CN112500504A - 一种肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法，岩藻聚糖硫酸酯，由岩藻糖和半乳糖构成；其主链由1,3‑,1,4‑,1,3,4‑α‑L‑Fucp及1,3‑,1,6‑β‑D‑Galp构成，硫酸基团位于岩藻糖片段1,3‑α‑L‑Fucp的C‑4位、1,4‑α‑L‑Fucp的C‑3位及半乳糖片段1,3‑β‑D‑Galp的C‑6位、1,6‑β‑D‑Galp的C‑3位，支链由硫酸化岩藻寡糖Fuc2SO3、Fuc2(SO3)2、Fuc3(SO3)2、Fuc3(SO3)3及硫酸化半乳岩藻寡糖FucGal(SO3)2、Fuc2Gal(SO3)2构成。本发明的岩藻聚糖硫酸酯具有肿瘤靶向性，可用于抗肿瘤药物或抗肿瘤活性物质靶向运载体系的制备。

Description

一种肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋生物多糖制备技术领域，具体来说涉及一种肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
癌症是当前危害人类健康的主要疾病之一。目前，常规的癌症治疗方法在治疗过程中往往会产生严重的副作用，不仅降低患者自身的免疫力，还可能引发一系列并发症。寻找新的、特异性强的、选择性高的抗癌疗法迫在眉睫。近年来提出的靶向给药系统主要是利用具有一定肿瘤靶向性的载体，将药物定位于靶点器官，选择性杀伤肿瘤细胞，发挥治疗作用，目前已成为国内外药剂学研究的热点。其中，纳米粒载体系统作为靶向给药系统的研究重点，受到人们的广泛关注。岩藻聚糖硫酸酯是常用的构建靶向纳米粒载体的原料之一。近年来的研究表明，岩藻聚糖硫酸酯可以靶向P-选择素，以岩藻聚糖硫酸酯为原料的纳米粒子也可靶向P-选择素。P-选择素是一种粘附分子，主要参与细胞间选择性粘附、识别，通过介导肿瘤细胞与血小板、内皮细胞的粘附促进肿瘤细胞的转移。P-选择素在多种人类肿瘤细胞和肿瘤血管系统中呈现高表达状态，将肿瘤治疗药物通过纳米粒载体靶向运输到表达P-选择素的肿瘤上，可有效发挥治疗作用。岩藻聚糖硫酸酯不仅可以靶向P-选择素，而且由于自身具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种活性，进入体内后很少引起副反应，还可以辅助所运载的活性物质发挥作用。但是目前，纳米粒子的制备多采用海带、墨角藻等来源的岩藻聚糖硫酸酯，对于其他来源的岩藻聚糖硫酸酯的研究较少。而且，对于什么样结构的岩藻聚糖硫酸酯更适合构建肿瘤靶向性运载体系并没有明确的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯，由岩藻糖和半乳糖构成；其主链由1,3-,1,4-,1,3,4-α-L-Fucp及1,3-,1,6-β-D-Galp构成，硫酸基团位于岩藻糖片段1,3-α-L-Fucp的C-4位、1,4-α-L-Fucp的C-3位及半乳糖片段1,3-β-D-Galp的C-6位、1,6-β-D-Galp的C-3位，支链由硫酸化岩藻寡糖Fuc2SO3、Fuc2(SO3)2、Fuc3(SO3)2、Fuc3(SO3)3及硫酸化半乳岩藻寡糖FucGal(SO3)2、Fuc2Gal(SO3)2构成。
第二方面，本发明提供所述具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
将羊栖菜粉末脱脂后，收集沉淀部分，晾干；
向脱脂后的羊栖菜粉末中加入CaCl2溶液处理，取上清液；
将上清液浓缩，醇沉，收集沉淀部分；
将沉淀部分复溶后采用离子交换色谱分离，然后将目标溶液浓缩、脱盐、浓缩、干燥，即得。
第三方面，本发明所述的岩藻聚糖硫酸酯具有肿瘤靶向性，可在抗肿瘤药物或抗肿瘤活性物质靶向运载体系的制备方面应用。
第四方面，所述的岩藻聚糖硫酸酯的肿瘤靶向性的测定方法，包括如下步骤：
1)制备岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子：将所述的岩藻聚糖硫酸酯与壳聚糖制备成纳米粒子，同时包裹荧光染料IR-783；
2)采用ELISA法测定纳米粒子与P-选择素的相互作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的岩藻聚糖硫酸酯来源于羊栖菜，具有肿瘤靶向性且结构新颖。本发明的岩藻聚糖硫酸酯分子量为703千道尔顿，仅由岩藻糖和半乳糖构成；所述岩藻聚糖硫酸酯的主链是由1,3-,1,4-,1,3,4-α-L-Fucp及1,3-,1,6-β-D-Galp构成，硫酸基团位于岩藻糖片段1,3-α-L-Fucp的C-4位，1,4-α-L-Fucp的C-3位及半乳糖片段1,3-β-D-Galp的C-6位，1,6-β-D-Galp的C-3位。支链由硫酸化岩藻寡糖Fuc2SO3，Fuc2(SO3)2，Fuc3(SO3)2，Fuc3(SO3)3及硫酸化半乳岩藻寡糖FucGal(SO3)2，Fuc2Gal(SO3)2构成。本发明的岩藻聚糖硫酸酯可用于抗肿瘤药物或抗肿瘤活性物质靶向运载体系的制备。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为本发明实施例1的岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子的制备图；
图2是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子红外光谱图；
图3是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子电镜测试图；
图4是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子与P-选择素结合实验测定结果；
图5是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯纯度测定的高效凝胶渗透色谱和葡聚糖标准品的分子量对数对保留时间绘制的标准曲线及其回归方程；
图6是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的单糖组成高效液相色谱图；
图7是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的1H NMR谱图；
图8是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的13C NMR谱图；
图9是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的1H-1H COSY谱图；
图10是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的1H-13C HSQC谱图；
图11是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的1H-1H NOESY谱图；
图12是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯经降解得到的寡糖组分F1 ESI-MS谱图；
图13是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯经降解得到的寡糖组分F2 ESI-MS谱图；
图14是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯经降解得到的寡糖组分F3 ESI-MS谱图；
图15是本发明所述岩藻聚糖硫酸酯经降解得到的寡糖组分F4 ESI-MS谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
第一方面，本发明提供一种具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯，由岩藻糖和半乳糖构成；其主链由1,3-,1,4-,1,3,4-α-L-Fucp及1,3-,1,6-β-D-Galp构成，硫酸基团位于岩藻糖片段1,3-α-L-Fucp的C-4位、1,4-α-L-Fucp的C-3位及半乳糖片段1,3-β-D-Galp的C-6位、1,6-β-D-Galp的C-3位，支链由硫酸化岩藻寡糖Fuc2SO3、Fuc2(SO3)2、Fuc3(SO3)2、Fuc3(SO3)3及硫酸化半乳岩藻寡糖FucGal(SO3)2、Fuc2Gal(SO3)2构成。
在一些实施例中，所述岩藻聚糖硫酸酯的分子量为703千道尔顿。
在一些实施例中，所述岩藻聚糖硫酸酯中的岩藻糖和半乳糖的摩尔百分比为73.16:26.84。
在一些实施例中，所述岩藻聚糖硫酸酯的糖基片段中1,3-α-L-Fucp、1,4-α-L-Fucp、1,3,4-α-L-Fucp、1,3-α-L-Fucp(4SO4)、1,4-α-L-Fucp(3SO4)、1,3,4-α-L-Fucp、terminal-α-L-Fucp、1,3-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp(6SO4)和1,6-β-D-Galp(3SO4)的摩尔比例为1:1.56:0.77:0.38:1.10:0.26:0.14:1.39:0.46:0.24。
第二方面，本发明提供所述具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
将羊栖菜粉末脱脂后，收集沉淀部分，晾干；
向脱脂后的羊栖菜粉末中加入CaCl2溶液处理，取上清液；
将上清液过滤后，浓缩，醇沉，收集沉淀部分；
将沉淀部分复溶后采用离子交换色谱分离，然后将目标溶液浓缩、脱盐、浓缩、干燥，即得。
在一些实施例中，羊栖菜的制备方法为：将新鲜羊栖菜洗净，除去泥沙后，40-50℃烘干，粉碎得到羊栖菜粉末。
在一些实施例中，用于脱脂的溶液为95％乙醇。
进一步的，脱脂溶液与羊栖菜粉末的体积比为20-30:1。
进一步的，脱脂的时间为20-30h，脱脂的温度为20-35℃。
进一步的，脱脂的次数为2-3次。
进一步的，脱脂完毕后，静置离心分离。
在一些实施例中，CaCl2溶液的质量百分数为1.8％-2.2％。用于去除褐藻酸钠。
进一步的，每克羊栖菜粉末中加入的CaCl2溶液的体积为20-30ml。
进一步的，向羊栖菜粉末中加入CaCl2溶液，在60-70℃下搅拌2-4h，搅拌结束静置离心，重复至少2次，合并上层清液。
在一些实施例中，上清液过滤后，将液体体积浓缩至原体积的1/10～1/20，再进行醇沉。
进一步的，用于醇沉的溶液为95％乙醇。
在一些实施例中，将沉淀部分复溶的溶剂为蒸馏水。
在一些实施例中，所述离子交换色谱为DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱。
进一步的，进行离子交换色谱分离时，依次采用蒸馏水、0.5mol/L氯化钠水溶液、1mol/L氯化钠水溶液、1.5mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，浓缩、脱盐，脱盐后的溶液浓缩、干燥，得到所述的岩藻聚糖硫酸酯。
更进一步的，所述脱盐为透析脱盐，截留分子量为10000Da。
更进一步的，所述干燥为冷冻干燥。
更进一步的，所述浓缩为减压浓缩。
第三方面，本发明所述的岩藻聚糖硫酸酯具有肿瘤靶向性，可在抗肿瘤药物或抗肿瘤活性物质靶向运载体系的制备方面应用。
第四方面，所述的岩藻聚糖硫酸酯的肿瘤靶向性的测定方法，包括如下步骤：
1)制备岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子：将所述的岩藻聚糖硫酸酯与壳聚糖制备成纳米粒子，同时包裹荧光染料IR-783；
2)采用ELISA法测定纳米粒子与P-选择素的相互作用。
在一些实施例中，步骤(1)中纳米粒子通过聚电解质自组装的方法形成，所述的壳聚糖脱乙酰度为85％，所述纳米粒子中岩藻聚糖硫酸酯与壳聚糖的体积比为0.6～1.4:1(两者质量分数相同)。
在一些实施例中，步骤(1)中的荧光染料先与岩藻聚糖硫酸酯混合溶解。
在一些实施例中，步骤(1)中的纳米粒子粒径为360-430nm，Zeta电位为26-30mV，多分散指数(PDI)为0.23-0.26。
在一些实施例中，步骤(2)中，采用ELISA法最终测定荧光度。
实施例1
具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羊栖菜洗净，除去泥沙，40-50℃过夜烘干，粉碎得到藻体粉末。取200g藻体粉末，加入4L的95％乙醇脱脂，室温下搅拌24h，重复3次。脱脂完毕后，静置离心，收集沉淀部分，自然晾干。
(2)将脱脂后的藻体粉末，加入6L 2％CaCl2溶液，60-70℃下搅拌3h，搅拌结束静置离心，重复2次，合并上层清液。
(3)将上清液超滤，截留分子量为100kDa，液体体积浓缩至原体积的1/10时，加入4倍体积的95％乙醇，醇沉，4℃静置过夜，离心，收集沉淀部分，40℃烘干，得到6.4g多糖。
(4)将(3)中所述多糖通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离，依次用蒸馏水、0.5mol/L氯化钠水溶液、1mol/L氯化钠水溶液、1.5mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，减压浓缩、透析脱盐(截留分子量为10000Da)，脱盐后的溶液减压浓缩、冷冻干燥，得到所述的岩藻聚糖硫酸酯。
(5)制备岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子：将所述的岩藻聚糖硫酸酯与壳聚糖配制成质量分数为0.1％的水溶液，其中岩藻聚糖硫酸酯水溶液中含有1mg/mL荧光染料IR-783，以体积比为0.6～1.4:1的比例，采用细胞超声破碎仪搅拌，制备纳米粒子。
(6)采用ELISA测定纳米粒子与P-选择素的相互作用。
(7)对岩藻聚糖硫酸酯的结构特点进行测试和分析，包括岩藻聚糖硫酸酯的分子量纯度分析、单糖组成分析、核磁共振波谱分析、寡糖的电喷雾质谱分析等。
(8)以下为肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的研究结果，包括其肿瘤靶向性测定和结构特点分析。
纳米粒子的红外光谱(图2)显示了壳聚糖和岩藻聚糖硫酸酯的特征吸收峰，表明壳聚糖与岩藻聚糖硫酸酯之间存在非共价相互作用，1643cm-1处为壳聚糖酰胺基C＝O的伸缩振动吸收峰，1560cm-1处为壳聚糖N-H的弯曲振动吸收峰，1250cm-1为岩藻聚糖硫酸酯硫酸基的S＝O伸缩振动吸收峰。
图3为纳米粒子透射电镜形态观察图，所述岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子呈现均匀的圆球状。
纳米粒子的肿瘤靶向性测定结果如图4所示，与空白组(牛血清白蛋白BSA组)相比，各比例的纳米粒子均与P-选择素具有相互作用，比例为1.4:1时，两者的结合作用最强。本实验研究结果表明，所述岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子可与P-选择素结合，具有肿瘤靶向性。
为探究构成所述肿瘤靶向性纳米粒子的岩藻聚糖硫酸酯的结构特点，本实施例对所述岩藻聚糖硫酸酯进行了结构解析。所述岩藻聚糖硫酸酯的单糖组成如图5所示。根据保留时间和峰面积进行计算，并与标准品进行对照，可知岩藻聚糖硫酸酯主要含有岩藻糖和半乳糖，摩尔百分比为73.16:26.84。
所述岩藻聚糖硫酸酯的纯度和分子量测定结果，如图6所示，岩藻聚糖硫酸酯出峰较为对称，说明纯度较高。根据标准曲线计算得知岩藻聚糖硫酸酯的分子量为703千道尔顿。
所述岩藻聚糖硫酸酯的糖基连接方式首先通过甲基化分析确定。脱硫前岩藻聚糖硫酸酯中岩藻糖主要由端基连接，1,3-，1,4-,1,3,4-,1,2,4-连接岩藻糖组成，半乳糖主要由1,3-,1,3,6-连接半乳糖组成，摩尔比例为3.52：13.72：21.35：30.90：1.95：19.05：9.51。脱硫后1,3-，1,4-连接岩藻糖、1,3-连接半乳糖增加，1,3,4-连接岩藻糖减少，1,2,4-连接岩藻糖、1,3,6-连接半乳糖消失，1,6-连接半乳糖出现，表明硫酸基团位于1,3-连接岩藻糖的C-4位，1,4-连接岩藻糖C-3、C-2位，1,3-连接半乳糖的C-6位，1,6-连接半乳糖的C-3位，主要位于1,4-连接岩藻糖和1,3-连接半乳糖的C-3位。
图7为所述岩藻聚糖硫酸酯的核磁共振氢谱，5.25、5.33、5.45ppm处为α-吡喃-岩藻糖端基氢信号，4.61ppm为β-吡喃-半乳糖端基氢信号。高场区1.44ppm为岩藻糖基甲基氢H-6信号，3.60-4.30ppm为糖基H-2～H-6信号。图8为所述岩藻聚糖硫酸酯核磁共振碳谱，101.01、102.01ppm为岩藻糖端基碳信号，104.36ppm为半乳糖端基碳信号，高场区17.46ppm为岩藻糖基甲基碳C-6信号，58-85ppm为糖基C-2～C-6信号。图9为所述岩藻聚糖硫酸酯的同核化学位移相关谱(1H-1H COSY)，图10为所述岩藻聚糖硫酸酯的异核单量子化学位移相关谱(1H-13C HSQC)，图11为所述岩藻聚糖硫酸酯的核欧沃豪斯效应相关谱(1H-1H NOESY)。通过图9-11，同时考虑到甲基化分析结果，可知：糖基D的异头氢信号5.25ppm与异头碳信号101.01ppm相关，其C-4处化学位移信号向低场移动，表明C-4处有连接，推断其为→4)-α-L-Fucp-(1→；糖基E的异头氢信号5.33ppm与异头碳信号101.01ppm相关，其C-3处的化学位移信号向低场移动，表明C-3处有连接，推断其为→3)-α-L-Fucp-(1→。同理，糖基F/G/H的异头氢信号与异头碳信号102.01ppm相关，其C-3,C-4处的化学位移信号向低场移动，表明糖基F/G/H为双取代岩藻糖基，推断其分别为→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→,→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→以及→3,4)-α-L-Fucp-(1→。糖基A/B/C的异头氢信号与异头碳信号104.36ppm相关，其C-3,C-6处的化学位移信号向低场移动，推断其分别为→3)-β-D-Galp-(1→,→6)-β-D-Galp(3SO4)-(1→,→3)-β-D-Galp(6SO4)-(1→。根据1H-1H NOESY谱，糖基D的异头氢信号与糖基C,E的H-3信号，糖基H的H-4信号相关，表明存在以下连接方式：→4)-α-L-Fucp-(1→3)-β-D-Galp(6SO4)-(1→,→4)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→和→4)-α-L-Fucp-(1→4,3)-α-L-Fucp-(1→。相关信号D(H1)/A(H3),F(H3),G(H4),H(H3)的存在表明存在以下连接方式→4)-α-L-Fucp-(1→3)-β-D-Galp-(1→,→4)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→,→4)-α-L-Fucp-(1→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→和→4)-α-L-Fucp-(1→3,4)-α-L-Fucp-(1→。此外，相关信号E(H1)/A(H3),F(H3),G(H4),H(H3)的存在，表明→3)-α-L-Fucp-(1→3)-β-D-Galp-(1→,→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→,→3)-α-L-Fucp-(1→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→和→3)-α-L-Fucp-(1→3,4)-α-L-Fucp-(1→可能存在。相关信号F/G/H(H1)/A(H3)的存在表明存在以下连接片段→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→3)-β-D-Galp-(1→,→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→3)-β-D-Galp-(1→和→3,4)-α-L-Fucp-(1→3)-β-D-Galp-(1→。相关信号A/B/C(H1)/F(H3),G(H4),H(H3)表明存在以下糖基连接片段→3)-β-D-Galp-(1→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→,→3)-β-D-Galp(6SO4)-(1→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→,→6)-β-D-Galp(3SO4)-(1→3)-α-L-Fucp(4SO4)-(1→,→3)-β-D-Galp-(1→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→,→3)-β-D-Galp(6SO4)-(1→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→,→6)-β-D-Galp(3SO4)-(1→4)-α-L-Fucp(3SO4)-(1→,→3)-Galp-(1→3,4)-α-L-Fucp-(1→,→3)-Galp(6SO4)-(1→3,4)-α-L-Fucp-(1→和→6)-β-D-Galp(3SO4)-(1→3,4)-α-L-Fucp-(1→。相关信号A/C(H1)/B(H6)表明表明存在→3)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp(3SO4)-(1→和→3)-β-D-Galp(6SO4)-(1→6)-β-D-Galp(3SO4)-(1→。
为了进一步研究肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的结构特点，对岩藻聚糖硫酸酯进行了酸降解。对降解得到的寡糖片段采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。岩藻聚糖硫酸酯硫酸酯的降解：将岩藻聚糖硫酸酯用0.1mol/L的HCl溶液配制成1％的水溶液，80℃反应6小时。降解产物以氢氧化钠水溶液中和，降解产物透析浓缩后加入2倍体积的95％乙醇，醇沉，将上清液减压浓缩，冻干。采用凝胶柱Bio-Gel P4分离纯化，所得寡糖组分分别命名为F1-F4。图12-15为寡糖组分F1-F4的ESI-MS谱图，F1为硫酸化单糖，包括硫酸化岩藻单糖FucSO3和硫酸化半乳单糖GalSO3。F2为硫酸化单糖与二糖的混合物，包括硫酸化岩藻单糖FucSO3，硫酸化岩藻二糖Fuc2SO3，硫酸化岩藻半乳二糖FucGalSO3，二硫酸化岩藻二糖Fuc2(SO3)2，二硫酸化岩藻半乳二糖FucGal(SO3)2，F3为硫酸化岩藻三糖，包括三硫酸化岩藻三糖Fuc3(SO3)3和二硫酸化岩藻三糖Fuc3(SO3)2。综上所述，肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的支链由硫酸化岩藻寡糖和硫酸化半乳岩藻寡糖构成。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：由岩藻糖和半乳糖构成；其主链由1,3-、1,4-、1,3,4-α-L-Fucp及1,3-、1,6-β-D-Galp构成，硫酸基团位于岩藻糖片段1,3-α-L-Fucp的C-4位、1,4-α-L-Fucp的C-3位及半乳糖片段1,3-β-D-Galp的C-6位、1,6-β-D-Galp的C-3位，支链由硫酸化岩藻寡糖Fuc2SO3、Fuc2(SO3)2、Fuc3(SO3)2、Fuc3(SO3)3及硫酸化半乳岩藻寡糖FucGal(SO3)2、Fuc2Gal(SO3)2构成。
2.根据权利要求1所述的具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯的分子量为703千道尔顿。
进一步的，所述岩藻聚糖硫酸酯中的岩藻糖和半乳糖的摩尔百分比为73.16:26.84；
进一步的，所述岩藻聚糖硫酸酯的糖基片段中1,3-α-L-Fucp、1,4-α-L-Fucp、1,3,4-α-L-Fucp、1,3-α-L-Fucp(4SO4)、1,4-α-L-Fucp(3SO4)、1,3,4-α-L-Fucp、terminal-α-L-Fucp、1,3-β-D-Galp、1,3-β-D-Galp(6SO4)和1,6-β-D-Galp(3SO4)的摩尔比例为1:1.56:0.77:0.38:1.10:0.26:0.14:1.39:0.46:0.24。
3.权利要求1或2所述具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
将羊栖菜粉末脱脂后，收集沉淀部分，晾干；
向脱脂后的羊栖菜粉末中加入CaCl2溶液处理，取上清液；
将上清液浓缩，醇沉，收集沉淀部分；
将沉淀部分复溶后采用离子交换色谱分离，然后将目标溶液浓缩、脱盐、浓缩、干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：羊栖菜的制备方法为：将新鲜羊栖菜洗净，除去泥沙后，40-50℃烘干，粉碎得到羊栖菜粉末。
5.根据权利要求3所述的具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：用于脱脂的溶液为90％-98％的乙醇溶液，优选为95％乙醇；
进一步的，脱脂溶液与羊栖菜粉末的体积比为20-30:1；
进一步的，脱脂的时间为20-30h，脱脂的温度为20-35℃；
进一步的，脱脂的次数为2-3次；
进一步的，脱脂完毕后，静置离心分离。
6.根据权利要求3所述的具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：CaCl2溶液的质量百分数为1.8％-2.2％；
进一步的，每克羊栖菜粉末中加入的CaCl2溶液的体积为20-30ml；
进一步的，向羊栖菜粉末中加入CaCl2溶液，在60-70℃下搅拌2-4h，搅拌结束静置离心，重复至少2次，合并上层清液。
7.根据权利要求3所述的具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：上清液过滤后，将液体体积浓缩至原体积的1/10～1/20，再进行醇沉；
进一步的，将沉淀部分复溶的溶剂为蒸馏水。
8.根据权利要求3所述的具有肿瘤靶向性岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：所述离子交换色谱为DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱；
进一步的，进行离子交换色谱分离时，依次采用蒸馏水、0.5mol/L氯化钠水溶液、1mol/L氯化钠水溶液、1.5mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，浓缩、脱盐，脱盐后的溶液浓缩、干燥，得到所述的岩藻聚糖硫酸酯；
更进一步的，所述脱盐为透析脱盐，截留分子量为10000Da；
更进一步的，所述干燥为冷冻干燥；
更进一步的，所述浓缩为减压浓缩。
9.权利要求1或2所述的岩藻聚糖硫酸酯具有肿瘤靶向性，可在抗肿瘤药物或抗肿瘤活性物质靶向运载体系的制备方面应用。
10.权利要求1或2所述的岩藻聚糖硫酸酯的肿瘤靶向性的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)制备岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子：将所述的岩藻聚糖硫酸酯与壳聚糖制备成纳米粒子，同时包裹荧光染料IR-783；
2)采用ELISA法测定纳米粒子与P-选择素的相互作用；
在一些实施例中，步骤(1)中纳米粒子通过聚电解质自组装的方法形成，所述的壳聚糖脱乙酰度为85％，所述纳米粒子中岩藻聚糖硫酸酯与壳聚糖的体积比为0.6～1.4:1；
在一些实施例中，步骤(1)中的荧光染料先与岩藻聚糖硫酸酯混合溶解；
在一些实施例中，步骤(1)中的纳米粒子粒径为360-430nm，Zeta电位为26-30mV，多分散指数为0.23-0.26；
在一些实施例中，步骤(2)中，采用ELISA法最终测定荧光度。
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