CN112501263A - 人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法，采用荧光定量PCR法对试验中采集的食蟹猴外周血、脏器组织样本进行hPC‑MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度的检测并推算出细胞数，可以用来进行动物体内植入人源间充质干细胞之后的安全性评价。用来示踪动物体内植入的人源间充质干细胞的定向分布，是一种在动物实验时，兼具安全性，灵敏度，特异性，非侵入性，长久性等优点于一身的干细胞药物安全性评价所用的细胞分布检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于示踪动物体内植入人源间充质干细胞定向分布的检测方法。
背景技术
间充质干细胞是一类具有强大的自我更新和复制能力、多向分化潜能的成体干细胞；间充质干细胞具有低免疫原性和抗原提呈能力，在免疫调节中具有独特的双向调控能力；使其在移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、心血管系统疾病、神经退行性疾病等中具有极大的临床应用价值。当前脐带胎盘来源的间充质干细胞日益成为间充质干细胞的热点来源。新生儿脐带属医疗废弃物，采集容易，对供者无损伤，不涉及伦理问题。脐带中干细胞含量极其丰富，具有更低的免疫原性，体外培养时扩增能力更强，因而成为替代骨髓来源间充质干细胞的理想选择。
外源性干细胞治疗的细胞传递途径有两种方式：通过循环系统的全身干细胞传递和局部干细胞传递，对于全身干细胞传递研究已知干细胞经体循环会分布于肺、肝、脾等多个脏器及淋巴结内，约4-10％的干细胞会归巢至损伤缺血区域；对于局部注射干细胞，则注重于干细胞存活、分布、功能方面的研究，没有局部传递方式移植干细胞的再转移研究。
大量动物和临床研究均表明干细胞移植确实能改善心、脑和肝等器官功能，干细胞移植治疗器官功能缺损性疾病如缺血性心脏病、心力衰竭(心衰)，脑血管疾病、脑损伤、肝硬化或肝功能衰竭，神经损伤等级已成为21世纪医学的标志性成果。然而，评价细胞植入、分布、存活、迁移、分化和功能的干细胞标记示踪研究明显滞后于整体功能改善的观察，成为干细胞治疗机制探讨的瓶颈因素和新的研究热点。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法，采用荧光定量PCR法对试验中采集的食蟹猴外周血、脏器组织样本进行hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度的检测并推算出细胞数，可以用来进行动物体内植入人源间充质干细胞之后的安全性评价。
本发明的目的是提供一种检测方法。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)分别取待测动物的肝脏、肺脏及全血18-25mg作为基质，每种基质中分别加入不同浓度的hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞标准品W0568的细胞稀释悬液，混合均匀，稀释成浓度呈梯度分布的多个混合样本，对每一个混合样本分别进行DNA提取，每一个混合样本提取3批以上，并对提取后的DNA 样本进行qPCR扩增，检测并计算出qPCR扩增后的DNA平均产出量；
以DNA提取前标准品W0568细胞数的对数为横坐标，以DNA提取后的DNA 平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算，确定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的关系，找出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的回归方程；
(2)配制标准曲线，使用的标准品为hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞标准品W0568的DNA；配制质控品DNA样本，用去离子水将标准品进行不同浓度稀释，配置成高质控溶液HQC、中质控溶液MQC和低质控溶液LQC；
(3)对待测动物静脉滴注给予hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞，按照所需观察的时间点取样，然后对待测动物的血液及组织进行取样，所述组织包括全血、肝脏、肺及其他组织；对样本进行qPCR检测，得出提取前hPC-MSC 人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数；然后对样本进行DNA提取，形成待测DNA样本；
(4)配制qPCR反应体系中所需的样本，按《生物分析样本排列示意图》加入对应的标准曲线DNA样本、质控品DNA样本、待测DNA样本、空白基质阴性对照DNA样本和纯水无模板阴性对照到对应的孔中，进行qPCR扩增，检测并计算出qPCR扩增后的DNA平均产出量；
(5)根据步骤(1)得到的回归方程，以步骤(3)得到的提取前hPC-MSC 人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数的对数为横坐标，以步骤(4)得到的qPCR扩增后测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算，得出提取前动物组织或全血中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(1)中，分别取待测动物的肝脏、肺脏及全血18-25mg作为基质，每种基质中分别加入浓度为2 ×104cell/μL、2×103cell/μL，2×102cell/μL及20cell/μL的hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞标准品W0568的细胞稀释悬液50μL，混合均匀形成混合样本，用全自动核酸纯化仪对每一个混合样本进行DNA提取，分别提取3批，并对提取后的DNA样本进行qPCR扩增，检测并计算出qPCR扩增后的DNA平均产出量；以提取前标准品W0568细胞数的对数为横坐标，以提取后qPCR测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算，确定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的关系。
进一步的，所述待测动物为食蟹，则hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的回归方程为：以提取前W0568细胞数的对数为横坐标x，以提取并qPCR扩增后测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标y，进行线性回归计算，得出：(1)全血中：y＝0.8344x-1.411；(2)肝脏中y＝0.6806x-0.7357； (3)肺及其他组织中：y＝0.7981x-1.1843。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(1)中，对提取后的DNA样本进行qPCR扩增后的检测方法中，标准曲线定量范围为 0.0025-25.0000ng/μL，定量下限为0.0025ng/μL，定量上限为25.0000ng/ μL，检测限为0.00125ng/μL；若待测样本浓度大于定量下限的浓度且复孔浓度值％CV≤60％，出具浓度结果；待测样本的复孔Cq值均小于检测限的Cq值，表示该样本为阳性，但不出具浓度结果。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(3)中，采集给药血液样本512个，组织样本190个，共702个，存放在低于-66℃的冰箱中。存放时间不宜过长。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(2)中，所述标准品W0568的DNA的浓度为115ng/μL，所述标准曲线样本中包含6个浓度的标准曲线样本和一个检出限样本，所述标准曲线样本检测浓度与理论浓度比较，准确度需满足：-75.00％≤％RE≤150.00％。
具体的，根据表1配制标准曲线样本，其中标准品为hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液标准品DNA(浓度约为：115ng/μL)，按下表进行稀释先加入一定量体积的去离子水，再加入相应体积hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液标准品DNA、STD1-STD4到离心管中，涡旋混匀备用。
表1标准曲线样本的配制
注：以上配制可根据实际需要按比例放大或缩小，在原始记录如实记录。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，进一步的，所述标准曲线样本中包含6个浓度的标准曲线样本和一个检出限样本，所述标准曲线样本检测浓度与理论浓度比较，准确度需满足：-75.00％≤％RE≤150.00％。
如果某个标准曲线样本不符合该标准，则剔除标准曲线上由于明确或不明原因产生失误的样本，重新从CFX ManagerTM Software获取的标准品Cq值，扩增效率(Efficiency)，R2及标准曲线方程的Slope和截距，重新计算目的基因的起始浓度。至少75％标准曲线样本需满足上述接受标准，否则拒绝该分析批。
本发明使用的分析方法的定量范围为0.0025-25.0000ng/μL。qPCR测定食蟹猴血液/组织样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液浓度的标准曲线拟合参数汇总见表4，qPCR测定食蟹猴血液/组织样本中hPC-MSC 人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液浓度的标准曲线数据统计结果见表5。结果显示，标准曲线各浓度批内％RE在-20.11％-50.43％范围内，R2在0.994-0.999 范围内，扩增效率(E)在80.0％-93.0％之间。
表4 qPCR测定食蟹猴血液/组织样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液浓度的标准曲线拟合参数汇总
备注：标准曲线拟合公式：Cq＝Slope LogX0+y-int；其中X0为样本起始浓度，y-int为截距， Slope为斜率。
表5 qPCR测定食蟹猴血液/组织样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液浓度的标准曲线样本各浓度准确度；
备注：″＊″表示扩增效率不在范围内删点；″/″表示无计算数据。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，进一步的，所述质控品样本包括低、中、高3个浓度的质控品样本，质控品样本检测浓度与理论浓度比较，至少67％质控品样本、每一浓度水平至少50％样本准确度需满足-75.00％≤％RE≤ 150.00％，批间的％CV≤60.00％，批间-75.00％≤％RE≤150.00％。
进一步的，所述高质控溶液HQC的浓度为20.0000ng/μL、中质控溶液MQC 的浓度为0.5000ng/μL和低质控溶液LQC的浓度为0.0050ng/μL。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(3)中，检测待测 DNA样本的浓度，若待测样本为组织样本，则对组织DNA样本进行稀释；若待测样本为全血，则对全血DNA样本不稀释。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，进一步的，若待测样本为全血，提取方法及浓度测定方法具体为：
A:加样：取200μL枸橼酸钠抗凝全血按《生物分析样本排列示意图》加入96孔样本板中；
B:上机：设置纯化程序，洗脱体积选择100μL，用DNA提取试剂盒在全自动核酸纯化仪上进行DNA提取并保存；
C：用紫外/可见光分光光度计检测所提取样本的DNA浓度并记录，测定 A260/A280、A260/A230的值，得出DNA浓度。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(4)中，若待测样本为组织，提取方法及浓度测定方法具体为：
Ⅰ：组织匀浆：将组织样本转移至研磨管中，加入200μL的MagNA Pure 96 DNA组织裂解缓冲液，进行匀浆1min，瞬时离心将样本收集到管底，形成组织匀浆液；
Ⅱ：加样：取步骤Ⅰ制备的全部组织匀浆液按《生物分析样本排列示意
图》加入96孔样本板中；
Ⅲ：上机：设置纯化程序，洗脱体积选择200μL，用DNA提取试剂盒在全自动核酸纯化仪上进行DNA提取并保存；
(4)用紫外/可见光分光光度计检测所提取样本的DNA浓度并记录，测定A260/A230及A260/A280的值，得出DNA浓度。
本发明中的全血或组织均在低于零下66℃的下保存。所有样本转移至加样孔中时，都要尽量将样本转移至加样孔的底部，必要时，可采用瞬时离心的方法，所述瞬时离心的时间为15s。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，进一步的，所述组织DNA样本具体稀释方法为：通过计算，若DNA样本按最低需求稀释度稀释后浓度小于55 ng/μL，则按最低需求稀释度稀释；若超过55ng/μL，则将样本浓度稀释至50 ng/μL；心脏、肝脏DNA样本的最低需求稀释度为稀释2倍，肺脏、肾脏、脾脏DNA样本的最低需求稀释度为稀释4倍。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(4)中，配置反应体系具体为：除模板外，其余组分按以下比例表6配制qPCR反应体系，依据反应孔的数量等比例放大，混匀后，按《生物分析样本排列示意图》将反应预混液加入对应反应孔中，16μL/孔。
表6qPCR反应体系的配制
注：(1)模板分别为标准曲线DNA样本、质控品DNA样本、待测DNA样本、空白基质阴性对照DNA样本(Neg)和纯水无模板阴性对照(NTC)；(2)若反应中不加空白基质干扰时，则X＝0。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(4)中，按《生物分析样本排列示意图》加入对应的标准曲线DNA样本、质控品DNA样本、待测DNA样本、空白基质阴性对照DNA样本(Neg)和纯水无模板阴性对照(NTC) 到对应的孔中，4μL/孔，2复孔，若液体挂壁，瞬时离心将液体离下。
根据本发明的具体实施方式的检测方法，其中，步骤(5)中，所述qPCR扩增程序具体为：设置qPCR反应扩增程序，进行qPCR反应扩增，qPCR扩增程序如下：染料选择SYBRGreen，扩增体积为20μL，热盖温度105℃；初步扩增包括：95.0℃for 5min；95.0℃for 15s；59.0℃for 15s； 72.0℃for 30s；共N轮循环；进一步扩增包括：95.0℃for 15s，34 个循环；Melt Curve 65.0℃to 95.0℃,Increment 0.5℃for 5sec；共 M轮循环。
进一步的，所述qPCR扩增程序为
(1)按《生物分析样本排列示意图》设置相应的排版。
(2)设置qPCR反应扩增程序。
qPCR扩增程序如下：染料选择SYBR Green，扩增体积为20μL，热盖温度105℃；
①95.0℃for 5min
②95.0℃for 15sec
③59.0℃for 15sec
④72.0℃for 30sec
+Plate Read
⑤GOTO②，34more times
⑥Melt Curve 65.0℃to 95.0℃,Increment 0.5℃for 5sec
+Plate Read
END
(3)运行qPCR反应扩增程序。
数据处理和分析
所用的主要软件或数据系统如下表7：
表7所用的主要软件或数据系统
从CFX ManagerTM Software获取的标准品Cq值，扩增效(Efficiency)， R2及标准曲线方程的Slope和截距，计算标准曲线样本目的基因起始浓度，计算公式为：Conc.＝10(Cq 值-y-int)/Slope,其他样本的DNA起始浓度直接从软件获得。计算检测结果及涉及计算数据四舍五入后保留小数点后4位，相对误差 (％RE)，精密度(％CV)保留小数点后2位。
待测样本判断标准：1、若待测样本浓度大于LLOQ的浓度且复孔浓度值％CV≤60％，出具浓度结果；2、待测样本的复孔Cq值均小于LoD(浓度为 0.00125ng/μL)的Cq值，表示该样本为阳性，但不出具浓度结果。
W0568细胞与DNA产量的相关性：以提取前hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数的对数为横坐标，以提取后qPCR测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算：(1)全血中：y＝0.8344x-1.411； (2)肝脏中：y＝0.6806x-0.7357；(3)肺及其他组织中：y＝0.7981x-1.1843。计算所得细胞数不保留小数位数。
报告中所用相对误差(％RE)、标准偏差(SD)以及精密度(％CV)等值均由 OfficeExcel 2010(美国Microsoft公司)软件计算得出。计算公式如下：
平均值：
(Ct为实测浓度)；
相对误差百分比：
(Ct为实测浓度， Cn为理论浓度)；
变异系数百分比：
(
为检测浓度平均值)；
标准偏差：
(
为检测浓度平均值)。
目前，干细胞标记主要分为体外示踪(病理学示踪)和体内示踪。病理学示踪主要有移植前体外预先标记培养的干细胞，包括荧光染料标记(标记细胞核或细胞膜)，核素标记方法，Y染色体标记以及报告基因转染，体内示踪包括MR、核素显像、光学成像等。
1体外示踪技术
1.1荧光染料标记
荧光染料标记，细胞核染色如DAPI标记，缺点是细胞分裂会导致标记强度降低、灵敏度会下降，适合短期定量分析，细胞死亡后还会释放出DAPI，将周围未标记的细胞标记而产生假阳性；Hoechst染色存在部分干细胞拒染的现象。
荧光染料标记，细胞膜染色如Dil标记，类似于磷脂的方式与脂蛋白结合嵌进生物质膜内，并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。其特点是特异性强，灵敏度高，存在把标记物转移到未标记细胞的现象，适合短期的标记示踪；PKH26、PKH67，与细胞膜的脂质区域能稳定结合，清晰地显现细胞的结构，但是随着时间的流失而消失，也是适合于短期的细胞追踪。
1.2核素标记
目前常用来示踪标记的核素有3H-、125I-、14C-、99mTc、32P-等，其中以氚标记脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)应用最为广泛，主要用于检测干细胞的细胞动力学和增殖研究。细胞增殖时需摄取各种嘧啶核苷，3H-TDR作为DNA补救合成的前体，可较特异地在S期掺入细胞DNA中。干细胞分裂增殖快，3H-TDR 易被掺入标记。
核素标记干细胞移植治疗后在同一张切片上作放射自显影+免疫组化也可观察移植细胞在体内的分布、迁移情况。核素示踪灵敏度高，可以稳定长期地示踪。
存在的问题是有一定的放射性污染，检测复杂。
1.3 Y染色体标记
目前国际上比较认可的Y染色体标记细胞追踪移植细胞技术是选用雄性供体和雌性宿主，利用Y染色体作为标志物。
优点：标记技术简单，且标记效率很高，利用荧光原位杂交(FISH)技术进行追踪荧光标记的细胞能清楚地观察到，适合长期体内试验定量分析。存在的问题是不能观察自体细胞移植研究，且追踪异体移植细胞时需要雄性供体，雌性宿主，有较大的局限性。
1.4报告基因转染
利用基因载体将标志基因导入干细胞中，通过筛选获得表达标志基因的细胞，然后通过荧光显微镜可直接观察移植细胞在体内的生物学情况，此类标志基因主要有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、B-半乳糖苷酶等，以GFP应用最广泛。
2体内跟踪技术，分子成像技术
自1999年Weissleder提出分子影像学概念以来，MRI、核医学成像和光学成像蓬勃发展，因还未研发针对干细胞特异性或相对特异性标志分子的示踪剂，核医学成像应用较少。
目前在干细胞示踪研究中应用较多的主要是磁标记细胞MRI示踪成像和光学成像，但光学成像尚处于仅应用于小动物实验性成像阶段。
2.1 MRI
磁共振示踪突出的优势，极佳的空间分辨力,扫描能明确部位，实时显像并连续跟踪标记的细胞，能用于导向治疗和跟踪，检测细胞阈值远低于有效治疗剂量。磁共振细胞示踪时间不仅与细胞转归相关，还与细胞内铁含量、局部注射细胞量、磁共振仪器分辨力、成像条件调节有关。
MRI示踪存在的问题，安全性有待进一步研究：虽然大部分研究表明顺磁性铁标记后不影响干细胞的活性、增殖和向其他细胞的分化能力，但也有作者报道标记后的骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化能力受损；灵敏度相对不足；非特异性显像：标记干细胞在体内死亡、裂解，释放出的氧化铁颗粒能否造成非特异性显像尚无定论。由于氧化铁不能够跟随细胞的分裂而自体复制，所以在监测移植后干细胞的增殖和分化方面存在一定不足。
2.2核素标记
放射性核素显像示踪的优点是背景信号低，信噪比较高，研究显示能检测经血管注射后向归巢的少量干细胞。磁共振成像敏感性不如核素显像。
核素标记也可能对治疗细胞有放射性损害，甚至有癌变的潜在危险。损害的大小与放射性元素的物理学特性和特定细胞的易感性有关。
和磁共振示踪相反，放射性核素显像灵敏度较高，能检测标记细胞的生物学分布，包括外周血管注射后归巢到心肌的细胞百分比，但观察时间受核素衰减的制约，且空间分辨力低。
光学显像虽能敏感检测少量细胞，但不能断层成像，不能应用于大动物或人类。核素报告基因显像需要较大量的细胞。
2.3分子成像技术总结
报告基因显像优点是较特异，可长期示踪，但灵敏性和空间分辨力均不理想，操作复杂有致突变可能，不适用于大动物和人类；
放射性核素示踪灵敏，但示踪时间极短，空间分辨力差；
磁共振示踪虽然相对安全，示踪时间较长，心脏结构显示清晰，但灵敏度有限。新的纳米材料示踪剂正在研制中。
2.4理想的活体细胞示踪剂需要同时具备以下的特点：
安全性：不影响细胞存活、生长、分化及其他生物学作用；不影响细胞基因组成；有其清除途径；如从携带细胞释放，不影响周围组织和受者。
灵敏度：能准确反映少量标记细胞的行为(包括位置、移行)和标记细胞的数量等。
特异性：能反映标记细胞外移、死亡或被巨噬细胞吞噬等情况，间质对标记细胞或标记物的非特异性处置不应对靶细胞数量和生物学活动造成错误判断。
长久性：示踪时间较长，标记物不会自动衰减或随细胞分裂而稀释，可用非侵入性方法反复探测示踪。
空间分辨力：能对标记细胞进行清晰的解剖学空间定位。
事实上，不管是直接标记还是报告基因显像，均无法同时具备以上特性。
本发明的有益效果为：本发明的人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法，采用荧光定量PCR法对试验中采集的食蟹猴外周血、脏器组织样本进行hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度的检测并推算出细胞数，可以用来进行动物体内植入人源间充质干细胞之后的安全性评价。
本发明的人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法用来示踪动物体内植入的人源间充质干细胞的定向分布，是一种在动物实验时，兼具安全性，灵敏度，特异性，非侵入性，长久性等优点于一身的干细胞药物安全性评价所用的细胞分布检测方法，具体如下：
安全性：不影响细胞存活、生长、分化及其他生物学作用；不影响细胞基因组成；示踪分子无需清除和释放，不影响周围组织和受者；
灵敏度：能准确反映少量标记细胞的行为(包括位置、移行)和标记细胞的数量等，可以根据DNA的浓度回推到细胞数量，可精确到；
特异性：能反映标记细胞外移、死亡或被巨噬细胞吞噬等情况，间质对标记细胞或标记物的非特异性处置不应对靶细胞数量和生物学活动造成错误判断；
长久性：示踪时间较长，标记物不会自动衰减或随细胞分裂而稀释，可用非侵入性方法反复探测示踪；
空间分辨力：能对标记细胞进行清晰的解剖学空间定位。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示本发明中qPCR测定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液 DNA浓度的典型标准曲线；
图2显示本发明中qPCR测定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液 DNA浓度的典型扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明具体实施例中所用的紫外/可见光分光光度计的型号均为NANO DROP2000；实时荧光定量检测系统采用自Bio-Rad，型号为CFX96；全自动核酸纯化仪采购自Roche，型号为MagNA Pure96，主要试剂见下表8。
表8主要试剂一览表
实施例1
本实施例提供了一种人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法，具体为食蟹猴外周血样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量的检测；
方法：采用荧光定量PCR法对试验中采集的食蟹猴外周血进行hPC-MSC 人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度的检测并推算出细胞数；
申请人于2019.04.23-2019.08.14采集给药血液样本512个，组织样本190 个，共702个，存放在低于-66℃冰箱，于2019.08.14-2019.11.11完成样本 DNA提取，于2019.09.17-2019.11.13完成样本qPCR检测；
结果：在试验研究剂量下，各剂量组首次给药后，各血液样本中测得 hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度统计如下表9：
表9首次给药后血液样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度数据(单位：ng/μL)
在试验研究剂量下，各剂量组首次给药后，所采集的200μL全血样本中 hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液的细胞个数统计如下表10：
表10首次给药后200μL血液样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞总数数据(单位：个)
在试验研究剂量下，各剂量组末次给药后，测得hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度统计如下表11：
表11末次给药后血液样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度数据(单位：ng/μL)
在试验研究剂量下，末次给药后所采集的200μL全血样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液的细胞个数统计如下表12：
表12末次给药后200μL血液样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞总数数据 (单位：个)
在试验研究剂量下，食蟹猴静脉滴注0.9％氯化钠注射液后(对照组)的血液样本中未检测出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA。
3.1×106细胞/kg组：首次给药，8只(8/10比例)猴给药后5分钟或 24小时血液中检测出干细胞DNA，浓度为0.0043-0.3177ng/μL，对应的200 μL全血中干细胞个数分别为18-3099个。另外，4只猴给药后5分钟或6小时检测结果为阳性。末次给药，所有猴给药后5分钟血液中检测出干细胞DNA，浓度为0.0065-0.0498ng/μL，对应的200μL全血中干细胞个数分别为 29-336个。另外，2只猴给药后6小时检测结果为阳性。
9.3×106细胞/kg组：首次给药，7只(7/10比例)猴给药后5分钟或 6小时血液中检测出干细胞DNA，浓度为0.0028-0.0250ng/μL，对应的200μ L全血中干细胞个数分别为11-147个。另外，6只猴给药后5分钟-12小时检测结果为阳性。末次给药，所有猴给药后5分钟或6小时血液中检测出干细胞DNA，浓度为0.0066-0.0827ng/μL，对应的200μL全血中干细胞个数分别为30-618个。另外，5只猴给药后6或12小时检测结果为阳性。
3.1×107细胞/kg组：首次给药，所有猴(10/10比例)给药后5分钟 -12小时血液中检测出干细胞DNA，浓度为0.0054-0.0549ng/μL，对应的200 μL全血中干细胞个数分别为24-378个。另外，8只猴给药后12或24小时检测结果为阳性。末次给药，所有存活猴(9/9比例)给药后5分钟-24小时血液中检测出干细胞DNA，浓度为0.0042-0.4604ng/μL，对应的200μL全血中干细胞个数分别为17-4833个。另外，所有猴在给药后6-72小时检测结果为阳性。
结论：在试验研究剂量下，首、末次给药后全血样本中检出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞的动物数汇总如下表13(单位：只，每个剂量组的试验动物数为10只，采样时间点为5min-168h)：
表13检出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞的动物数汇总
三组测得目的基因最高浓度分别为0.3177ng/μL、0.0827ng/μL、 0.4604ng/μL，所对应采集的200μL全血中目标干细胞的含量分别为3099 Cell/200μL全血、618Cell/200μL全血及4833Cell/200μL全血。
在试验研究剂量下，食蟹猴静脉滴注0.9％氯化钠注射液(对照组)中未检出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
实施例2
本实施例提供了一种人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法，具体为：食蟹猴组织样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量的检测；
方法：采用荧光定量PCR法对试验中采集的食蟹猴心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏组织进行hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度的检测并推算出细胞数
结果：在试验研究剂量下，各组织样本中所有时间点中均未检测出 hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA。
在试验研究剂量下，食蟹猴静脉滴注0.9％氯化钠注射液后(对照组)的组织样本中均未检测出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA。
末次给药后7天及恢复期结束，各组猴心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏各脏器均未检测出干细胞DNA。
结论：在试验研究剂量下，所有组织脏器的采集时间点均未检出hPC-MSC 人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
在试验研究剂量下，食蟹猴静脉滴注0.9％氯化钠注射液(对照组)中未检出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞。
本发明的食蟹猴组织样本共涉及27个分析批，所有分析批均为通过的有效分析批。qPCR测定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液DNA浓度的典型标准曲线见附图1，典型扩增曲线见附图2，分析批信息见表14。
表14分析批信息摘要
复测样本结果见表15：
表15食蟹猴复测血液/组织样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液浓度汇总
备注：
复测原因：“1”Cq值一个阴性，一个阳性(包括定量)；
“2”结果明显异常；
报告原因：“1”复测结果复孔Cq值均为“阴性”或者“一个阴性，一个阳性(包括定量)”报告BDL；
“2”复测结果复孔Cq值均为阳性(包括定量)，报告P或定量浓度结果；
“3”对于结果明显异常的样本，复测两次，两次结果为阳性或者定量，报告报告P或者定量结果，其余报告阴性。
复测样本类型有Cq值一个阴性、一个阳性和结果异常个数为20个，占总样本量的2.83％。
综上所述，本发明经过方法学验证，得到了本方法的各步骤接受标准，包括标准曲线，精密度与准确度，检出限(LoD)及引物特异性、抑制剂的干扰、基质DNA的干扰以及W0568细胞与DNA产量的相关性等接受标准，得到了一个可靠的稳定的检测方法。
并且放大样本，进行大规模(血液样本512个，组织样本190个)702个样本进行了qPCR检测，得到了稳定的发挥，检测结果通过验证，稳定可靠。使用qPCR测定动物体内血液/组织样本中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液干细胞分布情况，兼具安全性，灵敏度，特异性，非侵入性，长久性等优点，是干细胞药物安全性评价所用的细胞分布检测方法。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种人源间充质干细胞在动物体内定向分布的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)分别取待测动物的肝脏、肺脏及全血18-25mg作为基质，每种基质中分别加入不同浓度的hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞标准品W0568的细胞稀释悬液，混合均匀，稀释成浓度呈梯度分布的多个混合样本，对每一个混合样本分别进行DNA提取，每一个混合样本提取3批以上，并对提取后的DNA样本进行qPCR扩增，检测并计算出qPCR扩增后的DNA平均产出量；
以DNA提取前标准品W0568细胞数的对数为横坐标，以DNA提取后的DNA平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算，确定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的关系，找出hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的回归方程；
(2)配制标准曲线，使用的标准品为hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞标准品W0568的DNA；配制质控品DNA样本，用去离子水将标准品进行不同浓度稀释，配置成高质控溶液HQC、中质控溶液MQC和低质控溶液LQC；
(3)对待测动物静脉滴注给予hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞，按照所需观察的时间点取样，然后对待测动物的血液及组织进行取样，所述组织包括全血、肝脏、肺及其他组织；对样本进行qPCR检测，得出提取前hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数；然后对样本进行DNA提取，形成待测DNA样本；
(4)配制qPCR反应体系中所需的样本，按《生物分析样本排列示意图》加入对应的标准曲线DNA样本、质控品DNA样本、待测DNA样本、空白基质阴性对照DNA样本和纯水无模板阴性对照到对应的孔中，进行qPCR扩增，检测并计算出qPCR扩增后的DNA平均产出量；
(5)根据步骤(1)得到的回归方程，以步骤(3)得到的提取前hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数的对数为横坐标，以步骤(4)得到的qPCR扩增后测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算，得出提取前动物组织或全血中hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞注射液细胞数。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，分别取待测动物的肝脏、肺脏及全血18-25mg作为基质，每种基质中分别加入浓度为2×104cell/μL、2×103cell/μL，2×102cell/μL及20cell/μL的hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞标准品W0568的细胞稀释悬液50μL，混合均匀形成混合样本，用全自动核酸纯化仪对每一个混合样本进行DNA提取，分别提取3批，并对提取后的DNA样本进行qPCR扩增，检测并计算出qPCR扩增后的DNA平均产出量；以提取前标准品W0568细胞数的对数为横坐标，以提取后qPCR测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标，进行线性回归计算，确定hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的关系；
进一步的，所述待测动物为食蟹，则hPC-MSC人胎盘绒毛膜间充质干细胞数量与检出DNA浓度之间的回归方程为：以提取前W0568细胞数的对数为横坐标x，以提取并qPCR扩增后测定的DNA平均产出量的对数为纵坐标y，进行线性回归计算，得出：(1)全血中：y＝0.8344x-1.411；(2)肝脏中y＝0.6806x-0.7357；(3)肺及其他组织中：y＝0.7981x-1.1843。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，对提取后的DNA样本进行qPCR扩增后的检测方法中，标准曲线定量范围为0.0025-25.0000ng/μL，定量下限为0.0025ng/μL，定量上限为25.0000ng/μL，检测限为0.00125ng/μL；若待测样本浓度大于定量下限的浓度且复孔浓度值％CV≤60％，出具浓度结果；待测样本的复孔Cq值均小于检测限的Cq值，表示该样本为阳性，但不出具浓度结果。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述标准品W0568的DNA的浓度为115ng/μL，所述标准曲线样本中包含6个浓度的标准曲线样本和一个检出限样本，所述标准曲线样本检测浓度与理论浓度比较，准确度需满足：-75.00％≤％RE≤150.00％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质控品样本包括低、中、高3个浓度的质控品样本，质控品样本检测浓度与理论浓度比较，至少67％质控品样本、每一浓度水平至少50％样本准确度需满足-75.00％≤％RE≤150.00％，批间的％CV≤60.00％，批间-75.00％≤％RE≤150.00％；进一步的，所述高质控溶液HQC的浓度为20.0000ng/μL、中质控溶液MQC的浓度为0.5000ng/μL和低质控溶液LQC的浓度为0.0050ng/μL。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，检测待测DNA样本的浓度，若待测样本为组织样本，则对组织DNA样本进行稀释；若待测样本为全血，则对全血DNA样本不稀释。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，若待测样本为全血，待测DNA样本的提取方法及浓度测定方法具体为：
A:加样：取200μL枸橼酸钠抗凝全血按《生物分析样本排列示意图》加入96孔样本板中；
B:上机：设置纯化程序，洗脱体积选择100μL，用DNA提取试剂盒在全自动核酸纯化仪上进行DNA提取并保存；
C：用紫外/可见光分光光度计检测所提取样本的DNA浓度并记录，测定A260/A280及A260/A230的值，得出DNA浓度。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，若待测样本为组织，待测DNA样本的提取方法及浓度测定方法具体为：
Ⅰ：组织匀浆：将组织样本转移至研磨管中，加入200μL的MagNA Pure 96DNA组织裂解缓冲液，进行匀浆1min，瞬时离心将样本收集到管底，形成组织匀浆液；
Ⅱ：加样：取步骤Ⅰ制备的全部组织匀浆液按《生物分析样本排列示意图》加入96孔样本板中；
Ⅲ：上机：设置纯化程序，洗脱体积选择200μL，用DNA提取试剂盒在全自动核酸纯化仪上进行DNA提取并保存；
(4)用紫外/可见光分光光度计检测所提取样本的DNA浓度并记录，测定A260/A280及A260/A230的值，得出DNA浓度。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述组织DNA样本的具体稀释方法为：通过计算，若DNA样本按最低需求稀释度稀释后浓度小于55ng/μL，则按最低需求稀释度稀释；若超过55ng/μL，则将样本浓度稀释至50ng/μL；心脏、肝脏DNA样本的最低需求稀释度为稀释2倍，肺脏、肾脏、脾脏DNA样本的最低需求稀释度为稀释4倍。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(4)中，所述qPCR扩增程序均具体为：设置qPCR反应扩增程序，进行qPCR反应扩增，qPCR扩增程序如下：染料选择SYBR Green，扩增体积为20μL，热盖温度105℃；初步扩增包括：95.0℃for 5min；95.0℃for15s；59.0℃for 15s；72.0℃for 30s；进一步扩增包括：95.0℃for 15s，34个循环；MeltCurve 65.0℃to 95.0℃,Increment 0.5℃for 5sec。
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