CN112516175A - 海螵蛸的处理方法、海螵蛸产品及止血促愈合材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海螵蛸的处理方法、海螵蛸产品及止血促愈合材料。该处理方法包括：采用第一盐溶液对海螵蛸粉末进行第一次清洗，得到第一次清洗海螵蛸；采用第二盐溶液对第一次清洗海螵蛸进行第二次清洗，得到第二次清洗海螵蛸；采用脱细胞溶液对第二次清洗海螵蛸进行脱细胞处理，得到脱细胞海螵蛸；以及采用缓冲液对脱细胞海螵蛸进行第三次清洗，得到处理后海螵蛸。应用本发明的技术方案，通过多次处理，将海螵蛸内不良反应的物质和生物去除，以降低其免疫原性，同时充分发挥海螵蛸疏松多孔的特性，以达到快速止血的效果，满足临床需要。

Description

海螵蛸的处理方法、海螵蛸产品及止血促愈合材料

技术领域

本发明涉及生物质止血材料的制备领域，具体而言，涉及一种海螵蛸的处理方法、海螵蛸产品及止血促愈合材料。

背景技术

快速止血、有效伤口护理是减轻创伤并发症、提高预后质量的有效方式，对于各种创面均适用，尤其对于急性创伤、战地创伤、工地创伤等紧急救护尤为重要。

目前临床常用止血类材料有多种，以生物材料的效果最佳，但也存在不足：改性淀粉类材料可用于贯穿伤等大出血量创伤的快速止血，但无促进愈合作用，且难以清理，残留物易引发炎症；氧化纤维素类材料可有效止血且易生物降解，但对创面愈合效果较差；壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸等海洋源性材料可有效止血、促进愈合、抑制炎症反应，但对于大出血量创伤的快速止血尚难以满足需求。

海螵蛸是软体动物体内的文石类材料，由85％以上的碳酸钙和部分氨基酸、少量脂肪、糖类等组成，质地疏松、吸附收敛性好。本草纲目中将其作为一昧中药，有收敛止血、固精止带、制酸止痛、收湿敛疮等功效。目前常将中药海螵蛸与其它中药进行组合来满足止血等功能需要，但是多种中药剂的组合使用导致止血药材成本增加，且中药药效较慢不适于临床止血。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种海螵蛸的处理方法、海螵蛸产品及止血促愈合材料，以解决现有技术中海螵蛸难以适用于临床止血需要的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种海螵蛸的处理方法，该处理方法包括：采用第一盐溶液对海螵蛸粉末进行第一次清洗，得到第一次清洗海螵蛸，第一盐溶液为氯化钠溶液和/或氯化钾溶液；采用第二盐溶液对第一次清洗海螵蛸进行第二次清洗，得到第二次清洗海螵蛸，第二盐溶液为次氯酸钠溶液和/或次氯酸钾溶液；采用脱细胞溶液对第二次清洗海螵蛸进行脱细胞处理，得到脱细胞海螵蛸，脱细胞溶液包括水、脱氧胆酸钠、表面活性剂、钙螯合剂和蛋白酶；以及采用缓冲液对脱细胞海螵蛸进行第三次清洗，得到处理后海螵蛸。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：步骤S11，采用质量含量为2～5％的第一盐溶液、以1:5～1:20的固液比对海螵蛸粉末进行清洗后第一次固液分离，优选将海螵蛸粉末和第一盐溶液进行第一混合搅拌，第一混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为1～4h；可选的步骤S12，重复1～3次步骤S11，得到第一次清洗海螵蛸。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：第二次清洗的过程包括：步骤S21，将第一次清洗海螵蛸以1:5～1:20的固液比浸渍于浓度为0.1～1mol/L的第二盐溶液中并进行超声处理，然后进行第二次固液分离，优选超声处理的时间为0.5～2h；可选的步骤S22，重复1～3次步骤S21，得到第二次清洗海螵蛸。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，优选阴离子表面活性剂为碳原子数为10～16的烷基硫酸钠，优选非离子表面活性剂包括聚乙二醇辛基苯基醚和烷基糖苷，优选钙螯合剂为EDTA，优选蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和DipaseⅡ中的任意一种或多种。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：脱细胞溶液包括水以及溶解在水中的0.5～4wt.％的脱氧胆酸钠、0.1～1wt.％阴离子表面活性剂、0.02～0.05wt.％EDTA、0.1～1wt.％Triton X-100、0.1～1wt.％烷基糖苷和0.05～5μg/ml的蛋白酶。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：脱细胞处理的过程包括：将第二次清洗海螵蛸与脱细胞溶液以1:5～1:20的固液比并进行第二混合搅拌，然后进行第三次固液分离，得到脱细胞海螵蛸，第二混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为2～18h。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选为PBS、Hank’s、D-Hank’s中的任意一种。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：第三次清洗的过程包括：步骤S31，将脱细胞海螵蛸与缓冲液以1:5～1:20的固液比并进行第三混合搅拌，然后进行第四次固液分离，第三混合搅拌的转速40～100rpm、时间为2～4h，优选第四次固液分离为真空过滤或离心；可选的步骤S32，重复1～3次步骤S31，得到处理后海螵蛸。

进一步地，上述第一次清洗的过程包括：海螵蛸粉末的粒径为200～400目，处理方法还包括制备海螵蛸粉末的过程，制备海螵蛸粉末的过程包括：步骤S01，将新鲜海鳔鞘去除冗余组织后用去离子水清洗，得到预处理海螵蛸；步骤S02，将预处理海螵蛸裁切去除外鞘、切片后，得到海螵蛸片，优选海螵蛸片的厚度为0.1～0.5cm；步骤S03，采用质量含量为2～5％的第一盐溶液、以1:5～1:20的固液比对海螵蛸片进行1～5次清洗后第五次固液分离，得到清洗海螵蛸片，优选各次清洗包括将海螵蛸片和第一盐溶液进行第四混合搅拌，第四混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为1～4h；步骤S04，对清洗海螵蛸片进行干燥、粉碎，得到海螵蛸粉末，优选干燥为真空干燥或冷冻干燥。

根据本发明的另一方面，提供了一种海螵蛸产品，该海螵蛸产品通过上述任一种的处理方法得到。

根据本发明的另一方面，提供了一种止血促愈合材料，包括海螵蛸和载体，海螵蛸为上述任一种海螵蛸产品，优选载体选自壳聚糖或其衍生物、透明质酸、羟丙基甲基纤维素、氧化纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白胶、富血小板纤维中的一种或多种，优选海螵蛸和载体的重量比为1～3:1。

应用本发明的技术方案，通过多次处理，将海螵蛸内不良反应的物质和生物去除，以降低其免疫原性，同时充分发挥海螵蛸疏松多孔的特性，以达到快速止血的效果，满足临床需要。进一步地，将其与壳聚糖等海洋源性材料进行组合，相互之间起到协同增效作用，进而实现具有快速止血，有效伤口护理的作用。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如本申请背景技术中所描述的，海螵蛸作为中药成分与其它中药剂进行组合作为止血材料，但是其止血药效发挥较慢，难以适用于临床快速止血需要，因此，为了解决上述问题，本申请提供了一种海螵蛸的处理方法、海螵蛸产品及止血促愈合材料。

在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种海螵蛸的处理方法，该处理方法包括：采用第一盐溶液对海螵蛸粉末进行第一次清洗，得到第一次清洗海螵蛸，第一盐溶液为氯化钠溶液和/或氯化钾溶液；采用第二盐溶液对第一次清洗海螵蛸进行第二次清洗，得到第二次清洗海螵蛸，第二盐溶液为次氯酸钠溶液和/或次氯酸钾溶液；采用脱细胞溶液对第二次清洗海螵蛸进行脱细胞处理，得到脱细胞海螵蛸，脱细胞溶液包括水、脱氧胆酸钠、表面活性剂、钙螯合剂和蛋白酶；以及采用缓冲液对脱细胞海螵蛸进行第三次清洗，得到处理后海螵蛸。

本申请采用脱细胞处理和多次清洗对海螵蛸进行处理，而不是采用中药处理常用的炒制，一方面可以将海螵蛸中会导致人体产生不良反应的物质和生物去除，以降低其免疫原性，另一方面保留了海螵蛸的疏松多孔结构，并避免炒制过程中海螵蛸的脆化。

具体地，首先，单独或共同使用氯化钠溶液和氯化钾溶液对海螵蛸进行第一次清洗，以去除其中的脂肪和盐溶性杂蛋白，避免它们在人体内析出而造成免疫反应。其次，单独或共同使用次氯酸钠溶液和次氯酸钾溶液对海螵蛸进行第二次清洗。作为海洋源性材料，海螵蛸中有产生腥味的过敏原小分子物质，次氯酸盐可以有效去除这些物质，有效脱腥，避免在止血时造成过敏反应。同时，次氯酸盐还可以使海螵蛸进一步脱脂，降低免疫反应的可能性。经过上述处理后，海螵蛸中还存留有活性细胞，在止血过程中会造成免疫排斥反应，因此用脱细胞液对其进一步处理，脱去其中细胞。最后，用缓冲液清洗以调节海螵蛸达到人体适宜的pH值范围。通过本申请的处理方法，使海螵蛸中会使人体产生过敏、排异等不良反应的物质予以去除。在保留了海螵蛸的疏松多孔的特性基础上可以充分发挥海螵蛸的快速止血效果，满足临床需要。进一步地将其与壳聚糖等海洋源性材料进行组合，相互之间起到协同增效作用，进而实现具有快速止血，有效伤口护理的作用。

在本申请一种优选的实施例中，优选上述第一次清洗的过程包括：步骤S11，采用质量含量为2～5％的第一盐溶液、以1:5～1:20的固液比对海螵蛸粉末进行清洗后第一次固液分离。利用上述浓度的盐溶液，在相对较高的液固比下，可以有效提高其对海螵蛸粉末中的脂肪和盐溶性杂蛋白的去除效果。同时，为了提升脱除上述物质的效率，优选将海螵蛸粉末和第一盐溶液进行第一混合搅拌，第一混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为1～4h。进一步地，还可以采用可选的步骤S12，重复1～3次步骤S11，得到第一次清洗海螵蛸。通过反复处理，尽可能地降低海螵蛸中的脂肪和盐溶性蛋白含量，以实现对脂肪和盐溶性蛋白尽可能的彻底去除。

在本申请一种优选的实施例中，优选第二次清洗的过程包括：步骤S21，将第一次清洗海螵蛸以1:5～1:20的固液比浸渍于浓度为0.1～1mol/L的第二盐溶液中并进行超声处理，然后进行第二次固液分离，优选超声处理的时间为0.5～2h。可选的步骤S22，重复1～3次步骤S21，得到第二次清洗海螵蛸。利用合适浓度的盐溶液与相对较高的固液比，可以使次氯酸盐溶液更好地去除海螵蛸中的过敏原小分子物质和脂肪。同时，通过超声处理，通过超声波的振动作用，将孔内的小分子物质以及具有粘附性的脂肪更易于从海螵蛸主体上剥离，进而提升清洗效果。此外，还可以反复重复步骤S21，尽可能地降低海螵蛸中的过敏原小分子物质和脂肪的含量。

针对海螵蛸中细胞的性质，为了达到更好的脱细胞效果，优选脱细胞溶液中表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，优选阴离子表面活性剂为碳原子数为10～16的烷基硫酸钠，比如十二烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠。优选非离子表面活性剂包括聚乙二醇辛基苯基醚和烷基糖苷。优选钙螯合剂为EDTA。优选蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和DipaseⅡ中的任意一种或多种。

为了进一步提升脱细胞溶液的脱细胞效果，优选脱细胞溶液包括水以及溶解在水中的0.5-4wt.％的脱氧胆酸钠、0.1～1wt.％阴离子表面活性剂、0.02～0.05wt.％EDTA、0.1～1wt.％Triton X-100、0.1～1wt.％烷基糖苷和0.05～5μg/ml的蛋白酶，上述各物质在上述浓度范围内更容易发挥相互协同的作用。

在本申请一种优选的实施例中，上述脱细胞处理的过程包括：将第二次清洗海螵蛸与脱细胞溶液以1:5～1:20的固液比并进行第二混合搅拌，然后进行第三次固液分离，得到脱细胞海螵蛸，第二混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为2～18h。利用较高的固液比，可以使脱细胞溶液更好地去除海螵蛸中的细胞。同时，通过搅拌，提高脱细胞溶液与第二次清洗海螵蛸的混合碰撞效果，进而可以提升清洗效率和效果。

优选地，缓冲液为磷酸盐缓冲液，该磷酸缓冲液可以采用本领域常规pH值范围的常规组成的磷酸缓冲液，为了节约其用量并提高缓冲效果，优选为PBS、Hank’s、D-Hank’s中的任意一种。同时利用上述缓冲液对海螵蛸进行清洗，可以调节海螵蛸的pH和盐含量接近人体细胞的水平，使海螵蛸发挥止血作用时尽可能地减少人体的不良反应。

在本申请一种优选的实施例中，优选第三次清洗的过程包括：步骤S31，将脱细胞海螵蛸与缓冲液以1:5～1:20的固液比并进行第三混合搅拌，然后进行第四次固液分离，第三混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为2～4h，优选第四次固液分离为真空过滤或离心。可选的步骤S32，重复1～3次步骤S31，得到处理后海螵蛸。利用较高的固液比，可以有效地实现用缓冲液调节海螵蛸表面体系的pH值和盐含量的目的。同时，搅拌可以提升操作的效率和效果。此外，对用缓冲液清洗完的海螵蛸通过真空过滤或离心，可以提升过滤效率，降低过滤后海螵蛸中水分和易于操作等优势。上述真空过滤或离心为常用的操作手段，在此不再赘述。

为了更好地发挥海螵蛸的止血效果，优选海螵蛸粉末的粒径为200～400目，优选处理方法还包括制备海螵蛸粉末的过程，制备海螵蛸粉末的过程包括：步骤S01，将新鲜海鳔鞘去除冗余组织后用去离子水清洗，得到预处理海螵蛸；步骤S02，将预处理海螵蛸裁切去除外鞘、切片后，得到海螵蛸片，优选海螵蛸片的厚度为0.1～0.5cm；步骤S03，采用质量含量为2～5％的第一盐溶液、以1:5～1:20的固液比对海螵蛸片进行1～5次清洗后第五次固液分离，得到清洗海螵蛸片，优选各次清洗包括将海螵蛸片和第一盐溶液进行第四混合搅拌，第四混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为1～4h；步骤S04，对清洗海螵蛸片进行干燥、粉碎，得到海螵蛸粉末，优选干燥为真空干燥或冷冻干燥。步骤S03中的同时或单独使用氯化钠溶液和氯化钾溶液对海螵蛸片进行清洗，可以初步去除海螵蛸中的脂肪，并起到一定消毒、杀菌的作用。优选采用搅拌操作以加强上述效果。步骤S04中优选对海螵蛸粉末的干燥为真空干燥或冷冻干燥，以减少在处理过程中有可能造成的杂菌污染。

在本申请又一种典型的实施方式中，提供了一种海螵蛸产品，该海螵蛸产品通过上述任一种处理方法得到。

本申请采用脱细胞处理和多次清洗对海螵蛸进行处理，而不是采用中药处理常用的炒制，一方面可以将海螵蛸中会导致人体产生不良反应的物质和生物去除，以降低其免疫原性，另一方面保留了海螵蛸的疏松多孔结构，并避免炒制过程中海螵蛸的脆化。

具体地，首先，单独或共同使用氯化钠溶液和氯化钾溶液对海螵蛸进行第一次清洗，以去除其中的脂肪和盐溶性杂蛋白，避免它们在人体内析出而造成免疫反应。其次，单独或共同使用次氯酸钠溶液和次氯酸钾溶液对海螵蛸进行第二次清洗。作为海洋源性材料，海螵蛸中有产生腥味的过敏原小分子物质，次氯酸盐可以有效去除这些物质，有效脱腥，避免在止血时造成过敏反应。同时，次氯酸盐还可以使海螵蛸进一步脱脂，降低免疫反应的可能性。经过上述处理后，海螵蛸中还存留有活性细胞，在止血过程中会造成免疫排斥反应，因此用脱细胞液对其进一步处理，脱去其中细胞。最后，用缓冲液清洗以调节海螵蛸达到人体适宜的pH值范围。通过本申请的处理方法，使海螵蛸中会使人体产生过敏、排异等不良反应的物质予以去除。在保留了海螵蛸的疏松多孔的特性基础上可以充分发挥海螵蛸的快速止血效果，满足临床需要。进一步地将其与壳聚糖等海洋源性材料进行组合，相互之间起到协同增效作用，进而实现具有快速止血，有效伤口护理的作用。在本申请又一种典型的实施方式中，提供了一种止血促愈合材料，包括海螵蛸和载体，海螵蛸为上述海螵蛸产品，优选载体选自壳聚糖或其衍生物、透明质酸、羟丙基甲基纤维素、氧化纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白胶、富血小板纤维中的一种或多种。

通过将海螵蛸和各种具有止血功能的载体相结合，使得止血促愈合材料可以拥有更佳的止血和促愈合效果，并且使其可以适应更多、更复杂的临床应用场景。

此外，由于止血促愈合材料需要分别发挥海螵蛸和载体的作用，为了适应人体伤口的软组织结构，优选海螵蛸和载体的重量比为1～3:1。

以下结合实施例，进一步说明本申请的有益效果。

实施例1

1)预处理：①将新鲜海鳔鞘去除冗余等组织，用去离子水多次冲洗干净。②裁切去除海鳔鞘外鞘，切片，得到厚度约0.3cm海鳔鞘片；③将海鳔鞘片迅速置于-40℃冷冻，使用前取出于室温下流水解冻。

2)清洗、分离：①以固液比1：20(w/w)的5wt.％NaCl溶液以100rpm搅拌2h后排除废液，重复2次；②固液分离得到清洗海螵蛸片。

3)干燥、粉碎：对清洗海螵蛸片真空干燥，粉碎，300目过筛，得到海螵蛸粉末。

4)清洗、分离：以固液比1：20(w/w)混合海螵蛸粉末和5％NaCl溶液，以100rpm的转速搅拌2h后排除废液，重复2次。

5)①将上述处理后的海鳔鞘粉末以固液比1：20(w/w)与1mol/L NaClO溶液混合，并浸泡2h，超声处理0.5h；重复以上操作2次；②上述经处理的海鳔鞘粉末以固液比1:20(w/w)与含有0.1wt.％Triton X-100，0.02wt.％EDTA，0.05μg/ml胰蛋白酶，0.1wt.％十二烷基硫酸钠，0.1wt.％烷基糖苷和0.5wt.％脱氧胆酸钠的复合脱细胞液混合，并以100rpm的转速搅拌4h；待处理完毕后进行固液分离出处理后的海鳔鞘粉末。

6)清洗、分离：①以固液比1:20(w/w)将海鳔鞘粉末与PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)混合，以100rpm的转速搅拌2h后排除废液，以上步骤重复2次；②真空过滤，分离出处理后的海鳔鞘粉末。

7)复合处理：将上述处理后的海鳔鞘粉末加入到2％羧甲基壳聚糖溶液中，固液比1:1(w/v)，混匀，脱气泡。

8)成型及无菌处理：对分海鳔鞘粉末冷冻干燥后，分装、封口、灭菌，得到海鳔鞘复合材料。

实施例2

与实施例1的区别在于，4)中NaCl溶液的质量百分比为2％。

实施例3

与实施例1的区别在于，4)中以固液比1:5确定NaCl溶液的使用量。

实施例4

与实施例1的区别在于，4)中搅拌速度为40rpm。

实施例5

与实施例1的区别在于，4)中搅拌时间为1h。

实施例6

与实施例1的区别在于，4)中搅拌时间为4h。

实施例7

与实施例1的区别在于，5)①中以固液比1:5(w/w)确定NaClO溶液的使用量。

实施例8

与实施例1的区别在于，5)①中NaClO溶液的浓度为0.1mol/L。

实施例9

与实施例1的区别在于，5)①中超声时间为2h。

实施例10

与实施例1的区别在于，将5)②中胰蛋白酶替换为胃蛋白酶。

实施例11

与实施例1的区别在于，将5)②中胰蛋白酶替换为胰蛋白酶、胃蛋白酶和DipaseⅡ的混合溶液，其中胰蛋白酶、胃蛋白酶和DipaseⅡ的质量比为1:1:1。

实施例12

与实施例1的区别在于，将5)②中烷基糖苷换为聚乙二醇辛基苯基醚。

实施例13

与实施例1的区别在于，5)②中Triton X-100的浓度为1wt.％。

实施例14

与实施例1的区别在于，5)②中EDTA的浓度为0.05wt.％。

实施例15

与实施例1的区别在于，5)②中胰蛋白酶的浓度为5μg/ml。

实施例16

与实施例1的区别在于，5)②中十二烷基硫酸钠的浓度为1wt.％。

实施例17

与实施例1的区别在于，5)②中烷基糖苷的浓度为1wt.％。

实施例18

与实施例1的区别在于，5)②中脱氧胆酸钠的浓度为4wt.％。

实施例19

与实施例1的区别在于，5)②中搅拌速度为40rpm。

实施例20

与实施例1的区别在于，5)②中搅拌时间为2h。

实施例21

与实施例1的区别在于，5)②中搅拌时间为18h。

实施例22

与实施例1的区别在于，4)中以固液比1:5确定NaCl溶液的使用量。

实施例23

与实施例1的区别在于，4)中搅拌速度为40rpm。

实施例24

与实施例1的区别在于，4)中搅拌时间为1h。

实施例25

与实施例1的区别在于，4)中搅拌时间为4h。

实施例26

与实施例1的区别在于，将6)中PBS换为Hank’s。

实施例27

与实施例1的区别在于，6)①中以1:5(w/w)的固液比确定PBS缓冲液的使用量。

实施例28

与实施例1的区别在于，6)①中搅拌速度为40rpm。

实施例29

与实施例1的区别在于，6)①中搅拌时间为4h。

实施例30

1)预处理：①将新鲜海鳔鞘去除冗余等组织，用去离子水多次冲洗干净。②裁切去除海鳔鞘外鞘，切片，得到厚度约0.3cm海鳔鞘片；③将海鳔鞘片迅速置于-40℃冷冻，使用前取出于室温下流水解冻。

2)清洗、分离：①以固液比1：20(w/w)的5wt.％NaCl溶液以100rpm搅拌2h后排除废液，重复5次；②固液分离得到清洗海螵蛸片。

3)干燥、粉碎：对清洗海螵蛸片真空干燥，粉碎，300目过筛，得到海螵蛸粉末。

4)清洗、分离：以固液比1：20(w/w)混合海螵蛸粉末和5％NaCl溶液，以100rpm的转速搅拌2h后排除废液，重复3次。

5)①将上述处理后的海鳔鞘粉末以固液比1：20(w/w)与1mol/L NaClO溶液混合，并浸泡2h，超声处理0.5h；重复以上操作3次；②上述经处理的海鳔鞘粉末以固液比1:20(w/w)与含有0.1wt.％Triton X-100，0.02wt.％EDTA，0.05μg/ml胰蛋白酶，0.1wt.％十二烷基硫酸钠，0.1wt.％烷基糖苷和0.5wt.％脱氧胆酸钠的复合脱细胞液混合，并以100rpm的转速搅拌4h；待处理完毕后进行固液分离出处理后的海鳔鞘粉末。

6)清洗、分离：①以固液比1:20(w/w)将海鳔鞘粉末与PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)混合，以100rpm的转速搅拌2h后排除废液，以上步骤重复3次；②真空过滤，分离出处理后的海鳔鞘粉末。

7)复合处理：将上述处理后的海鳔鞘粉末加入到2％羧甲基壳聚糖溶液中，固液比1:1(w/v)，混匀，脱气泡。

8)成型及无菌处理：对分海鳔鞘粉末冷冻干燥后，分装、封口、灭菌，得到海鳔鞘复合材料。

实施例31

1)预处理：①将新鲜海鳔鞘去除冗余等组织，用去离子水多次冲洗干净。②裁切去除海鳔鞘外鞘，切片，得到厚度约0.3cm海鳔鞘片；③将海鳔鞘片迅速置于-40℃冷冻，使用前取出于室温下流水解冻。

2)清洗、分离：①以固液比1：20(w/w)的5wt.％NaCl溶液以100rpm搅拌2h后排除废液；②固液分离得到清洗海螵蛸片。

3)干燥、粉碎：对清洗海螵蛸片真空干燥，粉碎，300目过筛，得到海螵蛸粉末。

4)清洗、分离：以固液比1：20(w/w)混合海螵蛸粉末和5％NaCl溶液，以100rpm的转速搅拌2h后排除废液。

5)①将上述处理后的海鳔鞘粉末以固液比1：20(w/w)与1mol/L NaClO溶液混合，并浸泡2h，超声处理0.5h；②上述经处理的海鳔鞘粉末以固液比1:20(w/w)与含有0.1wt.％Triton X-100，0.02wt.％EDTA，0.05μg/ml胰蛋白酶，0.1wt.％十二烷基硫酸钠，0.1wt.％烷基糖苷和0.5wt.％脱氧胆酸钠的复合脱细胞液混合，并以100rpm的转速搅拌4h；待处理完毕后进行固液分离出处理后的海鳔鞘粉末。

6)清洗、分离：①以固液比1:20(w/w)将海鳔鞘粉末与PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)混合，以100rpm的转速搅拌2h后排除废液；②真空过滤，分离出处理后的海鳔鞘粉末。

7)复合处理：将上述处理后的海鳔鞘粉末加入到2％羧甲基壳聚糖溶液中，固液比1:1(w/v)，混匀，脱气泡。

8)成型及无菌处理：对分海鳔鞘粉末冷冻干燥后，分装、封口、灭菌，得到海鳔鞘复合材料。

实施例32

与实施例1的区别在于，7)中以固液比为3:1确认羧甲基壳聚糖溶液的加入量。

对比例1

与实施例1的区别在于，2)①中以1：2(w/w)的固液比确定NaCl溶液的添加量。

对比例2

与实施例1的区别在于，5)①中以1：2(w/w)的固液比确定NaClO溶液的添加量。

对比例3

与实施例1的区别在于，5)②中以1：2(w/w)的固液比确认复合脱细胞液的添加量。

对比例4

与实施例1的区别在于，复合脱细胞液中十二烷基硫酸钠的含量为0.05wt.％，烷基糖苷含量为0.05wt.％。

对比例5

与实施例1的区别在于，复合脱细胞液中不含EDTA和蛋白酶。

对比例6

与实施例1的区别在于，复合脱细胞液中Triton X-100的含量为0.05wt.％，脱氧胆酸钠的含量为0.25wt.％。

止血效果及组织相容性试验结果

取本申请实施例和对比例中所得海鳔鞘复合材料，分别评价对肝脏出血的止血效果。建立大鼠肝脏损伤出血模型，并以市售壳聚糖海绵为阳性对照组，记录出血时间及出血量，结果如表1所示。此外，观察组织学情况并评价其组织相容性，使用本申请实施例制备的海鳔鞘复合材料来止血，创面颜色、肿胀、渗液、愈合质量等均未出现明显的组织学反应。上述结果显示，本发明制备的海鳔鞘复合材料具有良好的止血效果，组织相容性好，无明显的免疫排斥反应，具有开发为低价高质新型止血修复材料的潜力。

测试结果如表1所示。

表1

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

本申请采用脱细胞处理和多次清洗对海螵蛸进行处理，而不是采用中药处理常用的炒制，一方面可以将海螵蛸中会导致人体产生不良反应的物质和生物去除，以降低其免疫原性，另一方面保留了海螵蛸的疏松多孔结构，并避免炒制过程中海螵蛸的脆化。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种海螵蛸的处理方法，其特征在于，所述处理方法包括：

采用第一盐溶液对海螵蛸粉末进行第一次清洗，得到第一次清洗海螵蛸，所述第一盐溶液为氯化钠溶液和/或氯化钾溶液；

采用第二盐溶液对所述第一次清洗海螵蛸进行第二次清洗，得到第二次清洗海螵蛸，所述第二盐溶液为次氯酸钠溶液和/或次氯酸钾溶液；

采用脱细胞溶液对所述第二次清洗海螵蛸进行脱细胞处理，得到脱细胞海螵蛸，所述脱细胞溶液包括水、脱氧胆酸钠、表面活性剂、钙螯合剂和蛋白酶；以及

采用缓冲液对所述脱细胞海螵蛸进行第三次清洗，得到处理后海螵蛸。

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述第一次清洗的过程包括：

步骤S11，采用质量含量为2～5％的所述第一盐溶液、以1:5～1:20的固液比对所述海螵蛸粉末进行清洗后第一次固液分离，优选将所述海螵蛸粉末和所述第一盐溶液进行第一混合搅拌，所述第一混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为1～4h；

可选的步骤S12，重复1～3次所述步骤S11，得到所述第一次清洗海螵蛸。

3.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述第二次清洗的过程包括：

步骤S21，将所述第一次清洗海螵蛸以1:5～1:20的固液比浸渍于浓度为0.1～1mol/L的所述第二盐溶液中并进行超声处理，然后进行第二次固液分离，优选所述超声处理的时间为0.5～2h；

可选的步骤S22，重复1～3次所述步骤S21，得到所述第二次清洗海螵蛸。

4.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，优选所述阴离子表面活性剂为碳原子数为10～16的烷基硫酸钠，优选所述非离子表面活性剂包括聚乙二醇辛基苯基醚和烷基糖苷，优选所述钙螯合剂为EDTA，优选所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶和DipaseⅡ中的任意一种或多种。

5.根据权利要求4所述的处理方法，其特征在于，所述脱细胞溶液包括水以及溶解在水中的0.5～4wt.％的脱氧胆酸钠、0.1～1wt.％阴离子表面活性剂、0.02～0.05wt.％EDTA、0.1～1wt.％Triton X-100、0.1～1wt.％烷基糖苷和0.05～5μg/ml的蛋白酶。

6.根据权利要求1或4或5所述的处理方法，其特征在于，所述脱细胞处理的过程包括：

将所述第二次清洗海螵蛸与所述脱细胞溶液以1:5～1:20的固液比并进行第二混合搅拌，然后进行第三次固液分离，得到所述脱细胞海螵蛸，所述第二混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为2～18h。

7.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选为PBS、Hank’s、D-Hank’s中的任意一种。

8.根据权利要求1或7所述的处理方法，其特征在于，所述第三次清洗的过程包括：

步骤S31，将所述脱细胞海螵蛸与所述缓冲液以1:5～1:20的固液比并进行第三混合搅拌，然后进行第四次固液分离，所述第三混合搅拌的转速40～100rpm、时间为2～4h，优选所述第四次固液分离为真空过滤或离心；

可选的步骤S32，重复1～3次所述步骤S31，得到所述处理后海螵蛸。

9.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述海螵蛸粉末的粒径为200～400目，所述处理方法还包括制备所述海螵蛸粉末的过程，所述制备海螵蛸粉末的过程包括：

步骤S01，将新鲜海鳔鞘去除冗余组织后用去离子水清洗，得到预处理海螵蛸；

步骤S02，将所述预处理海螵蛸裁切去除外鞘、切片后，得到海螵蛸片，优选所述海螵蛸片的厚度为0.1～0.5cm；

步骤S03，采用质量含量为2～5％的所述第一盐溶液、以1:5～1:20的固液比对所述海螵蛸片进行1～5次清洗后第五次固液分离，得到清洗海螵蛸片，优选各次清洗包括将所述海螵蛸片和所述第一盐溶液进行第四混合搅拌，所述第四混合搅拌的转速为40～100rpm、时间为1～4h；

步骤S04，对所述清洗海螵蛸片进行干燥、粉碎，得到所述海螵蛸粉末，优选所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。

10.一种海螵蛸产品，所述海螵蛸产品通过权利要求1至9中任一项所述的处理方法得到。

11.一种止血促愈合材料，包括海螵蛸和载体，所述海螵蛸为权利要求10所述的海螵蛸产品，优选所述载体选自壳聚糖或其衍生物、透明质酸、羟丙基甲基纤维素、氧化纤维素、海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白胶、富血小板纤维中的一种或多种，优选所述海螵蛸和所述载体的重量比为1～3:1。