm的动脉瘤的患者和患有直径小于6cm的动脉瘤的患者。

本发明的另一方面提供了选自由表5的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在患有动脉瘤患者的体外预后中的用途。本发明的另一方面提供了选自由表5的基因组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在测定患有动脉瘤的患者对动脉瘤的治疗方案的反应中的用途。

在上述方面的一些实施方式中，至少COL11A1和/或COL5A2是所选的生物标记物。另一个实施方式提供了选自由TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因(任选地与COL11A1和COL5A2之一或二者组合)的表达产物作为体外生物标记物的用途。优选地，COL11A1和COL5A2两者均在所选的生物标记物中。在其他实施方式中，所选的生物标记物是表5中所公开的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种基因的表达产物。在一个特定的实施方式中，选择至少COL11A1、COL5A2和MMP2的表达产物。在其他特定的实施方式中，选择至少以下基因的表达产物：COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9和BMP1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1和ITGA4，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4和ITGB1，或至少COL11A1、COL5A2、MMP2、MMP9、BMP1、ITGA4、ITGB1和TGFB1。在另一个特定的实施方式中，选择了八种基因的表达产物。在其他实施方式中，该生物标记物是表5bis中所公开的至少一种基因以及表5中所公开的至少一种基因或如上定义的其任意组合的表达产物。

本发明的体外方法提供了诊断预后和/或对治疗(监测)信息的反应。在一个实施方式中，本发明的方法进一步包括步骤(i)收集诊断、预后和/或对治疗(监测)信息的反应，和(ii)将信息保存在数据载体中。

在本发明的意义上，“数据载体”应被理解为任何手段(例如纸)，其含有用于诊断和/或预后受试者的ECM降解、癌症或动脉瘤的有意义的信息数据。这样的手段可以被认为是载体。该载体也可以是能够携带预后数据的任何实体或设备。例如，该载体可以包含存储介质，如ROM(例如CD ROM或半导体ROM)，或磁记录介质，例如软盘或硬盘。此外，该载体可以是可传输的载体，如电或光信号，其可以经由电缆或光缆或通过无线电或其他手段来传送。当诊断/预后/对治疗数据的反应体现在可以直接通过电缆或其他设备或装置传送的信号中时，改载体可以由这样的电缆或其他设备或装置构成。其他载体与USB设备和计算机档案相关。合适的数据载体的示例是纸、CD、USB、PC中的计算机档案或具有相同信息的声音记录。

最后，本发明的另一方面提供了一种用于执行如上述方面中定义的诊断、预后和/或对治疗的反应的方法中的任一种的算法。在本发明的意义上，术语“算法”也与用于正确分类个体样品的数据的集合或决策图、预测因子和组合同义。

根据本发明的方面和实施方式，ECM降解、癌症或动脉瘤的诊断、预后和/或对治疗的反应可以使用数学算法进行，该数学算法结合或独立于其他临床参数评估包含一种或多种如上定义的生物标记物的生物分子、蛋白、蛋白片段、抗体和/或mRNA的可检测水平，以将个体样品正确分类为源自健康患者、具有降解的ECM、癌症(包括特定的癌症阶段和转移风险)或动脉瘤(包括动脉瘤的大小和破裂风险)的患者。

分类算法可以简单到确定所测量的特定生物标记物或生物标记物子集的量是高于还是低于特定阈值(参考值)。当使用多个生物标记物时，分类算法可以是线性回归公式。可替代地，分类算法可以是多种学习算法中的任一种的乘积。在复杂分类算法的情况下，可能需要使用计算机(例如可编程数字计算机)对数据执行算法，从而确定分类。在任一情况下，然后可以在有形介质上记录状态，例如以计算机可读格式(如内存驱动器或磁盘)或仅简单打印在纸上。结果也可以在计算机屏幕上报告。该算法用作诊断和/或预后方法，并且其特别地为用于实施在前述方面中所公开的方法的试剂盒的一部分。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和该词语的变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包含”包括“由……组成”的情况。除非另有说明，否则本申请中在此所用的所有术语都应以本领域已知的普通含义来理解。本申请中所用的某些术语的其他更具体的定义如上所述，并且旨在统一地应用于整个说明书和权利要求书，除非另有明确列出的定义提供了更广泛的定义。

本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员来说在阅读了说明书之后将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践而获知。以下实施例和附图是作为说明提供的，它们并非旨在限制本发明。此外，本发明包括本文所述的特定和优选实施方式的所有可能组合。

附图说明

图1癌症患者中的实时定量RT-PCR反应。图A至F显示胶原XIα-1、胶原Vα-2、胶原Vα-1、胶原Iα-1、胶原Iα-2和胶原IIIα-1的实时定量扩增曲线。

图2癌症患者中的实时定量RT-PCR反应。图A至D显示整合素受体α-4、整合素受体β-1、整合素受体α-3和整合素受体α-6的实时定量扩增曲线。

图3癌症患者中的实时定量RT-PCR反应。图A至F显示基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1和β-肌动蛋白的实时定量扩增曲线。

图4动脉瘤患者的实时定量RT-PCR反应。图A至F显示胶原XIα-1、胶原Vα-2、胶原Vα-1、胶原Iα-1、胶原Iα-2和胶原IIIα-1的实时定量扩增曲线。

图5动脉瘤患者的实时定量RT-PCR反应。图A至D显示整合素受体亚基α-4、整合素受体亚基β-1、整合素受体亚基α-3和整合素受体亚基α-6的实时定量扩增曲线。

图6动脉瘤患者的实时定量RT-PCR反应。图A至F显示基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1和β-肌动蛋白的实时定量扩增曲线。

实施例

实施例1.癌症患者的表达模式

方法：如通过计算机断层扫描所证实的，从来自患有非小细胞肺癌的患者(总共46名患者：13名患者I阶段，11名患者II阶段，13名患者III阶段和9名患者IV阶段)和来自无任何恶性肿瘤的患者(对照，n＝6)的外周血样中提取总RNA。

通过柱内重组DNA酶处理除去DNA。将总RNA洗脱在无RNA酶的水中，并保存在-80℃下直到进一步使用。通过Quant-iT RNA测定试剂盒在Qubit 1.0荧光计(Invitrogen/Thermo Fisher，美国)中测定RNA浓度，其采用对RNA而不是DNA特异的染料。所有RNA数量充足。

根据RT2 First Strand试剂盒(Qiagen，德国)在热循环仪Primus 25(MWG-Biotech，德国)中由1μg总RNA和随机六聚体在20μL总体积中合成cDNA。该RT2 FirstStrand试剂盒包括专有基因组DNA消除步骤以在反转录前除去RNA样品中的任何残留污染，从而消除假阳性信号。也使用RNA阴性对照(空白)。通过Quant-iT DNA测定试剂盒在qubit1.0荧光计(Invitrogen/Thermo Fisher，USA)中测定cDNA浓度，其采用对DNA而不是对RNA特异的染料。然后将cDNA样品保存在-20℃下直到进行实时定量PCR分析。

为了研究COL11A1(所有变体)、COL5A2、COL5A1(所有变体)、TGFB1、ITGA4(所有变体)、ITGB1(所有变体)、MMP2(所有变体)、MMP9、BMP1(所有变体)、ITGA3、ITGA6(所有变体)、TIMP1、COL1A1、COL3A1和COL1A2的mRNA表达水平，通过使用合适的RT2 qPCR引物测定法(Qiagen，德国)和RT2 SYBR Green Mastermix(Qiagen，德国)在总体积为20μL中在Rotor-Gene Q MDX(Qiagen，德国)实时热循环仪中验证实时RT-qPCR测定法。测定每种基因的所有转录产物(变体)。引物是上述表3中公开的那些。使用β-肌动蛋白作为参考基因。为了进行扩增，遵循制造商的说明书。

通过在2％w/v琼脂糖凝胶上电泳并且通过熔点分析检查所有产物的大小和纯度。在每次运行中，每次扩增每个cDNA样品的一种基因。同样对于我们的实验室内部质量控制，选择随机cDNA样品以包括在所有运行中。所研究基因的鉴定如下：

1.COL11A1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为胶原XIα-1

基因编号：1301

位置：1p21.1

外显子计数：71

2.COL5A2[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为胶原Vα-2

基因编号：1290

位置：2q32.2

外显子计数：55

3.COL5A1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为胶原Vα-1

基因编号：1289

位置：9q34.3

外显子计数：68

4.COL3A1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为胶原IIIα-1

基因编号：1281

位置：2q32.2

外显子计数：51

5.COL1A1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为胶原Iα-1

基因编号：1277

位置：17q21.33

外显子计数：51

6.COL1A2[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为胶原Iα-2

基因编号：1278

位置：7q21.3

外显子计数：52

7.ITGA3[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为整合素受体亚基α-3

基因编号：3675

位置：17q21.33

外显子计数：26

8.ITGA4[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为整合素受体亚基α-4

基因编号：3676

位置：2q31.3

外显子计数：29

9.ITGA6[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为整合素受体亚基α-6

基因编号：3655

位置：2q31.1

外显子计数：28

10.ITGB1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为整合素受体亚基β-1

基因编号：3688

位置：10p11.22

外显子计数：18

11.MMP2[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为整合素受体亚基β-1基质金属肽酶2

基因编号：4313

位置：16q12.2

外显子计数：17

12.MMP9[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为基质金属肽酶9

基因编号：4318

位置：20q13.12

外显子计数：13

13.TIMP1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为TIMP金属肽酶抑制剂1

基因编号：7076

位置：Xp11.3

外显子计数：6

14.BMP1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为骨形态发生蛋白1

基因编号：649

位置：8p21.3

外显子计数：25

15.TGFB1[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为转化生长因子β1

基因编号：7040

位置：19q13.2

外显子计数：7

16.ACTB[智人(homo sapiens，人类)]，本文也称为肌动蛋白β

基因编号：60

位置：7p22.1

外显子计数：6

ACTB基因的NCBI参考序列是NG_007992.1(其转录物是NG_007992.1)

为了制备β-肌动蛋白基因测定的校准物(标准品)，将几种PCR产物联合，然后通过PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen/Thermo Fisher)纯化，接着通过Quant-iT dsDNA宽范围测定试剂盒在qubit 1.0荧光计(Invitrogen/Thermo Fisher，美国)中测量浓度。拷贝数/μL如前所述计算(Kroupis C.等人,Clin Biochem.2005,vol.38,issue 1,p.50-57)。连续稀释高度浓缩的校准物，并获得两种基因的标准曲线。作为相对定量的方法，使用Livak和Schmittgen(同上)的2^-ΔΔCt(RQ＝2-^ΔΔCt，其中RQ是mRNA表达)。

统计方法以95％置信区间计算基因组合的qRT-PCR的灵敏度和特异性。灵敏度/特异性结果被测量为在患有非小细胞肺癌的患者组中上调的转录生物标记物(n＝46，灵敏度)和在对照患者中下调的转录生物标记物(n＝6，特异性)。另外，灵敏度/特异性结果被测量为在患有晚期转移阶段的非小细胞肺癌的患者亚组内上调的转录生物标记物(n＝22，处于III和IV阶段的患者-灵敏度)和在患有早期阶段非小细胞肺癌的患者亚组内下调的(或与对照相比上调程度较低)转录生物标记物(n＝24，处于I和II阶段的患者-特异性)。P值由Fisher精确检验给出，这些检验比较了所比较的亚组之间的比例。

结果：

图1示出了来自患有非小细胞肺癌的患者中的各种类型的胶原的代表性实时RT-PCR曲线。清楚地表明，与对照相比，在患有非小细胞肺癌的患者中XIα-1、Vα-2和Vα-1型胶原的mRNA表达水平更高。还表明这些次要原纤维形成胶原的表达水平在非小细胞肺癌的晚期和转移阶段(III和IV阶段)中甚至更过度表达。表6示出了相对于参考组(非癌症患者)的倍数变化表达模式。

表6.相对于参考组(非癌症患者)在患有非小细胞肺癌的患者中各种类型胶原的倍数变化表达模式

图2示出了来自患有非小细胞肺癌的患者中的各种类型的整合素受体的代表性实时RT-PCR曲线。清楚地表明，与对照相比，在患有非小细胞肺癌的患者中整合素受体α-4、β-1、α-3和α-6的mRNA表达水平更高。值得注意的是，这些整合素受体的表达水平在II阶段更高且在非小细胞肺癌的晚期和转移阶段(III和IV阶段)中甚至更过度表达。表7示出了相对于参考组(非癌症患者)的倍数变化表达模式。

表7.相对于参考组(非癌症患者)在患有非小细胞肺癌的患者中各种类型整合素受体的倍数变化表达模式

图3示出了来自患有非小细胞肺癌的患者中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1和参考基因β-肌动蛋白的代表性实时RT-PCR曲线。清楚地表明，与对照相比，在患有非小细胞肺癌的患者中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1的mRNA表达水平更高。还表明这些正在控制ECM重塑的mRNA的表达水平在非小细胞肺癌的晚期和转移阶段(III和IV阶段)中甚至更过度表达。在对照和不同阶段的非小细胞肺癌患者中，β-肌动蛋白的表达水平没有变化。表8示出了相对于参考组(非癌症患者)的倍数变化表达模式。

表8.相对于参考组(非癌症患者)在患有非小细胞肺癌的患者中各种类型基质金属蛋白酶、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1和参考基因β-肌动蛋白的倍数变化表达模式

在琼脂糖电泳凝胶中测试RT-PCR反应的所有产物。所有扩增产物均由预期分子量位置的单个产物表示。进一步的DNA测序分析证实了扩增的PCR产物的预期序列。

总之，发现胶原XIα-1、胶原Vα-2、胶原Vα-1、整合素受体α-4、整合素受体β-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和骨形态发生蛋白-1基因的表达模式提供了外周血中癌症(在这种情况下特别是非小细胞肺癌)的可靠诊断信息。这些基因的过表达与癌症阶段之间也存在相关性。如上所述，这组基因可以充分分析控制ECM重塑/降解的新分子机制。更具体地，通过使用这8个核心基因，可以以0.98的灵敏度(95％置信区间：0.89-1.00，P＜0.001)和1.00的特异性(95％置信区间：0.61-1.00，P＜0.001)区分患有非小细胞肺癌的患者和对照。最后，8种基因的表达模式可以0.95的灵敏度(95％置信区间：0.78-0.99，P＜0.001)和0.96的特异性(95％置信区间：0.80-0.99，P＜0.001)区分患有晚期转移性非小细胞肺癌(III和IV阶段)的患者和患有早期阶段非小细胞肺癌(I和II阶段)的患者。

该组基因不仅在区分对照和癌症患者以及区分早期阶段癌症患者和晚期转移患者方面显示出高灵敏度和特异性，而且除此之外，可以定量早期和转移阶段。更具体地，由于其可以从表6-8和图1-3中得出，因此可以提供基因表达水平的倍数变化以用于早期和转移阶段之间的定量目的(表9)。

表9.基于相对于对照的外周血中基因表达水平(mRNA)的倍数变化，定量患有非小细胞肺癌的患者的早期和晚期阶段(转移阶段)。

基因	癌症早期阶段	癌症晚期阶段(转移阶段)
			胶原XIα-1	>5倍变化	>10倍变化
胶原Vα-2	>2倍变化	>5倍变化
			胶原Vα-1	>2倍变化	>5倍变化
基质金属蛋白酶-2	>5倍变化	>8倍变化
			基质金属蛋白酶-9	>7倍变化	>11倍变化
骨形态发生蛋白-1	>2倍变化	>5倍变化
			整合素受体α-4	>1倍变化	>6倍变化
整合素受体β-1	>2倍变化	>8倍变化

该组基因反映了ECM重塑，ECM重塑在患者的监测和随访中是必需的，尤其是在治疗干预之后。成功的治疗干预将导致这些基因的表达水平接近对照。在上述实验测量中，如详细描述的，发现次要原纤维形成胶原的水平以及参与无癌症患者中ECM降解的基因水平(通过计算机断层扫描证实)在外周血中以显著较低的水平表达。尽管上述实验在患有非小细胞肺癌的患者中进行，但我们在患有乳腺癌诊断的女性患者中已经证实了类似的表达模式。因此，由于这些检测到的变化实际上反映了ECM中的变化，它们可潜在地用于区分患有其他类型癌症的患者，特别是具有通过ECM降解转移的能力的患者。

实施例2.动脉瘤患者的表达模式

方法：如通过计算机断层扫描所证实的，从来自患有胸主动脉瘤(即升胸主动脉)的患者(总共42名患者：21名患有主动脉直径在5cm和6cm之间的胸主动脉瘤的患者，13名患有主动脉直径在6cm和7cm之间的胸主动脉瘤的患者和8名患有主动脉直径大于7cm的胸主动脉瘤的患者)和来自无主动脉瘤的患者(对照，n＝13)的外周血样品提取总RNA。

该方法与实施例1中的方法相同。

结果：

图4显示了来自对照和患有小(主动脉直径为5-6cm)、中(主动脉直径为6-7cm)和大尺寸胸主动脉瘤(主动脉直径＞7cm)的患者中各种类型胶原的代表性实时RT-PCR曲线。清楚地表明，与对照相比，在患有胸主动脉瘤的患者中XIα-1、Vα-2和Vα-1型胶原的mRNA表达水平更高。还表明这些次要原纤维形成胶原的表达水平在大尺寸的胸主动脉瘤(主动脉直径＞7cm)中甚至更过度表达。表10显示了相对于参考组(具有正常胸主动脉直径的患者，其直径范围在2.5cm和3.0cm之间)的倍数变化表达模式。

表10.相对于参考组(具有正常胸主动脉直径的患者)在患有胸主动脉瘤的患者中各种类型胶原的倍数变化表达模式

图5显示了来自患有胸主动脉瘤的患者中的各种类型的整合素受体的代表性实时RT-PCR曲线。清楚地表明，与对照相比，在患有胸主动脉瘤的患者中整合素受体亚基α-4、β-1、α-3和α-6的mRNA表达水平更高。值得注意的是，这些整合素亚基受体的表达水平增加显示在相对小尺寸的动脉瘤(主动脉直径为5-6cm)中，并且在较大尺寸的胸主动脉瘤(主动脉直径为6-7cm和＞7cm)中甚至更过度表达。表11显示了相对于参考组(具有正常胸主动脉直径的患者)的倍数变化表达模式。

表11.相对于参考组(具有正常胸主动脉直径的患者)在患有胸主动脉瘤的患者中各种类型整合素受体的倍数变化表达模式

图6显示了来自患有胸主动脉瘤的患者中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1和参考基因β-肌动蛋白的代表性实时RT-PCR曲线。这表明与对照相比，在患有胸主动脉瘤的患者中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1的mRNA表达水平更高。还表明这些正在控制ECM重塑的mRNA的表达水平在直径较大的胸主动脉瘤中甚至更过度表达。在对照和不同尺寸胸主动脉瘤的患者中，β-肌动蛋白的表达水平没有变化。表12显示了相对于参考组(具有正常胸主动脉直径的患者)的倍数变化表达模式。

表12.相对于参考组(具有正常胸主动脉直径的患者)在患有胸主动脉瘤的患者中各种类型基质金属蛋白酶、骨形态发生蛋白-1、转化生长因子β-1和参考基因β-肌动蛋白的倍数变化表达模式

总之，发现胶原XIα-1、胶原Vα-2、整合素受体α-4、整合素受体β-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、转化生长因子β-1和骨形态发生蛋白-1基因的表达模式提供了外周血中动脉瘤(在这种情况下特别是胸主动脉瘤)的可靠诊断信息。这些基因的过表达与动脉瘤尺寸之间也存在相关性。这组基因可以充分分析控制ECM重塑的提出的新分子机制。更具体地，通过使用这些基因(所有这些基因在患有胸主动脉瘤的患者中都显著上调，并且较大直径的胸主动脉瘤显著上调)，可以以0.95的灵敏度(95％置信区间：0.89-1.00，P＜0.001)和0.92的特异性(95％置信区间：0.78-1.00，P＜0.001)区分胸主动脉瘤患者和对照。最后，通过使用这些基因，可以以0.95的灵敏度(95％置信区间：0.86-1.00，P＜0.001)和0.86的特异性(95％置信区间：0.71-1.00，P＜0.001)区分具有较大主动脉瘤(直径大于6cm)的患者和具有较小主动脉瘤(直径在5cm和6cm之间)的患者。

该组基因不仅在区分对照与患有胸主动脉瘤的患者以及区分患有相对小尺寸的主动脉瘤的患者与患有相对较大尺寸的胸主动脉瘤的患者方面显示出高灵敏度和特异性，而且除此之外，与对照相比，可以在小尺寸(主动脉直径为5-6cm)与较大尺寸的胸主动脉瘤(主动脉直径＞6cm)之间进行定量。更具体地，由于其可以从表10-12和图4-6中得出，因此可以提供基因表达水平的倍数变化以用于小尺寸和较大尺寸的胸主动脉瘤之间的定量目的(表13)。

表13.基于相对于对照的外周血中基因表达水平(mRNA)的倍数变化，定量小尺寸和较大尺寸的胸主动脉瘤。

基因	动脉瘤5-6cm	动脉瘤≥6cm
			胶原XIα-1	>5倍变化	>15倍变化
胶原Vα-2	>1.5倍变化	>5倍变化
			基质金属蛋白酶-2	>3倍变化	>10倍变化
基质金属蛋白酶-9	>2.5倍变化	>12倍变化
			骨形态发生蛋白-1	>5倍变化	>10倍变化
整合素受体α-4	>1.5倍变化	>5倍变化
			整合素受体β-1	>3倍变化	>8倍变化
转化生长因子β-1	>3倍变化	>10倍变化

该组所选基因反映了ECM重塑/降解，ECM重塑在患者的监测和随访中是必需的，尤其是在治疗干预之前和之后。一个已经患有主动脉瘤的患者仍然处于在主动脉的另一个部位患有另一个主动脉瘤的风险中。成功的治疗干预将导致这些基因的表达水平接近对照。在实验测量中，发现次要原纤维形成胶原的水平以及参与无动脉瘤患者中ECM降解的基因水平(通过计算机断层扫描证实)在外周血中以显著较低的水平表达。尽管上述结果获自患有胸主动脉瘤的患者，但是在患有腹或胸腹主动脉瘤的患者中可以检测到类似的表达模式。因此，上述基因的差异表达可潜在地用于区分患有其它类型动脉瘤的患者。

最后，非常重要的是，在我们的临床系列中，已经通过其他大的临床数据集证实，被诊断患有胸主动脉瘤的患者中约有19％曾有过经治疗的恶性肿瘤病史，所述恶性肿瘤通常包括以下恶性肿瘤之一：男性患者中的非小细胞肺癌、结肠癌和前列腺癌，以及女性患者中的非小细胞癌、结肠癌和乳腺癌。相反，在被诊断为恶性肿瘤的患者中，也在计算机断层扫描中检测到以约24％百分比存在的主动脉瘤(主要是胸主动脉瘤)。恶性肿瘤与主动脉瘤的共存表明这些疾病确实具有共同的ECM重塑分子机制，反之亦然，因为在两种情况下，它们的进展(主动脉增大或转移性疾病)都是基于ECM的组成和生理/生物学性质的改变。

引文列表

非专利文献：

Livak and Schmittgen,“Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method”.Methods,2001,卷25,第4期,第402-8页

Kroupis C.et al,“Development and applications of a real-timequantitative RT-PCR method(QRT-PCR)for BRCA1 mRNA”.Clin Biochem,2005,卷38,第1期,第50-57页。

序列表

<110> I·图姆普利斯

<120> 诊断血液测试

<130> P4048PC00

<160> 32

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL1A1正向引物

<400> 1

ctctgactgg aagagtggag agta 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL1A1反向引物

<400> 2

ttggtggttt tgtattcaat cact 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL1A2正向引物

<400> 3

catcccagcc aagaactggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL1A2反向引物

<400> 4

actgggccaa tgtccacaaa 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL3A1正向引物

<400> 5

agtgaccgac aaaattccag ttat 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL3A1反向引物

<400> 6

cttttactgg tgagcacagt catt 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL5A1正向引物

<400> 7

ttcaagcgtg ggaaactgct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL5A1反向引物

<400> 8

gggagaagcc ttcactgtcc 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL5A2正向引物

<400> 9

tgagttgtgg agctgactct aatc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL5A2反向引物

<400> 10

taacagaagc atagcacctt tcag 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL11A1正向引物

<400> 11

gaaattgtac cttggtgcca ccaac 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COL11A1反向引物

<400> 12

ggatggatga gaatgagcac catat 25

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA3正向引物

<400> 13

acaaggatga ctgtgagcgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA3反向引物

<400> 14

ctgcctacct gcatcgtgta 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA4正向引物

<400> 15

gtctttgtca ctaaaatgtt cccca 25

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA4反向引物

<400> 16

cagcaagagc ggacctga 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA6正向引物

<400> 17

gttgggaggg tggttcaaca 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA6反向引物

<400> 18

cgaatcccat tgctttggca c 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGB1正向引物

<400> 19

atcagacgcg cagaggagg 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGB1反向引物

<400> 20

tgctgttcct ttgctacggt 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP2正向引物

<400> 21

cgcatctggg gctttaaaca t 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP2反向引物

<400> 22

ctgtctgggg cagtccaaag 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP9正向引物

<400> 23

ttcagggaga cgcccatttc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP9反向引物

<400> 24

tcgctggtac aggtcgagta 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TIMP1正向引物

<400> 25

cttctggcat cctgttgttg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TIMP1反向引物

<400> 26

ggtataaggt ggtctggttg 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP1正向引物

<400> 27

ccatgacaac aagcacgact g 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP1反向引物

<400> 28

gccacaatga cccactcaca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TGFB1正向引物

<400> 29

gagcctgagg ccgactacta 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TGFB1反向引物

<400> 30

gggttcaggt accgcttctc 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACTB正向引物

<400> 31

agcattgctt tcgtgtaaat tatg 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACTB反向引物

<400> 32

gtgtgcactt ttattcaact ggtc 24

Claims

1.一种用于测定受试者中细胞外基质(ECM)降解的体外方法，所述方法包括：测定从所述受试者分离的样品中选自由胶原V型α1链(COL5A1)、转化生长因子β-1(TGFB1)、整合素亚基α4(ITGA4)、整合素亚基β1(ITGB1)、基质金属肽酶2(MMP2)、基质金属肽酶9(MMP9)和骨形态发生蛋白1(BMP1)组成的组中至少一种基因的表达产物水平，所述至少一种基因任选地与胶原XI型α1链(COL11A1)和胶原V型α2链(COL5A2)中的一者或两者组合测定，其中，当所述表达产物水平高于参考值时，这表明降解的ECM。

2.选自由COL5A1、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为体外生物标记物在检测受试者的ECM降解中的用途，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或二者组合。

3.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中，测定至少三种基因、至少四种基因、至少五种基因、至少六种基因、至少七种基因、至少八种基因或至少九种基因的表达水平。

4.根据权利要求3所述的方法或用途，其中，选择COL11A1和COL5A2与选自由COL5A1、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因组合。

5.根据权利要求4所述的方法或用途，其中，选择COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9。

6.根据权利要求5所述的方法或用途，其中，另外选择BMP1和ITGA4。

7.根据权利要求6所述的方法或用途，其中，另外选择COL5A1、TGFB1和ITGB1。

8.根据权利要求1或3-7中任一项所述的方法或根据权利要求2或3-7中任一项所述的用途，其中，另外选择选自由整合素亚基α3(ITGA3)、整合素亚基α6(ITGA6)、基质金属肽酶的组织抑制剂1(TIMP1)、胶原I型α1链(COL1A1)、胶原III型α1链(COL3A1)和胶原I型α2链(COL1A2)组成的组中的至少一种基因的表达产物。

9.根据权利要求1或3-8中任一项所述的方法或根据权利要求2或3-8中任一项所述的用途，其中，所述ECM降解表明所述患者患有癌症、动脉瘤、或癌症和动脉瘤两者。

10.一种用于诊断受试者癌症的体外方法，所述方法包括测定从所述受试者分离的样品中选自由COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中至少一种基因的表达产物水平，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或两者组合测定，其中，当所述表达产物水平高于参考值时，这表明所述受试者患有癌症。

11.一种用于测定受试者的癌症转移风险的体外方法，所述方法包括测定从所述受试者分离的样品中选自由COL11A1、COL5A2、COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，当所述表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少10倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A1参考值至少5倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少8倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少11倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少5倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少6倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达，

这表明所述受试者具有癌症转移的高风险。

12.一种用于预后癌症患者的体外方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中选自由COL11A1、COL5A2、COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，当所述表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少10倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于COL5A1参考值至少5倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少8倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少11倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少5倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少6倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达，

这表明预后不良。

13.一种用于在受试者中推荐抗癌疗法的体外方法，所述方法包括：

(a)通过根据权利要求10-11中任一项所定义的方法诊断所述受试者是否患有癌症或通过根据权利要求12所定义的方法确定患有癌症的所述受试者的预后不良，并且

(b)如果所述受试者被诊断为患有癌症或癌症预后不良，则推荐抗癌疗法。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述受试者具有高转移风险，并且推荐的疗法是针对转移性癌症。

15.一种用于测定癌症患者对抗癌疗法的反应的体外方法，所述方法包括测定从患者分离的样品中选自由COL11A1、COL5A2、COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，其中，所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段的降低表明良好的反应。

16.根据权利要求10-15中任一项所述的方法，其中，测定至少COL11A1或COL5A2。

17.选自由COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外诊断受试者癌症中的用途，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或二者组合。

18.根据权利要求17所述的用途，其用于测定癌症转移的风险。

19.选自由COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在向患有癌症的受试者推荐抗癌疗法中的用途，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或二者组合。

20.根据权利要求19所述的用途，其用于向具有高转移风险的受试者推荐转移性癌症的疗法。

21.选自由COL11A1、COL5A2、COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外预后受试者癌症中的用途。

22.选自由COL11A1、COL5A2、COL5A1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的基因的表达产物作为生物标记物在测定癌症患者对抗癌疗法的反应中的用途。

23.根据权利要求21-22中任一项所述的用途，其中，选择至少COL11A1或COL5A2。

24.根据权利要求10-16中任一项所述的方法或根据权利要求17-23中任一项所述的用途，其中，选择至少COL11A1和COL5A2。

25.根据权利要求10-16或24中任一项所述的方法或根据权利要求17-24中任一项所述的用途，其中，选择至少三种基因、至少四种基因、至少五种基因、至少六种基因、至少七种基因或至少八种基因。

26.根据权利要求25所述的方法或用途，其中，选择至少COL11A1、COL5A2、COL5A1和MMP2。

27.根据权利要求26所述的方法或用途，其中，另外选择MMP9和BMP1。

28.根据权利要求27所述的方法或用途，其中，另外选择ITGA4和ITGB1。

29.根据权利要求10-16或24-28中任一项所述的方法或根据权利要求17-28中任一项所述的用途，其中，另外选择选自由TGFB1、ITGA3、ITGA6、TIMP1、COL1A1、COL3A1和COL1A2组成的组中的至少一种基因的表达产物。

30.根据权利要求7-16或24-29中任一项所述的方法或根据权利要求17-29中任一项所述的用途，其中，所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、小肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、肾癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、喉癌、口咽癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、阴道癌、尿道癌、睾丸癌、骨癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤。

31.根据权利要求30所述的方法或用途，其中，所述癌症是非小细胞肺癌或乳腺癌。

32.根据权利要求13-16或24-30中任一项所述的方法或根据权利要求19、20、22或23-30中任一项所述的用途，其中，所述抗癌疗法选自手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法及其组合。

33.根据权利要求32所述的方法或用途，其中，所述转移风险高且所述疗法是选自手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、靶向疗法和激素疗法的至少两种疗法的组合。

34.一种用于诊断受试者的动脉瘤的体外方法，所述方法包括测定从所述受试者分离的样品中选自由TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中至少一种基因的表达产物水平，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或两者组合测定，其中，当所述表达产物水平高于参考值时，这表明所述受试者患有动脉瘤。

35.一种用于诊断受试者的动脉瘤破裂风险的体外方法，所述方法包括测定从所述受试者分离的样品中选自由COL11A1、COL5A2、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，当所述表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少15倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于TGFB1参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少12倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少10倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少5倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达，

这表明所述动脉瘤破裂的高风险。

36.一种用于预后患者动脉瘤的体外方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中选自由COL11A1、COL5A2、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，其中，当所述表达产物具有以下水平时：

相对于COL11A1参考值至少15倍的过表达，

相对于COL5A2参考值至少5倍的过表达，

相对于TGFB1参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP2参考值至少10倍的过表达，

相对于MMP9参考值至少12倍的过表达，

相对于BMP1参考值至少10倍的过表达，

相对于ITGA4参考值至少5倍的过表达，或者

相对于ITGB1参考值至少8倍的过表达，

这表明预后不良。

37.一种用于在受试者中推荐动脉瘤的治疗方案的体外方法，所述方法包括：

(a)通过根据权利要求34-35中任一项所定义的方法诊断所述受试者是否患有动脉瘤或通过根据权利要求36所定义的方法确定患有动脉瘤的所述受试者的预后不良，并且

(b)如果所述受试者被诊断为患有动脉瘤，则推荐动脉瘤的治疗方案。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，当所述受试者被诊断为患有动脉瘤破裂的高风险时，推荐适用于高破裂风险的动脉瘤的治疗方案。

39.一种用于测定患有动脉瘤的患者对动脉瘤治疗方案的反应的体外方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中选自由COL11A1、COL5A2、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物水平，并将所述表达产物水平与在所述疗法开始之前或在所述疗法的较早阶段针对相同患者所确定的相同基因的表达产物水平进行比较，其中，所述基因的表达产物相对于疗法开始或所述疗法的较早阶段的降低表明良好的反应。

40.根据权利要求34-39中任一项所述的方法，其中，测定至少COL11A1或COL5A2的表达。

41.选自由TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外诊断受试者动脉瘤中的用途，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或二者组合。

42.选自由COL11A1、COL5A2、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外诊断动脉瘤破裂的风险中的用途。

43.选自由COL11A1、COL5A2、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在体外预后受试者动脉瘤中的用途。

44.选自由TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的至少一种基因的表达产物作为生物标记物在向患有动脉瘤的受试者推荐治疗方案中的用途，所述至少一种基因任选地与COL11A1和COL5A2中的一者或二者组合。

45.根据权利要求44所述的用途，其用于向患有高破裂风险动脉瘤的受试者推荐适用于高破裂风险的动脉瘤的治疗方案。

46.选自由COL11A1、COL5A2、TGFB1、ITGA4、ITGB1、MMP2、MMP9和BMP1组成的组中的基因的表达产物作为生物标记物在测定患有动脉瘤的患者对动脉瘤治疗方案的反应中的用途。

47.根据权利要求41-46中任一项所述的用途，其中，选择至少COL11A1或COL5A2。

48.根据权利要求34-40中任一项所述的方法或根据权利要求41-47中任一项所述的用途，其中，选择至少COL11A1和COL5A2。

49.根据权利要求34-40或48中任一项所述的方法或根据权利要求41-48中任一项所述的用途，其中，选择至少三种基因、至少四种基因、至少五种基因、至少六种基因、至少七种基因或至少八种基因。

50.根据权利要求49所述的方法或用途，其中，选择至少COL11A1、COL5A2、MMP2和MMP9。

51.根据权利要求50所述的方法或用途，其中，另外选择BMP1和ITGA4。

52.根据权利要求51所述的方法或用途，其中，另外选择ITGB1和TGA4。

53.根据权利要求34-40或48-52中任一项所述的方法或根据权利要求41-52中任一项所述的用途，其中，另外选择选自由COL5A1、ITGA3、ITGA6、TIMP1、COL1A1、COL3A1和COL1A2组成的组中的至少一种基因的表达产物。

54.根据权利要求34-40或48-53中任一项所述的方法或根据权利要求41-53中任一项所述的用途，其中，所述动脉瘤选自主动脉瘤、脑动脉血管的动脉瘤、髂骨动脉的动脉瘤和锁骨下动脉的动脉瘤。

55.根据权利要求54所述的方法或用途，其中，所述动脉瘤是主动脉瘤，优选是胸主动脉瘤。

56.根据权利要求37-40或48-54中任一项所述的方法或根据权利要求41-54中任一项所述的用途，其中，所述动脉瘤的治疗方案选自开放手术、支架植入术的血管内修复、给予他汀类药物、给予β阻断剂和给予抗高血压剂。

57.根据权利要求1、3-16、24-40或48-56中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是外周血。

58.根据权利要求1、3-16、24-40或48-57中任一项所述的方法或根据权利要求2-9、17-33或41-57中任一项所述的用途，其中，所述表达产物是mRNA。

59.根据权利要求1、3-16、24-40或48-58中任一项所述的方法，其中，定量测定mRNA。

60.根据权利要求59所述的方法，其中，通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定mRNA。

61.根据权利要求1、3-16、24-40或48-57中任一项所述的方法或根据权利要求2-9、17-33或41-57中任一项所述的用途，其中，所述表达产物是蛋白质。

62.一种试剂在根据权利要求1、3-16、24-40或48-61中任一项所定义的方法中用于测定表达产物水平的用途。

63.根据权利要求62所述的试剂用途，其中，所述表达产物是mRNA，并且对于每个所选的基因，所述试剂是表3的引物。

64.根据权利要求62所述的试剂用途，其中，所述表达产物是蛋白质。

65.根据权利要求62-64中任一项所述的试剂用途，其中，所述试剂形成试剂盒的一部分。