CN112533639A - 掩蔽的抗体的药物配制品 - Google Patents

Abstract

本披露涉及包含掩蔽的抗原结合蛋白质的低pH药物组合物和/或配制品。

Description

掩蔽的抗体的药物配制品

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月31日提交的美国临时申请号62/712,906的权益，将其通过引用特此并入。

技术领域

本披露涉及包含掩蔽的抗原结合蛋白质的低pH药物组合物和/或配制品。

通过引用并入的材料的交叉引用

通过引用以其整体并入与本文同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，并且标识如下：名称为“52811_Seqlisting.txt”的ASCII(文本)文件，创建于2018年7月30日，大小为12,007字节。

背景技术

基于蛋白质的药物是临床(前)开发和商业产品中增长最快的治疗剂之一。与小化学药物相比，蛋白质药物在相对低的浓度下具有高特异性和活性，并且典型地提供对高影响疾病的治疗，这些高影响疾病是例如各种癌症、自身免疫疾病和代谢障碍(Roberts,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2014年7月；32(7):372-80,Wang,Int J Pharm.[国际药学杂志]1999年8月20日；185(2):129-88)。

由于商业规模纯化方法的进步，现在可以在制造时以高纯度获得基于蛋白质的药物，例如重组蛋白质和抗体。然而，重组蛋白质(包括抗体)仅临界稳定(marginallystable)并且极易受到化学和物理降解二者的影响。化学降解是指涉及共价键的修饰，例如脱酰胺化、氧化、裂解或形成新的二硫桥键、水解、异构化或去糖基化。物理降解包括蛋白质去折叠、对表面的不希望的吸附和聚集。处理这些物理和化学不稳定性是蛋白质药物开发中最具挑战性的任务之一(Chi等人,Pharm Res[药物研究],第20卷，第9期,2003年9月,第1325-1336页,Roberts,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2014年7月；32(7):372-80)。

蛋白质聚集代表蛋白质和抗体物理不稳定性的主要事件，并且其发生通常归因于使溶剂和疏水蛋白质残基之间的热力学上不利的相互作用最小化的固有倾向。这是特别成问题的，因为在生产、重折叠、纯化、灭菌、运输和储存过程中经常遇到。即使在蛋白质或抗体天然状态在热力学上高度有利(例如，中性pH和37℃)并且没有应激的溶液条件下也会发生聚集(Chi等人,Pharm Res[药物研究],第20卷，第9期,2003年9月,第1325-1336页,Roberts,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2014年7月；32(7):372-80,Wang,Int JPharm.[国际药学杂志]1999年8月20日；185(2):129-88,Mahler J Pharm Sci.[药物科学杂志]2009年9月；98(9):2909-34)。

抗体聚集是成问题的，因为它会损害生物活性。此外，抗体的聚集导致不希望的药物产品外观，并且由于从终产物中除去聚集体所需的复杂的纯化步骤而降低了产物产率。最近，人们还越来越关注聚集的抗体(甚至是人源化或全人源抗体)可以显著增加患者对活性抗体/蛋白质单体产生免疫应答的风险，导致形成中和抗体和抗药性，或其他不良副作用(Mahler J Pharm Sci.[药物科学杂志]2009年9月；98(9):2909-34)。

总的来说，已经报道了通过多种机制使蛋白质聚集最小化的若干努力。通过修饰蛋白质(包括抗体)的一级结构，还可以稳定蛋白质(包括抗体)并且因此防止聚集体形成和其他化学变化，从而增加内部疏水性并且降低外部疏水性。然而，蛋白质或抗体的基因工程化可能导致功能受损和/或免疫原性增加。另一种方法集中于聚集体的解离(称为“解聚”)，以通过使用多种机制例如温度、压力、pH和盐来恢复功能性天然单体。目前，蛋白质和抗体聚集体主要在下游加工的精制步骤中作为杂质被除去。然而，在高水平的高分子量(HMW)抗体种类的情况下，除去大量的HMW不仅导致显著的产率损失，而且对设计稳健的下游加工提出了挑战(Chi等人,Pharm Res[药物研究],第20卷，第9期,2003年9月,第1325-1336页)。

在生物学和生物技术应用中保持蛋白质稳定性和活性面临严重挑战。本领域存在对优化的药物组合物的需求，该药物组合物提供抗体或治疗性蛋白质的增强的稳定性并减少在配制、填充、运输、储存和施用期间的聚集和变性或降解，从而防止功能丧失和不良免疫原性反应。

发明内容

本披露提供了用于最小化或减少掩蔽的抗原结合蛋白质的聚集和/或高分子量种类的药物组合物和/或配制品。在一些实施例中，本披露提供了一种药物组合物或配制品，该药物组合物或配制品包含：(A)掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如Probody或ProTIA前药)，该掩蔽的抗原结合蛋白质包含：(i)与抗原结合的抗体或其抗原结合片段(AB1)；和(ii)与AB1偶联的掩蔽结构域(MD1)，其中该掩蔽结构域包含：(a)抑制或降低AB1与该抗原的结合的掩蔽肽或掩蔽多肽(MP1)；和(b)蛋白质识别位点(PR1)，其中蛋白质与该PR1的结合或或蛋白酶对该PR1的切割增加AB1与该抗原的结合；(B)至少一种缓冲剂；和(C)至少一种多元醇，其中该药物组合物或配制品的pH低于该掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1和MD1区的等电点(pI)。

在一些其他实施例中，本披露还提供了一种药物组合物或配制品，该药物组合物或配制品包含：(A)掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如Probody或ProTIA前药)，该掩蔽的抗原结合蛋白质包含：(i)与抗原结合的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)；和(ii)与AB1偶联的第一掩蔽结构域(MD1)，其中该掩蔽结构域包含：(a)抑制或降低AB1与该抗原的结合的掩蔽肽或掩蔽多肽(MP1)；和(b)蛋白质识别位点(PR1)，其中蛋白质与该PR1的结合或或蛋白酶对该PR1的切割增加AB1与该抗原的结合；(iii)与第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)；和(vi)与AB2偶联的第二掩蔽结构域(MD2)，其中该第二掩蔽结构域包含：(a)抑制或降低AB2与该抗原的结合的掩蔽肽或掩蔽多肽(MP2)；和(b)第二蛋白质识别位点(PR2)，其中蛋白质与该PR2的结合或或蛋白酶对该PR2的切割增加AB2与该第二抗原的结合；(B)至少一种缓冲剂；和(C)至少一种多元醇，其中该药物组合物或配制品的pH低于该掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1、AB2、MD1和MD2区的等电点(pI)。

在一些方面，该掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如Probody或ProTIA前药)的AB1和/或AB2区是scFv或Fab，和/或结合在细胞(包括，例如CD3)表面上表达的抗原。

本披露的药物组合物或配制品包含至少一种缓冲剂。在一些实施例中，该缓冲剂选自下组，该组由以下组成：乙酸盐、谷氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、组氨酸、磷酸盐和2-(N-吗啉代)乙磺酸盐或其组合。在一些实施例中，该至少一种缓冲剂在组合物或配制品中以从约5mM至约200mM(例如5mM至200mM)或约10mM至约50mM(例如10mM至50mM)的浓度范围存在。

本披露的药物组合物或配制品还包含至少一种多元醇。在一些实施例中，该多元醇是糖。在一些实施例中，该糖选自下组，该组由以下组成：单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链型葡聚糖(linear branched dextran)和线性非支链型葡聚糖(linear non-branched dextran)或其组合。在一些实施例中，该多元醇是糖醇(例如山梨糖醇)。在一些实施例中，该多元醇是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、甘油、环糊精或磺丁基环糊精(captisol)。在一些实施例中，该至少一种多元醇在组合物或配制品中以从约1％(w/V)至约20％(w/V)(或约9％(w/V)至约12％(w/V))的浓度范围存在。

在一些情况下，本披露的药物组合物或配制品可任选地进一步包含至少一种表面活性剂。在一些实施例中，该表面活性剂选自下组，该组由以下组成：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克(pluronic)F68、曲拉通(triton)X-100、聚氧乙烯3和PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000或其组合。在一些实施例中，该至少一种表面活性剂在组合物中以从0.004％(w/V)至约0.5％(w/V)(或约0.001％(w/V)至约0.01％(w/V))的浓度范围存在。

在一些实施例中，该组合物或配制品的pH大于3.5，和/或该pH比掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如Probody或ProTIA前药)的AB1、AB2、MD1和/或MD2区(下文进一步描述)的pI低约2个pH单位。在一些实施例中，该组合物或配制品的pH在7.0和3.6之间。在一些实施例中，该组合物或配制品的pH范围是从约3.5至约5.5或范围是从4.0至5.0。在一些实施例中，该组合物或配制品的pH是约4.2或约3.6。在一些实施例中，该组合物或配制品的pH是4.2或3.6。

本披露的药物组合物或配制品可任选地进一步包含氨基酸赋形剂。在一些实施例中，该氨基酸赋形剂以从约0.1％(mM)至约20％(mM)的浓度范围存在。

在一些实施例中，本披露的药物组合物或配制品包含10mM谷氨酸盐、9％(w/V)蔗糖和0.01％(w/V)聚山梨醇酯80，并且其中液体药物组合物的pH是4.2或3.6。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质在组合物中以从约0.1mg/mL至约17mg/mL，或从约0.1mg/mL至约30mg/mL的浓度范围存在。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质在组合物中以从约50μg至约200mg的量范围存在。

本披露的药物组合物可以是冻干组合物或液体组合物。在一些实施例中，该药物组合物是重构的冻干组合物。

在一些实施例中，该药物组合物是液体组合物，该液体组合物在2℃-8℃、4℃和/或25℃储存0周、1周、2周和/或4周后是稳定的。在一些实施例中，与参考药物组合物(其由1mg/ml掩蔽的抗原结合蛋白质、100mM甘氨酸(pH 4.9)组成)相比，如通过超高效液相色谱(SE-UHPLC)测量的，该药物组合物或配制品的抗体聚集和/或高分子量抗体种类减少约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。

在另一个方面，本文描述了治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本披露的组合物或配制品。

除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”，并允许存在一个或多个特征或组分)。应理解，虽然说明书中的多个实施例是使用“包含”语言呈现的，但在多种情况下，也可以使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关的实施例。除非上下文另有指示，否则应注意，术语“一种/一个(a或an)”是指一种/一个或多种/多个，例如，“一种/一个免疫球蛋白分子”应理解为代表一种/一个或多种/多个免疫球蛋白分子。同样地，术语“一种/一个(a或an)”、“一种或多种/一个或多个(one ormore)”以及“至少一种/至少一个(at least one)”可以互换地使用。此外，本文使用的“和/或”应被视为具有或不具有另一个指定特征或组分的两个指定特征或组分中的每一个的具体披露内容。因此，如在本文中例如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一项：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

还应理解，当描述值范围时，所描述的特征可以是在该范围内找到的单个值。例如，“从约pH 4至约pH 6的pH”可以是但不限于，pH 4、4.2、4.6、5.1、5.5等，以及这些值之间的任何值。另外，“从约pH 4至约pH 6的pH”不应被解释为意指所考虑配制品的pH在储存期间在pH 4至pH 6的范围内变化2个pH单位，而是指溶液的pH可以在该范围内挑选值，并且pH在约该pH下保持缓冲。在一些实施例中，当使用术语“约”时，其意指所列举数字加上或减去所列举数字的10％。

在本文描述的任何范围内，该范围的端点包括在该范围内。然而，该描述还考虑了排除较低和/或较高端点的相同范围。从本申请的整体，包括附图和具体实施方式，本发明的另外的特征和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且所有这些特征都旨在作为本发明的方面。同样，本文描述的本发明的特征可以重组成另外的实施例，这些实施例也旨在作为本发明的方面，无论这些特征的组合是否在上文作为本发明的一个方面或实施例具体提及。而且，只有本文描述为对本发明至关重要的这些限制才应被视为这样的限制；本文未描述为至关重要的、本发明的缺少限制的变化旨在作为本发明的方面。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[生物医学与分子生物学简明词典],Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞与分子生物学词典],第3版,1999,Academic Press[学术出版社]；以及the Oxford Dictionary Of BiochemistryAnd Molecular Biology[牛津生物化学与分子生物学词典],修订的,2000,OxfordUniversity Press[牛津大学出版社]为技术人员提供了本披露中使用的许多术语的综合词典。

单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。本文提供的小标题不是本披露的不同方面或各方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。

本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。

附图说明

图1A-1D是提供尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃或25℃储存时，在第0周、2周和4周配制品B中双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的％主峰(左图)和％高分子量种类(右图)。

图2A-2D是提供SE-UHPLC分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃或25℃储存时，在第0周、1周、2周和4周配制品C中双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的％主峰(左图)和％高分子量种类(右图)。

图3A-3D是提供SE-UHPLC分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃或25℃储存时，在第0周、2周和4周配制品D中双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的％主峰(左图)和％高分子量种类(右图)。

图4A-4D是提供SE-UHPLC分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃或25℃储存时，在第0周、2周和4周配制品E中双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的％主峰(左图)和％高分子量种类(右图)。

图5A-5D是提供SE-UHPLC分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃或25℃储存时，在第0周、2周和4周配制品F中双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的％主峰(左图)和％高分子量种类(右图)。

图6A和6B是提供SE-UHPLC分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃储存时，在第0周(下图)和4周(上图)配制品A(“起始材料”)、配制品F(“pH 7.0”)、配制品E(“pH 6.3”)、配制品D(“pH 5.2”)、配制品C(“pH 4.2”)或配制品B(“pH 3.6”)中双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的％高分子量种类。

图7A和7B是图表，这些图表显示了与起始材料(配制品A)相比，透析进入低pH配制品(配制品C)中后聚集减少。

图8A和B是图表，这些图表显示了当在4℃或25℃储存0周、1周或两周时，如通过尺寸排阻分析确定的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质(1mg/mL)在低pH配制品(配制品C)中的稳定性。在图8A中，色谱图是偏移的。

图9A和B是条形图，这些条形图显示了如通过尺寸排阻(SEC)分析确定的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质在低pH配制品(具有高浓度(例如17mg/mL))中的稳定性。与蛋白质浓度为11mg/mL的配制品A(“起始材料”)相比，蛋白质浓度为17mg/mL的配制品C具有显著更低的聚集/％高分子量种类(左图)。在4℃储存0周、二周或四周后，蛋白质浓度为17mg/mL的配制品C也是稳定的(右图)。

图10A-10D是提供尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)分析结果的条形图，这些条形图显示了当在2℃-8℃或25℃储存时，在第0周、2周和4周配制品A中掩蔽的双特异性抗体的％主峰(左图)和％高分子量种类(右图)。

图11是示例性掩蔽的抗原结合蛋白质(也称为“Probody”)的图示。

图12是示例性掩蔽的抗原结合蛋白质(也称为“ProTIA前药”)的图示。“ECBM”是抗原结合结构域(即抗原结合结构域(AB1))；“TABM”是第二抗原结合结构域(即第二抗原结合结构域(AB2))；“RS”是可以被蛋白酶(即蛋白质识别结构域(PR))裂解的肽或多肽序列；“主体部分(Bulking Moiety)”是抑制或降低ECMB和/或TABM结合抗原(例如掩蔽的结构域(MD))的能力的肽或多肽。一旦前体形式的ProTIA在RS位点被裂解，ECBM和/或TABM与抗原的结合就会增加。

具体实施方式

具体的基于蛋白质的药物(包括抗体)在较长时间段内在液体配制品中通常不稳定，并且尤其是在升高温度(例如25℃和更高)下不稳定。本披露描述了低pH配制品，这些低pH配制品包含与一种、两种或更多种抗原结合的掩蔽的抗原结合蛋白质。在一些实施例中，该双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质以这样的方式特异性结合CD3(包括，例如CD3的ε链)和细胞表面抗原(包括，例如EGFR)以瞬时地使恶性细胞接近活化的T细胞，从而诱导T细胞介导的对抗体结合的恶性细胞的杀伤。

本发明基于的总体概念是发现包含掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)的液体药物组合物的胶体稳定性在满足以下两点的pH下得到显著改善：(1)低于掩蔽的抗原结合蛋白质(例如，如下所述的VH/VL区或其抗原结合片段或AB1和/或AB2区)的抗体或抗原结合结构域的等电点(pI)和(2)低于掩蔽的抗原结合蛋白质的掩蔽结构域(下文进一步描述的MD1和MD2区)的pI。掩蔽的抗原结合蛋白质的重链和轻链典型地具有不同的等电点(pI)，其中完整的重链通常比完整的轻链具有更高的pI。掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)和/或该掩蔽的抗原结合蛋白质内的区域或结构域的pI可以通过许多方法中的任何一种来确定(包括，例如使用如Perez-Riverol,Y.等人描述的Bjellqvist算法，Isoelectric pointoptimization using peptide descriptors and support vector machines.[使用肽描述符和支持向量机的等电点优化]Journal of proteomics[蛋白质组学杂志]75,2269-2274(2012)，将其通过引用并入本文)。还参见，Kozlowski LP.IPC–Isoelectric PointCalculator.[IPC-等电点计算器]Biology Direct.[生物学直通报告]2016；11:55(将其通过引用并入本文)，其描述了等电点计算器(IPC)的细节，可在线在http://isoelectric.ovh.org获得。

掩蔽的抗原结合蛋白质区(如下文进一步描述的MD1和/或MD2区)的pI通常不同于掩蔽的抗原结合蛋白质(包括例如，如下所述的重链/轻链或其抗原结合，或AB1和/或AB2区)的抗原结合部分的pI。

表1中提供了理论掩蔽的抗原结合蛋白质的其他代表性的理论AB和MD区的pI。表1中还提供了推荐的pH，以减少这些代表性的理论掩蔽的抗原结合蛋白质、双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质和多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的聚集并改善其稳定性。

表1

因此，在本文我们描述了药物组合物，其中掩蔽的抗原结合蛋白质组合物的pH(1)低于掩蔽的抗原结合蛋白质(例如，如下文进一步描述的VH/VL区或其抗原结合片段，或AB1和/或AB2区)的抗体或抗原结合结构域的等电点(pI)并且(2)低于掩蔽的抗原结合蛋白质的掩蔽结构域(如下文进一步描述的MD1和MD2区)的pI。虽然不希望被任何特定理论所束缚，但药物组合物的低pH确保掩蔽的抗原结合蛋白质的子区(包括例如，如下文进一步描述的抗原结合区和掩蔽区或AB1和/或AB2区)带有净正电荷，其导致减少抗体聚集并增加稳定性的结构域间和结构域内排斥。在结构域(例如掩蔽结构域)具有酸性pI并且另一个结构域(例如抗体或抗原结合结构域)具有碱性pI的情况下，如果药物组合物的pH在每个结构域的pI之间(例如在pH 7下)，则可以产生偶极子，这导致增加抗体聚集并降低稳定性的分子内和分子间静电吸引。虽然不希望被任何特定理论所束缚，但静电吸引可能导致聚集，并因此导致形成不希望的高分子量(HMW)种类。HMW种类关键性地影响溶液的稳定性或分散体的胶体稳定性。这是掩蔽的抗原结合蛋白质(包括双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)的特定问题，该抗原结合蛋白质可具有多个抗原结合结构域和/或多个掩蔽多肽，其中每个掩蔽多肽与周围的氨基酸在局部相互作用，导致其他并发症。本披露组合物的低pH允许各种结构域的质子化和静电排斥，从而导致掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性抗原结合蛋白质)的HMW种类的发生率出乎意料地降低。在一些实施例中，该药物组合物的pH范围是从3.5至5.5。优选的是pH值为4.0至5.5，例如pH值为4.2至4.8。在一些实施例中，优选的pH值是pH值为3.6至4.2。在一些实施例中，该组合物的pH比掩蔽的抗原结合蛋白质(下文进一步描述)的AB1、AB2、MD1和/或MD2区的pI低约2个pH单位。在一些实施例中，该组合物的pH在约7.0至约3.6之间。在一些实施例中，该组合物的pH大于约3.5。

配制品的各个方面描述如下。节标题的使用仅仅是为了便于阅读，而不是旨在限制本身。整个文件旨在被视为统一的披露，并且应理解，可以考虑本文描述的特征的所有组合。

缓冲液

本披露的药物组合物包含缓冲剂，该缓冲液任选地可选自下组，该组由以下组成：乙酸盐、谷氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、组氨酸、磷酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸盐、磷酸钾、钾盐、二价阳离子、钙、镁、锰、锌、乙酸/乙酸钠、柠檬酸/柠檬酸钠、琥珀酸/琥珀酸钠、酒石酸/酒石酸钠、组氨酸/组氨酸HCl、甘氨酸、Tris、谷氨酸盐、氨基酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸及其组合。在一些实施例中，该药物组合物包含至少一种选自下组的缓冲液，该组由以下组成：乙酸盐、谷氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、组氨酸、磷酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸盐及其组合。

通常采用缓冲剂来控制配制品中的pH。在一些实施例中，以一定浓度添加缓冲液使配制品的pH保持在约3.5至约5、或约4.0至约5.5、或约4.0至约5.0、或约4.2至约4.8、或4.2、或3.6、或大于3.5。pH对配制品的影响可以使用若干种方法(例如加速的稳定性研究)中的任何一种或多种来表征。

有机酸、磷酸盐和Tris是蛋白质配制品中的合适缓冲液(表2)。缓冲种类的缓冲容量在等于pKa的pH下最大，并且随着pH从这个值增加或减小而降低。百分之九十的缓冲能力存在于其pKa的一个pH单位内。缓冲容量也随缓冲液浓度的增加而成比例增加。

选择缓冲液时典型地会考虑若干个因素。例如，缓冲液种类及其浓度应基于其pKa和所希望的配制品pH来定义。同样重要的是确保缓冲液与蛋白质药物、其他配制品赋形剂相容，并且不催化任何降解反应。最近，已示出聚阴离子羧酸盐缓冲液例如柠檬酸盐和琥珀酸盐与蛋白质的侧链残基形成共价加合物。要考虑的第三个方面是缓冲液可能诱导的刺痛和刺激感。

表2：常用的缓冲剂及其pK_a值

选择配制品中存在的缓冲液系统以在生理学上相容并保持所希望的pH。

缓冲液能以适于将配制品的pH维持在预定水平的任何量存在。缓冲液可以按约0.1mM和约1000mM(1M)之间、或约5mM和约200mM之间、或约5mM至约100mM之间、或约10mM和约50mM之间的浓度存在。合适的缓冲液浓度涵盖约200mM或更低的浓度。在一些实施例中，配制品中的缓冲液以约190mM、约180mM、约170mM、约160mM、约150mM、约140mM、约130mM、约120mM、约110mM、约100mM、约80mM、约70mM、约60mM、约50mM、约40mM、约30mM、约20mM、约10mM或约5mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲液的浓度为至少约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700或900mM。在一些实施例中，缓冲液的浓度为在约1、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或90mM和100mM之间。在一些实施例中，缓冲液的浓度为在约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30或40mM和50mM之间。在一些实施例中，缓冲液的浓度为约10mM。

用于缓冲本文列出的配制品的其他示例性pH缓冲剂包括但不限于甘氨酸、谷氨酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、乙酸盐和天冬氨酸。氨基酸例如组氨酸、精氨酸、脯氨酸和谷氨酸也可用作缓冲剂。

多元醇

本文描述的药物组合物还包含至少一种多元醇。多元醇涵盖一类赋形剂，其包括糖(例如甘露糖醇、蔗糖或山梨糖醇)和其他多元醇(例如甘油和丙二醇)。聚合物聚乙二醇(PEG)包括在这个类别中。多元醇通常用作液体和冻干的肠胃外蛋白质配制品两者中的稳定赋形剂和/或等张剂。多元醇可以保护蛋白质免受物理和化学降解途径的影响。

适用于本文披露的药物组合物的示例性多元醇包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘氨酸、精氨酸HCL、多羟基化合物(包括例如多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、磺丁基环糊精、N-甲基吡咯烷、纤维素和透明质酸)和氯化钠(Carpenter等人,Develop.Biol.Standard[生物标准化的发展]74:225,(1991))。

适用于本文披露的药物组合物的另外的多元醇包括但不限于丙二醇、甘油(丙三醇)、苏糖、苏糖醇、赤藓糖、赤藓糖醇、核糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、来苏糖、麦芽糖醇、山梨糖醇、山梨糖、葡萄糖、甘露糖、甘露糖醇、左旋糖、右旋糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、木糖醇、肌醇、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖、1,2,6-己三醇等。高级糖包括葡聚糖、丙二醇或聚乙二醇。与非还原糖相比，还原糖，例如果糖、麦芽糖或半乳糖更容易氧化。糖醇的另外的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇或异麦芽酮糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原糖苷。单糖苷包括通过还原二糖(例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖)而获得的化合物。

在一些实施例中，该至少一种多元醇选自下组，该组由以下组成：单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链型葡聚糖和线性非支链型葡聚糖或其组合。在一些实施例中，该至少一种多元醇是选自下组的二糖，该组由以下组成：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇和山梨糖醇或其组合。

在一些实施例中，该药物组合物包含浓度为约0％w/v至约40％w/v、或约0％w/v至约20％w/v、或约1％w/v至约15％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，该药物组合物包含浓度为至少0.5％w/v、至少1％w/v、至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v、至少9％w/v、至少10％w/v、至少11％w/v、至少12％w/v、至少13％w/v、至少14％w/v、至少15％w/v、至少16％w/v、至少17％w/v、至少18％w/v、至少19％w/v、至少20％w/v、至少30％w/v或至少40％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，该药物组合物包含浓度为约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v、约10％w/v、约11％w/v、约12％w/v、约13％w/v、约14％w/v至约15％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，该药物组合物包含浓度为约1％w/v至约15％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在又另一个实施例中，该药物组合物包含浓度为约9％w/v、约9.5％w/v、约10％w/v、约10.5％w/v、约11％w/v、约11.5％w/v或约12％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，该药物组合物包含浓度为约9％w/v至约12％w/v的至少一种多元醇(例如糖)。在一些实施例中，该至少一种多元醇(例如糖)在组合物中的浓度为约9％w/v。在一些实施例中，该至少一种多元醇选自下组，该组由以下组成：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇和山梨糖醇或其组合。在一些实施例中，该多元醇是蔗糖，并且在组合物中以从约9％w/v至约12％w/v的浓度范围存在。

如果希望，配制品还可包括适于形成冻干的“饼”的适量的膨胀和渗透压调节剂，例如糖。

在优选的实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质药物组合物或配制品包含10mM谷氨酸盐或10mM乙酸盐、9％(w/V)蔗糖和0.01％(w/V)聚山梨醇酯80，其中该药物组合物或配制品的pH是4.2或3.6。

表面活性剂

本文披露的药物组合物可进一步任选地包含至少一种表面活性剂。表面活性剂通常用于蛋白质配制品中以防止表面诱导的降解。表面活性剂是两亲性分子，具有与蛋白质竞争界面位置的能力。表面活性剂分子的疏水部分占据界面位置(例如，空气/液体)，而分子的亲水部分保持朝向主体溶剂定向。在足够的浓度下(典型地在洗涤剂的临界胶束浓度附近)，表面活性剂分子的表面层用于防止蛋白质分子吸附在界面处。表面诱导的降解由此被最小化。表面活性剂包括例如山梨糖醇聚乙氧基化物的脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80(参见例如

)。两者的不同之处仅在于脂族链的长度，它们分别赋予分子C-12和C-18疏水特征。因此，聚山梨醇酯80比聚山梨醇酯20具有更高的表面活性并且具有更低的临界胶束浓度。表面活性剂泊洛沙姆188也已用于若干种市售的液体产品，例如

和

洗涤剂还可以影响蛋白质的热力学构象稳定性。蛋白质的洗涤剂不稳定可以根据洗涤剂分子的疏水性尾部来合理解释，这些洗涤剂分子能以部分或完全去折叠的蛋白质状态进行特异性结合。这些类型的相互作用可以引起构象平衡向更扩展的蛋白质状态的转变(即，增加蛋白质分子的疏水部分的暴露以补充结合聚山梨醇酯)。或者，如果蛋白质天然状态展现出一些疏水表面，则与天然状态结合的洗涤剂可稳定该构象。

聚山梨醇酯的另一个方面是它们固有地易受氧化降解的影响。通常，作为原料，它们含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链的氧化，尤其是甲硫氨酸。添加稳定剂引起的氧化损伤的可能性强调了配制品中应使用最低有效浓度的赋形剂。对于表面活性剂，给定蛋白质的有效浓度将取决于稳定机制。已经假定，如果表面活性剂稳定的机制与防止表面变性有关，则有效浓度将在洗涤剂的临界胶束浓度附近。相反，如果稳定机制与特定的蛋白质-洗涤剂相互作用相关，则有效的表面活性剂浓度将与蛋白质浓度和相互作用的化学计量有关(Randolph T.W.,等人,Pharm Biotechnol.[药物生物技术],13:159-75(2002))。

还能以适当的量添加表面活性剂以防止在冷冻和干燥过程中表面相关的聚集现象(Chang,B,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]85:1325,(1996))。示例性表面活性剂包括但不限于阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和两性表面活性剂，包括衍生自天然存在的氨基酸的表面活性剂。阴离子表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、丁二酸二辛基磺酸钠和二辛基磺酸钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、脱氧胆酸钠和甘氨脱氧胆酸钠盐。阳离子表面活性剂包括但不限于苯扎氯铵或苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶一水合物和溴化十六烷基三甲铵。两性离子表面活性剂包括但不限于CHAPS、CHAPSO、SB3-10和SB3-12。非离子表面活性剂包括但不限于毛地黄皂苷、曲拉通(Triton)X-100、曲拉通X-114、吐温(TWEEN)20和吐温80。在另一个实施例中，表面活性剂包括聚桂醇400；聚氧乙烯40硬脂酸酯；聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60；甘油单硬脂酸酯，聚山梨醇酯20、40、60、65和80；大豆卵磷脂和其他磷脂例如DOPC、DMPG、DMPC和DOPG；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素和羧甲基纤维素。

本文描述的药物组合物可进一步任选地包含单独的或呈不同比率的混合物的至少一种表面活性剂。在一些实施例中，该组合物包含浓度为约0.001％w/v至约5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，该组合物包含浓度为至少0.001％w/v、至少0.002％w/v、至少0.003％w/v、至少0.004％w/v、至少0.005％w/v、至少0.007％w/v、至少0.01％w/v、至少0.05％w/v、至少0.1％w/v、至少0.2％w/v、至少0.3％w/v、至少0.4％w/v、至少0.5％w/v、至少0.6％w/v、至少0.7％w/v、至少0.8％w/v、至少0.9％w/v、至少1.0％w/v、至少1.5％w/v、至少2.0％w/v、至少2.5％w/v、至少3.0％w/v、至少3.5％w/v、至少4.0％w/v或至少4.5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，该组合物包含浓度为约0.004％w/v至约0.5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，该组合物包含浓度为约0.004％w/v、约0.005％w/v、约0.007％w/v、约0.01％w/v、约0.05％w/v、约0.1％w/v、约0.2％w/v、约0.3％w/v或约0.4％w/v至约0.5％w/v的表面活性剂。在一些实施例中，该组合物包含以约0.001％w/v至约0.01％w/v的浓度掺入的表面活性剂。在一些实施例中，该表面活性剂是聚山梨醇酯80，并且该聚山梨醇酯80以约0.01％w/v的浓度存在。

其他考虑

如本文使用的，术语“药物组合物”涉及适于向有需要的受试者施用的组合物。术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文中可互换地使用，是指任何希望施用药物组合物的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等，优选人。本披露的药物组合物是稳定的和药学上可接受的，即能够引发所希望的治疗效果，而不会在施用药物组合物的受试者中引起任何不希望的局部或全身性作用。本发明的药学上可接受的组合物可以特别是无菌的和/或药学上惰性的。具体地，术语“药学上可接受的”可以意指由管理机构或其他受普遍承认的药典批准在动物中使用，并且更特别地在人中使用。

本披露提供的药物组合物包含掩蔽的抗原结合蛋白质(例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)。在一些实施例中，提供了治疗有效量的掩蔽的抗原结合蛋白质。“治疗有效量”意指所述掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)引发所希望的治疗效果的量。可以通过标准药物方法在细胞培养物或实验性动物中确定治疗功效和毒性，例如ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。治疗和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且它能以ED50/LD50比表示。通常优选展现出大治疗指数的药物组合物。

可以将蛋白质和抗体配制品，包括本文披露的药物组合物胃肠外施用。肠胃外给予时，它们必须是无菌的。无菌稀释剂包括药学上可接受的(对人施用是安全且无毒的)并且对于制备液体药物组合物(例如冻干后重构的药物组合物)是有用的液体。示例性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。稀释剂可包括盐和/或缓冲液的水溶液。

赋形剂是包括在药物组合物或配制品中的添加剂，因为它们赋予或增强药物产品的稳定性、递送和可制造性。无论包含赋形剂的原因如何，赋形剂必须是安全且患者耐受的。对于蛋白质药物和抗体，赋形剂的选择尤其重要，因为它们可以影响药物的功效和免疫原性两者。因此，需要在适当选择赋形剂的情况下开发蛋白质配制品，该赋形剂提供合适的稳定性、安全性和适销性。

本文描述的赋形剂通过它们的化学类型或它们在药物组合物/配制品中的功能性作用来组织。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将能够容易地改变赋形剂的量或范围，而不会将粘度增加至不希望的水平。可以选择赋形剂以实现最终溶液的所希望的渗透压(即等渗、低渗或高渗)，pH，所希望的稳定性，抗聚集或抗降解或抗沉淀，在冷冻、冻干或高温条件下的保护，或其他性质。本领域已知各种类型的赋形剂。示例性赋形剂包括盐、氨基酸、其他张度剂、表面活性剂、稳定剂、膨胀剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。

此外，当以例如百分比(％)w/v报告在药物组合物或配制品中的特定赋形剂时，本领域技术人员将认识到也考虑了该赋形剂的当量摩尔浓度。

其他稳定剂和膨胀剂

本文描述的药物组合物可进一步任选地包含至少一种稳定剂(包括糖、聚合物和/或多元醇)。稳定剂包括一类可用作冷冻保护剂、冻干保护剂和玻璃形成剂的化合物。冷冻保护剂用于在低温下在冷冻期间或在冷冻状态稳定蛋白质。通过在冷冻干燥的脱水阶段期间保留蛋白质的天然样构象性质，冻干保护剂稳定冷冻干燥的固体剂型中的蛋白质或抗体。玻璃态性质根据其作为温度的函数的松弛性质被分类为“强”或“易碎”。重要的是，冷冻保护剂、冻干保护剂和玻璃形成剂与蛋白质或抗体保持相同的相以赋予稳定性。示例性冻干保护剂包括但不限于甘油和明胶，以及蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。

氨基酸

在一些实施例中，本文描述的药物组合物进一步包含一种或多种氨基酸。氨基酸在蛋白质和抗体配制品或药物组合物中具有多种用途，作为缓冲液、膨胀剂、稳定剂和抗氧化剂。采用组氨酸和谷氨酸来缓冲蛋白质或抗体配制品，pH范围分别为5.5–6.5和4.0–5.5。组氨酸的咪唑基团的pKa＝6.0，并且谷氨酸侧链的羧基基团的pKa为4.3，这使得它们适合于在各自的pH范围内缓冲。谷氨酸发现于一些配制品中(例如，

)。组氨酸通常发现于市售蛋白质/抗体配制品(例如，

)中。它提供了柠檬酸盐的良好替代物，已知柠檬酸盐是一种在注射时引起刺痛的缓冲液。有趣的是，据报道，组氨酸在液体和冻干呈递两者中以高浓度使用时也具有稳定作用(Chen B,等人,PharmRes.[药物研究],20(12):1952-60(2003))。还观察到组氨酸(高达60mM)降低高浓度抗体配制品的粘度。然而，在同一项研究中，作者观察到在不锈钢容器中抗体的冻融研究期间含有组氨酸的配制品中聚集和变色增加。作者将此归因于钢容器腐蚀引起的铁离子的影响。组氨酸的另一个注意事项是它在金属离子存在下经历光氧化(Tomita M,等人,Biochemistry[生物化学],8(12):5149-60(1969))。在配制品中使用甲硫氨酸作为抗氧化剂似乎很有前景；已经观察到它对多种氧化应激有效(Lam XM,等人,J Pharm Sci.[药物科学杂志],86(11):1250-5(1997))。

氨基酸甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸稳定蛋白质或抗体。甘氨酸也是冻干配制品中的膨胀剂(例如，

)。精氨酸已示出是有效抑制聚集的试剂，并已用于液体配制品和冻干配制品两者(例如，

液体)。本文描述的药物组合物可进一步任选地包含上述氨基酸中的任何一种或多种。

抗氧化剂

在一些实施例中，本文描述的药物组合物进一步包含一种或多种抗氧化剂。蛋白质残余物的氧化来自许多不同的来源。除了添加具体的抗氧化剂之外，防止氧化蛋白质损害涉及在整个制造过程和产品储存中仔细控制许多因素，例如大气氧、温度、光暴露和化学污染。最常用的药物抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂或螯合剂。治疗性蛋白质或抗体配制品中的抗氧化剂必须是水溶性的并且在整个产品保质期内保持活性。还原剂和氧/自由基清除剂通过消融溶液中的活性氧种类起作用。通过结合促进自由基形成的痕量金属污染物，例如EDTA的螯合剂可以是有效的。例如，EDTA用于酸性成纤维细胞生长因子的液体配制品中，以抑制金属离子催化的半胱氨酸残基的氧化。EDTA已用于市售的产品，像

和

因此，本文描述的药物组合物可进一步任选地包含这些还原剂、氧/自由基清除剂和/或螯合剂中的任何一种或多种。

然而，抗氧化剂本身可以诱导对蛋白质的其他共价或物理变化。文献中已经报道了许多这样的情况。还原剂(像谷胱甘肽)可引起分子内二硫键的破坏，这可导致二硫化物改组。在过渡金属离子存在下，抗坏血酸和EDTA已示出可以促进许多蛋白质和多肽中的甲硫氨酸氧化(Akers MJ和Defelippis MR.Peptides and Proteins as ParenteralSolutions.[肽和蛋白质作为肠胃外溶液]在：Pharmaceutical Formulation Developmentof Peptides and Proteins.[肽和蛋白质的药物配制品开发]Sven Frokjaer,LarsHovgaard,编辑.Pharmaceutical Science.[药物科学]Taylor和Francis,UK(1999))；Fransson J.R.,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]86(9):4046-1050(1997)；Yin J,等人,Pharm Res.[药物研究],21(12):2377-83(2004))中。据报道，硫代硫酸钠可降低rhuMabHER2中光和温度诱导的甲硫氨酸氧化水平；然而，在该研究中也报道了硫代硫酸盐-蛋白质加合物的形成(Lam XM,Yang JY等人,J Pharm Sci.[药物科学杂志]86(11):1250-5(1997))。根据掩蔽的抗原结合蛋白质的具体应激和敏感性选择适当的抗氧化剂。

金属离子

在一些实施例中，该药物组合物进一步包含一种或多种金属离子。通常，过渡金属离子在蛋白质或抗体药物组合物或配制品中是不希望的，因为它们可以催化蛋白质中的物理和化学降解反应。然而，当它们是蛋白质的辅因子时，特定金属离子包括在配制品中，其中它们形成配位络合物(例如胰岛素的锌悬浮液)。最近，已经提出使用镁离子(10–120mM)来抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸(参见，例如国际专利公开号WO 2004/039337)。示例性金属离子包括但不限于Ca⁺²离子、Mg⁺²、Mn⁺²、Zn⁺²、Cu⁺²和Fe⁺²。

防腐剂

在一些实施例中，该药物组合物进一步包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从相同容器中多次提取的多次使用肠胃外配制品时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保质期或使用期限内的产品无菌性。常用的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、烷基对羟基苯甲酸酯(例如羟苯甲酸甲酯或羟基苯甲酸丙酯)、苯扎氯铵和苄索氯铵。具有抗微生物保护活性的化合物的其他实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵和氯化六烃季铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇，例如丁醇、苯酚、苯甲醇、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

多次使用注射笔呈递任选地包括经防腐处理的配制品。例如，目前市场上可获得经防腐处理的hGH配制品。

(液体，诺和诺德公司(Novo Nordisk))、Nutropin

(液体，基因泰克公司(Genentech))和健豪宁(Genotropin)(冻干-双室药筒，法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn))含有苯酚，而

(礼来公司(Eli Lilly))用间甲酚进行配制。

在经防腐处理的剂型的配制品开发期间考虑了若干个方面。防腐剂浓度的优化涉及在剂型中测试给定的防腐剂，其浓度范围赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性。例如，使用差示扫描量热法(DSC)，在开发用于白细胞介素-1受体(I型)的液体配制品中成功筛选了三种防腐剂。基于防腐剂在市售产品中常用浓度下对稳定性的影响，对防腐剂进行排序(Remmele RL Jr.等人,Pharm Res.[药物研究],15(2):200-8(1998))。

一些防腐剂会引起注射位点反应，这是选择防腐剂时需要考虑的另一个因素。在专注于评估Norditropin中防腐剂和缓冲液的临床试验中，与含有间甲酚的配制品相比，观察到含有苯酚和苯甲醇的配制品的疼痛感觉降低(Kappelgaard A.M.,Horm Res.[激素研究]62增刊3:98-103(2004))。有趣的是，在常用的防腐剂中，苯甲醇具有麻醉性质(MinogueSC和Sun DA.,Anesth Analg.[麻醉与镇痛],100(3):683-6(2005))。

本披露还考虑了不包含任何防腐剂的药物组合物。

掩蔽的抗原结合蛋白质

本文描述的药物组合物或配制品包含掩蔽的抗原结合蛋白质。“掩蔽的抗原结合蛋白质”是包括与抗原结合结构域(AB)偶联(例如通过共价键或接头)的掩蔽结构域(MD)的蛋白质，使得MD的偶联抑制或降低AB与其抗原的结合。MD进一步包含蛋白质识别位点(PR)，该蛋白质识别位点包括蛋白质或蛋白酶的底物或结合位点，使得当蛋白质或蛋白酶结合和/或裂解该蛋白质识别位点时，AB结构域结合抗原或通过AB结构域与抗原的结合增加或被诱导。掩蔽的抗原结合蛋白质先前已经描述于例如国际公开号WO 2017/040344、美国专利号9540440、美国公开号20150118254、美国专利号9127053、美国专利号9517276和美国专利号8563269中，将其各自通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质是Probody(如描述于，例如图11；或Polu KR和Lowman HB.Expert Opin BiolTher.[生物疗法的专家意见]2014年8月；14(8):1049-53；或Desnoyers LR等人,SciTransl Med.[科学转化医学]2013年10月16日；5(207))或ProTIA前药(如描述于，例如图12；或Schellenberger V.Amunix unveils next-generation immuno-oncologic cancertherapy platform.[Amunix公司公布了下一代免疫肿瘤癌症疗法平台]https://biopharmadealmakers.nature.com.2016年9月版,B20；还参见http://www.amunix.com/technology/pro-tia/)。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质从N-末端到C-末端具有如下的结构排列：MD-AB或AB-MD。在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质包括连接肽(LP)，并且该掩蔽的抗原结合蛋白质从N-末端到C-末端具有如下的结构排列：MD-LP-AB或AB-LP-MD。

如上文讨论的，术语“掩蔽的抗原结合蛋白质”是指处于如下状态的掩蔽的抗原结合蛋白质：天然状态，以及当蛋白质或蛋白酶与该掩蔽的抗原结合蛋白质的蛋白质识别位点(PR)内的结合位点或底物结合(其可导致对PR的裂解或诱导结构构象改变)时的状态(即活性状态)。因此，对于技术人员将是显而易见的是，在一些实施例中，由于蛋白酶对PR的裂解，掩蔽的抗原结合蛋白质可以缺乏MD，这导致至少MD的释放(例如，其中MD未通过共价键(例如半胱氨酸残基之间的二硫键)与该掩蔽的抗原结合蛋白质连接)。

当掩蔽的抗原结合蛋白质在天然状态下处于存在抗原的情况下时，与当掩蔽的抗原结合蛋白质处于活性状态时(即，当蛋白质或蛋白酶与PR结合和/或除去或移位MD时)AB与抗原的结合相比，AB与抗原的结合减少或被抑制。当与不与MD缔合的AB的结合相比时(即，当掩蔽的抗原结合蛋白质处于活性状态时)，当在体外和/或体内结合测定中测量时，该掩蔽的抗原结合蛋白质在天然状态下结合抗原的能力降低，例如，降低了至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或甚至约100％。

在一些实施例中，该蛋白质识别位点(PR)作为蛋白酶(优选细胞外蛋白酶)的底物起作用。可以基于蛋白质或蛋白酶来选择PR，该蛋白质或蛋白酶由接近表达抗原的细胞的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生和/或由与掩蔽的抗原结合蛋白质的AB的所希望抗原共定位于组织中的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生。在一些实施例中，该蛋白酶是u型纤溶酶原激活剂(uPA，也称为尿激酶)、豆荚蛋白和/或蛋白裂解酶(也称为MT-SP1或MTSP1)。在一些实施例中，该蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)。在一些实施例中，该蛋白酶是描述于Rawlings,N和Salvesen,G.Handbook of Proteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册](第三版).爱思唯尔公司(Elsevier),2013.ISBN:978-0-12-382219-2(出于所有目的将其通过引用并入本文)中的蛋白酶之一。

本文描述的药物组合物可含有具有AB或MD(其中pI为酸性(小于pH 7.0)、中性(约pH 7.0)或碱性(大于pH 7.0))的掩蔽的抗原结合蛋白质。在一些实施例中，双特异性或多特异性抗原结合蛋白质中的AB结构域可具有酸性、中性和/或碱性pI，而MD也可具有酸性、中性和/或碱性pI。在一些实施例中，本文描述的药物组合物含有具有AB和MD(其中二者的pI都是酸性、中性或碱性的，或者AB具有酸性pI和MD具有中性或碱性pI)的掩蔽的抗原结合蛋白质。在其他实施例中，AB可具有中性或碱性pI，而MD具有酸性pI。

在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质包括特异性结合抗原的抗体或其抗原结合片段(AB)。在一些实施例中，结合抗原的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是小鼠、嵌合的、人源化或完全人源单克隆抗体。在一些优选实施例中，抗原结合片段是Fab片段、F(ab′)₂片段、scFv或scAb。

在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合选自下组的抗原，该组由以下组成：EGFR、间皮素、CDH3、CD3或其组合。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合选自下组的抗原，该组由以下组成：激素、生长因子、细胞因子、细胞表面受体或其任何配体。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段结合选自下组的抗原，该组由以下组成：此类细胞因子、淋巴因子、生长因子或其他造血因子，包括但不限于：M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNFα、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、促血小板生成素、干细胞因子和促红细胞生成素。用于本文的另外的生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白质-1、骨形态发生蛋白质-2、骨形态发生蛋白质-3、骨形态发生蛋白质-4、骨形态发生蛋白质-5、骨形态发生蛋白质-6、骨形态发生蛋白质-7、骨形态发生蛋白质-8、骨形态发生蛋白质-9、骨形态发生蛋白质-10、骨形态发生蛋白质-11、骨形态发生蛋白质-12、骨形态发生蛋白质-13、骨形态发生蛋白质-14、骨形态发生蛋白质-15、骨形态发生蛋白质受体IA、骨形态发生蛋白质受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体α、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、上皮衍生的中性粒细胞引诱剂、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α2、生长相关的蛋白质、生长相关的蛋白质α、生长相关的蛋白质β、生长相关的蛋白质γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白质、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养因子-3、神经营养因子-4、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜在转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白质I、转化生长因子β结合蛋白质II、转化生长因子β结合蛋白质III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体和嵌合蛋白质及其生物学或免疫学活性片段。

在一些实施例中，抗体或抗原结合片段结合选自下组的抗原，该组由以下组成：p53、KRAS、NRAS、MAGEA、MAGEB、MAGEC、BAGE、GAGE、LAGE/NY-ESO1、SSX、酪氨酸酶、gp100/pmel17、Melan-A/MART-1、gp75/TRP1、TRP2、CEA、RAGE-1、HER2/NEU、WT1。

在示例性方面，抗体或抗原结合片段结合在免疫细胞表面上表达的抗原。在一些实施例中，掩蔽的抗原结合蛋白质结合选自下组的分化簇分子，该组由以下组成：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和CD182。

在一些实施例中，抗体或抗原结合片段选自下组，该组由以下组成：莫罗单抗-CD3(以商标名称Orthoclone

市售的产品)、阿昔单抗(以商标名称

市售的产品)、利妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)(美国专利号5,843,439)、巴利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、达利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、帕利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、英利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、曲妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)、阿仑单抗(以商标名称

市售的产品)、阿达木单抗(以商标名称

市售的产品)、托西莫单抗-I131(以商标名称

市售的产品)、依法利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、西妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)、替伊莫单抗(以商标名称

市售的产品)、奥马珠单抗(以商标名称

市售的产品)、贝伐单抗(以商标名称

市售的产品)、那他珠单抗(以商标名称

市售的产品)、兰尼单抗(以商标名称

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市售的产品)、依库珠单抗(以商标名称

市售的产品)、培舍珠单抗(以商标名称

市售的产品)、戈利木单抗(以商标名称

市售的产品)、康纳单抗(以商标名称

市售的产品)、卡妥索单抗(以商标名称

市售的产品)、优特克单抗(以商标名称

市售的产品)、托珠单抗(以商标名称

市售的产品)、奥法木单抗(以商标名称

市售的产品)、德尼单抗(以商标名称

市售的产品)、贝利木单抗(以商标名称

市售的产品)、瑞西巴库单抗、易普利姆玛(以商标名称

市售的产品)和帕妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)。在示例性实施例中，抗体是以下中之一：抗TNFα抗体，例如阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、戈利木单抗和培舍珠单抗；抗IL1β抗体，例如康纳单抗；抗IL12/23(p40)抗体，例如优特克单抗和布瑞吉努单抗；以及抗IL2R抗体，例如达利珠单抗。合适的抗癌抗体的实例包括但不限于抗BAFF抗体，例如贝利木单抗；抗CD20抗体，例如利妥昔单抗；抗CD22抗体，例如依帕珠单抗；抗CD25抗体，例如达利珠单抗；抗CD30抗体，例如伊雷单抗；抗CD33抗体，例如吉妥珠单抗；抗CD52抗体例如阿仑单抗；抗CD152抗体，例如易普利姆玛；抗EGFR抗体，例如西妥昔单抗；抗HER2抗体，例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；抗IL6抗体，例如司妥昔单抗；抗VEGF抗体，例如贝伐单抗；以及抗IL6受体抗体，例如托珠单抗。

在一些实施例中，该药物组合物包含双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质。先前已经描述了双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质。参见，例如国际公开号WO2017/040344；美国专利公开号2015/0079088(将其通过引用并入本文)。“双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质”是结合两种不同的抗原或表位的掩蔽的抗原结合蛋白质，而“多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质”是识别三种或更多种不同的抗原或表位的掩蔽的抗原结合蛋白质。

在一些实施例中，双特异性或多特异性抗原结合蛋白质的一种抗体或其抗原结合片段(AB1)结构域对靶抗原具有特异性，并且另一种抗体或其抗原结合片段(AB2)结构域对另一种靶抗原具有特异性。在一些实施例中，双特异性或多特异性抗原结合蛋白质的一种抗体或其抗原结合片段(AB1)结构域对靶抗原的表位具有特异性，并且另一种抗体或其抗原结合片段(AB2)结构域对相同靶抗原的另一个表位具有特异性。

双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包括至少一个包含蛋白质识别位点(PR)的掩蔽结构域(MD)，其中MD抑制或降低AB与抗原的结合。该至少一个MD包含蛋白质识别位点(PR)，该蛋白质识别位点包括蛋白质或蛋白酶的底物或结合位点，使得当蛋白质或蛋白酶结合和/或裂解该蛋白酶识别位点时，AB结构域结合抗原或结合增加。对于双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质，该掩蔽的抗原结合蛋白质优选包含两个MD(例如MD1和MD2)，其降低每个抗原结合结构域(AB1和AB2)结合其各自的抗原或表位的能力。

本文提供的掩蔽的抗原结合蛋白质和/或双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质在循环中是稳定的并且在预期的疗法和/或诊断位点被激活，但在正常(即健康)组织中不被激活。当处于活性状态时，该掩蔽的抗原结合蛋白质和/或双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质展现出与抗原的结合，所述结合至少与相应的未修饰的抗体或双特异性或多特异性抗原结合蛋白质(即，不包含掩蔽结构域的对应抗体(counterpart))与抗原的结合相当。

术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白质形式、包含重链和轻链、并且包含可变区和恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(典型地具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。参见，例如Janeway等人,“Structure of the Antibody Molecule and theImmunoglobulin Genes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999)。抗体可进一步任选地包含恒定结构域，使得抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任何一种。可变区典型地包含至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫相关蛋白质序列],Public Health Service[公共卫生署]N.I.H.,贝塞斯达,马里兰州；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，位于框架区内(由Kabat等人,1991指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。

术语“抗体片段”、“其抗体片段”或“抗原结合抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”或“其抗原结合片段”是指与抗原结合的完整抗体的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv和单链抗体。

在多个方面，该抗体是单克隆抗体。在某些方面，该抗体是人抗体。在某些方面，该抗体是嵌合的或人源化的。术语“嵌合”是指含有来自两种或更多种不同抗体的结构域的抗体。嵌合抗体可以例如含有来自一个种类的恒定结构域，和来自第二种类的可变结构域，或更一般地，可以含有来自至少两个种类的氨基酸序列的区段。“嵌合”和“人源化”两者通常是指组合来自多于一个种类的区域的抗原结合蛋白质。嵌合抗体还可以含有同一种类内的两种或更多种不同抗体的结构域。在一个实施例中，嵌合抗体是CDR接枝抗体。

当与抗原结合蛋白质相关使用时，术语“人源化”是指如下抗原结合蛋白质(例如，抗体)，其至少具有来自非人来源的CDR区，并且被工程化为具有比原始来源的抗体更相似于真实的人抗体的结构和免疫功能。例如，人源化可涉及将来自非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人框架区中。通常，在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人起源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(其CDR内除外)。CDR(部分或全部由源自非人生物体的核酸编码)被接枝到人抗体可变区的β-折叠框架中以产生抗体，其特异性由接枝的CDR决定。这种抗体的产生描述于例如国际专利公开号WO 92/11018；Jones,1986,Nature[自然]321:522-525；和Verhoeyen等人,1988,Science[科学]239:1534-1536，所述公开均通过引用整体并入。通常采用选择的受体框架残基向相应的供体残基的“回复突变”，以重新获得在初始接枝的构建体中丧失的亲和力(参见例如，美国专利号5530101；5585089；5693761；5693762；6180370；5859205；5821337；6054297；和6407213，均通过引用整体并入)。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白(典型地是人免疫球蛋白)恒定区的至少一部分，并且因此典型地包含人Fc区。

多特异性抗体的非限制性实例包括三特异性抗体、四特异性抗体等。掩蔽的抗原结合蛋白质(包括双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)任选地是多价的；多价是指抗体上结合位点的总数，无论结合位点是否识别相同或不同的抗原或表位。

在多个实施例中，本文描述的双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质结合人CD3(SEQ ID NO:3)。例如，在多个方面，双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质通过T细胞上的CD3ε的接合来激活T细胞。也就是说，抗体激动、刺激、激活和/或增强CD3介导的T细胞活化。CD3的生物学活性包括，例如T细胞活化以及通过T细胞受体(TCR)的CD3与抗原结合亚基之间的相互作用的其他信号传导。

本文披露的双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质任选地与CD3ε结合，其中结合常数(Kd)≤1μM，例如，在一些实施例中，≤100nM、≤10nM或≤1nM。

在多个方面，该掩蔽的抗原结合蛋白质(例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)结合表皮生长因子受体(EGFR)。人EGFR的序列以SEQ ID NO:4提供。本文披露的多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质任选地与人EGFR结合，其中结合常数(Kd)≤1μM，例如，在一些实施例中，≤100nM、≤10nM或≤1nM。

在优选的实施例中，该掩蔽的双特异性或多特异性抗原结合蛋白质结合CD3和EGFR二者。

在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质是异源二聚体，使得它包括作为Fab(例如IgG Fab)的抗原结合结构域和作为scFv的抗原结合结构域。例如，在示例性实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质包含结合一个靶标(例如EGFR)的重链和轻链(例如IgG重链和轻链)以及结合第二靶标(例如，T细胞表面抗原例如CD3)的scFv结构域。单链抗体(scFv)是抗原结合蛋白质，其中VL和VH区通过接头(例如，通常长度为约15至约20个氨基酸的氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白质链，其中该接头足够长以允许蛋白质链在自身上回折并形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等人,1988,Science[科学]242:423-26和Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA 85:5879-83)。适用于scFv的接头的实例是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。其他示例性接头含有至少4-5个氨基酸，范围为从约4个残基至约20个残基。

掩蔽的抗原结合蛋白质的示例性形式包含(i)含有scFv的两条重链，该scFv可操作地附接在一条或两条重链的N-末端附近，和(ii)两条轻链，其与重链缔合以形成抗原结合结构域，其中该scFv结合CD3并且Fab部分结合EGFR。在这个实例中，该抗原结合蛋白质包含三个(或四个)抗原结合结构域，其典型地结合两种或更多种不同的抗原(或表位)。适于将scFv连接至重链可变区的接头的实例是GGGGS(SEQ ID NO:2)。示例性接头含有至少1个具有4-5个氨基酸的合适接头。

掩蔽的抗原结合蛋白质包含与抗体(AB)偶联(例如，通过共价键或另一种形式的附接)的掩蔽结构域(MD)。掩蔽结构域(MD)包含掩蔽肽(或掩蔽多肽)(MP)和蛋白质识别位点(PR)。掩蔽肽(或掩蔽多肽)可以是一段氨基酸，其妨碍抗原结合结构域与其抗原的结合。通常，采用长度为5-15个氨基酸的短序列的掩蔽肽，但也考虑了更短和更长的序列(即掩蔽多肽)。掩蔽结构域进一步描述于，例如国际公开号Wo 2017/040344；美国专利公开号2015/0079088(通过引用以其整体并入，并且特别是关于与结合EGFR的抗体一起使用的掩蔽结构域的披露内容)和美国专利公开号2016/0194399(通过引用以其整体并入，并且特别是关于与结合CD3的抗体一起使用的掩蔽结构域的披露内容)中。

在一些实施例中，该掩蔽肽(或掩蔽多肽)(MP)通过蛋白质识别位点(PR)附接到抗原结合结构域(AB)，该蛋白质识别位点任选地是更大接头序列的一部分(即，将MP连接到抗原结合蛋白质的一段氨基酸)。PR作为蛋白质或蛋白酶(优选细胞外蛋白酶)的底物(或结合位点)起作用。可以基于蛋白质或蛋白酶来选择PR，该蛋白质或蛋白酶由接近表达靶标的细胞的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生和/或由与掩蔽的抗原结合蛋白质的至少一种AB的所希望靶标共定位于组织中的细胞(包括，例如肿瘤细胞)产生。在一些实施例中，该蛋白酶是u型纤溶酶原激活剂(uPA，也称为尿激酶)、豆荚蛋白和/或蛋白裂解酶(也称为MT-SP1或MTSP1)。在一些实施例中，该蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)。在一些实施例中，该蛋白酶是描述于Rawlings,N和Salvesen,G.Handbook of Proteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册](第三版).爱思唯尔公司(Elsevier),2013.ISBN:978-0-12-382219-2中的蛋白酶之一。可替代地，MP通过不可裂解的蛋白质结合结构域与抗原结合蛋白质偶联。在这方面，PR任选地是氨基酸序列，该氨基酸序列在与例如蛋白质或蛋白酶相互作用时构象改变，使得MP的位置被调整并且AB可自由地结合靶标。

在本披露的多个方面，双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含构建体的每个抗原结合部分(例如AB1、AB2、AB3等)的MD。例如，包含两个Fab部分和两个scFv的双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质可以包含两组MD，这两组MD可独立地是相同或不同的。为了说明，双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含(i)结合CD3的两个scFv和附接到每个scFv的MD1(对于每个scFv，任选地是相同的MD)，和(ii)结合EGFR的两个Fab部分和附接到每个Fab的MD2(对于每个Fab，任选地是相同的MD)。在多个方面，MD1和MD2的PR包含相同的蛋白质识别序列，允许在与蛋白酶接合后在相同环境中释放每个结合区的MD。MD可以附接在抗原结合结构域的N-末端或C-末端，只要MD能够妨碍抗原结合结构域与靶标的结合，并且一旦释放MD接头不会干扰结合。当抗原结合结构域是Fab时，MD可以与重链可变区或轻链可变区可操作地连接。在双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质包含具有与重链融合的Fab抗原结合结构域和scFv二者的完整抗体(即“堆叠”构象)的情况下，与Fab抗原结合结构域缔合的MD优选地与轻链可变区融合。

在一些实施例中，双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质中的一个AB结构域(例如AB1)与T细胞表面配体(例如CD3)接合，并任选地采用scFv的形式。与CD3接合的示例性掩蔽的抗原结合蛋白质包括但不限于国际公开号WO 2017/040344、美国专利公开号20160194399(通过引用以其整体并入)。

在一些实施例中，抗原结合蛋白质中的一个AB结构域(例如AB2)与肿瘤抗原(例如EGFR)接合。与EGFR接合的示例性掩蔽的抗原结合蛋白质包括但不限于披露于美国专利公开号20150079088(将其披露内容通过引用以其整体并入本文)中的那些抗体。

在一些实施例中，该掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)被修饰以改变抗体的等电点。例如，在一些实施例中，一个或两个掩蔽结构域中的一个或多个带负电荷的pH敏感氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)被带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)取代。在一些实施例中，替换抗体的一个或多个掩蔽部分中的天冬氨酸可以增加pI。在一些实施例中，一个或两个掩蔽结构域中的一个或多个带负电荷的pH敏感氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)被除去或被中性氨基酸取代。

虽然本披露的掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)在本文中通常被描述为包含完整抗体结构，但是本披露还考虑使用缺少传统的两条重链/两条轻链结构的至少一部分的抗原结合抗体片段。用作掩蔽的抗原结合蛋白质的片段包含与如上所述的掩蔽结构域(MD)可操作地连接的抗原结合结构域(AB)。例如，在一些实施例中，该抗原结合蛋白质包含通过合适的接头(例如，足够长度以允许每个scFv结合其靶标的氨基酸区段)连接的两个scFv。一个或两个scFv附接到MD；当两个scFv附接到MD时，MD可以是相同或不同的(即，尽管在多个方面MP和/或PR是不同的，但优选地PR是相同的)。

在一些实施例中，该药物组合物或配制品包含掩蔽的抗原结合蛋白质(例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)，其量的范围为从约50μg至约200mg(或从约500μg至约150mg、或从约50mg至约200mg、或约50mg至约150mg、或约50mg至约100mg、或约50mg至约75mg)。在一些实施例中，该药物组合物包含掩蔽的抗原结合蛋白质(包括双特异性或多特异性掩蔽的抗体结合蛋白质)，其量为约50μg、约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约550μg、约600μg、约650μg、约700μg、约750μg、约800μg、约850μg、约900μg、约950μg、约1mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约105mg、约110mg、约115mg、约120mg、约125mg、约130mg、约135mg、约140mg、约145mg、约150mg、约155mg、约160mg、约165mg、约170mg、约175mg、约180mg、约185mg、约190mg、约195mg或约200mg。

在一些实施例中，该药物组合物包含掩蔽的抗原结合蛋白质(例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)，其浓度范围为从约0.1mg/mL至约50mg/mL(或从约1mg/mL至约10mg/mL、或从约10mg/mL至约20mg/mL、或从20mg/mL至约50mg/mL、或从约1mg/mL至约17mg/mL、或从约0.5mg/mL至约5mg/mL、或从约1mg/mL至约5mg/mL、或从约3mg/mL至约6mg/mL)。在一些实施例中，该药物组合物包含掩蔽的抗原结合蛋白质，其浓度为约0.1mg/mL、约0.5mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL、约15mg/mL、约16mg/mL、约17mg/mL、约18mg/mL、约19mg/mL、约20mg/mL、约21mg/mL、约22mg/mL、约23mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL、约30mg/mL、约31mg/mL、约32mg/mL、约33mg/mL、约34mg/mL、约35mg/mL、约36mg/mL、约37mg/mL、约38mg/mL、约39mg/mL、约40mg/mL、约41mg/mL、约42mg/mL、约43mg/mL、约44mg/mL、约45mg/mL、约46mg/mL、约47mg/mL、约48mg/mL、约49mg/mL或约50mg/mL。

配制品的剂量和治疗用途

术语“有效剂量(effective dose或effective dosage)”定义为足以实现或至少部分实现所希望效应的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已罹患疾病的患者的疾病及其并发症的量。对此用途有效的量或剂量将取决于有待治疗的病状(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的应答、施用途径、患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或病状(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。可以根据主治医生的判断调整适当的剂量，以使得它可以一次施用至患者或经一系列施用而施用至患者，并且以便获得最佳治疗效果。

治疗有效量的掩蔽的抗原结合蛋白质(例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)优选地导致疾病症状的严重程度降低，无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病折磨而产生的损害或残疾。为了治疗表达被本文描述的掩蔽的抗原结合蛋白质(包括双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)识别的抗原的癌症、肿瘤或恶性细胞，治疗有效量的掩蔽的抗原结合蛋白质(例如抗肿瘤细胞抗原(例如EGFR)/抗CD3双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)，相对于未治疗的患者优选地抑制细胞分裂或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在例如预测功效的动物模型中评估分子抑制肿瘤生长的能力。

本文描述的药物组合物和配制品可用于治疗、缓解和/或预防有需要的患者中的如本文所述的病理医学病状。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。治疗包括将配制品应用或施用至患有疾病/病症、具有疾病/病症的症状或具有患疾病/病症的倾向的患者的体内、分离的组织或细胞，目的是治愈、痊愈、缓和、减轻、改变、补救、缓解、改善或影响该疾病、该疾病症状或患该疾病的倾向。术语“疾病”是指将受益于用本文描述的药物组合物进行的治疗的任何病状。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所考虑疾病的病理学病状。如本文使用的，术语“缓解”是指通过将掩蔽的抗原结合蛋白质施用至有需要的受试者，对疾病状态(例如，患有肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的疾病状态)的任何改善。在癌症的情况下，这种改善可以被视为例如减缓或停止患者的肿瘤或癌症或转移性癌症的进展。如本文使用的，术语“预防(prevention)”意指避免疾病或病症或其症状的发生或复发。例如，在癌症的情况下，“预防”涵盖避免受试者中肿瘤或癌症或转移性癌症的发生或复发。

在一些实施例中，本披露提供了用于治疗病症或疾病的方法，该病症或疾病与被本文描述的掩蔽的抗原结合蛋白质识别的一种或多种抗原相关。

在一个实施例中，本披露提供了用于治疗增殖性疾病(例如癌症或肿瘤性疾病)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文描述的药物组合物的步骤。恶性赘生物(通常称为癌症)通常侵入并破坏周围组织，并可能形成转移，即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”涵盖转移到除原始肿瘤之外的其他组织或器官。术语“有需要的受试者”或“需要治疗的那些”包括已经患有病症的那些以及有待预防病症的那些。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。

施用途径

示例性施用途径包括但不限于局部途径(例如表皮、吸入、鼻、眼、耳/耳部、阴道、黏膜)；肠途径(例如口腔、胃肠、舌下、唇下、颊、直肠)；和肠胃外途径(例如静脉内、动脉内、骨内、肌肉内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮、鼻内、经黏膜、滑膜内、管腔内)。优选地，该药物组合物通过胃肠外施用，例如静脉内、皮下或肌肉内施用。肠胃外施用可以通过注射，例如推注注射，或通过输注，例如连续输注来实现。施用可通过贮库实现长期释放。在一些实施例中，通过初始推注、随后连续输注以维持药物产品的治疗循环水平静脉内施用该药物组合物。在一些实施例中，该药物组合物以一次性剂量施用。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利号4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中。

本披露考虑了具有本文描述特征的冻干组合物。如果药物组合物已被冻干，则在施用之前首先将冻干材料在适当液体中重构。可以将冻干材料在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冷冻干燥前蛋白质所处于的相同配制品中重构。本披露考虑了具有本文描述特征的先前冻干组合物的重构组合物。药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或与额外的疗法(例如视需要的抗癌疗法，例如其他蛋白质和非蛋白质药物)组合施用。这些药物可以与如本文定义的本披露的组合物同时施用，或者在施用所述配制品之前或之后以及时定义的间隔和剂量分别施用。

药剂盒

作为另外的方面，提供了包含一种或多种本文描述的药物组合物的药剂盒，该药物组合物以利于用于施用受试者的方式包装。在一个实施例中，此类药剂盒包括本文描述的药物组合物(例如，包含掩蔽的抗原结合蛋白质(例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)的组合物)，该药物组合物包装在容器中，例如在密封瓶、小管、单次使用或多次使用的小瓶、预填充式注射器或预填充式注射装置中，该药剂盒任选地具有贴附于容器上或包括在包装中的标签，该标签描述了化合物或组合物在实践该方法中的用途。在一个方面，该组合物被包装为一个单位剂型。该药剂盒可以进一步包括适于根据具体的施用途径施用该组合物的装置。优选地，该药剂盒含有描述本文描述的掩蔽的抗原结合蛋白质或本文描述的药物组合物的用途的标签。

通常，对于本发明的药物组合物，可以想到多种储存和/或剂型，这取决于预期的施用途径、递送型式和所希望的剂量(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,Oslo,A.,编辑,(2012))。技术人员将意识到，特定剂型的这种选择可以例如影响抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

实例

实例1

糖稳定剂(例如蔗糖)和低pH对掩蔽的抗原结合蛋白质组合物的聚集的影响

产生包含在100mM甘氨酸(pH 4.9)中的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质(1mg/mL)的组合物(配制品A)。该液体组合物在2℃-8℃储存后或在2℃-8℃储存四周后立即显示出显著的聚集，其具有大约27％-28％的高分子量(HMW)种类(参见图6、7和10)。

为了通过改善稳定性并减少聚集和HMW种类的量来改善组合物的临床效用，将该组合物缓冲液交换到如下范围从pH 3.6至pH 7.0的若干种配制品(配制品B-F)中：

配制品B：10mM谷氨酸盐、9％蔗糖、pH 3.6

配制品C：10mM谷氨酸盐、9％蔗糖、pH 4.2；

配制品D：10mM乙酸盐、9％蔗糖、pH 5.2；

配制品E：10mM磷酸盐、9％蔗糖、pH 6.3；和

配制品F：10mM磷酸盐、9％蔗糖、pH 7.0。

通过在4℃在7000kDa截止盒(cutoff cassette)中透析起始组合物过夜来进行缓冲液交换，其中有三次缓冲液变化。在添加0.01％聚山梨醇酯80后将透析的材料装瓶，并在2℃-8℃和25℃监测样品的稳定性一个月。每种配制品中装瓶的掩蔽的抗原结合蛋白质的最终浓度为1mg/mL。在2℃-8℃和25℃，分别在第两周和四周，通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)分析所有样品。配制品B-F的SE-UHPLC分析结果分别列于图1-6中。配制品A的SE-UHPLC分析结果列于图10中。

如图6A所示，与起始组合物(即配制品A)相比，在2℃-8℃储存四周后，％高分子量(HMW)种类在较低pH配制品中显著降低。例如，本文描述的掩蔽的抗原结合蛋白质配制品从观察到的聚集的最高量到最低量排序是配制品A>配制品F>配制品E>配制品D>配制品C>配制品B。

该数据有力地表明含有掩蔽的抗原结合蛋白质的药物组合物的稳定性、聚集和临床效用通过以下显著改善：(1)添加糖或稳定剂(例如蔗糖)-其中包含糖或稳定剂(例如蔗糖)使聚集/％HMW种类减少了约3倍；和(2)在低pH下配制药物组合物，其中该pH低于掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1、AB2、MD1和MD2区的等电点(pI)-这进一步使聚集/％HMW种类减少了另外的约3倍。使用Bjellqvist算法确定双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1、AB2、MD1和MD2区的pI，以具有与表1中提供的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质2相当的模式。当在大于4.54的pH下配制时，似乎带负电荷的MD1会超过另外带正电荷的蛋白质，有可能导致溶液不稳定。在较低的pH是4下，所有组分(例如AB1、AB2、MD1和MD2)带正电荷的程度不同，从而产生排斥力。该数据强烈支持糖或稳定剂(例如蔗糖)和低pH(其中该pH低于掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1、AB2、MD1和/或MD2区的等电点(pI))的组合协同地或剧烈地降低了包含掩蔽的抗原结合蛋白质(包括，例如双特异性或多特异性掩蔽的抗原结合蛋白质)的药物组合物的聚集/％HMW种类。

实例2

通过添加糖或稳定剂(例如蔗糖)和低pH来逆转双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质组合物的聚集

如实例1中所述，将具有高起始聚集水平的双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质样品缓冲液交换到低pH配制品缓冲液(配制品C)中。简言之，通过在4℃在7000kDa截止盒中透析起始材料过夜来进行缓冲液交换，其中有三次缓冲液变化。透析过程导致聚集水平显著降低，这说明低pH配制品能够逆转初始聚集。比较图2B(报告了配制品C的3.91％HMW种类)和图10B(报告了配制品A的28.49％HMW种类)的时间零点。该比较也显示在图7B中。通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)分析样品，该技术使用尺寸排阻超高效分析柱基于其流体力学体积来分离溶液中的蛋白质。

如图8A-8B所示，在4℃和25℃储存0周、1周和两周后，1mg/mL的透析材料是稳定的。储存后的聚集水平没有升高。在25℃储存的样品通过SEC展现出高分子种类略微降低，这表明聚集可以由疏水相互作用驱动。

低pH配制品(配制品C)在较高浓度下在稳定双特异性掩蔽的抗原结合蛋白质方面也是有效的。与11mg/mL的起始材料(配制品A)相比，17mg/mL的低pH配制品缓冲液(配制品C)中的蛋白质具有显著更低的聚集(图9)。在4℃储存0周、两周和4周后，17mg/mL材料是稳定的(图9)。即使与配制品A(图10)相比，配制品C在2℃-8℃或25℃在第0周、2周和4周(图2)表现出聚集/％HMW种类的显著减少和稳定性改善，与配制品C相比，在pH 3.6下的配制品B显示聚集/％HMW种类的另外减少。参见，例如图6；还参见图1并与图2进行比较。该数据显示，进一步降低药物组合物的pH-其已经低于掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1、AB2、MD1和MD2区的等电点(pI)-可进一步降低该掩蔽的抗原结合蛋白质的聚集。

实例3

多元醇(例如蔗糖)和低pH对掩蔽的抗原结合蛋白质组合物的聚集的影响

确定ProTIA前药的抗体结构域(AB1和/或AB2)和膨胀剂/掩蔽结构域(MD1和/或MD2)的pI，该ProTIA前药包含如国际公开号WO 2017/040344的表5、10和/或12和/或图36或37中所述的氨基酸序列。接下来，将ProTIA前药在合适的缓冲液(例如10mM谷氨酸盐或10mM乙酸盐)中连同合适的多元醇(例如9％蔗糖)以及任选地表面活性剂(例如0.01％聚山梨醇酯80)一起配制，并且将该组合物的pH降低至约7.0-3.5之间，使得该组合物的pH低于抗体结构域(AB1和/或AB2)和膨胀剂/掩蔽结构域(MD1和/或MD2)的pI。如实例1和2中所述，评估多元醇和低pH对ProTIA前药低pH聚集的影响。

序列表

<110> 安进公司

<120> 包含掩蔽的抗原结合蛋白的配制品和药物组合物

<130> A-2243-WO-PCT

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 接头

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 接头

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 207

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD3

<400> 3

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 4

<211> 1091

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> EGFR

<400> 4

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Gly Gln Lys

130 135 140

Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu

145 150 155 160

Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly

165 170 175

Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala

180 185 190

Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys

195 200 205

Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu

210 215 220

Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val

245 250 255

Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu

260 265 270

Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys

275 280 285

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

290 295 300

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

305 310 315 320

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

325 330 335

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

340 345 350

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

355 360 365

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

370 375 380

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

385 390 395 400

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

405 410 415

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

420 425 430

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

435 440 445

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

450 455 460

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

465 470 475 480

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

485 490 495

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

500 505 510

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

515 520 525

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

530 535 540

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

545 550 555 560

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

565 570 575

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

580 585 590

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

595 600 605

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg

610 615 620

Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu

625 630 635 640

Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln

645 650 655

Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val

660 665 670

Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro

675 680 685

Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu

690 695 700

Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val

705 710 715 720

Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys

725 730 735

Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys

740 745 750

Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr

755 760 765

Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu

770 775 780

Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val

785 790 795 800

Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu

805 810 815

Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro

820 825 830

Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His

835 840 845

Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr

850 855 860

Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser

865 870 875 880

Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile

885 890 895

Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser

900 905 910

Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg

915 920 925

Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu

930 935 940

Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu

945 950 955 960

Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln

965 970 975

Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser

980 985 990

Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn

995 1000 1005

Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg

1010 1015 1020

Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp

1025 1030 1035

Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Gly Glu Trp Leu Val Trp Lys Gln

1040 1045 1050

Ser Cys Ser Ser Thr Ser Ser Thr His Ser Ala Ala Ala Ser Leu

1055 1060 1065

Gln Cys Pro Ser Gln Val Leu Pro Pro Ala Ser Pro Glu Gly Glu

1070 1075 1080

Thr Val Ala Asp Leu Gln Thr Gln

1085 1090

Claims (38)

1.一种药物组合物，该药物组合物包含：

(a)掩蔽的抗原结合蛋白质，该掩蔽的抗原结合蛋白质包含：

(i)与抗原结合的抗体或其抗原结合片段(AB1)；和

(ii)与AB1偶联的掩蔽结构域(MD1)，其中该掩蔽结构域包含：

a.抑制或降低AB1与该抗原的结合的掩蔽肽或掩蔽多肽(MP1)；和

b.蛋白质识别位点(PR1)，其中蛋白质与该PR1的结合或蛋白酶对该PR1的切割增加AB1与该抗原的结合；

(b)至少一种缓冲剂；和

(c)至少一种多元醇，

其中该药物组合物的pH低于该掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1和MD1区的等电点(pI)。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中该掩蔽的抗原结合蛋白质进一步包含：

(iii)与第二抗原结合的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)；和

(iv)与AB2偶联的第二掩蔽结构域(MD2)，其中该第二掩蔽结构域包含：

a.抑制或降低AB2与该抗原的结合的掩蔽肽或掩蔽多肽(MP2)；和

b.蛋白质识别位点(PR2)，其中蛋白质与该PR2的结合或蛋白酶对该PR2的切割增加AB2与该抗原的结合；

其中该药物组合物的pH低于该掩蔽的抗原结合蛋白质的AB1、AB2、MD1和MD2区的等电点(pI)。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中该掩蔽的抗原结合蛋白质是Probody或ProTIA前药。

4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中AB1和/或AB2是scFv或Fab。

5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中AB1和/或AB2结合在细胞表面上表达的抗原。

6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中该至少一种缓冲剂选自下组，该组由以下组成：乙酸盐、谷氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、组氨酸、磷酸盐和2-(N-吗啉代)乙磺酸盐或其组合。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中该至少一种缓冲剂以约5mM至约200mM的浓度范围存在。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中该至少一种缓冲剂以约10mM至约50mM的浓度范围存在。

9.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中该至少一种多元醇选自下组，该组由以下组成：糖、环状多糖、糖醇、线性支链型葡聚糖和线性非支链型葡聚糖或其组合。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其中该糖是单糖或二糖。

11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇、甘油、环糊精、磺丁基环糊精或其组合。

12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中该至少一种多元醇以约1％(w/V)至约20％(w/V)的浓度范围存在。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其中该至少一种多元醇以约9％(w/V)至约12％(w/V)的浓度范围存在。

14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种表面活性剂。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中该至少一种表面活性剂选自下组，该组由以下组成：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯3和PEG 3350、PEG 4000和PEG 8000或其组合。

16.如权利要求14或15所述的药物组合物，其中该至少一种表面活性剂以约0.001％(w/V)至约0.5％(w/V)的浓度范围存在。

17.如权利要求16所述的药物组合物，其中该至少一种表面活性剂以约0.001％(w/V)至约0.01％(w/V)的浓度范围存在。

18.如权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，其中该组合物的pH比AB1、AB2、MD1和/或MD2的pI低约2个pH单位。

19.如权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，其中该组合物的pH大于约3.5。

20.如权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中该组合物的pH在7.0和3.6之间。

21.如权利要求1-20中任一项所述的药物组合物，其中该组合物的pH在4.0和5.0之间。

22.如权利要求1-21中任一项所述的药物组合物，其中该组合物的pH在3.5和5.5之间。

23.如权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中该组合物的pH是约4.2或3.6。

24.如权利要求1-23中任一项所述的药物组合物，该药物组合物具有150mOsm至500mOsm的渗透压范围。

25.如权利要求1-24中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含氨基酸赋形剂。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其中该氨基酸赋形剂以约0.1mM至约20mM的浓度范围存在。

27.如权利要求1-26中任一项所述的药物组合物，其中该组合物包含10mM谷氨酸盐、9％(w/V)蔗糖和0.01％(w/V)聚山梨醇酯80，并且其中该药物组合物的pH是4.2或3.6。

28.如权利要求1-27中任一项所述的药物组合物，其中该掩蔽的抗原结合蛋白质以约0.1mg/ml至约30mg/ml的浓度范围存在。

29.如权利要求1-28中任一项所述的药物组合物，其中该掩蔽的抗原结合蛋白质以从约50μg至约200mg的量范围存在。

30.如权利要求1-29中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物是冻干组合物。

31.如权利要求1-30中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物是液体组合物。

32.如权利要求31所述的药物组合物，其中该药物组合物是重构的冻干组合物。

33.如权利要求1-32中任一项所述的药物组合物，其中该组合物是液体组合物并且在2℃-8℃、4℃和/或25℃储存0周、1周、2周、4周、2个月、6个月、1年和/或2年后是稳定的；或者其中该组合物是冻干组合物并且在2℃-8℃、4℃和/或25℃储存0周、1周、2周、4周、2个月、6个月、1年、2年、3年、4年和/或5年后是稳定的。

34.如权利要求1-33中任一项所述的药物组合物，其中抗体聚集的量减少。

35.如权利要求1-34中任一项所述的药物组合物，其中如通过超高效液相色谱(SE-UHPLC)测量的，高分子量抗体种类的量减少。

36.如权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中与参考药物组合物相比，在高于该药物组合物的pH下，抗体聚集和/或高分子量抗体种类的量减少约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。

37.如权利要求1-36中任一项所述的药物组合物，其中使用Bjellqvist算法测量或确定该pI。

38.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1-37中任一项所述的组合物。

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