CN112500918A - 一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物油脂提取技术领域，具体涉及一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂。所述微生物油脂无溶剂提取方法，以干菌体为原料，通过酶解破壁获得油脂；所述酶解破壁所采用的酶包括葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶及磷脂酶。本发明通过选择四种特定的酶，并以特定顺序对干菌体进行三次酶解破壁处理，可大大提升难破壁微生物如霉菌等的破壁效果，从而可采用常规分离技术提取高品质油脂。

Description

一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂

技术领域

本发明属于微生物油脂提取技术领域，具体涉及一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂。

背景技术

目前微生物功能脂质提取工艺分为溶剂法和非溶剂法。溶剂法是指将菌体干燥后直接采用烷烃类非极性溶剂萃取，如CN104479862A，虽然萃取率高，但需要使用大量的挥发性且可燃的有机溶剂，对操作安全和设备安全提出较高的要求，且回收工艺成本高；此外，少量溶剂还容易残留在油脂产品中，对产品品质有较大影响。

非溶剂法是指直接在水相中提取微生物油脂的工艺，通常为在发酵液中对菌体细胞壁破壁裂解，形成乳液后同时或分步进行破乳，分离得到油脂，如CN1416469A、CN105960235A和CN106061475A。所述破壁裂解方法可分为酸法、碱法或酶法。该方法解决了溶剂萃取存在的各种问题，但该方法具有一定的局限性，更适合于细胞壁比较薄、形态圆整的微生物细胞，例如裂殖壶菌、破囊壶菌；对于具有多层细胞壁、细胞壁较厚、细胞壁组成复杂或者形态为非圆整型的微生物，例如丝状的被孢霉属，细胞壁较厚的酵母、双鞭甲藻等，破壁效果不理想。

CN108949337A公开了一种微生物毛油的提取方法，先将发酵液离心，浓缩，再利用纤维素酶酶解，再利用蛋白酶酶解，离心，得到粗油脂；通过两步法酶解使油脂提取率高达95％，且提取过程中控制pH值在7以下，避免油脂被破坏。该方法虽一定程度提高破壁效果，但对于细胞壁厚、组成复杂的霉菌的破壁仍不理想。

虽然现有技术也有采用极端的化学方法使细胞破壁裂解，但容易导致油脂氧化，严重破坏了油脂品质，并且这种方法需要付出相当高的能耗及时间来执行，虽然有研究表明可将裂解和破乳同时进行来节约工时、或者蒸发发酵液中的水分来帮助破乳，但这必然会影响到整体的提取效果，无法获得达到令人满意的收率，并且高强度的条件也影响所得油脂的品质。

CN103643580A公开了一种干法提取微生物油脂的方法，将干菌体进行膨化破壁或蒸炒破壁，再进行机械压榨，获取毛油。该方法对破壁设备要求较高，同时对细胞壁厚、组成复杂的霉菌的破壁效果也不理想。

CN102533879A公开了一种微生物油脂提取方法，其是以微生物发酵液为原料，利用酶法破壁辅助有机溶剂浸提微生物油脂；并具体公开了用于破壁的可选酶有十几种。该方法虽浸提率高，但由于使用有机溶剂，不符合本行业的绿色发展需求。

发明内容

本方案的第一目的是提供一种适用于细胞壁厚、组成复杂的霉菌的微生物油脂无溶剂提取方法。所述方法破碎时间短、生产效率高，对破壁设备及操作条件要求不高，更适用于工业化实施。

所述微生物油脂无溶剂提取方法，是以干菌体为原料，通过酶解破壁获得油脂；所述酶解破壁所采用的酶包括葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶及磷脂酶。

我们发现，酶法破壁技术虽已被广泛应用，但基于原料、提取工艺的不同，对破壁程度要求不一，例如CN102533879A，以微生物发酵液为原料，破壁难度相对较低。但对于以真菌、霉菌等难破壁微生物干菌体为原料而言，破壁难度较大，常规酶解效果并不理想。对此，本案通过对现有可用于酶解破壁的酶进行深入研究，发现通过上述四种酶组合处理，可大大提升丝状真菌、霉菌等难破壁微生物的破壁效果。

优选地，所述酶解破壁的顺序为：葡聚糖酶酶解阶段、蛋白酶酶解阶段、几丁质酶酶解阶段。通过特定酶解顺序可进一步提高破壁效果。

所述磷脂酶可单独作为对干菌体酶解的一个阶段，或出于节省整体酶解时间考虑可以与上述任一一种酶复配酶解，优选后者，可进一步提升破壁效果。进一步优选磷脂酶与葡聚糖酶或几丁质酶复配酶解。

所述葡聚糖酶的酶解阶段中，以干菌体计，所述葡聚糖酶的添加量为1-5％；体系pH为4.5-6.5。更优选地，所述葡聚糖酶为β-葡聚糖酶。

所述蛋白酶酶解阶段中，以干菌体计，所述蛋白酶的添加量3-8％；体系pH为5-8。更优选地，所述蛋白酶为酸性、中性或碱性蛋白酶中的一种或几种。

所述几丁质酶酶解阶段中，以干菌体计，所述几丁质酶的添加量为3-8％；体系pH为6-7.5。

所述磷脂酶酶解时，其添加量为1-5％；当其单独酶解时，体系pH为3-6。

作为本发明的优选具体实施方式之一，所述酶解破壁包括下述阶段：

所述葡聚糖酶酶解阶段，以干菌体计，所述β-葡聚糖酶的添加量之和为1-5％，体系pH为4.5-6.5；

所述蛋白酶酶解阶段，以干菌体计，所述蛋白酶的添加量3-8％，体系pH为5-8；

所述几丁质酶酶解阶段，以干菌体计，所述几丁质酶和所述磷脂酶的添加量为3-10％，体系pH为6-7.5。

研究表明，通过控制酶解处理中四种酶的组合方式、添加量范围及体系pH变化程度产生协同作用，不仅显著改善丝状真菌等难破壁微生物的破壁效果，而且大大缩短破壁处理时间，提高整体破壁效率，且确保油脂未受到破坏。

优选地，所述酶解破壁还包括果胶酶酶解。

进一步优选地，控制所述葡聚糖酶酶解阶段、蛋白酶酶解阶段的体系的温度为40-60℃；所述几丁质酶酶解阶段的体系的温度为30-45℃，如此更有利于提高破壁程度，缩短破壁时间，同时保障油脂品质。

进一步优选地，每次酶解完成后，先将体系升温至80℃灭活再降温。

本发明中，根据微生物的不同，每次酶解时间也相应不同，通常来讲，每次酶解的时间控制在8-22h之间，以免油脂被破坏。

为了进一步提高酶解破壁效果，所述微生物油脂无溶剂提取方法还包括在所述酶解破壁前，对干菌体进行干法破碎处理至质量分数90％的干菌体的粒径不大于300μm。通过控制干法破碎程度，既可以增大酶法反应中菌体的比表面积，进而提升破壁率，同时又减轻干法破碎菌体工艺的压力，降低对干法破壁设备及操作条件的较高要求，更有利于提高企业综合效益。

所述干法破碎为研磨和/或剪切时，控制操作温度≤45℃；进一步优选地，所述干法破碎是在真空或充氮保护下进行的，如此既可通过延长破碎时间进一步提升破壁率，又避免功能脂质在长时间破壁处理过程中被氧化，降低功能脂质品质。

或，所述干法破碎为超微粉碎时，所述干菌体的含水率控制在3-10％之间，且控制所述超微粉碎的压力在0.1-1MPa之间。

为了更进一步提高酶解破壁效果，所述微生物油脂无溶剂提取方法还包括在所述干法破碎处理后、所述酶解破壁前，对破碎后的干菌体进行复水剪切处理至质量分数50％的干菌体的粒径不大于80μm，且质量分数90％的干菌体的粒径不大于220μm。通过控制复水剪切程度，进一步增大酶法反应中菌体的比表面积，进而提高破壁率，同时又减轻干法破碎菌体工艺的压力及酶解破壁工艺的压力，降低对干法破壁设备及操作条件的较高要求，更有利于提高企业综合效益。

所述微生物油脂无溶剂提取方法还包括：将所述酶解破壁后的反应液分离，得到微生物功能脂质产物。

所述分离可通过离心、沉降或过滤实现。优选地，所述离心的转速为6000-10000r，时间为3-30min。

本发明所述微生物油脂无溶剂提取方法适用于大多数微生物，如双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母、高山被孢霉、三孢布拉霉等，特别适用于高山被孢霉、三孢布拉霉等这类细胞壁厚、组成复杂的霉菌，可显著提高此类微生物的油脂提取率。

本方案的第二目的是提供一种采用上述方法制得的微生物功能脂质。

优选的，所述微生物功能脂质安全性高且富含多不饱和脂肪酸。

所述多不饱和脂肪酸为ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸或十八碳四烯酸中的一种或多种。

优选地，所述微生物功能脂质中甘油三酯含量达到90％以上，所述微生物功能脂质的酸价≤4，缩水甘油酯≤0.3ppm，3-MCPD≤1.5ppm。

进一步优选地，ARA油脂中，甘油三酯≥90％，ARA含量≥40％，酸价≤4，缩水甘油酯≤0.3ppm，3-MCPD≤1.5ppm，更优选的，3-MCPD≤1.0ppm。

进一步优选地，DHA油脂中，甘油三酯≥90％，DHA含量≥40％，酸价≤4，缩水甘油酯≤0.3ppm，3-MCPD≤1.5ppm，3-MCPD≤1.0ppm。

优选的，所述微生物为三孢布拉霉时，所述微生物功能脂质中含有类胡萝卜素；所述类胡萝卜素包括β-胡萝卜素和番茄红素。

优选的，所述微生物功能脂质是针对粗制的微生物油脂而言。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明通过选择四种特定的酶，并以特定顺序对干菌体进行三次酶解破壁处理，可大大提升难破壁微生物如霉菌等的破壁效果，从而可采用常规分离技术提取高品质油脂。

(2)本发明通过增设干法破碎及复水剪切处理，既可以增大酶法反应中菌体的比表面积，进而提升破壁率，同时又减轻干法破碎菌体工艺的压力，降低对干法破壁设备及操作条件的较高要求，更有利于提高企业综合效益。

(3)相对于现有粗制的微生物油脂，本发明所得微生物功能脂质富含多不饱和脂肪酸或类胡萝卜素，安全性高。

附图说明

图1为实施例1与对比例3提取得到的微生物油脂对比照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1、实验材料来源：

β-葡聚糖酶AB Enzymes；ROHALASE BXL；

蛋白酶，安占美；EF108；

磷脂酶AB Enzymes；RHALASE PL-XTRA；

几丁质酶，购自上海鼓臣生物，CAS号9001-06-3。

2、油脂收率测定：

取离心分离上清液，用正己烷萃取3次至正己烷层无色，合并萃取液，水浴60℃真空-0.09MPa脱溶。称量回收油脂重量，计算油脂回收率。

3、干菌体的获得：

高山被孢霉干菌体通过下述方法获得：先将高山被孢霉发酵液过滤，45℃真空干燥，得到干菌体；所得干菌体中水分含量为5％；(实施例1-4)

三孢布拉霉干菌体通过下述方法获得：先将三孢布拉霉发酵液过滤，45℃真空干燥，得到干菌体；所得干菌体中水分含量为5％；(实施例5)

双鞭甲藻干菌体通过下述方法获得：先将双鞭甲藻发酵液过滤，45℃真空干燥，得到干菌体；所得干菌体中水分含量为6％；(实施例6)

4、干法破碎处理：

将上述三种干菌体通过超微粉碎处理，在0.5MPa的压力下得到粉碎后的干菌体，90％的物料颗粒不大于300μm即可。

实施例1从高山被孢霉中提取多不饱和脂肪酸油脂(磷脂酶与葡聚糖酶复配酶解)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切复水15min，粒径为D50＝73μm；D90＝202μm。

酶解破壁包括下述各阶段：

葡聚糖酶酶解阶段：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.82，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

转速9000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率90.87％。

所得ARA油脂中：甘油三酯93％，ARA含量45％，酸价1.22mgKOH/g，缩水甘油酯0.07ppm，3-MCPD0.6ppm。

图1为实施例1与对比例3提取得到的微生物油脂对比照片。

实施例2从高山被孢霉中提取多不饱和脂肪酸油脂(未剪切)

步骤如下：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，搅拌均匀。

酶解破壁：

葡聚糖酶酶解阶段：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.82，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

9000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率80.46％。低于实施例1的收率。

所得ARA油脂中：甘油三酯93％，ARA含量48.3％，酸价1.05mgKOH/g，缩水甘油酯0.26ppm，3-MCPD0.9ppm。

实施例3从高山被孢霉中提取多不饱和脂肪酸油脂(酶解阶段顺序改变)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切复水15min，粒径为D50＝73μm；D90＝202μm。

酶解破壁：

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

葡聚糖酶酶解阶段：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：温度调整至35℃，调节pH 6.80，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：转速9000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率80.78％。

所得ARA油脂中：甘油三酯92％，ARA含量45.6％，酸价1.52mgKOH/g，缩水甘油酯0.1ppm，3-MCPD0.8ppm

实施例4从高山被孢霉中提取多不饱和脂肪酸油脂(磷脂酶与几丁质酶复配酶解)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切复水15min，粒径为D50＝73μm；D90＝202μm。

酶解破壁：

葡聚糖酶酶解阶段：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.02，加入占菌体质量5％几丁质酶+3％磷脂酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

转速9000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率92.78％。

所得ARA油脂中：甘油三酯93％，ARA含量45％，酸价1.23mgKOH/g，缩水甘油酯0.07ppm，3-MCPD0.7ppm。

实施例5从三孢布拉霉中提取功能脂质

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切复水15min，粒径为D50＝73μm；D90＝202μm。

酶解破壁：

葡聚糖酶酶解阶段(破外壁)：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.82，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

转速9000rpm，40℃，离心20min，获得含有β-胡萝卜素的微生物功能脂质。

进一步加工：所得含有β-胡萝卜素的微生物功能脂质再经过加碱皂化和水洗除皂的步骤后，得到β-胡萝卜素晶体。晶体收率为83.3％。

实施例6从双鞭甲藻中提取功能脂质(菌体的改变)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切复水15min，粒径为D50＝73μm；D90＝202μm。

酶解破壁：

葡聚糖酶酶解阶段(破外壁)：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.82，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

转速9000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率56.06％，显著低于实施例1和实施例2的收率。

所得DHA油脂中，甘油三酯92％，DHA含量40％，酸价1.52mgKOH/g，缩水甘油酯0.30ppm，3-MCPD1.48ppm。

对照例1从高山被孢霉中提取功能脂质(省略酶解破壁)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，15rpm剪切复水15min，剪切完成粒径D50＝88μm；D90＝235μm。

80℃，250rpm搅拌2h；加入占总量0.5％NaCl，80℃保温30min。

离心：

8000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率33.01％。

对照例2：从高山被孢霉中提取功能脂质(省略酶解破壁)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，15rpm剪切复水15min，剪切完成粒径D50＝88μm；D90＝220μm。

调节pH 5.01，55℃水浴搅拌19h。升温至80℃，保温30min。

降温至55℃，调节pH 7.06，55℃水浴搅拌8h。升温至80℃，保温30min。

离心：

8000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率45.74％。

对照例3：从高山被孢霉中提取功能脂质(替换为酸法破壁)

步骤如下：

剪切复水：

湿菌体加入2倍质量纯水，20krpm剪切40min，剪切完成粒径D50＝187μm，D90＝440μm。

酸法裂解破壁：

将剪切菌体转移入圆底烧瓶中，设置冷凝管回流，350rpm机械搅拌加入占湿菌体重量10％的浓盐酸，于加热套中100℃搅拌18h。

离心：

8000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率93.57％。

毛油颜色深，测得酸价8.23mgKOH/g；脱色后油脂中3-MCPD：10ppm；缩水甘油酯：1ppm。相比实施例1，所得毛油中油脂氧化受损严重，品质低。

对照例4：从高山被孢霉中提取功能脂质(以湿菌体为原料)

步骤如下：

剪切复水：

湿菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切30min，高压均质至粒径D50＝7μm；D90＝120μm。

酶解破壁：

调节pH 5.49，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶+6％果胶酶，55℃水浴搅拌19h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

降温至55℃，调节pH 6.57，加入占菌体质量4％蛋白酶，55℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

8000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率24.7％。

对照例5从高山被孢霉中提取多不饱和脂肪酸油脂(省略蛋白酶酶解)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，12krpm剪切复水15min，粒径D50＝75μm；D90＝212μm。

酶解破壁：

葡聚糖酶酶解阶段(破外壁)：调节pH 5.21，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶+3％磷脂酶+6％果胶酶，55℃水浴搅拌19h。酶解完成升温至80℃，保温30min。(增加6％果胶酶)

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.82，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

转速8000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率58.06％。低于实施例2的收率。

对照例6从高山被孢霉中提取多不饱和脂肪酸油脂(省略磷脂酶酶解)

步骤如下：

剪切复水：

超微粉碎干菌体加入5倍质量纯水，20krpm剪切复水15min，粒径为D50＝73μm；D90＝202μm。

酶解破壁：

葡聚糖酶酶解阶段(破外壁)：调节pH 4.90，加入占菌体质量3％β-葡聚糖酶，50℃水浴搅拌22h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

蛋白酶酶解阶段：降温至50℃，调节pH 7.09，加入占菌体质量4％蛋白酶，50℃水浴搅拌8h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

几丁质酶酶解阶段：降温至35℃，调节pH 6.82，加入占菌体质量5％几丁质酶，35℃水浴搅拌13h。酶解完成升温至80℃，保温30min。

离心：

转速9000rpm，40℃，离心20min，进行分离。毛油收率52.78％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种微生物油脂无溶剂提取方法，包括：以干菌体为原料，通过酶解破壁获得油脂；其特征在于，所述酶解破壁所采用的酶包括葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶及磷脂酶。

2.根据权利要求1所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述酶解破壁的处理顺序为：葡聚糖酶酶解阶段、蛋白酶酶解阶段、几丁质酶酶解阶段。

3.根据权利要求2所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述磷脂酶单独作为对干菌体酶解的一个阶段；或，与葡聚糖酶、蛋白酶、几丁质酶中的一种酶复配酶解；

优选地，所述磷脂酶与几丁质酶或葡聚糖酶复配酶解。

4.根据权利要求3所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述葡聚糖酶的酶解阶段中，以干菌体计，所述葡聚糖酶的添加量之和为1-5％；体系pH为4.5-6.5；

和/或，所述蛋白酶酶解阶段中，以干菌体计，所述蛋白酶的添加量3-8％；体系pH为5-8；

和/或，所述几丁质酶酶解阶段中，以干菌体计，所述几丁质酶的添加量为3-8％；体系pH为6-7.5；

和/或，所述磷脂酶酶解时，其添加量为1-5％；当其单独酶解时，体系pH为3-6；

和/或，所述酶解破壁还包括果胶酶酶解。

5.根据权利要求4所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述酶解破壁包括下述阶段：

所述葡聚糖酶酶解阶段，以干菌体计，所述β-葡聚糖酶和所述磷脂酶的添加量之和为1-5％，体系pH为4.5-6.5；

所述蛋白酶酶解阶段，以干菌体计，所述蛋白酶的添加量3-8％；体系pH为5-8；

所述几丁质酶酶解阶段，以干菌体计，所述几丁质酶和所述磷脂酶的添加量为3-10％，体系pH为6-7.5。

6.根据权利要求5所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，控制所述葡聚糖酶酶解阶段、蛋白酶酶解阶段的体系的温度为40-60℃；

和/或，控制所述几丁质酶酶解阶段的体系的温度为30-45℃。

7.根据权利要求1-6任一所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，在所述酶解破壁前，对干菌体进行干法破碎处理，且至质量分数90％的干菌体的粒径不大于300μm。

8.根据权利要求7所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，对破碎后的干菌体进行复水剪切处理，并至质量分数50％的干菌体的粒径不大于80μm，及质量分数90％的干菌体的粒径不大于220μm。

9.根据权利要求1所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述微生物为双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母、高山被孢霉或三孢布拉霉。

10.权利要求1-9任一所述微生物油脂无溶剂提取方法获得的微生物功能脂质。

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