CN112512535A - 用于提高胚胎着床的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种提高受试者中的胚胎着床的方法，所述的方法包括向所述的受试者的子宫腔施用有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的包含铜和/或锌的制剂。可替代地，可将装置插入所述的受试者的子宫腔持续有效刺激子宫内膜产生LIF和/或VEGF的时间段，其中所述的装置包含铜和/或锌。所述的方法适用于通过辅助生殖技术中的任一种进行治疗的女性，所述的辅助生殖技术诸如那些涉及胚胎移植的技术，诸如体外受精(IVF)以及包括IVF‑ICSI(卵母细胞胞浆内单精子注射)和体外成熟(IVM)治疗的变型，以及涉及宫腔内人工授精(IUI)疗法的技术。然而，所述的方法也适用于希望通过自然受孕来改善怀孕前景的女性。

Description

用于提高胚胎着床的方法
技术领域
本公开涉及辅助生殖技术诸如体外受精(IVF)的领域。更具体地，本公开涉及用于提高受试者的移植胚胎着床的方法以及制剂和装置。
优先权文件
本申请要求于2018年5月29日提交的题为“用于提高胚胎着床的方法(Method forenhancing embryo implantation)”的澳大利亚临时专利申请号2018901900的优先权，其内容以引用的方式整体并入本文。
背景技术
虽然在过去的三十年中，IVF治疗的巨大进步极大地促进了对如何优化体外胚胎发育的理解，但是在用于优化或提高移植胚胎的成功着床的方法方面进展甚微。即使在今天，将形态良好的遗传上正常的胚胎移植到“可生育”受者(即，没有自身生育潜力障碍的女性，诸如纯男性因素不育症)的子宫仍不能保证成功着床，其中这些“最优”胚胎中多达一半未能着床(Dahdouh等人，2015)。因此，与超过95％的胚胎成功着床的物种(诸如小鼠和兔子)相比，人IVF可被认为是非常低效的(Valbuena等人，2017)。此外，许多接受IVF治疗的女性进行了多个优质胚胎的移植但从未成功怀孕，这表明了在这种反复着床失败(RIF)队列中着床的主要障碍。此外，许多女性没有孩子，因为她们的胚胎未能成功着床，而不是不能产生胚胎(Martin，1995)，这当然意味着潜在的着床缺陷。
迄今为止，已知唯一增加RIF着床的治疗方法是通过刮宫术(也称为“子宫内膜搔刮术”)(Nastri等人，2015)或插入并随后取出避孕的子宫内避孕装置(IUCD)(Mao等人，2017)来破坏子宫内膜。尚不完全了解这种过程如何提高着床，但据报道与子宫内膜破坏相关的炎症反应会导致释放已知提高胚胎发育的细胞因子和生长因子(Liang等人，2015)。然而，当前这些治疗RIF的方法有几个缺点。首先，它们通常在实际的胚胎移植前至少进行一个月经周期，从而使受损的子宫内膜随着月经脱落，然后有时间自我修复-据报道，在与胚胎移植相同的月经周期中子宫内膜的破坏(刮宫)损害着床，正如预期的那样这种过程破坏子宫内膜的完整性，并与子宫腔内大量出血相关(Karimzade等人，2010)。其次，接受子宫内膜活检或IUCD插入的过程对于受者而言是痛苦的。因此，理想的疗法将是相对无痛、无副作用并且可在与预期的胚胎移植相同的月经周期中进行的疗法。
目前尚不清楚为什么人类生殖的效率比大多数其他动物物种低。然而，早期生殖事件中显著的物种间差异可能是造成这种异常的原因，并且提供了一些关于如何提高人类着床的见解。在诸如啮齿动物、兔子和猪的多产繁殖者中，子宫颈在交配前后保持开放状态，从而使大量的精浆和精子浸润子宫内膜，并开始产生生长因子和细胞因子，并另外导致产生明显的交配后子宫炎症反应(Schjenken和Robertson，2014；Robertson和Sharkey，2016)。这种对精液的炎症反应会重塑子宫内壁，并且促进胚胎的生长和发育。手术切除男性副性腺(前列腺、精囊)，从而阻止子宫暴露于精浆，导致子宫炎症反应显著减少和着床受损，这是这种反应的生殖重要性所在(Schjenken和Robertson，同上；Robertson和Sharkey，同上)。然而，女性的子宫腔暴露于相对较少数量的精子和相关的精浆蛋白中，因为精子在到达子宫之前必须穿过宫颈粘液“过滤器”(Schjenken和Robertson，同上)。物种之间的这种显著不同的生殖生理学意味着，与宫内射精动物相比，女性在性交后暴露于精液而引发能够增加着床的炎症反应的可能性较小。
除了精浆外，还报道了其他子宫炎症的诱因。例如，已知锌和铜金属离子对培养中的子宫内膜细胞具有细胞毒性(Wu等人，2012)，并在暴露于IUCD的情况下产生子宫内炎症反应(Sadovsky等人，1975；Stanford和Mikolajczyk，2002)。虽然已知这种IUCD相关的子宫内膜炎症是避孕的，从而损害胚胎的成功着床(Kelly等人，1969；Sheppard,1987；Stanford和Mikolajczyk同上)，但本发明人假设，子宫内膜暴露于铜离子和/或锌离子的时间较短，或剂量较低时，可能产生不太强烈的炎症反应，这可能能够上调有益细胞因子(诸如血管内膜生长因子(VEGF)和白血病抑制因子(LIF))的产生，但不足以引起通常在IUCD使用者中观察到的有害子宫内膜破坏。
胚胎的着床过程是复杂的级联事件，其需要卵巢类固醇(例如雌激素和孕酮)作用与子宫内膜上胚胎本身的旁分泌(例如hCG和细胞因子)之间的精确相互作用(Norwitz等人，2001)。排卵及随后血清孕酮升高后，子宫内膜腺上皮细胞转化为高度活性的分泌细胞，所述的分泌细胞合成可提高胚胎的发育并改变子宫内膜功能的各种物质(例如营养素、生长因子和细胞因子)。子宫上皮的LIF和VEGF的产生是在辅助着床中起关键作用的两种关键细胞因子(Norwitz等人，同上)。
支持LIF在着床中起关键作用的证据
有大量证据表明LIF在胚胎着床中起关键作用，诸如：
1.在LIF“敲除”小鼠(即不产生LIF的小鼠模型)中，产生了正常胚胎，但是它们不能植入子宫中(Stewart等人，1992；Chen等人，2002)。然而，将这些LIF-/-胚胎移植到野生型(产生LIF的)小鼠，或在妊娠第4天通过注射将外源性LIF人工递送到LIF-/-小鼠，恢复了正常的着床能力(Stewart等人，同上；Chen等人，同上)。此外，鼠子宫上皮中LIF受体的组织特异性消融也导致着床失败(Cheng等人，2017)。所有这些发现表明，LIF活性对于小鼠着床绝对至关重要。
2.子宫内膜产生LIF的高峰在可生育女性的黄体期，即胚胎正常开始着床的确切时间(Charnock-Jones等人，1994；Cullinan等人，1996)。
3.反复IVF着床失败的女性中子宫内膜LIF的产生减少(Mikolajczyk等人，2007；Choi等人，2016)，这表明LIF在着床过程中起着至关重要的作用。
4.据报道，向培养中的鼠胚胎中添加LIF促进子宫内膜发育到“孵化的”胚泡阶段，并且增加体外滋养层细胞的生长(Lavranos等人，1995)。类似地，据报道，鼠胚胎在体外暴露于LIF并随后使用类似于人IVF的经宫颈技术移植它们，提高着床率和妊娠率(Mitchell等人，2002)。
5.相反，据报道，使用LIF中和抗体(Mitchell等人，同上)或聚乙烯糖基化的LIF拮抗剂(Lalitkumar等人，2013)在体外阻断LIF作用分别抑制小鼠和人的着床潜力。此外，已表明在妊娠第5天将LIF中和抗体递送到子宫腔会显著损害恒河猴的着床(Sengupta等人，2006)。
6.子宫内膜发育不良(子宫内膜薄)，可能是由子宫内膜血管灌注不足引起的(Jinno等人，2001)，是导致着床失败的已知原因。有重要证据表明LIF参与子宫内膜和胎盘的血管生成(Alfer等人，2017)。
综上所述，子宫内膜LIF的产生在排卵后增加，并似乎通过提高胚胎发育来辅助着床，同时也引发了子宫内膜中似乎对于胚胎的初始附着和侵入(即着床)至关重要的事件。此外，子宫内膜LIF的产生低与IVF成功率降低和病因不明的不育症相关。此外，先前已经报道了以含铜IUCD形式暴露于铜会降低子宫内膜LIF表达并损害着床(Güney等人，2007)。然而，迄今尚不清楚较短时间的铜(或锌)暴露对子宫内膜LIF产生的影响。
支持VEGF在着床中起关键作用的证据
也有大量证据表明VEGF在胚胎着床中起关键作用，包括：
1.子宫内膜产生VEGF的高峰在可生育女性的黄体中期，即胚胎正常开始着床的确切时间。然而，在反复IVF着床失败的女性中未见到VEGF产生的这种黄体中期高峰(Jee等人，2009)，这表明VEGF在着床过程中起着至关重要的作用。
2.VEGF通过增加血管渗透性和提高血管扩张剂的产生来引发子宫内膜组织水肿(Rockwell等人，2002)。子宫内膜组织的水肿(蜕膜)使子宫表面紧邻胚泡，并且在建立容受性(着床的定位期)方面似乎很重要。
3.已经发现，损害VEGF基因表达的基因多态性(例如VEGF+405CC多态性)在反复IVF着床失败的女性中更为常见(Boudjenah等人，2012)，而VEGF+405CC多态性也与因纯男性因素不育症而进行IVF的“潜在可生育”女性的较低着床率相关(Boudjenah等人，2014)。
4.已表明通过施用VEGF中和抗体阻断VEGF活性在灵长类和啮齿动物妊娠模型二者中阻止着床(Rockwell等人，同上；Ghosh和Sengupta，2005)。
5.已表明将VEGF施加至培养中的胚胎增加了其发育速度/细胞分裂速率(Hannan等人，2011；Binder等人，2014)。
6.人子宫上皮细胞体外暴露于VEGF提高它们与胚胎表面发现的常见细胞外基质(ECM)蛋白(即纤连蛋白和胶原蛋白)的粘附性，从而潜在地辅助胚胎最初附着于子宫上皮(Binder等人，同上)。
7.据报道，在IVF期间成功受孕的女性与未受孕的女性相比，在黄体早期子宫内膜活检中VEGF的腺体表达显著更高(Jinno等人，同上；Seo等人，2011)。
8.据报道，在经历反复IVF着床失败的女性中，从子宫灌洗(黄体中期用无菌盐水冲洗子宫腔)获得的子宫内膜分泌物中VEGF的水平显著低于可生育对照中可见的水平(Hannan等人，同上)，从而表明VEGF可辅助着床。
9.VEGF中小鼠胚胎的培养增加了它们在体外对细胞外基质(纤连蛋白)涂覆的板的粘附性，同时还增加了将这些VEGF暴露的胚胎在移植到假妊娠受者时的成功着床(Binder等人，同上)。
10.已知VEGF在新生毛细血管的发育(血管生成)和组织的血管灌注中起着关键作用，其中薄子宫内膜的发育与低毛细血管密度和子宫内膜间质VEGF表达有关(Miwa等人，2009)。
综上所述，现有证据表明，子宫内膜来源的VEGF通过加速着床前胚胎的发育，增强胚胎与子宫上皮之间的粘附相互作用(改善与ECM蛋白的结合)，同时还增加潜在的子宫内膜间质水肿，在促进着床方面起着重要作用。VEGF作用的缺乏(例如通过上皮细胞的不良产生或通过阻断VEGF的作用)阻碍了着床。因此，已认为可提高子宫内膜的VEGF产生的疗法可增加在IVF治疗期间人胚胎的成功着床率。虽然先前报道铜会触发IUCD使用者子宫内膜VEGF的产生增加(Xin等人，2004；Rafi等人，2013)，但迄今尚不知道是铜离子的“短时暴发”暴露还是IUCD“异物”情况之外所谓铜递送会引发类似的VEGF反应，而不会引起子宫内膜破坏，诸如IUCD使用者中所见(Sadovsky等人，1975；Stanford和Mikolajczyk，2002)。类似地，在下文描述的实验之前，短期锌暴露对子宫内膜VEGF的产生的影响是未知的。
本公开涉及诸如IVF和子宫内授精(IUI)的辅助生殖技术领域，并且更具体地涉及一种用于提高受试者的移植胚胎着床的方法、制剂和装置。涉及使用铜离子和任选的锌离子的方法(以及制剂和装置)可能提供一种简单且相对便宜的治疗方法来提高胚胎着床，特别是在IVF或其他辅助生殖技术治疗后经历过反复着床失败(RIF)的女性中。
发明内容
在第一方面，本公开提供了一种提高受试者(即，女性或其他雌性动物)中的胚胎着床的方法，其中所述的方法包括向受试者的子宫腔施用有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的包含铜和/或锌的制剂。
在第二方面，本公开提供了一种提高受试者中的胚胎着床的方法，其中所述的方法包括将包含铜和/或锌的装置插入受试者的子宫腔持续有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的时间段。
所述的方法特别适用于通过辅助生殖技术中的任一种进行治疗的女性，并且所述的辅助生殖技术特别是那些涉及胚胎移植的技术，诸如体外受精(IVF)和包括IVF-ICSI(卵母细胞胞浆内单精子注射)的变型。
在第三方面，本公开提供了一种用于提高受试者中的胚胎着床的制剂，所述的制剂适用于向子宫腔施用并且包含有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的铜和/或锌，并且其中所述的制剂任选地包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在一些优选的实施方案中，铜和/或锌以溶液形式提供，诸如包含氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。
附图说明
图1提供了示出了由CuCl2(A)和ZnCl2(B)溶液提供的金属离子对由人Ishikawa子宫内膜腺癌细胞系(Ishikawa细胞)的培养物产生LIF的影响的图形结果；
图2提供了示出由CuCl2(A)和ZnCl2(B)溶液提供的金属离子对由Ishikawa细胞的培养物产生VEGF的影响的图形结果；
图3示出了在αMEM或G2培养基中评估从金属植入物释放到Ishikawa细胞的培养物中的铜和锌离子量的实验结果。将金属植入物(A)铜片植入物(Cu)和(B)铜锌片双金属植入物(CuZn)置于细胞培养物中，持续时间为2分钟和5分钟；
图4提供了示出从各种金属植入物(即铜片植入物(Cu)、铜锌片双金属植入物(CuZn)、锌片植入物(Zn)、锌铝片双金属植入物(ZnAl)和锌金片双金属植入物(ZnAu))释放的金属离子对Ishikawa细胞(A)产生LIF和(B)产生VEGF-A的影响的图形结果。在培养8小时后，从培养物上清液中进行测量。将细胞暴露于金属植入物2分钟；
图5提供了对比在“条件培养基”(即包括铜和锌离子)中培养的Ishikawa细胞(A)产生LIF和(B)产生VEGF的刺激的图形结果；产生LIF的实验还包括阳性对照，其中将Ishikawa细胞在暴露于铜锌片双金属植入物(CuZn)2分钟的培养基中培养；
图6提供了在将暴露于金属植入物(即铜片植入物(Cu)、锌片植入物(Zn)和铜锌片双金属植入物(CuZn))2分钟和5分钟的Ishikawa细胞培养8小时后获得的图形结果。这些图示出了金属植入物暴露对LIF产生(A、B)和VEGF产生(C、D)的影响；
图7提供了示出第3天鼠胚胎在以下培养基中培养后的胚胎着床生长的图像的实例：(A)新鲜G2培养基(对照)，(B)以Ishikawa细胞培养为条件的G2培养基和(C)以暴露于铜锌双金属植入物两分钟的Ishikawa细胞培养为条件的G2培养基；并且
图8示出了第3天鼠胚胎在以下培养基中培养后的胚胎着床生长(胚胎附着表面积，mm2)的程度的结果：新鲜G2培养基(对照)，以Ishikawa细胞培养为条件的G2培养基和以暴露于铜锌双金属植入物两分钟的Ishikawa细胞培养为条件的G2培养基。在66小时(A)和90小时(B)的时间点评估结果。
具体实施方式
在下文所述的实验中，本发明人发现经受由盐溶液或固体金属丝或片(“金属植入物”)提供的铜离子(Cu2+)和/或锌离子(Zn2+)的短期暴露的人子宫内膜细胞，产生的白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子(VEGF)的量增加，据信这两者在胚胎着床中具有重要作用。此外，当第3天胚胎在包括金属离子的“条件”培养基中生长时，使得滋养层细胞生长的表面积显著增加，从而表明胚胎健康和着床潜力得到改善。因此，本公开涉及新颖的方法(以及制剂和装置)，其涉及使用铜离子和任选的锌离子来提高子宫内膜产生LIF和/或VEGF，以提高女性(和其他雌性动物)中的胚胎着床，包括在IVF或其他辅助生殖技术治疗后经历过反复着床失败(RIF)的女性。
在第一方面，本公开提供了一种提高受试者(即，女性或其他雌性动物)中的胚胎着床的方法，其中所述的方法包括向受试者的子宫腔施用有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的包含铜和/或锌的制剂。
所述的方法适用于通过辅助生殖技术中的任一种进行治疗的女性，所述的辅助生殖技术诸如那些涉及胚胎移植的技术，诸如体外受精(IVF)以及包括IVF-ICSI(卵母细胞胞浆内单精子注射)和体外成熟(IVM)治疗的变型，以及涉及宫腔内人工授精(IUI)疗法的技术。然而，所述的方法也适用于希望通过自然受孕来改善怀孕前景的女性。
所述的方法可能特别适用于表现出子宫内膜发育不足或“薄”(例如，子宫内膜厚度为7mm或更小)的女性，这是公认的导致不育和胚胎移植后着床失败的原因(Kasius等人，2014；Yuan等人，2016)。在这方面，人们认为通过刺激子宫内膜产生被认为刺激子宫内膜血管生成的LIF和/或VEGF，可进行所述的方法以改善血管生成并由此治疗薄子宫内膜相关的着床失败。因此，本公开还延伸到治疗经历子宫内膜发育不足的女性的方法。经历子宫内膜发育不足的女性可通过标准超声成像(例如经阴道超声)轻松识别。
此外，虽然本公开的重点在于女性，但是本领域技术人员将认识到，本文所公开的方法(以及制剂和装置)也适用于其他非人雌性受试者(即其他雌性动物)，例如像，牲畜(例如牛、马和绵羊)、野外动物(例如熊猫、诸如老虎和狮子的大型猫科动物、大象等)和伴侣动物(诸如狗和猫)，特别是在采用辅助生殖技术(尤其是那些涉及胚胎移植的技术)来协助实现怀孕的情况下。
在一些实施方案中，在第一方面的方法中使用的制剂包含铜和任选的锌。
在其他实施方案中，制剂包含铜或铜和锌。
仍在其他实施方案中，制剂包含锌。
铜和/或锌可各自以例如元素(例如纯的)、合金、络合、氧化、盐(包括酯化盐和由有机酸形成的其他盐)或溶液形式中的一种或多种存在于制剂中。优选地，铜和/或锌以可在子宫内提供铜/锌离子源的形式存在。这种形式可包括纳米颗粒形式。制剂可呈例如液体、半固体或固体剂型的形式。
在一些实施方案中，铜和/或锌以溶液形式提供，诸如包含氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液、包含硫酸铜(CuSO4)和/或硫酸锌(ZnSO4)的溶液、葡萄糖酸铜和/或葡萄糖酸锌、氯酸铜(Cu(ClO4)2)和/或氯酸锌(Zn(ClO3)2)的溶液、包含硝酸铜(Cu(NO3)2)和/或硝酸锌(Zn(NO3)2)的溶液或包含溴化铜(CuBr)和/或溴化锌(ZnBr2)的溶液或它们的混合物(例如CuCl2和葡萄糖酸铜的溶液或CuCl2和ZnSO4的溶液)。此类溶液可在子宫内提供铜/锌离子源。
在其他实施方案中，铜和/或锌以半固体(例如凝胶或泡沫)形式提供。例如，包含CuCl2和/或ZnCl2的凝胶，或者包含铜和/或锌的纳米颗粒或包含CuCl2和/或ZnCl2的纳米颗粒的凝胶。凝胶可例如在子宫内提供短期贮库剂型。如本领域技术人员将理解的，也可使用众所周知的可注射原位贮库形成药物递送系统原位形成可生物降解的凝胶贮库。这种凝胶可在子宫内提供铜/锌离子源，其可实现铜/锌离子的受控且/或持续的释放。在合适的凝胶制剂的一些特定实施方案中，铜和/或锌可用羟乙基纤维素和甘油配制，并且在一个实例中，铜和/或锌可用
Figure BDA0002851405730000071
(IQ Medical Ventures BV；Rotterdam,The Netherlands)配制。
仍在其他实施方案中，铜和/或锌以固体剂型提供。例如，铜和/或锌可作为小的可溶解晶体或其他颗粒(例如金属的粉末或纳米颗粒)提供。例如，CuCl2和/或ZnCl2的晶体或其他颗粒。此类晶体或颗粒可以合适的载剂液体或凝胶(例如，可在施用前不久制备)的形式施用，或以由合适的子宫施加装置施用的可溶性片剂或胶囊的形式施用。此类晶体或其他颗粒可在子宫内提供铜/锌离子源。
应当理解，制剂并不是IUCD。
此外，应当理解，优选地，在第一方面的方法中使用的制剂不作为任何固体形式或在治疗后需要从子宫中手术切除的任何装置内提供。就这一点而言，上述实施方案的剂型将在许多(如果不是所有)情况下，通过允许以简单的方式(例如通过使用装置，例如像“加载”有制剂并且穿过子宫颈管并进入子宫腔的柔性导管)施用而无需随后去除制剂，来实现相对非侵入性且“舒适的”治疗。
制剂可包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂，其可根据要采用的剂型而变化。例如，对于铜和/或锌的盐的溶液，制剂可包含水或生理(等渗)盐水。对于包含铜和/或锌的盐的凝胶，制剂可包含生物相容性和可生物降解的聚合物赋形剂(例如丙交酯/乙交酯聚合物和羟乙基纤维素等)；在此类凝胶中，铜和/或锌可以酯化盐的形式存在，特别是包含饱和脂肪酸(诸如癸酸(decanoic(capric)acid))的盐(例如癸酸铜(2+))，或其他有机酸的盐，诸如D-葡萄糖酸的盐(例如葡萄糖酸铜)。如本领域技术人员将理解的，制剂还可包含选自以下的一种或多种物质：防腐剂(例如苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯)、粘合剂(例如淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖和无水乳糖)、以及天然和合成树胶(诸如阿拉伯胶)、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素和聚乙二醇)、润滑剂(例如油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁等)、保湿剂(例如甘油)、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、包衣剂和增溶剂，如特定剂型所需和/或所期望的。
此外，制剂可包含刺激LIF、VEGF或其他可能对胚胎着床有益的细胞因子、生长因子等(例如整合素)的产生或活性的一种或多种其他物质。例如，制剂还可包含有效量的苯甲酸，其被认为导致LIF和整合素V3和V5的表达增加，以促进胚胎着床(韩国专利公布号20160108690；其全部内容应视为以引用的方式并入本文)。
将制剂以有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量向受试者施用。
在一些实施方案中，所述的量通常是向子宫液提供至少500ppb的量的铜离子的量和/或向子宫液提供至少50ppb的量的锌离子的量。然而，优选地，将制剂以向子宫液提供至少1250ppb(更优选地，至少2500ppb)的量的铜离子和/或向子宫液提供至少100ppb(更优选地，至少250ppb)的量的锌离子的量向受试者施用。如本领域技术人员将容易理解的，可使用胚胎移植导管通过抽吸获得子宫液样品(Ametzazurra等人，2009)，并使用质谱法评估其金属离子含量。然而，可通过在37℃下向“模型”子宫液中添加不同量的制剂和量(例如，体积为5ml的合适培养基，诸如αMEM或G2培养基或合适的胚胎移植培养基)，并且通过在合适的时间点(例如，添加制剂后2分钟和/或5分钟)采集的培养基样品中由质谱法评估金属离子含量，来以其他方式测试制剂的合适量(即向子宫液提供至少500ppb的量铜离子和/或向子宫液提供至少50ppb的量锌离子)。人们认为铜和/或锌离子进入培养基中的“释放”将与子宫中将发生的释放基本相当。因此，在测试样品中检测到至少500ppb的铜离子量可指示适合施用的制剂(包含铜)的量。类似地，在测试样品中检测到至少50ppb的锌离子量指示适合施用的制剂(包含锌)的量。
在一些实施方案中，有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的制剂的量可为向子宫内膜液提供约0.025μg至约12.5μg(优选约0.25μg至约10μg，更优选约0.5μg至约5μg，并且最优选约0.05μg至约2.5μg)范围内的量的铜和/或约0.05μg至约12.5μg(优选约0.25μg至约10μg，更优选约0.5μg至约5μg，并且最优选约0.05μg至约2.5μg)等效范围内的量的锌的量。
在包含CuCl2溶液的制剂的一些实施方案中，制剂包含至少约20μM、优选至少约50μM浓度的CuCl2。特别地，制剂优选包含浓度在约20μM至约200μM范围内、更优选在50μM至150μM范围内的CuCl2溶液。这种制剂可以约100至1000μl、更优选约150至500μl的体积施用于受试者。
在包含ZnCl2溶液的制剂的一些实施方案中，制剂包含至少约20μM、优选至少约50μM浓度的ZnCl2。特别地，制剂优选包含浓度在约20μM至约150μM范围内、更优选在50μM至125μM范围内的ZnCl2溶液。这种制剂可以约100至1000μl、更优选约150至500μl的体积施用于受试者。
当受试者通过涉及胚胎移植的辅助生殖技术中的任一种接受治疗时，优选将制剂在胚胎移植之前和同一月经周期(在IVF的情况下，将被视为相同的IVF周期)内施用于受试者。优选地，将制剂在胚胎移植之前足以刺激子宫内膜产生一定水平的LIF和/或VEGF以提高胚胎着床的时间施用于受试者。优选地，在胚胎移植之前给予受试者单次施用制剂。在一些实施方案中，将制剂在胚胎移植前不超过14天、优选在胚胎移植前不超过约10天、并且更优选在胚胎移植前不超过约5天施用于受试者。在一些实施方案中，在胚胎移植前5天、或在胚胎移植前4天、或在胚胎移植前3天、或在胚胎移植前2天、或在胚胎前1天施用制剂。在其他实施方案中，在胚胎移植的同一天施用制剂；例如，在胚胎移植前不久(例如在胚胎移植的3小时、或60分钟、或30分钟、或10分钟、或5分钟或1分钟内)或不太优选地在胚胎移植后立即(例如在胚胎移植的10分钟内)施用制剂。在胚胎移植的同时施用制剂也可以是一种选择。例如，可将胚胎以制剂的形式移植到受试者，所述的制剂在此类实施方案中还可包含通常包含在标准胚胎移植培养基中的组分和物质(例如，发现于EmbryoGlueTM胚胎移植培养基中的组分和物质；Vitrolife,Gothenburg,Sweden)。可替代地，可通过在制剂中涂覆或浸渍胚胎移植导管(或插入子宫腔的胚胎移植导管的远端部分的至少一部分，或其一部分)以提供与胚胎移植同时施用的制剂；在这种实施方案中，如果导管的远端部分与导管的尖端(从中排出胚胎的地方)相距较短距离(例如1至3cm)的一部分在制剂中被涂覆或浸渍，则它可以是优选的。
虽然在前述段落中进行了描述，但是在第一方面的方法的一些优选的实施方案中，不在胚胎移植时(即同时地)或胚胎移植后施用制剂。即，此类实施方案的方法包括仅在胚胎移植之前施用制剂，优选为单次施用。
对于经历子宫内膜发育不足的女性，将制剂在相关月经周期中施用于子宫腔至少一次，并且优选在月经停止和排卵或伴随排卵的孕酮开始增加之间的时间段内。在一些实施方案中，可在此时间段多次施用制剂(例如，连续几天每天施用一次)。
当受试者通过IUI进行治疗时，优选将制剂在IUI之前和同一月经周期内(即在进行授精的同一月经周期内)施用于受试者。优选地，将制剂在排卵/授精之前足以刺激子宫内膜产生一定水平的LIF和/或VEGF以提高胚胎着床的时间施用于受试者。优选地，在授精之前给予受试者单次施用制剂。在一些实施方案中，将制剂在排卵前不超过9天、并且优选在排卵前不超过约5天施用于受试者。在一些实施方案中，在排卵前5天、或在排卵前4天、或在排卵前3天、或在排卵前2天或在排卵前1天施用制剂。在其他实施方案中，在排卵的同一天施用制剂。优选地，不在授精时(即同时地)或在授精后施用制剂。然而，对于经历子宫内膜发育不足的女性，将制剂在相关月经周期中施用于子宫腔至少一次；优选在月经停止和排卵或伴随排卵的孕酮开始增加之间的时间段内(例如，可在此时间段内多次施用制剂(例如，连续几天每天施用一次))。
当受试者希望通过自然受孕实现怀孕时，优选将制剂在排卵前和同一月经周期内施用于受试者。优选地，将制剂在排卵之前足以刺激子宫内膜产生一定水平的LIF和/或VEGF以提高胚胎着床的时间施用于受试者。在一些实施方案中，将制剂在排卵前不超过9天、并且优选在排卵前不超过约5天施用于受试者。在一些实施方案中，在排卵前5天、或在排卵前4天、或在排卵前3天、或在排卵前2天或在排卵前1天施用制剂。在其他实施方案中，在排卵的同一天施用制剂。对于经历子宫内膜发育不足的女性，将制剂在相关月经周期中施用于子宫腔至少一次；优选在月经停止和排卵或伴随排卵的孕酮开始增加之间的时间段内(例如，可在此时间段内多次施用制剂(例如，连续几天每天施用一次))。
在第二方面，本公开提供了一种提高受试者(即，女性或其他雌性动物)中的胚胎着床的方法，其中所述的方法包括将包含铜和/或锌的装置插入受试者的子宫腔持续有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的时间段。
适用于第二方面的方法的装置(或“子宫装置”)通常为细长形式(例如类似于外科探针或胚胎移植导管)。因此，装置可包括远端部分和近端基部部分，并且将装置插入子宫腔的步骤包括将远端部分的至少一部分插入子宫腔中。当将远端部分插入子宫腔中时，近端基部部分保持在受试者外部，使得能够插入和收回装置。插入子宫腔的远端部分的部分或其一部分可包含或设置有铜和/或锌，并且可产生铜和/或锌离子以刺激子宫内膜产生LIF和/或VEGF，而装置的其余部分可包含不锈钢或生物相容性聚合物。在一些实施方案中，插入子宫腔的远端部分的部分或其一部分可包含或涂覆有铜和/或锌金属，其可通过腐蚀而产生铜和/或锌离子(即，铜和/或锌作为元素金属提供，在将装置插入子宫腔后使装置与子宫液接触时，其表面上可具有金属的氧化形式并通过腐蚀而产生金属离子)。在其他实施方案中，铜和/或锌金属可以纳米颗粒的形式提供，以增加可用于腐蚀的表面积，从而有效地加速金属离子向子宫液的递送速率。在特定的实施方案中，装置可为胚胎移植导管(例如，用于将胚胎(悬浮于少量移植培养基中)移植到进行IVF治疗的女性的那种导管)，其中插入子宫腔的远端部分或其一部分包含或设置有铜和/或锌。当将装置用于通过涉及胚胎移植的辅助生殖技术中的任一种进行治疗的受试者时，如果需要的话，此实施方案能够在胚胎移植时将金属离子递送至子宫液。此外，通过使铜和/或锌离子能够在不增加子宫腔液体积的情况下进行递送，使用如所述的装置可避免与施用液体制剂(例如，CuCl2和/或ZnCl2的溶液)相关的任何潜在缺点。要在胚胎移植时进行金属离子递送的实施方案中，这可能是显著的优点，因为在胚胎移植过程中应用过量胚胎移植培养基与IVF成功率的降低有关(Sigalos等人，2017)。
将装置插入子宫腔持续有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的时间段。本领域技术人员将认识到，此时间段将是很短的(即避免子宫长期暴露于铜和/或锌离子对胚胎着床的抑制作用，如暴露于IUCD所实现的)。通常，所述的时间段将是向子宫液提供至少500ppb(优选地，至少1250ppb，并且更优选地，至少2500ppb)的量的铜离子和/或向子宫液提供至少50ppb(更优选地，至少250ppb)的量的锌离子的时间段。在任何情况下，此时间段将很少(如果有的话)超过60分钟，并且通常不会超过约10分钟。更优选地，所述的时间段将为约1分钟、或约2分钟、或约3分钟、或约4分钟或约5分钟。然而，应理解，铜和/或锌离子释放到子宫液中的速率可变化(这进而可能需要增加或减少插入时间)。例如，铜和/或锌金属与子宫液的接触将导致其腐蚀，从而将金属离子释放到溶液中。通过使其他金属与铜和/或锌金属接触，铜和/或锌离子的释放可减慢或加快，取决于金属在电流序列上的相对位置(Zipper等人，1977)。
当受试者通过涉及胚胎移植的辅助生殖技术中的任一种进行治疗时，优选将装置在胚胎移植之前和同一月经周期(在IVF的情况下，将被视为相同的IVF周期)内插入受试者的子宫腔中。优选地，将装置在胚胎移植之前足以刺激子宫内膜产生一定水平的LIF和/或VEGF以提高胚胎着床的时间插入。优选地，将装置在胚胎移植之前一次性插入受试者的子宫腔中。在一些实施方案中，在胚胎移植前不超过14天、优选在胚胎移植前不超过约10天、并且更优选在胚胎移植前不超过约5天插入装置。在一些实施方案中，在胚胎移植前5天、或在胚胎移植前4天、或在胚胎移植前3天、或在胚胎移植前2天、或在胚胎前1天插入装置。在其他实施方案中，在胚胎移植的同一天插入装置；例如，在胚胎移植前不久(例如在胚胎移植的3小时、或60分钟、或30分钟、或10分钟、或5分钟或1分钟内)或不太优选地在胚胎移植后立即(例如在胚胎移植的10分钟内)插入装置。此外，如上所述，在装置是胚胎移植导管的情况下，可在胚胎移植时实现将铜和/或锌离子递送至子宫液。
在第三方面，本公开提供了一种用于提高受试者中的胚胎着床的制剂，所述的制剂适用于向子宫腔施用并且包含有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的铜和/或锌，并且其中所述的制剂任选地包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在一些实施方案中，制剂包含铜和任选的锌。在其他实施方案中，制剂包含铜或铜和锌。在又其他实施方案中，制剂包含锌。
铜和/或锌可各自以例如元素(例如纯的)、合金、络合、氧化、盐(包括酯化盐和由有机酸形成的其他盐)或溶液形式中的一种或多种存在于制剂中。优选地，铜和/或锌以可在子宫内提供铜/锌离子源的形式存在。制剂可呈例如液体、半固体或固体剂型的形式。
在一些优选的实施方案中，铜和/或锌以溶液形式提供，诸如包含氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。这种溶液可在子宫内提供铜/锌离子源。优选地，溶液为CuCl2和/或ZnCl2的等渗盐溶液。
在其他实施方案中，铜和/或锌以半固体(例如凝胶或泡沫)形式提供。例如，包含CuCl2和/或ZnCl2的凝胶，或者包含铜和/或锌的纳米颗粒或包含CuCl2和/或ZnCl2的纳米颗粒的凝胶。凝胶可例如在子宫内提供短期贮库剂型，从而在子宫内提供铜/锌离子源，这可实现铜/锌离子的受控和/或持续的释放(例如，其中铜和/或锌是用羟乙基纤维素和甘油配制的凝胶)。
仍在其他实施方案中，铜和/或锌以固体剂型提供，诸如小的可溶晶体或其他颗粒(例如粉末或金属纳米颗粒)，例如CuCl2和/或ZnCl2的晶体或其他颗粒，所述的固体剂型可以合适的载剂液体或凝胶(例如，可在施用前不久制备)的形式施用，或以可溶性片剂或胶囊的形式提供。此类晶体或其他颗粒可在子宫内提供铜/锌离子源。
制剂可包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂，诸如上述那些。此外，制剂还可包含选自以下的一种或多种物质：防腐剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、包衣剂和增溶剂，诸如上述的那些。另外，制剂可包含刺激LIF、VEGF或其他可能对胚胎着床有益的细胞因子、生长因子等(例如整合素)的产生或活性的一种或多种其他物质。制剂还可包含通常包含在标准胚胎移植培养基中的组分和物质。
在一些优选的实施方案中，制剂包含CuCl2溶液，所述的溶液包含至少约20μM、优选至少约50μM浓度的CuCl2。特别地，制剂优选包含浓度在约20μM至约200μM范围内、更优选在50μM至150μM范围内的CuCl2溶液。在一些其他优选的实施方案中，制剂包含ZnCl2溶液，所述的溶液包含至少约20μM、优选至少约50μM浓度的ZnCl2。特别地，制剂优选包含浓度在约20μM至约150μM范围内、更优选在50μM至125μM范围内的ZnCl2溶液。
当制剂作为液体(例如，包含CuCl2和/或ZnCl2溶液的制剂)提供时，制剂可以适于将制剂施用于子宫腔的包装或装置的形式提供；例如，“加载”有适于穿过子宫颈管并进入子宫腔的柔性导管。这种导管可类似于用于将胚胎(悬浮于少量移植培养基中)移植到进行IVF治疗的女性的导管。导管可包含生物相容性聚合物并且被气密密封以用于运输和存储包含液体制剂，所述的液体制剂可设置在位于导管的尖端处或邻近导管的尖端的储液器或球中。导管的尖端可包括可能在使用前就破裂的易碎部分。否则，可用易于取下的帽或盖密封尖端。导管内包含的制剂的量可低至100至1000μl，或更优选地，体积在约150至500μl的范围内。
在第四方面，本公开提供了铜和/或锌的制剂用于提高受试者中的胚胎着床的用途，其中制剂适于以有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量施用于受试者的子宫腔。
在第五方面，本公开提供了铜和/或锌在制造用于提高受试者中的胚胎着床的制剂中的用途，其中制剂适于以有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量施用于受试者的子宫腔。
在第四和第五方面的用途中，受试者可为通过辅助生殖技术中的任一种进行治疗的女性，所述的辅助生殖技术特别是那些涉及胚胎移植的技术，诸如体外受精(IVF)，以及包括IVF-ICSI(卵母细胞胞浆内单精子注射)和体外成熟(IVM)治疗的变型。然而，受试者也可为接受宫内授精(IUI)疗法的女性，或希望通过自然受孕来改善她们的怀孕前景的女性。受试者也可选自其他非人雌性受试者，例如像牲畜。
铜和/或锌可各自以例如元素(例如纯的)、合金、络合、氧化、盐(包括酯化盐和由有机酸形成的其他盐)或溶液形式中的一种或多种存在于制剂中。优选地，铜和/或锌以可在子宫内提供铜/锌离子源的形式存在。制剂可呈例如液体、半固体或固体剂型的形式。在一些实施方案中，铜和/或锌以溶液形式提供，诸如包含氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。这种溶液可在子宫内提供铜/锌离子源。
制剂可包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂，诸如上述那些。此外，制剂还可包含选自以下的一种或多种物质：防腐剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、包衣剂和增溶剂，诸如上述的那些。另外，制剂可包含刺激LIF、VEGF或其他可能对胚胎着床有益的细胞因子、生长因子等(例如整合素)的产生或活性的一种或多种其他物质。
在一些优选的实施方案中，制剂包含CuCl2溶液，所述的溶液包含至少约20μM、优选至少约50μM浓度的CuCl2。特别地，制剂优选包含浓度在约20μM至约200μM范围内、更优选在50μM至150μM范围内的CuCl2溶液。在一些其他优选的实施方案中，制剂包含ZnCl2溶液，所述的溶液包含至少约20μM、优选至少约50μM浓度的ZnCl2。特别地，制剂优选包含浓度在约20μM至约150μM范围内、更优选在50μM至125μM范围内的ZnCl2溶液。
在下文通过以下非限制性实施例和附图进一步描述本公开的方法和制剂。
实施例
实施例1金属离子对体外LIF和VEGF产生的影响
材料和方法
使用人Ishikawa子宫内膜腺癌细胞系(Sigma-Aldrich；St Louis，MO，UnitedStates of America)模拟子宫内膜对铜和锌金属离子(Cu2+和Zn2+)的反应。细胞在Ishikawa培养基中在37℃、空气中5％CO2的气体环境下生长于T75烧瓶(Nalge NuncInternational，Rochester，NY，United States ofAmerica)中，所述的培养基由补充有5％胎牛血清(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，United States of America)的αMEM(Sigma-Aldrich)、2mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)1％非必需氨基酸(Sigma-Aldrich)组成，不含抗生素。培养基每48小时更新。使用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)对细胞进行传代培养。对于金属离子暴露实验，将细胞接种在2孔室载玻片(Ibidi，Martinsried，Germany)上。在子宫内膜细胞附着并达到80-90％的汇合后，使用如下所述的两种方法(盐溶液或金属植入物)将其暴露于铜和锌金属离子。
溶液中的金属离子
将氯化铜或氯化锌(Sigma-Aldrich)溶解于Ishikawa培养基中，以产生在0.2μM和200μM范围内的各种浓度的盐溶液，之后将其应用于接种在2孔室载玻片中的Ishikawa细胞持续8小时的时间段。暴露8小时后，将培养基取出，在4℃下以1000g离心10分钟，以使任何细胞碎片颗粒化，然后将上清液储存于-80℃下的Eppendorf管中。随后，使用复合免疫测定系统(elisakit.com，Scoresby，VIC，Australia)测定上清液中LIF和VEGF的含量。
金属植入物
使用金属丝(铜)或各种类型的金属片(铜、锌、铝和金)生成由各种金属组成的植入物。在一些情况下，植入物由两种金属(双金属植入物)，特别是铜和锌(CuZn)、锌和铝(ZnAl)以及锌和金(ZnAu)的片组成。热灭菌后，使植入物与Ishikawa细胞直接接触，然后使用灭菌的外科镊子将其在Ishikawa培养基或G2胚胎培养基(Vitrolife)中接种于2孔室载玻片上持续1分钟与5分钟之间的时间段，之后取出。4至8小时后收集Ishikawa细胞上清液，以1000g在4℃下离心10分钟，然后在-80℃下冷冻，用于之后通过质谱评估金属离子和细胞因子。
结果
在金属离子溶液的情况下，发现当CuCl2浓度超过2μM时，铜离子使LIF产生显著增加超过基线(参见图1A)，其中当浓度为200μM时，LIF产生比基线高420％。在8小时的孵育时间范围内，在测试剂量范围内未观察到与LIF产生相关的毒性。与对照相比，锌离子在50μM至150μM范围内的ZnCl2浓度下也使LIF产生显著增加(参见图1B)。但是，当以超过150μM的剂量施用时，锌离子似乎会引起毒性，并且观察到LIF产生减少(图2A)。关于VEGF产生，氯化铜溶液在浓度高于20μM时使VEGF产生显著增加，在100μM CuCl2浓度下达到高峰。在另一方面，与对照相比，氯化锌没有产生VEGF的显著增加，但在150μM浓度下似乎减少了VEGF产生(图2B)。
在铜丝/铜片和CuZn双金属片植入物的情况下，质谱证实了铜和锌离子在相对较短的时间内释放到条件αMEM/G2培养基中(参见图3A和图3B；注意：在用铜植入物获得且在图3A中示出的结果中，由于αMEM培养基中存在锌，因此检测到少量锌)。如所期望的那样，锌的存在(在CuZn双金属植入物中)减慢了铜离子向溶液中的释放(图3B)，其中锌似乎起到牺牲阳极的作用。另外，观察到，与CuCl2和ZnCl2溶液一样，来自丝和片金属植入物的铜离子和锌离子在多次重复中增加子宫内膜细胞培养产生LIF和VEGF(图4A和图4B)。铜或铜锌植入物的反应比任何其他金属组合的反应要好得多。
进行进一步的实验以确定这种LIF和VEGF产生的增加(即上调)是否与金属离子的释放、原位腐蚀期间化电流的相关产生或金属植入物的物理存在(“异物”反应)有关。这些实验包括向不含细胞的2孔室载玻片的每个孔中添加1.5ml IshikawaαMEM培养基，并在之后添加CuZn双金属植入物持续2分钟的时间段(此后使用无菌镊子将其取出)。然后将所得的“条件培养基”添加到含有Ishikawa细胞的2孔载玻片中，并孵育8小时的时间段，从而使这些细胞暴露于金属离子，但不暴露植入物的物理存在或因植入物腐蚀而产生的任何化电流。这些实验表明，含有铜离子和锌离子的条件培养基仍然能够引起LIF和VEGF产生的增加，高于对照未暴露培养物中的LIF和VEGF产生(参见图5A和图5B)。
实施例2金属离子对胚胎发育和附着的影响
材料和方法
将Ishikawa细胞在Ishikawa培养基中接种到2孔室载玻片上，直到它们达到80-90％汇合。然后，在暴露于金属植入物之前5分钟，将培养基更换为G2胚胎培养基，并将Ishikawa细胞暴露于铜、锌或铜锌双金属植入物2或5分钟的持续时间(或保持未暴露(对照))，然后在8小时后收集所得的G2培养基。然后如上文实施例1中所述的分析上清液，以确认金属植入物暴露导致子宫内膜LIF和VEGF产生的上调(参见图6A至6D)。
为了确定金属离子是否能够提高胚胎着床，将压实后的小鼠胚胎在进行生长测定之前暴露于“条件培养基”。特别地，在hCG后约21至22小时从超排卵的雌性F1小鼠中收集有核卵母细胞。在去除卵丘细胞后，将卵母细胞在20μl滴液(10个胚胎/滴)的G1培养基中在石蜡油(Vitrolife)下于37℃、6％CO2、5％O2和89％N2下培养。48小时后，将压实和桑椹胚期的胚胎随机移植至以下中培养：(i)未暴露于Ishikawa细胞的对照G2培养基(Vitrolife)；(ii)在2μl对照的Ishikawa暴露的G2中的单独培养物；或(iii)在2μl滴液的2分钟铜锌双金属植入物暴露的G2培养基中的单独培养物。48小时后，以以下方式评估胚泡进行生长的能力。首先，将平底96孔组织培养板(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，United StatesofAmerica)涂覆有纤连蛋白(10μg/ml；BD Biosciences)，用无菌PBS冲洗两次，并于4mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)一切孵育。然后冲洗各孔，之后用补充有5％FCS的G2培养基填充并在石蜡油(Ovoil；Vitrolife)下于37℃下平衡3小时，之后添加胚泡。将来自每个相应处理的已孵化的和正在孵化的胚泡放入准备好的孔(每孔1个胚胎)中，并孵育90小时。在培养期间，检查生长，并在移植到生长板后66小时和90小时时用配备有设置为37℃的加热台的倒置显微镜(Nikon Eclipse TS100-F)拍摄图像。通过使用ImageJ测量整个实验中拍摄的每个图像中的生长面积，获得每种处理的生长程度。收集所有图像并以匹配放大率进行分析。
结果和讨论
虽然在将铜和锌离子暴露的培养物中的条件培养基添加到鼠的第3天胚胎中时，未观察到胚胎发育速率的差异，但是3至4天后，滋养层细胞生长到纤连蛋白包被的板的表面积非常显著地增加(参见图7、8A和8B)，从而表明改善了胚胎健康和着床潜力。
后一观察结果很重要，有两个原因。首先，它证实了铜离子和锌离子介导子宫内膜LIF/VEGF产生上调以提高着床过程的能力。其次，它证实了虽然传统上认为铜离子和锌离子对着床前胚胎的发育有毒(Brinster和Cross，1972；Webb等人，1973；Holland和Pike1978；Erbach等人，1995)，但在这些实验中的短期暴露下，这种毒性并不显著。因此，尽管近半个世纪的教义表明含有铜或锌的IUCD提供有效的避孕法(Stanford，2002)，但从本文所述的结果来看很明显，将铜离子和/或锌离子短期递送至子宫内膜实际上可提高着床过程。
虽然不希望受到理论的束缚，但是认为在本文所述的实验之间观察到的差异表明铜对子宫内膜功能的有益作用(就LIF/VEGF产生而言)以及铜对IUCD使用者的子宫内膜健康和功能的充分描述的有害作用，这可通过递送到子宫内膜的铜的“剂量”的巨大差异来解释。即，多项研究已经检查了IUCD使用者中铜递送的速率，其中这个速率根据IUCD装置中铜的表面积和自初始插入以来的时间而变化。在一项此类研究中，据报道，向子宫递送的铜的平均量在每天13.3μg与116.7μg之间变化(Timonen，1976)。其他研究报道的平均递送速率为每天26.7μg(Chantler等人，1984)、14μg(Larsson等人，1981)和45μg(Hagenfeldt，1972)铜。在实施例1的实验中，在200M的CuCl2浓度下观察到子宫内膜LIF产生增加4倍。如果假设，女性的子宫腔具有约150μl的体积(Casslen，1986)，则需要在体内施加以提供相当于200M剂量的对应的铜的量为1.91g铜。此外，因为在体外超过100μM的CuCl2浓度下观察到子宫内膜VEGF产生相对下降(图2A)，所以在体内引起阳性子宫内膜反应所需的铜的最佳量可能接近1g，仅为IUCD使用者每天暴露于铜的量的约1％至7％的水平(Hagenfeldt，同上；Timonen，同上；Larsson等人，同上；Chantler等人，同上)。因此，认为需要引起可提高胚胎着床的有益的子宫内膜反应(即LIF/VEGF的增加)的铜的剂量必须低于13.3g，即由能够损害着床的IUCD装置报道的最低每天释放铜的速率(Copper T 100mm2 IUCD；Timonen，同上)。在实施例1的实验中，证实20M的CuCl2是引起子宫内膜LIF和VEGF增加的最低铜量，这相当于体内子宫递送0.191g剂量的铜。因此，在本公开的方法的一些优选的实施方案中，将制剂/装置施用/插入到受试者以将0.1g与10g之间剂量的铜递送到子宫腔。对于锌，类似的剂量范围也可为优选的。
除了子宫内膜LIF/VEGF产生上调外，铜离子和锌离子还可通过破坏子宫中可能存在的有害细菌来提高着床过程。即，虽然传统上认为子宫是没有潜在病原细菌的无菌区，但现在人们认识到，在一些不育女性中子宫内膜定植有某些细菌，并且这与着床潜力受损相关(Moreno等人，2016)。因为已知铜和锌均具有抗菌性质(Vincent等人，2016；Siddiqi等人，2018)，所以将铜离子或锌离子(或组合)局部施加到子宫腔可能杀死或抑制这群患者中潜在的着床损害细菌，从而提高其自然和IVF辅助生育潜力是有可能的。
实施例3提高移植胚胎的着床的治疗的预示性实施例
制备包含浓度为150μM的CuCl2和100μM的ZnCl2的等渗盐溶液。
经历过反复着床失败(RIF)，特别是具有优质胚胎的五次失败的IVF周期的35岁女性，在预期进一步移植IVF胚胎的5天前就诊。使用通常用于子宫内人工授精疗法的加载有200μl量的CuCl2/ZnCl2溶液的移植导管(例如Soft-PassTM人工授精导管；Cook MedicalInc.，Bloomington，IN，USA)，将所述的溶液施用于子宫腔。
在胚胎移植的预定日期，所述的女性再次就诊，并按照常规方案接受优质胚胎。
在整个说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”与“包括(include)”以及变型诸如“包含(comprising)”与“包括(including)”将被理解为暗示包含所陈述的整体或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。
本说明书中对任何现有技术的引用，不是并且不应被认为是承认对此类现有技术形成公知常识的一部分的任何形式的暗示。
本领域技术人员将理解的是，本公开的方法、用途和/或制剂不限于所描述的特定应用。所述的方法、用途和/或制剂也不限于它们的关于本文描述或叙述的特定要素和/或特征的优选实施方案。还应当理解，可在不脱离由以下权利要求阐述和定义的本公开的范围的情况下，对所述的方法、用途和/或制剂进行多次重新布置、修改和替换。
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Claims (65)

1.一种提高受试者中的胚胎着床的方法，其中所述方法包括向所述受试者的子宫腔施用有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的包含铜和/或锌的制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述制剂包含铜和任选的锌。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述铜和/或锌以溶液形式提供于所述制剂中。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)的溶液。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述制剂包含至少约20μM浓度的CuCl2的CuCl2溶液。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度和所述ZnCl2的浓度均为至少约20μM。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度在50μM至150μΜ的范围内，并且所述ZnCl2的浓度在50μM至125μΜ的范围内。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述制剂包含铜和/或锌的纳米颗粒。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述制剂向所述子宫液提供铜离子的量在约0.025μg至约12.5μg的范围内。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述制剂向所述子宫液提供铜离子的量在约0.05μg至约2.5μg的范围内。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述受试者为进行涉及胚胎移植的辅助生殖技术治疗的女性。
13.如权利要求12所述的方法，其中将所述制剂在胚胎移植之前和同一月经周期内施用于所述受试者。
14.如权利要求13所述的方法，其中将所述制剂在所述胚胎移植之前不超过14天施用于所述受试者。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中将所述制剂在所述胚胎移植之前不超过约5天施用于所述受试者。
16.如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中不在胚胎移植时或所述胚胎移植后施用所述制剂。
17.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述的受试者为经历子宫内膜发育不足的女性。
18.一种提高受试者中的胚胎着床的方法，其中所述方法包括将包含铜和/或锌的装置插入所述受试者的子宫腔持续有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的时间段。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述装置具有细长形式并且包括远端部分和近端基部部分，并且将所述装置插入所述子宫腔的步骤包括将所述远端部分的至少一部分插入所述子宫腔中。
20.如权利要求19所述的方法，其中插入所述子宫腔的所述远端部分的部分或其一部分可包含或设置有铜和/或锌，并且可产生铜和/或锌离子以刺激子宫内膜产生LIF和/或VEGF。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述装置为胚胎移植导管。
22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述装置包含铜，并且被插入所述子宫腔中持续向所述子宫液有效提供在约0.025μg至约12.5μg范围内的量的铜离子的时间段。
23.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述装置包含铜，并且被插入所述子宫腔中持续向所述子宫液有效提供在约0.05μg至约2.5μg范围内的量的铜离子的时间段。
24.如权利要求18至23中任一项所述的方法，其中将所述装置插入所述子宫腔中不超过约10分钟。
25.如权利要求24所述的方法，其中将所述装置插入所述子宫腔中约1分钟、或约2分钟、或约3分钟、或约4分钟、或约5分钟。
26.如权利要求18至25中任一项所述的方法，其中所述受试者为进行涉及胚胎移植的辅助生殖技术治疗的女性。
27.如权利要求26所述的方法，其中将所述装置在胚胎移植之前和同一月经周期内插入所述受试者的子宫腔中。
28.如权利要求27所述的方法，其中将所述装置在所述胚胎移植之前不超过14天插入所述受试者的子宫腔中。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中将所述装置在所述胚胎移植之前不超过约5天插入所述受试者的子宫腔中。
30.如权利要求21所述的方法，其中所述胚胎移植导管用于将胚胎移植到所述受试者，并同时将铜和/或锌离子递送到所述子宫液。
31.一种用于提高受试者中的胚胎着床的制剂，所述制剂适用于向子宫腔施用并且包含有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量的铜和/或锌，并且其中所述制剂任选地包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
32.如权利要求31所述的制剂，其中所述制剂包含铜和任选的锌。
33.如权利要求31或32所述的制剂，其中所述制剂呈液体剂型。
34.如权利要求31或32所述的制剂，其中所述铜和/或锌以溶液形式提供于所述制剂中。
35.如权利要求34所述的制剂，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)的溶液。
36.如权利要求34或35所述的制剂，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。
37.如权利要求34所述的制剂，其中所述制剂包含至少约20μM浓度的CuCl2的CuCl2溶液。
38.如权利要求34所述的制剂，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度和所述ZnCl2的浓度均为至少约20μM。
39.如权利要求34所述的制剂，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度在50μM至150μΜ的范围内，并且所述ZnCl2的浓度在50μM至125μΜ的范围内。
40.如权利要求31或33所述的制剂，其中所述制剂包含铜和/或锌的纳米颗粒。
41.如权利要求33至40中任一项所述的制剂，其还包含标准胚胎移植培养基。
42.一种装置，所述装置适于穿过子宫颈管并进入受试者的子宫腔，其中所述导管含有如权利要求33至41中任一项所述的制剂。
43.如如权利要求42所述的装置，其中所述装置为柔性导管。
44.一种装置，所述装置适于穿过子宫颈管并进入子宫腔，其中所述装置具有细长形式并且包括远端部分和近端基部部分，并且其中插入所述子宫腔的所述远端部分的部分或其一部分可包含或设置有铜和/或锌，并且可产生铜和/或锌离子以刺激子宫内膜产生LIF和/或VEGF。
45.如权利要求44所述的装置，其中所述装置为胚胎移植导管。
46.铜和/或锌的制剂用于提高受试者中的胚胎着床的用途，其中所述制剂适于以有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量施用于所述受试者的子宫腔。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述铜和/或锌以溶液形式提供于所述制剂中。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)的溶液。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述制剂包含至少约20μM浓度的CuCl2的CuCl2溶液。
51.如权利要求49所述的用途，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度和所述ZnCl2的浓度均为至少约20μM。
52.如权利要求49所述的用途，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度在50μM至150μΜ的范围内，并且所述ZnCl2的浓度在50μM至125μΜ的范围内。
53.如权利要求46或47所述的用途，其中所述制剂包含铜和/或锌的纳米颗粒。
54.如权利要求46至53中任一项所述的用途，其中所述制剂向所述子宫液提供铜离子的量在约0.025μg至约12.5μg的范围内。
55.如权利要求46至54中任一项所述的用途，其中所述制剂向所述子宫液提供铜离子的量在约0.05μg至约2.5μg的范围内。
56.铜和/或锌在制造用于提高受试者中的胚胎着床的制剂的用途，其中所述制剂适于以有效刺激子宫内膜产生白血病抑制因子(LIF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的量施用于所述受试者的子宫腔。
57.如权利要求56所述的用途，其中所述铜和/或锌以溶液形式提供于所述制剂中。
58.如权利要求57所述的用途，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)的溶液。
59.如权利要求58所述的用途，其中所述制剂为氯化铜(CuCl2)和/或氯化锌(ZnCl2)的溶液。
60.如权利要求59所述的用途，其中所述制剂包含至少约20μM浓度的CuCl2的CuCl2溶液。
61.如权利要求59所述的用途，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度和所述ZnCl2的浓度均为至少约20μM。
62.如权利要求59所述的用途，其中所述制剂包含CuCl2和ZnCl2的溶液，其中所述CuCl2的浓度在50μM至150μΜ的范围内，并且所述ZnCl2的浓度在50μM至125μΜ的范围内。
63.如权利要求56或57所述的方法，其中所述制剂包含铜和/或锌的纳米颗粒。
64.如权利要求56至63中任一项所述的用途，其中所述制剂向所述子宫液提供铜离子的量在约0.025μg至约12.5μg的范围内。
65.如权利要求56至64中任一项所述的用途，其中所述制剂向所述子宫液提供铜离子的量在约0.05μg至约2.5μg的范围内。
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