CN112533597A - 蛋白质和肽的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于分离多肽例如蛋白质组的方法、试剂和试剂盒。本文还提供了对自溶具有抗性，并且一旦消化完成就可以与生物样品选择性分离的修饰的胰蛋白酶多肽。

Description

蛋白质和肽的纯化方法
关于联邦提供资金的声明
本发明是在国家科学基金会授予的第IIP-1700833号基金的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月8日提交的美国临时专利申请第62/763,298号和2019年3月14日提交的美国临时专利申请第62/919,469号的权益，在此通过引用将各临时申请整体并入本文。
蛋白质组学研究细胞、组织和生物体中所有表达的蛋白质，其中细胞表达数千种不同的蛋白质，其浓度范围从每个细胞数百个拷贝到数千万个拷贝。蛋白质组学研究和诊断的主要障碍是样品制备。蛋白质样品来自多种来源，各来源都有其自身的制备问题。一些样品的盐含量高，一些样品的DNA和RNA含量高，一些样品非常稀，一些样品具有大量脂质和小有机化合物。没有通用的蛋白质样品制备方法。
蛋白质组学研究和诊断的重要绊脚石是肽样品的制备。肽生产中的常见步骤是蛋白质的蛋白水解消化。胰蛋白酶是用于蛋白质组学肽分析的最常见的蛋白水解酶。一旦蛋白质被消化，则必须在质谱分析之前去除胰蛋白酶。另外，胰蛋白酶容易自消化，这会使肽样品污染有因胰蛋白酶自溶而产生的肽。这些胰蛋白酶自溶肽会强烈干扰蛋白质组样品的分析。
需要制备用于蛋白质组学的蛋白质样品的改进方法。
发明概述
根据本发明的一个方面或实施方案，提供了包含连接于二羧酸酐部分的生物正交偶联对的成员的化合物。
根据本发明的另一方面，提供了修饰的胰蛋白酶多肽。该修饰的胰蛋白酶多肽包含：胰蛋白酶多肽；连接于胰蛋白酶多肽的生物素部分；以及连接于胰蛋白酶多肽的包含生物正交偶联对的成员的基团，其中胰蛋白酶多肽上包含生物正交偶联对的成员的基团与生物素部分的比例为1:4至1:6。还提供了制备胰蛋白酶多肽片段的方法，包括用修饰的胰蛋白酶多肽消化多肽。
在本发明的另一方面或实施方案中，提供了蛋白质或肽分离试剂盒，包含在容器中的权利要求1-13中任一项所述的化合物，或在包装的容器中的权利要求14或15所述修饰的胰蛋白酶多肽。
根据本发明的另一方面或实施方案，提供了纯化多肽的方法，包括：
使包含多肽的碱性pH的样品与一定量的包含部分的偶联化合物混合，所述部分包含通过接头连接于马来酸酐部分的生物正交偶联对的第一成员；
使样品中的多肽与连接于基质(substrate)的生物正交偶联对的第二成员偶联；
任选地洗涤与基质结合的多肽，以从结合基质的多肽中去除任何未结合的物质；和
在酸性pH的洗脱溶液中从基质中洗脱多肽。
在另一方面或实施方案中，提供了制备修饰的胰蛋白酶多肽的方法，包括使胰蛋白酶多肽与摩尔比为4:1至6:1的第一化合物和第二化合物缀合，所述第一化合物包含连接于生物素的胺反应性部分或巯基反应性部分，所述第二化合物包含连接于生物正交偶联对的第一成员的胺反应性部分或巯基反应性部分。
附图的简要说明
图1A和1B示意性地显示了本文所述蛋白质或多肽纯化方法的非限制性实例。
图2A和2B说明了使用mTet-CDM和TCO-珠净化蛋白质/肽的过程。图2A显示了反应的前半部分，其中使mTet-CDM与任何蛋白质或肽偶联，然后与TCO-珠混合。图2B显示了该过程的后半部分，其中使偶联mTet-CDM的蛋白质/肽与TCO珠偶联，洗去污染物，最后在弱酸性pH下逆转CDM与蛋白质/肽的连接。
图3提供了胰蛋白酶多肽的示例性序列(SEQ ID NO:1)。
图4是示例性盒(cartridge)的示意图。
图5说明了实施例1所述的示例性蛋白质纯化工作流程。
图6显示了mTet-PEG4-CDM的合成方案。
图7提供了TCO珠的说明性合成方案。
图8用mTet-CDM标记伯胺在100mM HEPES中的效率更高，并且在碳酸酐酶的标记率在～80％时达到平衡。在存在10mM HEPES pH 8.0(以浅蓝色显示)或100mM HEPES pH 8.0(以深蓝色显示)的情况下，用mTet-CDM标记碳酸酐酶蛋白。尽管在10mM HEPES pH 8.0中进行标记在～30％时达到平衡，但在100mM HEPES pH 8.0中进行标记在～80％时达到平衡，这表明较高的HEPES浓度对于广泛标记很重要。
图9.含有0.3M NaCl和1％SDS的缓冲液在防止蛋白质与TCO珠非特异性结合方面表现最佳。
图10.mTet-CA与TCO珠的结合在30min(分钟)内达到94％。为了找出使mTet标记的蛋白质与TCO珠结合的最佳孵育时间，进行了1小时的时程，并测定了mTet-CA与TCO珠的结合。30min后，94％的mTet-CA与TCO珠结合，并在此时间点达到平衡。对于所有未来的结合事件，使用30min的孵育时间。
图11.在3次洗涤中从TCO珠上洗脱mTet-CA，孵育时间短至15min。随着孵育时间的增加，在四次洗涤中洗脱与TCO珠结合的mTet-CA。计算并比较每个孵育时间的总洗脱产率(A)和每个单独洗涤的洗脱产率(15min的孵育洗脱用作代表图B)。所有洗脱孵育时间均产生高于80％的产率，其中30min产生的产率最高，为94％，在前两次洗脱洗涤中发现了89％的洗脱蛋白。
图12.全酵母裂解物的捕获、洗涤和释放导致81％的产率。含有100μg酵母蛋白质组的样品用mTet-CDM标记，并使用我们的捕获、洗涤和释放样品制备工作流程进行净化。洗脱后，回收了超过80％的蛋白质组。
图13.洗脱蛋白的2D-DIGE显示出相似的蛋白质组图谱，其中一些斑点在荷载样品(load sample)或洗脱样品中更富集。使用2D-DIGE比较未经受蛋白质组样品制备工作流程的酵母蛋白质组样品(A)和经受蛋白质组样品制备工作流程的酵母蛋白质组样品(B)。
图14.整个蛋白质净化工作流程的评估。条带1：荷载，条带2：未结合，条带3：洗脱1，条带4：洗脱2，条带5：模拟洗脱。注意洗脱级分中的脲减少了蛋白质样品的考马斯蓝(Coomassie Blue)染色。条带5显示了荷载样中相同量的蛋白质，但在洗脱缓冲液中。这表明洗脱了几乎100％的荷载蛋白。
图15.净化后Cy3伯克霍尔德菌(Burkholderia)裂解物的二维电泳凝胶。
图16提供的图形显示了实施例5的肽相对于缀合于该肽的mTet-CDM的量的回收率。
发明详述
除非另外明确指出，否则在本申请中指定的各种范围内的数值的使用表示为近似值，如同所述范围内的最小值和最大值均以词语“约”开头。以这种方式，可以使用在所述范围之上和之下的微小变化来获得与范围内的值基本相同的结果。同样，除非另外指出，否则范围的公开旨在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。如本文所用，“一个/种(a)”和“一个/种(an)”是指一个/种或多/种。患者是人类或非人类动物。
本文所用术语“包括/包含(comprising)”是开放式的，并且可以与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征为...”同义。本文所用的“包括”一个或多个所述要素或步骤的实施方案还包括但不限于“基本组成为”和“组成为”这些所述要素或步骤的实施方案。
“部分(moiety)”(多个“部分”)是指化合物的一部分，且包括诸如官能团等基团。因此，核苷碱基部分是指通过与另一化合物部分连接而得以修饰的核苷碱基，另一化合物部分为诸如聚合物单体，例如本文所述的核酸或核酸类似物单体，或为聚合物，例如本文所述的核酸或核酸类似物。
“烷基”是指包括1到约20个碳原子的直链、支链或环状烃基，例如但不限于C1-3、C1-6、C1-10基团，例如但不限于直链、支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。“取代的烷基”是指在1个或多个位置，例如1、1、2、3、4、5或甚至6个位置上被取代的烷基，该取代基通过本文所述的取代连接在任何可用原子上以产生稳定的化合物。“任选地取代的烷基”是指烷基或取代的烷基。"卤素"、“卤化物”和“卤代”是指-F、-Cl、-Br和/或-I。“亚烷基”和“取代的亚烷基”分别是指二价烷基和二价取代的烷基，包括但不限于乙烯基(-CH2-CH2-)。“任选地取代的亚烷基”是指亚烷基或取代的亚烷基。
“烯烃或烯基”是指包括2至约20个碳原子的直链、支链或环状烃基，例如但不限于C1-3、C1-6、C1-10基团，具有一个或多个例如1、2、3、4或5个碳-碳双键。“取代的烯烃”是指在1个或多个，例如1、2、3、4或5个位置上被取代的烯烃，该取代基通过本文所述取代连接在任何可利用的原子上以产生稳定的化合物。“任选地取代的烯烃”是指烯烃或取代的烯烃。同样，“亚烯基”是指二价烯烃。亚烯基的实例包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-)及其所有立体异构形式和构象异构形式。“取代的亚烯基”是指二价取代的烯烃。“任选地取代的亚烯基”是指亚烯基或取代的亚烯基。
“环烷基”是指单环、双环、三环或多环的3-14元饱和、不饱和或芳族环系统。“环烯基”是指单环、双环、三环或多环的3-14元环系统，且在环系统中包含至少一个碳-碳双键。环烷基可以通过任何原子连接。环烷基还考虑了稠合的环，其中环烷基稠合于芳基环或杂芳基环。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可以是未取代的或任选地被一个或多个下文所述的取代基取代。“环亚烷基(cycloalkylene)”是指二价环烷基。术语“任选地取代的环亚烷基”是指被1、2或3个连接在任何可利用的原子上以产生稳定化合物的取代基取代的环亚烷基。
如本文所用，“多肽”包括蛋白质和寡肽作为类别，并且通常是指包含两个或更多个氨基酸残基的多肽，尽管通常是指更长的氨基酸链。
包含多肽的“样品”可以是血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓液、细胞裂解物、细胞培养基或包含多肽的任何其他生物组合物。在一个实施方案中，样品是来自患者组织样品的细胞裂解物。在另一个实施方案中，通过裂解来自细胞培养物的成团细胞来制备样品，例如以产生重组蛋白或分析细胞、组织或器官培养物的细胞的蛋白质组。
接头是化合物中使一个部分连接至另一部分的部分。“惰性”接头是这样的部分，其使化合物中的一个部分与另一个部分共价连接，并且任选地使化合物中的一个部分与另一个部分间隔开，并且对整个化合物的活性没有实质性的负面影响，例如在本发明的上下文中，反应性基团(例如四嗪基团、琥珀酰二亚胺基(succidimidyl)基团或诸如马来酸酐等二羧酸酐基团)与其预期靶标反应并根据本文所述方法形成并维持键的能力。除了用于共价连接两个部分之外，接头还可具有有益的作用，例如在其连接的部分的物理分离中，例如，优化间隔以避免空间效应。接头还可以起到某些其他功能，例如改变整个分子的疏水性/亲水性，以提供另外的位点，例如被保护基保护的胺，用于使另外的部分连接到化合物上，或使整个分子刚性化。通过任何合适的连接部分(“连接”)，例如通过碳-碳键、酯、硫酯、胺、醚、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯与化合物的其他部分连接，使接头连接于该化合物的剩余部分。接头可以是仅包含碳和氢，或任选地包含一个或多个诸如N、O和/或S等杂原子的烃基。在本发明的上下文中，在一个实施方案中，一个合适的接头是包含PEG基团–(O-CH2-CH2)n–的二价部分，其中n为2-100，例如2-10(PEG2-10)或2-5(PEG2-5)，例如2、3、4(PEG4)、5、6、7、8、9或10。除了使PEG基团连接于四嗪和诸如马来酸酐部分等二羧酸酐部分上的合适连接之外，PEG接头还可以在任一端包含一个或多个亚甲基。
在本发明的一个方面或实施方案中，提供了包含与二羧酸酐部分连接的生物正交偶联对的第一成员例如四嗪部分的化合物。二羧酸酐，例如马来酸酐，例如柠康酸酐，已用于蛋白质缀合(参见例如Klapper ML and IM Klotz,[46]Acylation with DicarboxylicAcid Anhydrides Methods Enzymol.1972；25:531-6；Atassi MZ and AF Habeeb,[49]Reaction of proteins with citraconic anhydride Methods Enzymol.1972；25:546-53；Butler PJ,Hartley BS[14]Maleylation of amino groups Methods Enzymol.1972；25:191-9；A.J.Kirby and P.W.Lancaster,Structure and efficiency inintramolecular and enzymic catalysis.Catalysis of amide hydrolysis by thecarboxy-group of substituted maleamic acids Journal of the Chemical SocietyPerkin Transactions2 2(9)January 1972)。生物正交偶联对的第一成员，例如四嗪部分，与二羧酸酐连接，以产生可用于纯化多肽的化合物。
在使用时，通过在化合物的二羧酸酐与多肽的伯胺之间形成酰胺键使化合物与多肽连接后，使生物正交偶联对的第一成员与连接于基质的生物正交偶联对的第二成员反应，所述基质为例如珠、多孔表面或固体表面，从而产生结合基质的多肽(例如蛋白质或肽)。二羧酸酐部分与多肽伯胺的反应会形成酸不稳定性酰胺键。弱酸(例如，pH在＞2至6的范围内)会裂解缀合物的酰胺键，从而可以洗脱多肽。这样，用于从多肽中洗涤任何细胞组分、且不裂解基质与结合的多肽之间的酰胺键的洗涤溶液可以适于洗涤多肽的目的。
应该认识到样品中存在的一些非蛋白质化合物也可能包含伯胺，并且可以与多肽一起纯化。然而，对于大多数蛋白质组测定而言，这种非蛋白质污染预计不会对测定产生重大影响。因此，纯化是指通过从样品中去除其他成分来富集样品中的一种或多种成分。应当理解的是，在实施方案中，多肽或蛋白质的纯化过程通过例如用例如水、盐水、TRIS-EDTA、PBS等合适的洗涤溶液在不从柱上洗脱下多肽的条件下洗涤结合基质的多肽，来有效地使多肽与诸如核酸、碳水化合物和脂质等其他细胞材料分离。
一方面，使多肽结合于色谱柱基质，例如多孔基质或珠，使得可以在单个色谱柱中进行洗涤和洗脱(参见例如图1A)。色谱柱是能够保留基质并允许溶液通过基质而不会损失基质的任何容器。色谱柱通常是带有固定网或筛网的管。
在本发明的另一方面，提供了蛋白质或多肽的纯化方法。该方法是通用的，因为它仅靶向存在于所有多肽N末端的伯胺和赖氨酸残基。可以使用任何生物样品，例如获自患者的生物样品，或细胞、组织或器官培养物，活体组织切片，来自诸如尿液、血液、唾液、粘液、脑脊髓液、精液、吸出液等任何生物流体样品的成团细胞，用于产生重组蛋白的组织培养物等。在该方法中，例如通过使用众所周知的任何合适方法来制备细胞裂解物，例如通过均质化，任选地在存在任何合适的盐、缓冲液、表面活性剂、乳化剂、离液剂、螯合剂等的情况下，例如在脲、SDS或RIPA缓冲液中。一方面，在弱碱性缓冲液或盐溶液中制备细胞裂解物，例如以产生pH范围为>7至10，例如8-9.5的裂解物。样品可以不含细胞，可以不需要裂解，例如在分析分泌蛋白组的情况下，在产生分泌到培养基中的重组蛋白时，或在分析生物流体的无细胞制剂(例如离心的上清液)时。
如果要分析细胞裂解物，则一旦裂解细胞，如果需要，就使用例如盐或缓冲溶液将裂解物的pH调节至＞7-10的pH范围，例如8-9.5。使裂解物与包含双正交偶联对的连接于二羧酸酐部分的第一成员的化合物混合，所述二羧酸酐部分为例如但不限于mTET-PEG4-CDM，所述第一成员为例如但不限于四嗪部分。然后使样品与连接有生物正交偶联对的第二成员例如TCO的基质反应。可以通过任何合适的化学方法，使生物正交偶联对的第二成员与基质连接，例如通过NHS使其与基质的伯胺偶联。基质可以是珠，例如但不限于磁珠、琼脂糖珠、塑料表面或玻璃表面(例如诸如96孔板等多孔板的孔)或多孔基质。基质可包含不会在任何实质程度上干扰本文所述反应和过程的任何合适的基质材料。当以生物学和化学领域众所周知的方式偶联、洗涤和洗脱多肽时，基质可以包含在色谱柱、旋转柱或保留基质的任何其他物理形式中。磁珠以本领域公认的任何方式进行处理。
然后使用例如pH为6.0或更小的非酸性的任何合适的洗涤溶液洗涤结合多肽的基质，以防止使多肽连接于基质的酰胺键过早水解。合适的洗涤溶液包括但不限于水、盐水、PBS、Tris-EDTA或其他不会水解使多肽与基质连接的酰胺键的盐溶液或缓冲盐溶液。对于任何选择的基质，可以以本领域公认的方式将基质洗涤一次或多次。可以应用两个或更多个洗涤步骤，并使用相同或不同的洗涤溶液。
在上述和图1A所示方法的变型中，纯化的是肽，而不是整个蛋白质。这示意性地描绘于图1B中。简而言之，在细胞或组织裂解后添加蛋白酶消化步骤。在一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶，在另一个实施方案中，蛋白酶是如下所述的修饰的胰蛋白酶。
一旦洗涤了结合多肽的基质，则使用弱酸性洗脱液从基质上洗脱多肽。洗脱溶液的组成可以变化，这取决于洗脱多肽的所需最终用途。洗脱溶液的pH范围可以为2至＜7或2.5-6。通过使用与多肽的胺偶联的羧酸酐，一旦使多肽与基质偶联的酰胺键裂解了，则该多肽的伯胺就得以恢复。
“点击化学(click Chemistry)”描述了这样的反应，所述反应高收率、范围广、仅产生无需色谱法即可去除的副产物，且是立体特异性的、易于实施并且可以在容易去除或良性的溶剂中进行。在本公开的上下文中，点击化学反应是双正交的，这意味着它具有足够的选择性，使得它即使在复杂的生物环境中也可以可靠地进行。这些反应必须在存在于活体系统中的众多官能团(如亲核体、亲电体、还原剂、氧化剂和水)存在的情况下有效进行。同时，这些反应本身对生物学的影响应该最小。
在生物正交反应例如生物正交点击化学反应的上下文中，依赖于分子或部分之间在天然化合物中未发现的在本文中称为生物正交偶联对的键形成。此类反应优选为：对生物分子上存在的其他潜在反应性官能团具有选择性，在接近生理pH的水性介质中进行，并在室温(或高达37℃)下使用低反应物浓度具有快速反应速率，所有这些都可确保高修饰效率(Lopes Bernardes,G.,Oliveira,B.,&Guo,Z.(2017).Inverse electron demandDiels–Alder reactions in chemical biology.Chemical Society Reviews https://doi.org/10.17863/CAM.10698)。生物正交反应试剂(生物正交偶联对)不与诸如蛋白质或核酸等天然细胞产物发生反应。偶联在很宽泛的水性条件下发生，并且一旦形成就是稳定的。在一个实施方案中，生物正交反应是反电子需求Diels-Alder反应(IEDDA，例如反电子需求[4+2]Diels-Alder环加成)，其中，富电子亲二烯体(例如应变烯烃(strained alkene)与贫电子二烯(例如，四嗪，例如1,2,4,5-四嗪或4-(1,2,4,5-四嗪基)苯基部分，例如4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基、6-烷基-1,2,4,5-四嗪、6-吡啶-2-基-1,2,4,5-四嗪、6-嘧啶-2-基-1,2,4,5-四嗪、4-(6-烷基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基、4-(6-吡啶-2-基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基或4-(6-嘧啶-2-基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基，其中烷基可以是C1-4烷基)反应(参见例如Karver,MR,et al.,Synthesis and Evaluation of a Series of 1,2,4,5-tetrazines for Bio-orthogonal Conjugation.Bioconjug Chem.2011November 16；22(11):2263-2270)，这与标准电子需求Diels-Alder反应相反，在标准电子需求Diels-Alder反应中，富电子二烯与贫电子亲二烯体反应(对于进一步详情以及提供其他生物正交反应的实施例，参见例如Lopes Bernardes,G.,Oliveira,B.,&Guo,Z.(2017).ChemicalSociety Reviews https://doi.org/10.17863/CAM.10698)。注意“1,2,4,5-四嗪(1,2,4,5-tetrazine)”是指准确的1,2,4,5-四嗪化合物或1,2,4,5-四嗪基部分，而“一个1,2,4,5-四嗪(a 1,2,4,5-tetrazine)”是指包含1,2,4,5-四嗪基部分的化合物或部分。在另一个实例中，生物正交偶联对是炔烃-叠氮化物偶联对，例如众所周知的炔丙基部分和叠氮基部分。
在IEDDA反应中，使贫电子二烯，例如1,2,4,5-四嗪，与富电子亲二烯体例如应变亲二烯体反应，并使用微调贫电子二烯和富电子亲二烯体(“IEDDA偶联对”)的选择来定制反应动力学(同上)。用于IEDDA反应的合适的贫电子二烯的非限制性实例包括：四嗪，诸如1,2,4,5四嗪，例如甲基四嗪和三嗪(参见例如Devaraj,NK,et al.,Fast and SensitivePretargeted Labeling of Cancer Cells via Tetrazine/Trans-CycloocteneCycloaddition Agnew Chem Int Ed Engl.2009；48(38):7013-7016and Karver,MR,etal.,Bioconjug Chem.2011November 16；22(11):2263-2270)。用于IEDDA反应的富电子亲二烯体的非限制性实例是反式环辛烯。生物正交反应和反应对的一个非限制性实例是甲基四嗪(mTet)和反式环辛烯(TCO)的反应。之所以使用该IEDDA对是因为反应动力学快，并且该反应不需要催化剂。在下面的实施例中，使用这些试剂各自带有PEG间隔子(接头)的NHS酯将mTet-CDM蛋白/mTet-CDM-肽/游离mTet-CDM深度扩散到珠周围的聚合物壳中。其他合适的生物正交偶联反应包括炔烃-叠氮化物反应，例如与三叠氮化物和炔烃的反应，或炔烃-DBCO(二苯并环辛炔)反应。
本文所述的方法是利用点击化学来实现蛋白质和肽的净化。首先，合成了可逆蛋白标签的mTet衍生物，其称为mTet-CDM。mTet-CDM是非常有效的捕获试剂，但是需要去除过量的未使用的mTet-CDM。mTet是双正交偶联对的一半。该偶联对的另一半是TCO。mTet和TCO都不与其他生物化合物发生反应，因此被认为是生物正交的。这样，它们的反应是非常特异性的，没有副产物。
在该方法的实例中，为了捕获与蛋白质或肽偶联的游离mTet-CDM和mTet-CDM，使用具有结合的TCO的珠。珠的组成可以是非磁性珠或磁性珠。可以通过使TCO-NHS酯与胺衍生的珠反应来制备具有结合的TCO的珠。由于对于本文所述的目的而言，商业胺珠上的TCO分子的正常密度可能太低，因此可以通过从珠表面上生长含胺聚合物来修饰商业珠以携带10-50倍的氨基。然后使这些胺基团与TCO偶联，因此，珠会携带50倍的TCO。使用mTet-CDM和TCO珠净化蛋白质/多肽的过程如图2所示。
诸如胰蛋白酶等蛋白酶在蛋白质组学和生物化学中起重要作用。胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基的羧基末端裂解蛋白质，除非存在相邻的脯氨酸。这种裂解特异性使研究人员可以根据预测的胰蛋白酶裂解模式来鉴定编码单个蛋白质的基因。将称为胰蛋白酶肽的蛋白裂解物引入可精确测定胰蛋白酶肽的质量的质谱仪(MS)中。MS还能够测定胰蛋白酶肽的氨基酸序列，以进一步表征所研究的蛋白质。
胰蛋白酶是广为人知的、经过深入研究的酸性蛋白酶。示例性的胰蛋白酶蛋白序列(前体)如图3所示。“胰蛋白酶多肽”是指任何天然胰蛋白酶或其蛋白水解活性变体。大量胰蛋白酶和在序列上与天然胰蛋白酶不同的修饰的胰蛋白酶是已知的和/或可商购的，包括天然胰蛋白酶的序列变体。胰蛋白酶通常用于蛋白质组学研究，产生可以通过多种方法例如质谱或埃德曼测序(Edman sequencing)进行分析的胰蛋白酶肽。在实践中,胰蛋白酶自溶，其导致自溶产物可能掩盖待消化的蛋白质样品产生的肽，并且还导致产生伪胰蛋白酶，显示出广泛的特异性，包括类似于胰凝乳蛋白酶的活性。为了避免这些问题，在约1:20至1:50的胰蛋白酶与靶蛋白的低比例下进行典型的胰蛋白酶消化。此外，期望在消化后从蛋白质片段中去除胰蛋白酶。胰蛋白酶包含许多伯胺，例如Lys残基及其N末端。赖氨酸的伯胺可用于利用任何有用的化学方法例如NHS接头来连接基团。胰蛋白酶具有14个赖氨酸残基，只有两个精氨酸残基，即另一自溶靶标。NHS-生物素，例如生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯(见下文)，可用于修饰胰蛋白酶的赖氨酸残基和N-末端。此外，由于NHS-生物素不能完全标记胰蛋白酶，因此它无助于从蛋白质样品中完全去除胰蛋白酶。
Figure BDA0002930905090000121
本文描述了从肽样品中去除胰蛋白酶的方法。本文所述的方法产生高度抗自消化的胰蛋白酶衍生物，并且可以通过使用生物正交“点击”化学方法将胰蛋白酶衍生物化学交联至固体支持物基质上而将其从溶液中去除。如上所述，胰蛋白酶含有14个赖氨酸残基且仅含有两个精氨酸残基。因此，大多数自消化位点位于赖氨酸残基上。
在下面的实例中，为了限制自消化，将所有赖氨酸(加上氨基末端)的>95％与甲基四嗪-PEG4-NHS和生物素-NHS的混合物偶联。单独的生物素-NHS不会降低胰蛋白酶的反应性，而单独使用甲基四嗪-PEG4-NHS进行的广泛标记会导致蛋白质不溶性和酶活性的完全丧失。以甲基四嗪-PEG4-NHS与生物素-NHS的摩尔比为1:5结合这两种标记试剂允许胰蛋白酶活性的完全保持。该胰蛋白酶衍生物在本文中称为MB-胰蛋白酶。通过与含有反式环辛烯(TCO)的珠偶联，MB-胰蛋白酶上甲基四嗪的存在允许从溶液中几乎完全去除该蛋白质。甲基四嗪和TCO一起形成生物正交偶联对，其中这两个部分以非常快速的速率发生反应，形成共价键。在该点击化学对中可以使用其他四嗪基部分，或者在胰蛋白酶与基质例如珠的连接中可以使用其他生物正交点击化学对，进行去除。
在使用时，使用修饰的胰蛋白酶消化蛋白质样品，所述修饰的胰蛋白酶具有生物素侧基部分和侧基，所述侧基包含生物正交偶联对的第一成员，诸如四嗪基，例如甲基四嗪基部分，且例如生物素与生物正交偶联对成员的摩尔比为4:1至6:1，例如5:1。样品消化后，使消化物与生物正交偶联对的结合表面(例如结合珠)的第二成员(例如，点击化学伙伴)接触。例如，在四嗪作为生物正交偶联对的第一成员的情况下，反式环辛烯，或例如8个或更多碳的另一种应变环烯烃，可以是生物正交偶联对的结合表面的第二个成员。
同样，根据本发明的实施方案，用连接于胺或巯基反应性部分(例如NHS、马来酰亚胺或碘乙酰胺部分)的生物素和连接于胺或巯基反应性部分的生物正交偶联对的第一成员，例如但不限于NHS-生物素和NHS-四嗪基化合物，来修饰胰蛋白酶。在实施方案中，NHS-四嗪基化合物包含连接于NHS部分的四嗪基部分，例如具有以下结构：
Figure BDA0002930905090000131
其中R2为H或C1-3烷基；L是惰性接头，或
Figure BDA0002930905090000132
其中L’是惰性接头，并且任选地包含连接N-琥珀酰亚胺基部分的酯连接。在另一个实施方案中，该化合物具有以下结构：
Figure BDA0002930905090000133
其中n为2-10，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。
参考上面的结构，当与伯胺例如蛋白质反应时，NHS-四嗪基化合物会留下酰胺-四嗪基部分，例如：
Figure BDA0002930905090000134
同样，NHS生物素(下面的结构)会与多肽的伯胺反应，从而留下酰胺-生物素部分。
连接于胺或巯基反应性部分的生物正交偶联对的第一成员与连接于胺或巯基反应性部分的生物素的摩尔比，例如，NHS-四嗪基化合物与与胰蛋白酶反应的NHS-生物素的摩尔比，或连接于胺或巯基反应性部分的生物正交偶联对的第一成员与连接于胺或巯基反应性部分的生物素的比例，例如NHS-四嗪基残基与连接于胰蛋白酶多肽的NHS-生物素残基的比例(也就是说，例如，氨基-四嗪基部分与氨基-生物素部分的摩尔比)，为1:4至1:6。关于使用NHS-生物素和NHS-四嗪基化合物来修饰胰蛋白酶，较高量的生物素导致NHS-四嗪基化合物不能修饰大量胰蛋白酶多肽，导致蛋白质的有效捕获较差。较高量的NHS-四嗪基化合物会在水性环境中沉淀胰蛋白酶。
在本发明的一个方面，提供了蛋白质纯化方法和蛋白质纯化试剂盒。由于蛋白质组中蛋白质的巨大化学多样性，捕获整个蛋白质组的标准化蛋白质分离方法在历史上一直具有挑战性。长期存在的沉淀方法依赖于未折叠蛋白的疏水性，但是有些蛋白的疏水性不足以沉淀，而另一些蛋白的疏水性太强而无法回到溶液中。因此，下文所述的通用蛋白质净化方法和试剂盒包括以下特征：
(1)基于珠：蛋白质沉淀存在上述几个问题。另外，对离心的需求限制了其在自动化中的效用。基于珠的方法提供了较大的表面积，从而避免蛋白质沉淀问题，并且可自动化。
(2)细胞裂解程序的耐受性：本文所述方法和试剂适用于许多裂解方法。许多研究人员出于各种目的更喜欢将蛋白质样品保持在天然状态。因此，本文所述的方法和试剂能够纯化天然或变性状态的蛋白质样品。
(3)确定通用的蛋白质靶向特征：蛋白质沉淀方法和珠捕获方法依赖于一般的蛋白质特性，例如疏水性和电荷，而肽分离方法则依赖于疏水性、电荷和尺寸。蛋白质和多肽的疏水性、电荷和尺寸范围非常广。因此，靶向这些特性不会选择所有蛋白质/肽。所有蛋白质和肽共有的一个特征是脂肪族伯胺(氨基末端和赖氨酸残基)。核酸没有脂肪族伯胺；碳水化合物中的伯胺很少。因此，靶向伯胺具有捕获整个蛋白质组的最佳潜力。
(4)使用分子标签而不是直接偶联于珠：经由胺基团将蛋白质直接连接于珠需要大量的珠，因为由于胺反应性偶联试剂的固有水解速度，偶联反应不是很有效。如此大量的珠必须使用大量缓冲液来完全洗脱结合的蛋白质/肽，产生应需要额外步骤来浓缩洗脱的样品的稀溶液，这带来了其他问题。相反，本文所述的方法和试剂使用分子标签，其中标签的一端与蛋白质或肽上的伯胺偶联，标签的另一端指导标记的蛋白质/肽与珠的结合。
(5)使用点击化学将标记的蛋白质/肽共价连接于珠：由于标签的CDM一半形成可逆的共价键，因此使用点击化学在标签和珠之间形成稳定的共价键。特别是，对于下文的实施例，选择了甲基四嗪(mTet)和反式环辛烯(TCO)点击化学对，由于它们的生物正交反应性(与生物分子不反应)，因此它们具有快速的反应动力学，它们不像其他点击对一样需要铜催化剂，并且它们能够在典型细胞/组织裂解程序的相对苛刻条件下进行偶联，并能够承受去除非蛋白质污染物所需的严格洗涤步骤。
(6)所有点击-CDM的结合(游离的蛋白质/肽和结合的白质/肽)：蛋白质净化方法、试剂和试剂盒的特征是为进一步的生物化学或蛋白质组学分析产生适当浓缩的蛋白质/肽样品。该方法中使用适当的小体积珠来结合游离的未反应的标签和标记的蛋白质/肽。
在本发明的另一方面，提供了用于消化多肽或用于纯化蛋白质或多肽的试剂盒。试剂盒包括包装和至少试剂盒的所述组件。包装可以是适合于存储和/或递送试剂盒组件的任何合适容器，例如盒、套筒、管、纸箱、小袋、袋子等。“试剂盒”可以包括一个或多个用于试剂盒元件的单独容器，尽管在一个实施方案中，试剂盒的所有组件都被包装在一起，或者被包装在单个容器中。对于试剂或组合物而言，例如本文所述的试剂和组合物，试剂盒包括一个或多个含有所述试剂或组合物的容器。试剂盒可包含本文提出的任何实施方案的修饰的胰蛋白酶，偶联化合物，例如包含生物正交偶联对的连接于二羧酸酐部分的成员的化合物，例如，IEDDA偶联对的贫电子二烯或富电子亲二烯体成员，例如四嗪部分或TCO部分，或炔烃-叠氮化物对。基质与生物正交偶联对的第二成员偶联。基质可以是任何合适的形式，例如色谱柱中的磁珠、珠或多孔基质或固体表面的形式，例如多孔板的孔。试剂盒可以包括其他包含以下中的一种或多种的容器：消化溶液、偶联溶液、一种或多种洗涤液、洗脱液，任选地呈浓缩形式，例如2X、5X、10X或25X浓缩液。
试剂盒的容器可以是盒(cartridge)中的隔室，以用于消化或纯化样品中蛋白质的自动化或半自动化装置或系统中。
图4示意性地示出了盒100，其包括壳体105，四个隔室110a、110b、110c、110d，出口120，关闭的阀125和打开的阀125'。壳体105可具有任何有用的构造，并且适于插入自动化装置或系统中，以控制隔室110a、110b、110c、110d所含的组合物的递送。每个隔室可含有不同的试剂或组合物，或相同的试剂或组合物。阀125和125'可以由任何合适的机械或机电机构控制，例如通过螺线管，并且可以放置在盒100中或盒100外部的任何位置，例如，出口可以与阀流体耦合，阀是插入了盒100的装置的一部分。图4所示的盒100仅是示例性的，并且可以包括任何数量的隔室、任何形状、任何流体路径以及任何流体控制机构。工程领域的普通技术人员可以配置用于任何装置或系统例如自动化系统的盒。盒和/或从盒中取出的试剂或组合物的控制可以是自动化的，例如通过计算机执行的过程来控制。
实施例1-通用蛋白/肽的分离和净化
示例性的通用蛋白质/肽分离和净化试剂盒包括以下任何或所有试剂：TCO磁珠或TCO-非磁珠、mTet-CDM、细胞裂解缓冲液、去除非蛋白质污染物的洗涤缓冲液、逆转CDM-蛋白质/肽连接并回收纯化的蛋白质/肽样品的洗脱缓冲液。
细胞裂解物通过多种方法来制备，例如用SDS、脲或RIPA缓冲液裂解。如果需要完整的蛋白质蛋白质组，则在pH 8-9.5的弱碱性条件下将细胞裂解物中的蛋白质与mTet-CDM偶联。如果需要肽，则用诸如胰蛋白酶或Lys C等蛋白水解酶，例如但不限于包含生物素和四嗪基侧基的胰蛋白酶，例如下文所述的MB-胰蛋白酶，来消化裂解物中的蛋白质。在使用四嗪基修饰的胰蛋白酶的情况下，消化后通过将四嗪基修饰的胰蛋白酶与结合基质的TCO例如结合珠的TCO偶联来去除胰蛋白酶。其他生物正交反应化学方法，例如IEDDA偶联对，可用于修饰胰蛋白酶并从消化的蛋白质混合物中去除胰蛋白酶。然后在弱碱性条件下，例如pH 8-9.5，将所得的肽片段与mTet-CDM偶联。对于完整的蛋白质或肽，将TCO珠的足以在样品制备反应中结合总量mTet-CDM的等分试样添加到样品中。然后将样品振荡孵育(0℃–37℃)，以允许发生mTet：TCO点击反应。预计这需要1-10个小时，直到没有检测到游离mTet。然后重复洗涤珠(3-5次)以去除非蛋白质污染物。可以使用多种洗涤缓冲液来确保在非蛋白质物质上完全去除。这些缓冲液可以包括SDS、脲或盐。然后在弱酸性(例如pH2.5-6)条件下洗脱与珠结合的蛋白质/肽，以逆转CDM-蛋白质/肽连接。逆转缓冲液还含有适用于下游工作流程的组分。这可能包括脲、SDS、去污剂、盐或有机溶剂。这产生了不含污染物的纯化的蛋白质或肽样品。图5显示了工作流程。
图6显示了mTet-PEG-CDM的合成方案。起始原料是mTet-PEG4-胺(化合物1)和2-羧乙基-3-甲基-马来酸酐N-羟基琥珀酰亚胺酯(CDM-NHS)(化合物2)(定制合成)。由于CDM-NHS具有两个胺反应性部分，因此将2摩尔的mTet-PEG-胺与1摩尔的CDM-NHS结合，得到中间产物3。由于CDM与mTet-PEG-胺之间的连接对酸不稳定，因此，用HCl处理逆转该连接，并形成mTet-PEG-CDM 4的活化的CDM酸酐。终产物通过液相色谱法纯化，并通过NMR和MS分析。
mTet-CDM的非限制性合成实例如下：将mTet-PEG4-NH2盐酸盐1(5mmol)溶于1M pH为8.5的三乙基碳酸氢铵缓冲液(10ml)中。在室温搅拌下滴加溶解于无水乙腈(ACN,5ml)中的CDM-NHS酯2(2.5mmol)。继续搅拌1小时。将反应混合物浓缩至1ml的体积。加入2N HCl(5ml)以水解3，并将反应混合物搅拌30min。在
Figure BDA0002930905090000171
系统中，在RP-18上，使用乙腈/水/0.1％TFA作为流动相，使用逐步梯度，通过MPLC色谱法分离反应混合物。产物用约20％的乙腈洗脱(在254nm处监控)。通过UPLC(Waters)、RP-18柱，乙腈/水/0.1％TFA、0-0.5min、0％乙腈、0.5min-3min 0-100％乙腈线性梯度，运行时间5min，分析产物级分，在240nm和256nm处监控。收集纯级分并浓缩，得到486mg(34％)粉红色树脂状产物4。
TCO珠的合成
作为结合蛋白质或蛋白质片段以分离蛋白质的基质的实例，通过使用ATRP从胺珠的表面生长高密度聚合物链制备TCO珠。该过程的第一步是使引发剂分子偶联到胺珠上(图7)。使用标准的NHS酯偶联条件偶联引发剂N-2-溴-2-甲基丙酰基-NHS酯。调节引发剂的浓度以实现几乎完全的偶联。丙烯酰胺和氨丙基丙烯酰胺的共聚物从结合引发剂的珠的表面生长。目标是将珠的胺含量提高10倍至50倍。调节丙烯酰胺和氨乙基丙烯酰胺的比例以及共聚物的长度以使胺含量最大化，而不会显著增加蛋白质/肽的黏度或对聚合物涂层内部的可及性。共聚物中包括丙烯酰胺，以避免氨丙基侧链的过密堆积。合成的最后一步是使TCO-PEG-NHS与氨乙基侧链偶联。调节TCO PEG-NHS的浓度以使偶联最大化。任何未偶联的胺都会被乙酸酐封闭，以防止非特异性蛋白质结合。聚丙烯酰胺和PEG因低水平的非特异性蛋白结合而闻名。
实施例2-MB-胰蛋白酶的制备和表征
甲基四嗪-生物素-胰蛋白酶(MB-胰蛋白酶)通过混合以下来制备：1ml在25mMHEPES-NaOH pH 8.0中的1mg/ml胰蛋白酶、10mM CaCl2、3mM苯甲脒HCl、140μI在无水DMF中的100mM生物素-NHS和28μl在无水DMF中的100mM甲基四嗪-PEG4-NHS。将混合物在0℃下孵育30min，并相对于2x 1L的25mM HEPES-NaOH pH 8.0、10mM CaCl2透析过夜。M-胰蛋白酶可在4℃下保存高达60天，且活性损失<10％，或-80℃下保存更长时间。
可以通过以下测定法表征MB-胰蛋白酶。将1ml反应缓冲液(46mM HEPES-NaOH pH8.0、11.5mM CaCl2、1mM甲苯磺酰基精氨酸甲酯(TAME))与1μl～1mg/ml胰蛋白酶溶液合并。测量247nm处的光吸收率，并计算每微克胰蛋白酶每分钟水解的TAME的纳摩尔数。用甲基四嗪和生物素标记胰蛋白酶不会降低胰蛋白酶的催化活性。
根据下文，可以用荧光胺测定法来评估伯胺标记的程度。通过将0-10μg胰蛋白酶或10μg MB-胰蛋白酶溶解于200μl的100mM HEPES-NaOH pH 8.0中绘制标准曲线。在丙酮中加入50μl的3mg/ml荧光胺。混合并转移200μl每个反应液到黑色的96孔板中，以便在读板仪中进行荧光测量。使用390±5nm的激发波长和465±10nm的发射波长测量荧光。计算MB-胰蛋白酶样品中游离胺相对于标准曲线的程度。通常，在上述标记反应条件下标记＞95％的胺。
胰蛋白酶蛋白消化方案：在含有100mM HEPES-NaOH pH 8.0和变性剂混合物的缓冲液中，将等量的MB-胰蛋白酶与靶蛋白[通常为100μg MB-胰蛋白酶和100μg靶蛋白，总体积为400μl]混合，该变性剂混合物含有1％十二烷基硫酸钠(SDS)、1％
Figure BDA0002930905090000191
和0.5％脱氧胆酸钠。靶蛋白事先用二硫苏糖醇还原并用碘乙酰胺烷基化。在37℃下，消化通常在2小时内完成。
MB-胰蛋白酶的稳定性：MB-胰蛋白酶在含有高达0.1％SDS的缓冲液中，在含有高达4M脲的缓冲液中，并且在–80℃下在高达3个轮冷冻-解冻后，是完全有活性的。
实施例3
用mTet-CDM标记蛋白质和多肽。在两种不同的缓冲条件下用mTet-CDM标记蛋白质或肽。简而言之，将在100mM HEPES pH 8.0和25mM NaCl中浓度为0.5mg/mL的蛋白质与mTet-CDM(ACN中30mg/mL)一起孵育，其中，mTet-CDM比蛋白质高1-6质量倍。将标记报告为
Figure BDA0002930905090000192
总是以小于反应液总体积的10％的体积添加mTet-CDM。将反应液在4℃下孵育1小时。还在含有10mM HEPES pH 8.0和25mM NaCl的缓冲液中重复此标记过程。
使用荧光胺测定法测定mTet标记的程度，以检测游离的伯胺。使用0-10μg未标记的蛋白质/蛋白质组/肽制作未标记样品的标准曲线。将每种标准品稀释至最终体积为250μL的10mM HEPES，pH 8.0。将荧光胺以3mg/mL的浓度溶解在丙酮中，并将50μL的该溶液添加到每种溶液中并充分混合。对mTet标记的样品重复此操作。将溶液转移至MilliporeSigme(St.Louis,MO)的黑色聚苯乙烯平底Greiner
Figure BDA0002930905090000193
96孔板中。使用Tecan GroupLtd.(瑞士)的Tecan
Figure BDA0002930905090000194
酶标仪测定荧光。利用在400nm下激发，带宽30nm，进行激发，并在460nm下，带宽40nm，进行发射检测。通过绘制荧光强度相对游离胺的图表，创制标准曲线，并通过使用荧光强度值和标准曲线方程式求解游离胺，找到mTet样品中游离胺的数量。
mTet标记的蛋白质与TCO缀合的珠的结合。TCO琼脂糖珠购自Click ChemistryTools(Scottsdale,AZ)。为了测试用于防止非特异性结合的缓冲液条件，如前所述，但具有下述变化，制备了未标记和6X mTet-CDM标记的Cy5标记的碳酸酐酶的两种原液。添加mTet-CDM后，将样品在室温下孵育15min，然后添加0.83nmol的Cy5-NHS，然后在4℃下孵育1小时。在单独的试管中，将0.15μg未标记的或6X mTet标记的碳酸酐酶(mTet-CA)添加到100μL的以下每种缓冲液中：(A)0.3M NaCl和100mM HEPES，pH 8.0，(B)1％SDS和100mM HEPES，pH8.0，(C)0.3M NaCl、1％SDS和100mM HEPES，pH 8.0。向每种缓冲液中添加50μL在相同缓冲液中平衡的TCO珠，并在室温下颠倒旋转孵育1小时。通过在不添加TCO珠的情况下将相应的碳酸酐酶在相应的缓冲液中孵育，制备每个样品的荷载对照。通过在130V下于4-20％的SDS-PAGE凝胶上运行每个样品的上清液和荷载对照1小时来评估结合。使用内置成像仪获取图像。使用ImageJ经由荧光图像的像素密度量化保持未结合的标记的或未标记的碳酸酐酶的量。仅含有相应量的标记的或未标记的碳酸酐酶的荷载样品用作基线。将所有其他碳酸酐酶的量计算为荷载的百分比。通过从100％中减去在溶液中保持游离的碳酸酐酶的量来计算与TCO珠结合的量。
为了测试mTet标记的蛋白质与TCO珠完全结合所需的时间量，进行了结合的时程。将TCO珠在1％SDS、0.3M NaCl、100mM HEPES pH 8.0中平衡，并将30μL平衡的珠与25μg 6XmTet-CA一起孵育，最终总体积为80μL。将反应液在4℃下以1400rpm振荡孵育0min、5min、15min、30min或60min。在指定的孵育时间后，将珠离心成沉淀，并去除上清液。在没有TCO珠的情况下，通过将相同量的6X mTet-CA悬浮在相同量的缓冲液中来制备荷载对照。通过在130V下于4-20％SDS-PAGE凝胶上运行每个样品的上清液和荷载对照1小时来评估结合。使用内置成像仪获取图像。使用ImageJ经由荧光图像的像素密度量化保持未结合的mTet-CA碳酸酐酶的量。仅含有相应量的mTet-CA的荷载样品用作基线。将所有其他mTet-CA量计算为荷载的百分比。通过从100％中减去在溶液中保持游离的mTet-CA的量来计算与TCO珠结合的量。
从TCO珠洗脱mTet标记的蛋白质。使用用于二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)的洗脱缓冲液(20mM柠檬酸盐pH 3.0、7M脲、2M硫脲、10mM DTT、4％CHAPS)从TCO珠洗脱mTet标记的蛋白质。如前所述，使mTet-CA与珠结合，并用100μL含10mM HEPES pH 8.0的结合缓冲液代替100mM HEPES pH 8.0洗涤3次。洗涤时降低HEPES缓冲液的浓度有助于洗脱步骤。通过在室温下与50μL洗脱缓冲液一起以1400rpm振荡孵育，从珠上洗脱蛋白质。将上清液转移至新的试管中，并将洗脱步骤再重复三次。洗脱孵育时间进行15min、30min、60min和120min。评估每一孵育时间从珠洗脱的产率，并且还分析每个单独洗涤的蛋白质洗脱。通过在洗脱缓冲液中孵育起始量的mTet-CA制备每个样品的荷载对照。如前所述，使用SDS-PAGE和图像分析评估了释放的CA的百分比。将所有其他碳酸酐酶的量计算为荷载的百分比，以得到产率百分比。对于每个单独的洗涤，将像素计数相加，以获得整个洗脱过程中碳酸酐酶的总像素。然后，将每个泳道像素密度计算为总浓度的百分比，以确定在每个洗涤步骤中洗脱了多少蛋白质。
使用1D和2D凝胶电泳捕获、洗涤和释放整个酵母蛋白质组。使用卡内基梅隆大学(Carnegie Mellon University)约翰·伍尔福德实验室(John Woolford’s lab)提供的菌株JWY6147 leu2 his3 trp1 ura3制备酵母裂解物。将成团的酵母细胞重悬于裂解缓冲液中，进行2D-DIGE，并添加玻璃珠，等于总体积的一半。通过用玻璃珠以30秒的间隔涡旋裂解细胞六次，每次间隔在冰上30s。裂解后，通过在7,000rpm下离心10min使细胞碎片沉淀，并将上清液转移至新的试管中。使用标准Bradford分析法获得蛋白质浓度。
定量后，如前所述，蛋白质组用mTet-CDM进行6X标记，并用Cy5进行标记。在LoBindEppendorf管中，将200μL TCO珠用200μL裂解缓冲液洗涤3次。接着，将100μg的6X mTet标记的蛋白质组添加至珠，并在室温下以1400rpm振荡孵育1小时。去除上清液并弃去，并将珠用200μL裂解缓冲液洗涤3次。洗涤后，通过添加50μL 2D-DIGE洗脱缓冲液，并以1400rpm混合孵育30min，从珠上洗脱蛋白质。洗脱后，取出上清液并转移至新管中。该操作重复两次。将所有洗脱液合并在一起后，首先通过将样品在4-20％SDS-PAGE凝胶上于130V下运行1小时来测试产率。在洗脱液中用含有本实验所用起始量蛋白质组的荷载样品，运行洗脱液。如前所述量化产率。
为了对洗脱的蛋白质组进行2D-DIGE分析，如前所述，将在2D-DIGE裂解缓冲液中用Cy3标记20μg未标记的蛋白质组，用作对照。标记后，将57μL对照样品与57μL洗脱样品合并。向该样品中添加2.4μL3-10NL IPG缓冲液(GE Healthcare Bio-Sciences，宾夕法尼亚州匹兹堡)，并使用2D-DIGE运行样品。IPG试纸(18cm，pH 3-10NL)购自GE Healthcare Bio-Sciences(宾夕法尼亚州匹兹堡)，并用含有0.2％3-10NL IPG缓冲液的补液缓冲液(rehydration buffer)再水化16小时。使用购自Bio-Rad(Hercules,CA)的Protean IEF仪器进行等电聚焦(IEF)。使用先前描述的凝胶内方法进行平衡。使用12％分离胶在购自Bio-Rad(Hercules,CA)的Protein II xi电泳仪上进行二维SDS-PAGE。使用内置的成像仪获取凝胶图像。使用ImageJ创建比较堆栈(comparative stack)。首先，利用凝胶上的导引星将亮度和对比度设置为比较水平。然后，使用查找表功能更改每个凝胶的颜色。对照的Cy3设置为绿色,而洗脱液的Cy5设置为红色。然后将每种图像类型更改为RGB颜色，并将粘贴控制(paste control)设置为添加。从那里选择所有对照图像并将其添加到洗脱图像中。
用mTet-CDM标记单个蛋白质。纯化mTet-CDM之后，我们接下来想知道需要多少mTet-CDM才能有效地标记蛋白质上的伯胺。我们在存在10mM HEPES pH 8.0或100mM HEPESpH 8.0的情况下，用mTet-CDM标记了蛋白质碳酸酐酶，并使用荧光胺测定法分析了标记程度。标记效率在100mM HEPES pH 8.0中比在10mM HEPES pH 8.0中高得多(图8)。尽管在10mM HEPES pH 8.0中标记在约30％达到平衡，但在100mM HEPES中标记在约80％达到平衡。较高的HEPES浓度可能有助于稳定略微碱性的pH，从而确保蛋白质上所需的伯胺的适当质子化状态和马来酸酐环的打开。以前使用生物素-CDM的学生也证明了需要较高的HEPES浓度。基于此，本研究中的所有标记均在100mM HEPES pH 8.0中使用6X标记进行。
优化使mTet标记的蛋白与TCO珠结合的缓冲液条件和孵育时间。为了优化使mTet标记的蛋白与TCO珠结合的条件，我们首先要建立适当的缓冲液条件，以防止非特异性结合。我们从以前使用抗生物素蛋白珠的经验中获知，蛋白质倾向于非特异性地粘附于珠上，从而导致较低的蛋白质产率。我们还知道，缓冲液中存在的高SDS和高盐可能有助于防止非特异性结合。为了找到可防止与TCO珠非特异性结合的缓冲液条件，我们在0.3M NaCl、1％SDS或两者同时存在的情况下，将mTet标记的和未标记的碳酸酐酶与TCO珠一起孵育。我们发现，单独的0.3M NaCl不会防止未标记的蛋白与珠的非特异性结合，珠上未标记蛋白的损失83％(图9)。出人意料的是，尽管单独的1％SDS确实防止非特异性结合，但它也大大降低了mTet标记的蛋白与TCO珠的结合，仅结合了52％。含有0.3M NaCl和1％SDS两者的缓冲液显示出最佳结果，没有可检测到的非特异性结合，且标记的蛋白质与TCO珠的结合高达88％。这与以前使用生物素-CDM和抗生物素蛋白珠的工作相吻合，其中含有0.3M NaCl+1％SDS的缓冲液也获得最佳结果。对于本章中所有将来的测定，使用用于结合TCO珠的缓冲液，其含有0.3M NaCl、1％SDS和100mM HEPES pH 8.0。
为了确定防止与TCO珠非特异性结合的最佳缓冲液条件，将mTet标记的或未标记的碳酸酐酶与TCO珠在不同的结合缓冲液中孵育。没有mTet标记的蛋白质表示经由非特异性相互作用的任何结合，而mTet标记的样品表示经由特异性相互作用的结合。缺少TCO珠的样品是用于计算与TCO珠结合的％的荷载。含有0.3M NaCl和1％SDS的缓冲液在防止未标记的碳酸酐酶与TCO珠的非特异性结合方面表现最佳，同时仍允许mTet标记的碳酸酐酶与TCO珠结合。
我们接下来测试了mTet标记的蛋白质与TCO珠完全结合所需的孵育时间。使用一定量的mTet-CA和TCO珠进行时程，并在1h(小时)的过程中测定结合。仅30min后，94％的mTet-CA与TCO珠结合(图10)。在该时间点之后，结合几乎没有变化，在1小时后增加3％，达到97％结合。基于该时程，使用30min的孵育时间进行mTet标记的蛋白质的所有未来结合。
优化洗脱孵育时间和洗涤次数。为了优化蛋白质从TCO珠上的洗脱，需要考虑两个因素：从珠上完全去除所需的在洗脱缓冲液中的孵育时间和在洗脱缓冲液中的洗涤次数。由于琼脂糖珠中有一定量的死体积，因此仅在一个洗脱步骤中不能通过在洗脱缓冲液中孵育后去除上清液来去除蛋白质。相反，必须将珠在洗脱缓冲液中孵育，然后在珠的多次洗涤中收集蛋白质，以确保没有蛋白质损失于珠的死体积中。但是，每次在洗脱缓冲液中洗涤都会稀释最终的蛋白质浓度，而对于蛋白质组学技术(如2D-DIGE和MS)而言，过度稀释是不希望的，尤其是在需要低丰度蛋白质的情况下。在孵育时间与洗涤次数之间找到恰当的平衡，对于确保蛋白质从TCO珠中快速、集中地洗脱非常重要。
使mTet-CA与TCO珠结合，然后使用四次洗涤，并增加孵育时间将其从珠上洗脱。计算并比较每个孵育时间的产率。所有洗脱时间均显示产率大于80％，在30min时产率最高(94％)(图11(A))。这与以前的工作一致，以前的工作表明二甲基马来酸酐可在短至五分钟内再循环。分析各个洗涤的蛋白质洗脱，以确定所有蛋白质已从珠上洗脱下来时间点。在前两次洗涤中，超过85％的洗脱蛋白从珠上脱落，而三次洗涤则得到所有洗脱蛋白的99％(图11(B))。基于这些结果，本研究其余部分的洗脱使用了3次洗涤，每次孵育30min。
使用mTet-CDM和TCO珠捕获、洗涤和释放整个酵母蛋白质组。
在单个蛋白质的捕获和释放产生的产率超过90％的情况下，我们接下来试图将该技术应用于捕获、洗涤和释放整个蛋白质组。裂解酵母细胞，并从溶液中去除细胞碎片。蛋白质组用mTet-CDM进行6X标记，并使用先前建立的参数进行捕获、洗涤和释放。然后在SDS-PAGE凝胶上运行洗脱液以进行定量。在使用mTet-CDM和TCO珠进行整个样品制备工作流程之后，回收了80％以上的蛋白质组(图12)。该产率比目前本领域所用的样品制备方法高得多，这表明该技术有望用于蛋白质组样品制备。但是，该产率低于观察到的单个蛋白质的产率，并且这可能是由于裂解物中存在干扰分子所致。需要进行更多的工作来优化整个蛋白质组纯化的工作流程。
还使用2D-DIGE分析了洗脱的酵母蛋白质组。虽然2D-DIGE不能用于定量，但它可以显示出特异性的蛋白质损失，并使我们样品制备方法的任何系统性偏差显而易见。用Cy5染料标记洗脱的蛋白质，并用Cy3染料标记荷载对照。合并这些样品，然后通过其等电点和分子量来分离。然后使用Cy3和Cy5滤镜对凝胶成像。将两个图像叠加以显示两个样品之间的任何蛋白质损失。如果在工作流程中存在蛋白质损失偏差，则存在仅在Cy3荷载样品中出现而在洗脱的Cy5样品中不出现的特异性斑点。在比较荷载蛋白质组和洗脱蛋白质组后，观察到大多数蛋白质彼此重叠得很好(图13)。应当注意，洗脱的蛋白质组是首先用mTet-CDM标记的，mTet-CDM吸收用于连接Cy染料的同一伯胺。这意味着用Cy5染料进行标记比比较所用的荷载对照要暗得多，这可能使得它看起来好像荷载中存在洗脱中不存在的斑点一样，当斑点只是不可见时。尽管这些结果令人鼓舞，但使用巯基而不是伯胺进行染料标记会防止荷载和洗脱之间斑点亮度上的差异，从而可以进行定量。如果仍然使用染料标记来确保观察不到染料依赖性变化，则未来的实验应该使用银染以及使用交互标记探索染料标记或比较单独凝胶的替代方法。
实施例4
用旋转柱净化洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)裂解物。
通过在100mM HEPES pH 8.0、2％SDS的溶液中煮沸5分钟来溶解洋葱伯克霍尔德菌的细菌培养物沉淀。用探针超声仪以30％的功率将粘稠的溶液短暂超声处理约15秒。所得细菌细胞裂解物的浓度为120mg/ml。反应在室温(RT)下用153.3μl H2O、20μl 1M HEPESpH 8、10μl 10mg/ml洋葱伯克霍尔德菌裂解物和16.7μl 30mg/ml mTet-CDM的混合物进行1小时。将150μl TCO磁珠(购自Click Chemistry Tools(Scottsdale,AZ))在500μl 100mMHEPES pH 8+10％ACN中洗涤3次。
根据以下处理样品：
1.移出20μl反应物，用于荷载对照；
2.将180μl反应液添加到在冷室的珠中-颠倒混合1小时(注意：溶液在约15分钟内从粉红色变成无色)
3.洗涤珠3x 400μl WB[7M脲、2M硫脲、4％CHAPS、10mM DTT]+1mM HEPES pH 8
4.洗脱2x 50μl WB+5mM甲酸
5.在SDS-PAGE上运行每个步骤的10％。用WB+5mM甲酸中的裂解物制备模拟洗脱液
6.合并洗脱液并运行，用10mM TEAB制成碱性，用Cy3-NHS标记，并在2DE凝胶和二维电泳凝胶上运行(图14和15)。
实施例5
以下内容评估了接近100％回收含有醇脱氢酶、碳酸酐酶溶菌酶和牛血清白蛋白的肽混合物需要多少标记。表A提供了测试的反应混合物(μl)。
表A
Figure BDA0002930905090000261
样品进行如下处理：
设置上文的标记反应，在室温下孵育1小时。
孵育期间，每个反应用400μl 100mM HEPES pH 8.0、0.2％SDS将225μl TCO珠洗涤3X。
在柱筛板中洗涤珠。
将珠完全干燥，然后添加稀释的标记反应液。
使用100mM HEPES pH 8.0、0.2％SDS使标记反应液体积达到500μl。
将稀释的标记反应液添加到端盖打开的柱筛板内洗涤过的TCO珠中。
用胶带将柱捆成Eppendorf管，用作烤箱(rotisserie)的适配器。
冷室中在烤箱上孵育1小时。
回收上清液。
用10mM HEPES pH 8.0、25％ACN将珠洗涤2次。
用水将珠洗涤2次。
添加120μl 0.1％甲酸，并在8℃(将构建块设置为4℃，仅达到7℃)下搅拌(1500RPM)孵育1.5小时。
回收洗脱液。
添加120μl 0.1％甲酸50％ACN，并在7℃下搅拌(1500RPM)孵育1.5小时。
回收洗脱液。
添加120μl 0.1％甲酸50％ACN，并在7℃下搅拌(1500RPM)孵育1小时。
回收洗脱液。
设置四个标准曲线，以匹配样本中的各种缓冲液。
输入标准曲线：100mM HEPES pH 8.0，30％ACN。
上清液标准曲线：100mM HEPES pH 8.0，1.35％SDS
洗脱1标准曲线：0.1％FA
洗脱2,3标准曲线：0.1％FA，50％ACN
用于荧光胺测定法的样品制备如下：
输入：17.5μl的70μl标记反应液+182.5μl 100mM HEPES pH 8.0。
上清液：125μl的500μl上清液+75μl的100mM HEPES pH 8.0。
洗脱：30μl的120μl洗脱液+170μl的100mM HEPES pH 8.0。
向每个样品中添加50μl溶于丙酮的3mg/ml荧光胺，充分混合，然后将200μl等分到96孔板中。
结果(表B，图16)
表B
输入 洗脱总计 ％输入
0X 26.52 2.60 9.81
21X 13.81 52.06
45X 16.03 60.47
75X 24.79 93.48
已经参考某些示例性实施方案、可分散组成及其用途描述了本发明。然而，本领域普通技术人员应当认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对任何示例性实施方案进行各种替换、修改或组合。因此，本发明不受示例性实施方案描述的限制，而是受最初提交的所附权利要求书的限制。
序列表
<110> 卡耐基梅隆大学
A·卢卡斯
J·明登
<120> 蛋白质和肽的纯化方法
<130> 6526-1902651
<150> US 62/763,298
<151> 2018-06-08
<150> US 62/919,469
<151> 2019-03-14
<160> 1
<170> PatentIn 3.5 版本
<210> 1
<211> 231
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala
1 5 10 15
Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe
20 25 30
Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His
35 40 45
Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp
50 55 60
Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr
65 70 75 80
His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile
85 90 95
Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser
100 105 110
Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly
115 120 125
Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln
130 135 140
Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly
165 170 175
Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn
180 185 190
Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys
195 200 205
Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile
210 215 220
Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn
225 230

Claims (48)

1.包含与二羧酸酐部分连接的生物正交偶联对的成员的化合物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述生物正交偶联对的成员是IEDDA偶联对的贫电子二烯或富电子亲二烯体成员，诸如四嗪，例如1,2,4,5-四嗪部分或4-(1,2,4,5-四嗪基)苯基部分，或应变环烯烃，例如TCO。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述二羧酸酐部分是马来酸酐部分。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述生物正交偶联对的成员是四嗪部分，例如1,2,4,5-四嗪部分或4-(1,2,4,5-四嗪基)苯基部分。
5.根据权利要求4所述的化合物，具有以下结构：
Figure FDA0002930905080000011
其中
R1和R2独立地为H或C1-3烷基，且L是惰性接头。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述接头包含苯基。
7.根据权利要求6所述的化合物，具有以下结构：
Figure FDA0002930905080000012
其中L’为惰性接头。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的化合物，其中R1为甲基。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的化合物，其中R2为甲基。
10.根据权利要求5-9中任一项的化合物，其中R1和R2均为甲基。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的化合物，其中L包含PEG2-10基团。
12.根据权利要求1所述的化合物，具有以下结构：
Figure FDA0002930905080000021
其中n为2-10。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中n是4。
14.修饰的胰蛋白酶多肽，包含：
胰蛋白酶多肽；
连接于所述胰蛋白酶多肽的生物素部分；和
连接于所述胰蛋白酶多肽的包含生物正交偶联对的成员的基团，
其中所述胰蛋白酶多肽上包含生物正交偶联对的成员的基团与生物素部分的比例为1:4至1:6。
15.根据权利要求14所述的修饰的胰蛋白酶多肽，包含：
连接于所述胰蛋白酶多肽的NHS-生物素残基；和
连接于所述胰蛋白酶多肽的NHS-四嗪残基，
其中所述胰蛋白酶多肽上NHS-四嗪残基与NHS-生物素残基的比例为1:4至1:6。
16.根据权利要求15所述的修饰的胰蛋白酶多肽，其中所述NHS-四嗪残基具有以下结构：
Figure FDA0002930905080000022
其中L和L’为惰性接头，且R2为H或C1-3烷基，n为2-10。
17.纯化多肽的方法，包括：
使包含多肽的碱性pH的样品与一定量的包含部分的偶联化合物混合，所述部分包含通过接头与马来酸酐部分连接的生物正交偶联对的第一成员；
使所述样品中的多肽与连接于基质的生物正交偶联对的第二成员偶联；
任选地洗涤与所述基质结合的多肽，以从结合基质的多肽中去除任何未结合的物质；和
在酸性pH的洗脱溶液中从所述基质中洗脱所述多肽。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述碱性pH为>7至10，或为8-9.5，和/或所述酸性pH为2至<7，或为2.5-6。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述偶联化合物是权利要求1-13中任一项所述的化合物。
20.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述偶联化合物是mTet-PEG4-CDM。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述基质是珠或固体表面。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述基质是磁珠。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述基质是包含在色谱柱或旋转柱中的珠。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述基质是多孔基质。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中所述生物正交偶联对的第一成员是四嗪基，并且所述生物正交偶联对的第二成员是应变环烯烃，或其中所述生物正交偶联对的第一成员是应变环烯烃，并且所述生物正交偶联对的第二成员是四嗪基。
26.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中所述生物正交偶联对的第一成员是甲基四嗪部分，并且所述生物正交偶联对的第二成员是反式环辛烯部分，或者其中所述生物正交偶联对的第一成员是反式环辛烯部分，并且所述生物正交偶联对的第二成员是甲基四嗪部分。
27.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中，所述生物正交偶联对包括IEDDA偶联对或炔烃-叠氮化物点击对的贫电子二烯和富电子亲二烯体。
28.根据权利要求17-27中任一项所述的方法，还包括在使所述样品与所述偶联化合物混合之前，用蛋白酶消化所述样品的多肽。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述蛋白酶是修饰的胰蛋白酶多肽，包含：
胰蛋白酶多肽；
连接于所述胰蛋白酶多肽的生物素部分；和
连接于所述胰蛋白酶多肽的包含生物正交偶联对的成员的基团，
其中所述胰蛋白酶多肽上包含生物正交偶联对的成员的基团与生物素部分的比例为1:4至1:6。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述蛋白酶是修饰的胰蛋白酶多肽，包含：
胰蛋白酶多肽；
连接于所述胰蛋白酶多肽的NHS-生物素残基；和
连接于所述胰蛋白酶多肽的NHS-四嗪残基，
其中所述胰蛋白酶多肽上NHS-四嗪残基与NHS-生物素残基的比例为1:4至1:6。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述修饰的胰蛋白酶多肽的NHS-四嗪残基具有以下结构：
Figure FDA0002930905080000051
其中L和L’是惰性接头，且R2是H或C1-3烷基，n为2-10。
33.制备胰蛋白酶多肽片段的方法，包括用权利要求14-16中任一项所述的修饰的胰蛋白酶多肽消化多肽。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括使所述多肽的消化物与包含侧基的基质接触，所述侧基与所述修饰的胰蛋白酶多肽的四嗪基团形成生物正交IEDDA缀合对，以使所述修饰的胰蛋白酶多肽与所述基质结合，并将所述多肽的消化物与所述基质分离。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述基质是磁珠。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述基质是包含在色谱柱中的珠或多孔基质。
37.蛋白质分离试剂盒，包含在容器中的权利要求1-13中任一项所述的化合物，或在包装的容器中的权利要求14或15所述的修饰的胰蛋白酶多肽。
38.根据权利要求37所述的蛋白质分离试剂盒，包含在容器中的权利要求1-13中任一项所述的化合物。
39.根据权利要求37或38所述的蛋白质分离试剂盒，包含在容器中的权利要求14或15所述的修饰的胰蛋白酶多肽。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的蛋白质分离试剂盒，在包装中还包括包含侧基的基质，所述侧基与所述化合物或修饰的胰蛋白酶多肽的生物正交偶联对的第一成员形成生物正交IEDDA缀合对。
41.根据权利要求40所述的蛋白质分离试剂盒，其中所述与所述四嗪基团形成生物正交IEDDA缀合对的侧基是应变环烯烃部分，例如反式环辛烯。
42.根据权利要求40或41所述的蛋白质分离试剂盒，其中所述基质是珠、固体表面或多孔基质。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的蛋白质分离试剂盒，其中所述基质是包含在色谱柱或旋转柱中的珠或多孔基质。
44.根据权利要求40或41所述的蛋白质分离试剂盒，其中所述基质是磁珠。
45.根据权利要求37-44中任一项所述的蛋白质分离试剂盒，其中所述生物正交偶联对的第一成员是1,2,4,5-四嗪部分或4-(1,2,4,5-四嗪基)苯基部分，例如4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基部分。
46.根据权利要求37-35中任一项所述的蛋白质分离试剂盒，其中所述容器是用于自动化蛋白质分离系统的盒中的单独的隔室。
47.制备修饰的胰蛋白酶多肽的方法，包括使胰蛋白酶多肽与摩尔比为4:1至6:1的第一化合物和第二化合物缀合，所述第一化合物包含连接于生物素的胺反应性部分或巯基反应性部分，所述第二化合物包含连接于生物正交偶联对的第一成员的胺反应性部分或巯基反应性部分。
48.根据权利要求47所述的方法，其中使所述胰蛋白酶多肽与NHS生物素和NHS-四嗪化合物缀合。
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