CN112480242A - Spink7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 - Google Patents

Spink7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及SPINK7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，所述SPINK7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明为预防和/或治疗溃疡性结肠炎提供了一种新方法，并且由于SPINK7蛋白是人体内源性蛋白，其对人体可能的副作用很小，作为潜在的药物安全性高。因此，SPINK7蛋白、含有编码所述SPINK7蛋白的核酸分子的重组载体、重组微生物或转基因细胞系能够用于预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物，在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物、试剂盒中具有重要的应用价值。

Description

SPINK7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及SPINK7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)，是一类病因不明的慢性经过、反复发作的肠道炎症反应性疾病。近年来，IBD的发病趋势上升，已逐渐成为消化系统中的常见病。作为慢性病，IBD很难彻底治愈。溃疡性结肠炎病变主要位于结肠的黏膜层，以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，其主要临床症状表现为腹痛、腹泻、血性黏液便和体重减轻等，病理可见直肠、结肠等部位出现广泛脓肿、溃疡，大量炎症细胞在黏膜层和黏膜下层浸润。其治疗目标为减轻临床症状，促进肠道黏膜愈合，同时防止相关并发症的产生，改善患者生活质量，防止复发。临床常用药物治疗包括氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和抗体类生物制剂等，多因不良反应、毒副作用的影响效果受限。临床防治溃疡性结肠炎亟待更有效、安全的药物。
Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子7(Serine protease inhibitor kazal type 7,SPINK7)又名食管癌相关基因2(Esophageal cancer-related gene 2,ECRG2)，是最初由我国学者从食管组织克隆并鉴定出来的一个食管癌候选抑癌基因。SPINK7由258个碱基编码，翻译成含85个氨基酸的9.23KD大小的蛋白产物，可分泌到胞外，其氨基酸序列在任、小鼠、大鼠等哺乳动物高度保守。SPINK7蛋白在食管上皮、口腔黏膜等呈组成性表达，也表达于银屑病、湿疹等免疫性疾病的皮损区域。研究发现，SPINK7在调节细胞增殖与凋亡，迁移与侵袭，过敏性反应等事件中有重要作用，但其发挥作用的机制尚不完全清楚。
然而，目前尚未见报道SPINK7蛋白在溃疡性结肠炎这类疾病中的作用和机制的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种SPINK7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用，所述应用对预防和/或治疗溃疡性结肠炎更加有效、安全，为预防和/或治疗溃疡性结肠炎提供一种新的治疗策略。
本发明的技术方案是发现一种预防和/或治疗炎症性肠病的药物，其主要活性成分是SPINK7蛋白。
本发明还提供了一种产品，其包含治疗有效量的SPINK7蛋白，所述产品用于预防和/或治疗炎症性肠病。
所述产品可为药物、试剂盒。
本发明所述的SPINK7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：MKITGGLLLLCTVVYFCSSSEAASLSPKKVDCSIYKKYPVVAIPCPITYLPVCGSDYITYGNECHLCTESLKSNGRVQFLHDGSC。
编码所述SPINK7蛋白的核苷酸，其序列如SEQ ID No.2所示：atgaagatcactgggggtctccttctgctctgtacagtggtctatttctgtagcagctcagaagctgctagtctgtctccaaaaaaagtggactgcagcatttacaagaagtatccagtggtggccatcccctgccccatcacatacctaccagtttgtggttctgactacatcacctatgggaatgaatgtcacttgtgtaccgagagcttgaaaagtaatggaagagttcagtttcttcacgatggaagttgctaa。
含有编码所述SPINK7蛋白的核酸分子的重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
序列如SEQ ID No.1所示氨基酸的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质，以及将如SEQ ID No.1所示所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质，同样可以用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物。
本领域的技术人员应该理解，本发明所述的产品可以局部给药到炎症性肠病的损伤病变区域，也可以通过口服、静脉注射、肌肉注射等常规方式施用。
在使用本发明所述产品时，可以与其他预防和/或治疗炎症性肠病的制剂同时、或间隔一定时间进行施用。
本发明所述“治疗有效量”是指常用量，是临床常用的有效剂量范围，为介于最小有效量和极量之间的量。
有益效果：
申请人的实验验证，在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中，SPINK7转录水平、蛋白水平显著升高；采用SPINK7敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠制备DSS诱导的溃疡性结肠炎模型发现：SPINK7敲除小鼠溃疡性结肠炎严重程度显著高于对照野生型小鼠，其肠黏膜损伤程度显著加重；SPINK7慢病毒稳定感染的Raw264.7克隆经Western blot检测显示能够在蛋白水平高表达SPINK7，能够显著抑制LPS刺激下CXCL1、CCL3、CCL4、IL-1β、IL-6和OSM等炎症分子的表达。这些结果表明SPINK7蛋白可作为防治炎症性肠病的新的更有效的药物。本发明为预防和/或治疗溃疡性结肠炎提供了一种新方法，并且由于SPINK7蛋白是人体内源性蛋白，其对人体可能的副作用很小，作为潜在的药物安全性高。因此，SPINK7蛋白、含有编码所述SPINK7蛋白的核酸分子的重组载体、重组微生物或转基因细胞系能够用于预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物，在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物、试剂盒中具有重要的应用价值。
附图说明：
图1是SPINK7在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型中表达变化情况，其中，图1A是定量PCR检测2.0％DSS诱导后第7天SPINK7在结肠组织的表达，图1B是免疫组化显示2.0％DSS诱导后第7天SPINK7在结肠组织的表达定位情况。
图2是DSS诱导下两组动物体重变化的比较。
图3是DSS诱导下两组动物炎症性肠病DAI评分的比较。
图4是DSS诱导7天后两组动物结肠长度的比较。
图5是两组动物不造模时肠道形态学图片。
图6是两组动物DSS造模7天后肠道形态学图片。
图7是两组动物的结肠病理组织学评分结果。
图8是SPINK7慢病毒感染Raw264.7小鼠巨噬细胞的稳定克隆经Western blot检测显示能偶高表达SPINK7蛋白。
图9是SPINK7在Raw264.7小鼠巨噬细胞的高表达能够显著抑制LPS刺激的CXCL1、CCL3、CCL4、IL-1β、IL-6和OSM等炎症相关分子的上调表达。
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明进行具体的描述，需要指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。本发明中未明确记载的实验步骤和条件，均采用常规的实验步骤和条件。
本发明除说明具体来源的其他试剂，均采用市售的分析纯或生物级产品。
实施例1：SPINK7在溃疡性结肠炎结肠组织的表达
1.1实验方法：
动物：SPF级C57BL/6小鼠，6-8周龄，16只，购自中国人民解放军陆军军医大学实验动物中心。
葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)给药：DSS(分子量36000-50000)采用MP公司产品，配制2.0％浓度，取8只小鼠以自由饮用方式给药，每2天更换1次，连续饮用7天，制备DSS诱导的炎症性肠病模型。另外8只常规正常饮水处理作为对照组。
取材：小鼠每天称重，在第7天脱颈椎处死后，立即取结肠组织，部分用液氮冻存处理后置于-80℃冰箱保存，部分以4％多聚甲醛固定后常规制备蜡块。
Q-PCR检测结肠组织中SPINK7 mRNA的相对表达情况：冻存结肠组织取出后加入1ml的trizol裂解液(Invitrogen)进行充分匀浆处理，常规方法提取组织的总RNA。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(宝生物公司)逆转录处理后进行荧光定量PCR检测SPINK7的表达情况。引物信息如下：SPINK7 F:TAGCCACCCTTCAGCAACAG(SEQ ID No.3)，SPINK7 R:ACTGGATTTTTCCATTGCTTCTCA(SEQ ID No.4)；TBP F：AAGGGAGAATCATGGACCAG(SEQ ID No.5)，TBP R：CCGTAAGGCATCATTGGACT(SEQ ID No.6)。以TBP基因为内参，结果以SPINK7在炎症性肠病组织的表达是对照正常结肠组织的多少倍来表示。
免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测结肠组织中SPINK7蛋白表达情况：结肠组织蜡块以5μm连续切片，用于SPINK7蛋白免疫组化染色。
1.2实验结果：
小鼠以DSS处理后体重下降明显，定量PCR显示SPINK7在DSS处理第7天表达显著升高，达对照组的30余倍(***,P<0.001)(参见图1A)。病理切片后的HE染色可见，炎症性肠病组固出现明显溃疡，固有层有大量炎症细胞浸润；SPINK7的免疫组化染色可见大量阳性细胞(黑色染色)(参见图1B)。
实施例2：SPINK7蛋白对炎症性肠病的影响
2.1实验方法：
动物：SPINK7敲除小鼠(SPINK7-/-)及相应的对照野生型小鼠(wild type，WT)，每组8-10只。SPINK7敲除小鼠引种自赛业生物科技公司，在中国人民解放军陆军军医大学实验动物中心繁育。
DSS给药：方法同前。
体重测定：从正式实验开始的第一天起，每天上午10点钟进行体重测量，连续7天。
疾病活动度指数(disease activity index，DAI)评分测定：实验期间，每天记录小鼠体质量变化、粪便性状及便血情况，进行疾病活动度指数(DAI)评分的测定。DAI由体重减失率分数，大便性状分数和便血分数相加而得，分值在0～12之间。评分标准如下：1)体重减失率评分：体重无减轻，0分；减轻1％～4％，1分；减轻5％～9％，2分；减轻10％～14％，3分；减轻15％～20％，4分。2)大便性状评分：正常，0分；松散，1分；半成形稀，2分；不成形稀，3分；水样泄，4分。3)大便便血评分：便血阴性(－)，0分；便血弱阳性(+)，1分；便血阳性(++)，2分；便血强阳性(+++)，3分；肉眼可见血便，4分。
结肠长度测定：在DSS处理第7天脱颈椎处死小鼠后，取其结肠部分，放置在白色纸张上，用直尺量取长度，记录下来，以结肠长度作为一个方面来反应疾病严重程度。
结肠病理学切片及组织学评分：实验小鼠处死后，取全部结肠制备卷肠，石蜡包埋，切片4～5μm，常规二甲苯、各级乙醇、蒸馏水脱蜡至水；HE染色。苏木素染核，伊红染胞浆；中性树脂封片，光学显微镜观察病理组织学变化。结肠切片组织学评分标准分为黏膜炎细胞浸润、隐窝损伤和溃疡3个方面。炎症浸润(0-5)：0分：无浸润；1分，少量细胞局限于黏膜下层；2分：大量炎症细胞在黏膜下层；3分：黏膜下层和固有层都有炎症细胞浸润；4分：大量炎症细胞浸润出现在黏膜下层、固有层和血管周围；5分：炎症细胞穿透整个黏膜。隐窝损伤评分(0-4)：0分：无损伤；1分：少量损伤，隐窝之间有间隙；2分：隐窝之间存在大量间隙、杯状细胞丢失并有隐窝缩短；3分：大量隐窝丢失；4分：无隐窝。溃疡评分(0-3)：0分：无溃疡；1分：少量小的溃疡；2分：大量小的溃疡；3分：上皮层大量缺失。
2.2实验结果：
给DSS前，两组小鼠的体重相当。在DSS诱导下，小鼠体重明显下降；与对照野生型小鼠相比，SPINK7敲除小鼠的体重下降更加明显(图2，*P<0.05；**P<0.01)。
在DSS诱导下，根据体重、粪便、肛门出血情况进行疾病活动度指数(DAI)的综合评分，发现SPINK7敲除小鼠炎症性肠病严重程度显著高于对照野生型小鼠(图3，**P<0.01；***P<0.001)。
取材DSS诱导后第7天的结肠进行长度测量，结果显示SPINK7敲除小鼠的结肠长度显著短于对照野生组小鼠(图4，**P<0.01)。
病理形态学检测显示，在未给予DSS诱导的情况下，SPINK7敲除小鼠与对照野生小鼠未见明显差别(图5)；在给予DSS诱导7天后，SPINK7敲除小鼠结肠损伤明显严重(图6，黑线标识明显溃疡区域)，进一步组织病理学评分结果表明，SPINK7敲除小鼠炎性浸润、溃疡和隐窝损伤相关评分均显著高于野生对照组小鼠(图7，*P<0.05)。
实施例3：SPINK7对巨噬细胞炎症反应的影响
3.1实验方法：
细胞：小鼠巨噬细胞Raw264.7(购自ATCC)以含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(Gibco)培养。
SPINK7慢病毒感染稳定克隆筛选：
将Raw264.7细胞种板过夜，然后将构建并纯化的慢病毒lenti-CMV和lenti-SPINK7(金斯瑞生物科技有限公司)以MOI(感染复数)20对细胞进行感染。24h后换成新鲜培养基，继续培养48h。然后以嘌呤霉素(碧云天公司)进行单克隆筛选，7天后挑取单克隆扩大培养，进行后续实验。
Western blot检测SPINK7在Raw264.7细胞的表达：
建立稳定感染SPINK7慢病毒的Raw264.7细胞后，以Lysis M(Roche)提取其与对照细胞的总蛋白，行SDS-PAGE电泳后进行转膜，以兔来源的SPINK7抗体(Abcam)进行孵育，检测SPINK7在Raw264.7细胞的表达情况；β-actin蛋白作为内参照。
脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞的炎症模型：
慢病毒高表达SPINK7的Raw264.7细胞和空白对照细胞分别以5×105个细胞/孔的量接种到6孔板内，过夜培养。然后以终浓度为1ug/ml的LPS(Sigma公司)对细胞进行刺激制备炎症模型，在LPS作用的0h、4h和24h吸弃上清，以1ml trizol裂解细胞。
Q-PCR检测炎症相关分子的相对表达情况：前述trizol裂解的细胞按常规方法提取细胞的总RNA。进行荧光定量PCR的检测，方法同前。
相关引物信息如表所示：
CXCL1 F:CTGGGATTCACCTCAAGAACATC(SEQ ID No.7)，CXCL1 R:CAGGGTCAAGGCAAGCCTC(SEQ ID No.8)；CCL3 F:CATATGGAGCTGACACCCCG(SEQ ID No.9),CCL3 R:GTCAGGAAAATGACACCTGGC(SEQ ID No.10)；CCL4 F:CACCATGAAGCTCTGCGTGTC(SEQID No.11),CCL4 R:GCAGGAAGTGGGAGGGTCAG(SEQ ID No.12)；IL-1βF:TCTCGCAGCAGCACATCA(SEQ ID No.13),IL-1βR:CACACACCAGCAGGTTAT(SEQ ID No.14)；IL-6F:TGGGAAATCGTGGAAATGAG(SEQ ID No.15),IL-6R:CTCTGAAGGACTCTGGCTTTG(SEQ ID No.16)；OSM F:GCTCCAACTCTTCCTCTCAGC(SEQ ID No.17),OSM R:CAGGTGTGTTCAGGTTTTGG(SEQ IDNo.18)。以TBP基因为内参，结果以炎症分子是对照组0h表达的多少倍来表示。
3.2实验结果：
SPINK7慢病毒稳定感染的Raw264.7克隆经Western blot检测显示能够在蛋白水平高表达SPINK7(图8)。
以LPS刺激SPINK7高表达的Raw264.7细胞和其对照细胞后，检测炎症相关的趋化因子与细胞因子的表达，显示SPINK7高表达能够显著抑制CXCL1、CCL3、CCL4、IL-1β、IL-6和OSM等分子的表达(图9，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> SPINK7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
<141> 2020-12-04
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 85
<212> PRT
<213> SPINK7蛋白(Spink7 protein)
<400> 1
Met Lys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Cys Thr Val Val Tyr Phe
1 5 10 15
Cys Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Pro Lys Lys Val Asp Cys
20 25 30
Ser Ile Tyr Lys Lys Tyr Pro Val Val Ala Ile Pro Cys Pro Ile Thr
35 40 45
Tyr Leu Pro Val Cys Gly Ser Asp Tyr Ile Thr Tyr Gly Asn Glu Cys
50 55 60
His Leu Cys Thr Glu Ser Leu Lys Ser Asn Gly Arg Val Gln Phe Leu
65 70 75 80
His Asp Gly Ser Cys
85
<210> 2
<211> 258
<212> DNA
<213> SPINK7蛋白(Spink7 protein)
<400> 2
atgaagatca ctgggggtct ccttctgctc tgtacagtgg tctatttctg tagcagctca 60
gaagctgcta gtctgtctcc aaaaaaagtg gactgcagca tttacaagaa gtatccagtg 120
gtggccatcc cctgccccat cacataccta ccagtttgtg gttctgacta catcacctat 180
gggaatgaat gtcacttgtg taccgagagc ttgaaaagta atggaagagt tcagtttctt 240
cacgatggaa gttgctaa 258
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> SPINK7 F(SPINK7 F)
<400> 3
tagccaccct tcagcaacag 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> SPINK7 R(SPINK7 R)
<400> 4
actggatttt tccattgctt ctca 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> TBP F(TBP F)
<400> 5
aagggagaat catggaccag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> TBP R(TBP R)
<400> 6
ccgtaaggca tcattggact 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> CXCL1 F(CXCL1 F)
<400> 7
ctgggattca cctcaagaac atc 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> CXCL1 R(CXCL1 R)
<400> 8
cagggtcaag gcaagcctc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> CCL3 F(CCL3 F)
<400> 9
catatggagc tgacaccccg 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> CCL3 R(CCL3 R)
<400> 10
gtcaggaaaa tgacacctgg c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> CCL4 F(CCL4 F)
<400> 11
caccatgaag ctctgcgtgt c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> CCL4 R(CCL4 R)
<400> 12
gcaggaagtg ggagggtcag 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> IL-1β F(IL-1β F)
<400> 13
tctcgcagca gcacatca 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> IL-1β R(IL-1β R)
<400> 14
cacacaccag caggttat 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-6 F(IL-6 F)
<400> 15
tgggaaatcg tggaaatgag 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> IL-6 R(IL-6 R)
<400> 16
ctctgaagga ctctggcttt g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> OSM F(OSM F)
<400> 17
gctccaactc ttcctctcag c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> OSM R(OSM R)
<400> 18
caggtgtgtt caggttttgg 20

Claims (6)

1.SPINK7蛋白、含有编码所述SPINK7蛋白的核酸分子的重组载体、重组微生物和/或转基因细胞系在制备治疗预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SPINK7蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.一种产品，包含预防和/或治疗溃疡性结肠炎有效量的SPINK7蛋白。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述的产品为药物或试剂盒。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述SPINK7蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
6.编码SPINK7蛋白的核苷酸，其特征在于：该核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
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