CN112514889A - 一种新型冷冻保护液 - Google Patents

一种新型冷冻保护液 Download PDF

Info

Publication number
CN112514889A
CN112514889A CN202011423046.6A CN202011423046A CN112514889A CN 112514889 A CN112514889 A CN 112514889A CN 202011423046 A CN202011423046 A CN 202011423046A CN 112514889 A CN112514889 A CN 112514889A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
trehalose
glycerol
integrity
freezing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011423046.6A
Other languages
English (en)
Inventor
金�一
吕艳秋
陈璇
罗晓彤
韩越
程咪咪
曲星霖
张雨阳
孔令敏
李春宇
尹伊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yanbian University
Original Assignee
Yanbian University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yanbian University filed Critical Yanbian University
Priority to CN202011423046.6A priority Critical patent/CN112514889A/zh
Publication of CN112514889A publication Critical patent/CN112514889A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型冷冻保护液，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.05moL/L‑0.15moL/L。本冷冻保护液降低保护液毒性，提高冻融效果；在冷冻精子时能够显著改善精子的活力、质膜完整性、顶体完整性、酪氨酸磷酸化水平和鱼精蛋白缺乏水平、活率与线粒体膜电位，提高冻融后精子质量。

Description

一种新型冷冻保护液
技术领域
本发明涉及冷冻保存技术领域，具体涉及一种新型冷冻保护液。
背景技术
延边黄牛品种特征和肉品特性优良，具有鲜明的地域特色，是中国五大地方良种牛之一。冷冻保存对精子功能和生育能力的影响已经得到了广泛的研究，特别是在牛身上。精子的冷冻保存是保存哺乳动物精子的一种有效途径。该方法常常被用作培育优良后代，牲畜的生产潜力，以及辅助治疗因生育能力损伤而采取的人工授精等。所以对于遗传与育种方面，精子的冷冻保存是十分重要的方法。从雄性生殖器中取出活力良好的精子，经过对冷冻过程中的处理用来促进物种之间的遗传改良。精液冷冻保存中最重要的挑战是其对冷冻保存方法的内在敏感性，这种方法极大地改变了精子顶体完整性，质膜的流动性和渗透性以及DNA的完整性，并导致mRNA和蛋白质降解，严重损害精子的功能，降低存活率，产生毒性作用，从而影响生殖能力。所以探索最合适的浓度非常重要。
在冷冻保存过程中，甘油作为渗透性保护剂阻止了冰晶对精子膜的破坏作用，从而精子的活力、顶体膜完整性和质膜完整性等质量参数均有一定的改善。但是甘油的毒性会造成精子鱼精蛋白的缺失，造成受精率降低。
甘油通过渗透性来刺激细胞脱水到细胞外的作用，从而减少了可用于冷冻的细胞内水的体积。它的作用机理与其在低温下降低电解质浓度和渗透收缩程度的能力有关。具体而言，通过插入脂质双层中影响细胞质粘度，改变扩散速率并改变细胞膜特性。在高于5℃的温度下会引起渗透体积变化，更有可能会损坏细胞。因此，它们需要在冻结之前渗透，并且在解冻时必须迅速移除。但甘油也有不利影响，对精子是具有一定的毒性的。已经表明，甘油的摩尔浓度可以影响细胞质的物理特征(细胞质组织和粘度)，双层膜的渗透性和稳定性，以及蛋白质与膜的非共价键结合。在1992年Hammerstedt和Graham探讨家禽精子冷冻的问题时，阐述了甘油对精子的作用，这包括减弱了精子的受精能力。
许多实验结果证实海藻糖可被用作冷冻保护剂，因为海藻糖有助于细胞脱水，冷冻保存过程中产生横跨精子膜以减少水流和防止冰晶生产。并且海藻糖与精子膜磷脂和蛋白质相互作用并对其进行了修饰，从而改善了膜的柔韧性，进一步抵抗冷冻损伤。因为海藻糖无法扩散穿过质膜，从而产生渗透压，引起细胞脱水并使得细胞内冰晶形成的发生率降低。它与质膜中的磷脂相互作用，从而提高了精子的冷冻保存率。近些年来，在公羊和山羊精液的冷冻保护剂中添加高浓度的海藻糖可以较好的保护解冻后的运动参数，恢复率，耐热性和顶体完整性。
精子的冷冻保存可以延长其在体外的寿命，但是由于冷冻解冻过程中精子的结构和生理功能的改变，使得精子出现损伤，进而大大降低了其受孕率。为了减少在冷冻解冻过程中对精子的损伤程度，对冷冻保护剂的研究与完善是尤为重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冷冻保护液，其以海藻糖替代原始保护液中的部分甘油，降低保护液中甘油产生的毒性，提高冻融效果。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种新型冷冻保护液，其特征在于，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.05moL/L-0.15moL/L。
本发明的有益效果在于：降低保护液毒性，提高冻融效果；在冷冻精子时能够显著改善精子的活力、质膜完整性、顶体完整性、酪氨酸磷酸化水平和鱼精蛋白缺乏水平、活率与线粒体膜电位，提高冻融后精子质量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种新型冷冻保护液，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.05moL/L。
实施例2
一种新型冷冻保护液，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.1moL/L。
实施例3
一种新型冷冻保护液，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.15moL/L。
实施例4
精子活力、密度、质膜完整性、顶体膜完整性评估测定
实验试剂：除非另有说明，否则所有试剂均来自西格玛试剂公司(Sigma)。
精液的收集与冷冻解冻程序：
本试验在延边畜牧开发集团有限公司从20头延边黄牛中选择5-6头3-5岁、健康的延边黄牛采用手握法采取精液，每周2次采集精子样品，每头牛采集三次，仅收集其中活力≥90％精液进行试验。
冷冻：将冷冻保护液(蛋黄200mL/L，柠檬酸钠13.536g/L，三羟甲基氨基甲烷24.224g/L，葡萄糖11g/L，硫酸链霉素1g/L(100万单位)，青霉素0.8g/L(160万单位)添加精液样本中，甘油浓度根据实验而有所不同，最终浓度分别为60mL/L和30mL/L，并且向甘油浓度为30mL/L的处理组添加0、0.05、0.1和0.15moL/L海藻糖。充分混匀，调节精子浓度到1×108/mL。然后将稀释的精子样品吸进0.25ml(中型)麦管中，用聚乙烯醇粉末密封，并在4℃下平衡3.5h。平衡后，将麦管在液氮上方5cm熏蒸8-10min。然后将麦管插入液氮中进行储存。
解冻：将冷冻的麦管在37℃的水浴中解冻30s，用于研究精液的不同参数，并且在整个研究的过程中由同一位有经验的技术人员进行评估。将冷冻的麦管在的水浴中解冻30s，用于研究精液的不同参数，并且在整个研究的过程中由同一位有经验的技术人员进行评估。
精子运动能力、质膜完整性和顶体完整性的评估：
将精子样品置于已预热(37℃)的载玻片上，通过微生物动(静)态图像检测系统(CASA)对精子进行评估。简而言之，对于每个样品，将5μL精液等分试样放在分析仪的腔室中，该腔室在分析过程中保持在37℃。随机选择3个视野进行计算机辅助分析。总精子活力定义为具有任何活力精子的百分比。
精子质膜完整性通过低渗溶胀试验(HOST)进行检测，取100μL稀释后的精液与900μL低渗肿胀液(果糖13.512g/L，柠檬酸钠7.352g/L)在38.5℃下孵育30min。孵育后镜检(400×)，至少计数200个精子。
顶体完整性通过考马斯亮蓝染色进行检测，取100μL稀释后的精液涂于载玻片上，再取1mL考马斯亮蓝染色液将精子铺盖，避光下染色30min，随后镜检(400×)，至少计数200个精子。
精子活率与线粒体膜电位的评估：
赫斯特33342(Hoechst33342)染料，碘化丙啶染剂(PI)和线粒体膜电位检测荧光染料(JC-1)用于同时评估精液活力(头部)与线粒体膜电位水平(中段)。赫斯特33342(Hoechst33342)染料和碘化并啶染剂是特定于DNA的染料，赫斯特33342(Hoechst33342)染料染剂可将活细胞染成蓝色，碘化并啶染剂将死细胞染成红色。线粒体膜电位检测荧光染料是一种被广泛应用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。线粒体膜电位检测荧光染料在线粒体膜电位高的时后可以在线粒体的基质中聚集并能与之形成聚合物，然而在线粒体膜电位较低时，线粒体膜电位检测荧光染料则不可能在线粒体基质中聚集聚，此时线粒体膜电位检测荧光染料因无法形成聚合物而是一种单体，并且在荧光显微镜下会发出绿色荧光。为了进行分析在37℃避光的条件下，将2.5μL的赫斯特33342(Hoechst33342)染料(20μmol/L溶于二甲基亚砜(DMSO))和5μL的线粒体膜电位检测荧光染料(153μmol/L溶于二甲基亚砜)溶于已预热500μL的精子样品中，并且孵育20min。然后，再加入2.5μL的PI(2.4mmol/L溶于二甲基亚砜)溶于样品，并在37℃下孵育10min。随后，使用荧光显微镜观察染色的精子，在每个样品中评估了200至300个精子。
精子膜脂质紊乱流式细胞仪分析：
为了检测精子膜脂质紊乱水平，用部花青540(M540)和恶唑黄(Yo-Pro-1)对精子样本进行染色。用二甲基亚砜制备M540(1mM)和恶唑黄(Yo-Pro-1)(25μM)的储备溶液，对于每1mL稀释的精子样品(包含5-10×106个细胞)，添加2.7μL的M540(最终浓度为2.7μm)和1μL的恶唑黄(Yo-Pro-1)(最终浓度为25nm)储备液。M540和恶唑黄(Yo-Pro-1)染料是由488nm激光激发，恶唑黄(Yo-Pro-1)荧光由FL1通道接收，M540荧光由FL3通道接收。
色霉素A3(CMA3)染色精子鱼精蛋白的评估：
色霉素A3(CMA3)是特定于DNA以评估精子鱼精蛋白水平的常用染料：染色质结构异常时色霉素A3(CMA3)显阳性，精子头部发出亮绿色荧光；染色质结构正常时色霉素A3(CMA3)为阴性，精子头部发出暗绿色荧光。
简而言之，每个精液样品在不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤2次，并在4℃条件下于固定液(甲醇：冰醋酸3：1)中固定5min。涂片，将每张载玻片用100μL色霉素A3(CMA3)染色工作液(在McIlvaine缓冲液中加入0.25mg/mL(7mL柠檬酸0.1M+32.9mL七水合磷酸氢二钠0.2M，pH7.0，其中包含氯化镁10moL/L))避光染色处理20min。然后将载玻片在McIlvain的缓冲液中冲洗并风干。通过使用荧光显微镜观察染色的精子。每个载玻片上随机评估至少200个精子。
精子顶体膜蛋白分离：
每组分别取出1mL精液放入离心管中。用PBS和解冻后的精子按照1:1的比例进行混合后放入离心机中用600rpm 5min进行洗涤。随后将离心管取出，用移液枪除去上清后，分别向各组的离心管中加入获能液2mL，同时需要在离心机中继续离心600rpm 5min。离心完毕后，用移液枪除去上清并向离心管中继续加入获能液2mL。随后将对照组与处理组放入二氧化碳(CO2)培养箱中保存1h。保存时间到后将样品取出并放入离心机中进行离心600rmp 5min。离心完毕后用移液枪除去上清，并同时按照100：1的比例加入裂解液(RIPA)与蛋白酶抑制剂(PSMF)。本次实试分别添加了700μL裂解液(RIPA)和7μL蛋白酶抑制剂(PSMF)。随之放入振荡器上振荡计时3min。振荡完毕后将样品用移液枪放入1.5mL的离心管中，将对照组与处理组标记明确后放入已放好冰快的盒中，此处操作目的是防止蛋白质溶解。将其放在摇床上，时间持续40min。随后将样品取出并放入离心机中离心，离心时保证12000rpm，4℃，离心10min。最后将样品从离心机中取出，分别提取出上层清液并进行分装。将其置-80℃的条件下保存以待后续实验需要。
蛋白含量的测定：
在室温中取出冷冻的蛋白标准配制液，待其融化后取出七个5mL的离心管，并将1mg/mL的蛋白标准配制液取出0、10、20、40、60、80、100μL分别放入离心管中。同时向每个离心管中添加蒸馏水保证总体积为100μL。随后将上一步骤提取的蛋白样品每组各提取5μL，并向离心管中添加95μL的蒸馏水，保证总体积为100μL,将样品放入振荡机上，待振荡均匀后在每组样品中添加2mL的考马斯亮蓝溶液，混合溶液使其均匀，并在室温中放置2min。时间达到后，将样品用生物分光光度计进行比色分析，测定时要保证595nm的光被吸收同时浓度要从低到高去测定。最后把得到的结果绘制出标准曲线，利用公式计算出浓度。
凝胶电泳：
将两块清洗后的玻璃板对齐放入跑夹子中卡紧，并保证玻璃板可以垂直牢固的卡在架子上以等待向其中灌胶。量取3.3mL的30％丙烯酰胺、3.8mL的1.5M三羟甲基氨基甲烷(酸碱度8.8)、0.1mL的10％十二烷基硫酸钠和0.1mL的10％的过硫酸铵，同时加入2.7mL去离子水，最后加入四甲基乙二胺混合均匀后配制成10％的下层胶。为使得凝胶速度更快，应向里加入大约1mL的正丁醇。凝胶所产生的现象为胶水与水之间产生了一条折射线。胶凝后去除正丁醇，然后用水进行冲洗并随之用吸水纸吸干。5％的上层胶的配制：量取40μL 10％SDS、670μL的30％丙烯酰胺(29:1)、2.7mL的去离子水、500μL的1M三羟甲基氨基甲烷(pH6.8)和以及10％AP，最后加入8μL四甲基乙二胺混匀。插入梳子之前将剩余的地方灌胶灌满。要注意在灌胶的操作中确保没有气泡的产生。待上层胶凝固，加入已经配好的1×电泳缓冲液，加至超过玻璃板的上缘。然后两手将梳子轻轻拔出。进行上样。将电压调至100V，电流为300mA,功率在50W，时间1.5h。在电泳15min之后要及时将电压调至130V，终止的评定标准为溴酚兰跑出，跑胶在1/3时终止，最后将样品取出进行转膜的操作。
转膜：
将聚偏二氟乙烯膜膜和准备好的两层滤纸剪成与凝胶尺寸大小相同，随后在1×转膜缓冲液中将其放入并持续30min，达到片与片之间没有气泡的产生取出。按照两层滤纸—聚偏二氟乙烯膜—凝胶—两层滤纸的顺序进行摆放。每一层不产生气泡。以25V进行转移1.5h。
免疫印迹：
转膜后，用0.01M磷酸盐缓冲溶液洗涤膜三次，每一次洗涤10min。随后在培养皿中放入封闭液并把膜放置其中，在室温下利用摇床持续2h。再用0.01M磷酸盐缓冲溶液进行洗涤三次，每一次洗涤10min。加入一抗，放置4℃过夜。次日，用0.01M磷酸盐缓冲溶液进行洗涤三次，每一次洗涤10min。室温中使二抗温育1h。然后加入二抗，同时振荡。然后放入数字凝胶成像系统中，成像，拍照。
数据统计与分析：
所有试验均重复三次，使用统计学软件包进行统计分析差异性，结果以mean±SD表示，当P<0.05时，差异被认为是显著的。当P<0.01时，差异被认为是极显著的。
三头延边黄牛新鲜质量及动力学参数检测：
评估了本试验中使用的三头延边黄牛鲜精的质量与动力学参数，用精子微生物动(静)态图像检测系统分析仪检测精子的活力和运动状态。随后，用低渗肿胀法和考马斯亮蓝染色法检测出精子的质膜完整性和顶体膜完整性。结果列于表1和表2，可以看出三头延边黄牛鲜精质量与动力学参数之间无显著差异，且精子活力均≥90％，精液质量优良，适合用于本试验研究。
表1延边黄牛鲜精质量参数检测
Figure BDA0002823392520000081
表2延边黄牛鲜精动力学参数检测
Figure BDA0002823392520000082
注：VCL(Curvilinear velocity，μm/s)代表曲线速度、VSL(Straight linevelocity，μm/s代表直线速度、VAP(Average path velocity，μm/s)代表平均路径速度、LIN(Linearity，％)代表直线性运动、STR(Straightness，％)代表前向性运动
添加不同浓度海藻糖替代部分甘油对冻融延边黄牛精子质量参数的影响：
通过微生物动(静)态图像检测系统、低渗肿胀及考马斯亮蓝染色试验检测精子的动力、质膜完整性和顶体膜完整性。从表3中可以看出，与对照组相比，甘油浓度从60mL/L降低到30mL/L后精子活力、质膜完整性与顶体完整性均显著下降(P<0.05)，30mL/L甘油+海藻糖(0.05、0.1和0.15moL/L)处理组精子活力均显著高于对照组(P<0.05)，与30mL/L甘油处理组相比，30mL/L甘油+0.1moL/L海藻糖处理组精子质膜完整性和顶体完整性均显著提高(P<0.05)，且显著高于60mL/L甘油对照组。
表3延边黄牛冻融精子质量参数检测
Figure BDA0002823392520000091
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表4中可以看出，与对照组相比，甘油浓度从60mL/L降低到30mL/L后精子VCL和STR显著下降(P<0.05),30mL/L甘油+(0.05、0.1和0.15moL/L)海藻糖处理组VCL、VSL、VAP、LIN和STR均显著高于30mL/L甘油处理组(P<0.05)，同时显著高于60mL/L甘油对照组，且在海藻糖为0.1moL/L时对精子的保护效果最佳。
表4延边黄牛冻融精子动力学参数检测
Figure BDA0002823392520000101
注:VCL(Curvilinear velocity，μm/s)代表曲线速度、VSL(Straight linevelocity，μm/s)代表直线速度、VAP(Average path velocity，μm/s)代表平均路径速度、LIN(Linearity，％)代表直线性运动、STR(Straightness，％)代表前向性运动。不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
根据以上试验，说明用海藻糖替代部分甘油对精子具有很大的影响，且当海藻糖为0.1moL/L时可以得到更好的精子质量，因此，后续试验将使用浓度为0.1moL/L的海藻糖进行比较研究。
实施例4
海藻糖对冻融延边黄牛鱼精蛋白缺乏、脂质过氧化及获能后酪氨酸磷酸化的影响实验
实验内容：
添加不同浓度海藻糖对冻融延边黄牛精子活率与线粒体膜电位的影响
将新鲜精液、60mL/L甘油对照组和处理组(30mL/L甘油+0、0.1moL/L海藻糖)同时进行赫斯特33342/碘化丙啶/线粒体膜电位联合染色。用于评估精液活率和线粒体活性，经过冷冻解冻处理后的精子活率和线粒体膜电位显著低于鲜精组(P＜0.01)。各处理组与对照组相比均出现显著差异(P<0.01)。甘油浓度从60mL/L降低到30mL/L后精子的活率与线粒体膜电位水平均出现显著下降(P<0.01)。随后在添加0.1moL/L海藻糖处理组的精子活率和线粒体膜电位显著高于对照组(P＜0.01)。
添加不同浓度海藻糖对冻融延边黄牛精子膜脂质组织紊乱的影响
精液膜脂质紊乱水平的评估如表5所示，与鲜精组相比，经过冷冻解冻处理后活精子和死精子的膜脂质紊乱水平相对于鲜精组而言均显著升高升高(P＜0.05)。甘油浓度从60mL/L降到30mL/L的活精子膜脂质紊乱水平显著升高，死精子的膜脂质紊乱水平显著下降(P＜0.05)。在添加0.1moL/L海藻糖的处理组活精子与死精子的膜脂质紊乱水平显著下降(P＜0.05)。
表5冻融前后延边黄牛精子膜脂质组织紊乱的检测
Figure BDA0002823392520000111
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
添加不同浓度的海藻糖处理对冻融延边黄牛精子鱼精蛋白的影响
通过色霉素A3(CMA3)染色用来检测冻融精子的鱼精蛋白缺乏程度和DNA完整性，经过冷冻解冻后精子的鱼精蛋白缺乏水平均显著高于鲜精组(P＜0.01)，当甘油浓度从60mL/L降低到30mL/L解冻后精子的鱼精蛋白缺乏水平显著降低(P<0.01)，随后向30mL/L甘油冷冻法保护剂中添加0.1moL/L海藻糖处理，精子鱼精蛋白缺乏水平显著降低且显著低于60mL/L甘油对照组(P＜0.01)。
添加不同浓度的海藻糖处理对冻融延边黄牛的精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响
在获能过程中，信号通路被激活，导致蛋白酪氨酸磷酸增加，这是成功进行获能过程的关键标志。将冷冻精子在解冻之后进行获能处理，蛋白免疫印迹分析结果显示，在精子获能过程中，出现典型的酪氨酸磷酸化蛋白条带增加。经过冻融处理的精子酪氨酸磷酸化蛋白条带会有所减少。60mL/L甘油对照组相比，30mL/L甘油+0.1moL/L海藻糖处理组酪氨酸磷酸化蛋白条带会更为明显。
本实验研究将鲜精组、对照组(60mL/L甘油+0moL/L海藻糖)、处理组(30mL/L甘油+0、0.1moL/L海藻糖)进行赫斯特33342/碘化丙啶双标法染色和线粒体膜电位染色组合，同时评估精子的活率与线粒体膜电位。从结果表明30mL/L甘油+0.1moL/L海藻糖处理组的活率和线粒体膜电位显著高于对照组。由此进一步表明，海藻糖对精子的冷冻保护作用。
本实验研究将鲜精组、对照组(60mL/L甘油+0moL/L海藻糖)和处理组(30mL/L甘油+0、0.1moL/L海藻糖)进行色霉素A3染色检测。从实验结果显示，30mL/L甘油+0.1moL/L海藻糖处理组的鱼精蛋白缺乏水平显著少于对照组，这表明海藻糖具有保护鱼精蛋白-DNA结构的作用，也保持了精子的受精能力。
本实验研究中将60mL/L甘油对照组和处理组(30mL/L甘油+0、0.1moL/L海藻糖)冷冻解冻后，从结果显示在添加0.1moL/L海藻糖处理组与60mL/L甘油对照组相比的酪氨酸磷酸化蛋白条带数量更多。表明海藻糖可提高精子酪氨酸磷酸化水平，从而影响精子体外发育的水平。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.一种新型冷冻保护液，其特征在于，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.05moL/L-0.15moL/L。
CN202011423046.6A 2020-12-08 2020-12-08 一种新型冷冻保护液 Pending CN112514889A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011423046.6A CN112514889A (zh) 2020-12-08 2020-12-08 一种新型冷冻保护液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011423046.6A CN112514889A (zh) 2020-12-08 2020-12-08 一种新型冷冻保护液

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112514889A true CN112514889A (zh) 2021-03-19

Family

ID=74998184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011423046.6A Pending CN112514889A (zh) 2020-12-08 2020-12-08 一种新型冷冻保护液

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112514889A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112931491A (zh) * 2021-04-28 2021-06-11 山东省海洋生物研究院 一种大泷六线鱼精子低温保存液

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112931491A (zh) * 2021-04-28 2021-06-11 山东省海洋生物研究院 一种大泷六线鱼精子低温保存液

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1608382B1 (en) Process for the staining of sperm
Gil et al. Influence of centrifugation and different extenders on post-thaw sperm quality of ram semen
THURSTON et al. Morphologically distinct sperm subpopulations defined by Fourier shape descriptors in fresh ejaculates correlate with variation in boar semen quality following cryopreservation
CN1038691C (zh) 稳定的冻干哺乳动物细胞的制备方法
Tuncer et al. Effects of different doses of trehalose supplementation in egg yolk extender in frozen–thawed Angora buck semen
WO2002041906A2 (en) Methods and apparatus for producing gender enriched sperm
Sutovsky New approaches to boar semen evaluation, processing and improvement
EP2269617A1 (en) Process for enriching a population of sperm cells
CN112514889A (zh) 一种新型冷冻保护液
MX2014008839A (es) Anticongelante de yema de huevo de pato para la crioconservacion de semen de burro y el metodo de preparacion del mismo.
Chandler et al. Bovine spermatozoal head size variation and evaluation of a separation technique based on this size
Alm et al. A novel automated fluorometric assay to evaluate sperm viability and fertility in dairy bulls
Andrews et al. Characterization of N‐(6‐methoxy‐8‐quinolyl)‐p‐toluenesulfonamide for the detection of zinc in living sperm cells
Willems et al. Absence of an effect of lead acetate on sperm morphology, sister chromatid exchanges or on micronuclei formation in rabbits
Liu et al. Apoptosis in histiocytic necrotizing lymphadenitis
US20110236923A1 (en) Method for staining and sorting of a small volume of sperm
US11549098B2 (en) Processing of sperm cells
Pongsiri et al. The effect of false mount on quality of frozen-thawed semen in Bos indicus beef bulls
Almadaly et al. Plasma membrane integrity and morphology of frozen-thawed bull spermatozoa supplemented with desalted and lyophilized seminal plasma
Ruben et al. Serial section radioautography of the inner ear: histological technique
CN110325266B (zh) 通过电泳分离精子
Falk A biochemical laboratory manual for species characterization of some tilapiine fishes
Strzeżek et al. Biochemical properties and usefulness of boar semen for liquid preservation following atropine administration
Valeanu et al. Effect of Single layer centrifugation using Bovipure on frozen-thawed bovine sperm during a 6 hours survival test
Setyawan et al. Effects of cryoprotectant treatments on bovine sperm function and osmolyte content

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination