CN112469729A - 镇痛剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有交替立体化学的肽。特别地，本发明涉及在前四个氨基酸残基中包含(LDLD)的交替立体化学的肽。本发明还考虑了具有交替立体化学的肽在治疗疼痛中的用途。
Description
本申请要求于2018年5月31日提交的题为“Analgesics and Methods of UseThereof”的澳大利亚临时申请No.2018901944的权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文。本说明书包括28幅图，其中一些包含多个部分。
技术领域
本发明涉及具有交替立体化学(alternating stereochemistry)的肽。特别地，本发明涉及在前四个氨基酸残基中包含(LDLD)的交替立体化学的肽。本发明还考虑了具有交替立体化学的肽在治疗疼痛中的用途。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论绝不应被认为是承认该现有技术是本领域周知的或形成本领域公知常识的一部分。
短生物活性肽(4-50个残基)因其选择性和新药理特性二者而显示出巨大的希望。自从1970年代发现相对非选择性的阿片肽脑啡肽(enkephalin)和内啡肽(endorphin)以来，还发现了其它推定的内源性配体，包括四肽内吗啡肽(endomorphin)，相对于相关κ阿片(KOPr)和δ阿片(DOPr)亚型，其选择性地靶向μ阿片受体(MOPr)。大自然还在递送分离自蛙皮肤的七肽皮啡肽(dermorphin)和deltorphin II中发挥了发现作用，其分别为MOPr和DOPr的有效的选择性激动剂；有趣的是，二者都在第二个位置包含D-丙氨酸(Kreil,G.,InAntimicrobial peptides.Ciba Foundation Symposium,第186期,第77-90页.1994)。使用类似策略对哺乳动物阿片肽的合成修饰还提供了增强的生物稳定性和受体选择性。例如，引入D-丙氨酸使脑啡肽针对蛋白酶解稳定，并且在其C-末端附近的进一步取代产生了高度稳定的选择性MOPr激动剂，例如DAMGO([D-Ala2,N-MePhe4,Gly5-ol]-脑啡肽)。尽管已经从自然界分离了或开发了对阿片受体类型具有高亲和力和选择性的阿片肽激动剂和类似物，但迄今为止研究的所有已知有效内源性和合成阿片肽均或多或少地是无偏倚的或抑制蛋白(arrestin)偏倚性的，并且均产生强力的MOPr内化(例如Thompson GL等人(2015)Molecular Pharmacology 88:335-346)。最近报道了环状肽的一个实例是G偏倚性的(Piekielna-Ciesielska J等人(2018)Peptides 101:227-233。
MOPr处的激动剂是用于控制疼痛的极其重要的药物，但是使用它们通常会导致不良作用，包括呼吸抑制、便秘和耐受性。还具有滥用MOPr激动剂的可能。偏倚性激动描述了G蛋白偶联受体(GPCR)激动剂差异性地激动GPCR以偶联至不同的下游信号传导途径的能力。相对于β-抑制蛋白募集差异性地通过G蛋白进行信号传导的偏倚性阿片样物质引起了越来越多的关注，因为β-抑制蛋白募集的缺失可以改善副作用谱。例如，在β-抑制蛋白-2敲除小鼠中吗啡的镇痛作用得到增强和延长，而吗啡诱导的呼吸抑制和急性便秘减弱(Raehal,K.等人,Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 314,第3期(2005):1195-1201)。类似地，与吗啡相比，小鼠和大鼠中的有效镇痛剂G蛋白偏倚性MOPr激动剂奥塞利定(oliceridine)(TRV130)产生较少的呼吸抑制和胃肠道功能障碍(DeWire,S.等人,Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 344,第3期(2013):708-717)。与吗啡相比，奥塞利定在等效镇痛剂量下显示出降低的呼吸受损(Singla,N.等人,Journal of Pain Research 10(2017):2413)。降低的呼吸抑制可在超剂量的情况下提供改善的安全性，潜在降低了阿片样药物超剂量的发病率和死亡率负担，阿片样药物超剂量目前在许多辖区处于流行病比例。因此，需要开发具有较少的与经典阿片样物质如吗啡相关的不良作用的新镇痛剂。
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代方案。
发明内容
尽管已经在脊椎动物和许多其它动物中鉴定出阿片样物质家族，但在较低等的真核生物中尚未鉴定出与阿片样物质相关的肽。本发明涉及从澳大利亚青霉菌属物种的河口分离株MST-MF667中分离的四肽FvVf-OH(指定为Bilaid A)、FvVy-OH(指定为Bilaid B)和YvVf-OH(指定为Bilaid C)以及这些肽的衍生物，MST-MF667最初被报道为澳大利亚海洋来源的Penicillium bilaii。这些肽都具有四个氨基酸残基的交替立体化学(LDLD)。
在第一方面，本发明提供了分离的肽，包含式I
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
在本发明第一方面的一个实施方案中，
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
可以任选地被糖基化的L-氨基酸残基包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。
根据本发明第一方面的肽包括其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第一方面的肽包括其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第一方面的肽，其中R8是1个L-氨基酸残基的肽，其中所述L-氨基酸残基优选地是可以任选糖基化的残基。
在根据本发明第一方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第一方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第一方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
在某些实施方案中，在根据本发明第一方面的肽中，R6是氨基酸的侧链和/或R7是氨基酸的侧链。在某些实施方案中，R6是苏氨酸的侧链和/或R7是苏氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6或R7之一是苏氨酸的侧链，并且R6或R7之一是缬氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6和R7都是苏氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6是缬氨酸的侧链和/或R7是缬氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6和R7都是缬氨酸的侧链。
优选地，在根据本发明第一方面的肽中，R1和R2是氢。
在第二方面，本发明提供了包含式I的分离的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
在本发明第二方面一个实施方案中，
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
可以任选地被糖基化的L-氨基酸残基包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。
根据本发明第二方面的肽包括其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第二方面的肽包括其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第二方面的肽，其中R8是1个L-氨基酸残基的肽，其中所述L-氨基酸残基优选地是可以任选糖基化的残基。
在根据本发明第二方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第二方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第二方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第二方面的肽中，R1和R2是氢。
在第三方面，本发明提供了包含式I的分离的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；并且
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
在本发明第三方面的一个方案中，
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；并且
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第三方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第三方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第三方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第三方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第三方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
在某些实施方案中，在根据本发明第三方面的肽中，R6是氨基酸的侧链和/或R7是氨基酸的侧链。在某些实施方案中，R6是苏氨酸的侧链和/或R7是苏氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6或R7之一是苏氨酸的侧链，并且R6或R7之一是缬氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6和R7都是苏氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6是缬氨酸的侧链和/或R7是缬氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6和R7都是缬氨酸的侧链。
优选地，在根据本发明第三方面的肽中，R1和R2是氢。
在第四方面，本发明提供了包含式I的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是C1-C4烷基，优选-CH(CH3)2；
R7是C1-C4烷基，优选-CH(CH3)2；并且
R8是-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第四方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第四方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第四方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第四方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第四方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第四方面的肽中，R1和R2是氢。
在第五方面，本发明提供了包含式I的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中当R1或R2之一是氢并且R1或R2之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OZ1或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z2；
Z1是C1-C6烷基或芳基，优选地Z1是-CH2CH3；
Z2是C1-C6烷基或芳基，优选地Z2是-CH3；
其中R1和R2可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)；
R3和R4是-CH3；
R5是OH；
R6是C1-C4烷基；
R7是C1-C4烷基；并且
R8是-OH、-NH2、
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第五方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第五方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第五方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第五方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第五方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第五方面的肽中，R1和R2是氢。
在第六方面，本发明提供了包含式I的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中当R1或R2之一是氢并且R1或R2之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OZ1或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z2；
Z1是C1-C6烷基或芳基，优选地Z1是-CH2CH3；
Z2是C1-C6烷基或芳基，优选地Z2是-CH3；
其中R1和R2可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)；
R3和R4是-CH3；
R5是OH；
R6是-CH(CH3)2；
R7是-CH(CH3)2；并且
R8是-OH、-NH2、
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第六方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第六方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第六方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第六方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第六方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第六方面的肽中，R1和R2是氢。
在第七方面，本发明提供了包含式I的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢；
R2是氢；
R3和R4是-CH3；
R5是OH；
R6是-CH(CH3)2；
R7是-CH(CH3)2；并且
R8是-OH、-NH2、
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第七方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第七方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在第八方面，本发明提供了包含式I的分离的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、单键或C1-C3烷基，优选氢或-CH3；
R2是氢、单键或C1-C3烷基，优选氢或-CH3；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或-O(C1-C4)烷基；
R6是氨基酸的侧链，优选缬氨酸或苏氨酸残基的侧链，或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R7是氨基酸的侧链，优选缬氨酸或苏氨酸残基的侧链，或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
1至约30个L-氨基酸残基、或接头；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化；
其中当R8是接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R1或R2之一是单键时，R1和R2之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化。
可以任选地被糖基化的L-氨基酸残基包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。
根据本发明第八方面的肽包括其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第八方面的肽包括其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第八方面的肽，其中R8是1个L-氨基酸残基的肽，其中所述L-氨基酸残基优选地是可以任选糖基化的残基。
在根据本发明第八方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第八方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第八方面的肽中，R1或R2之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
在某些实施方案中，在根据本发明第八方面的肽中，R6是氨基酸的侧链和/或R7是氨基酸的侧链。在某些实施方案中，R6是苏氨酸的侧链和/或R7是苏氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6或R7之一是苏氨酸的侧链，并且R6或R7之一是缬氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6和R7都是苏氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6是缬氨酸的侧链和/或R7是缬氨酸的侧链。在某些实施方案中，R6和R7都是缬氨酸的侧链。
在根据本发明第八方面的包含作为R8的接头的肽中，所述接头没有特别限制。合适的接头包括基于氨基酸的接头，包括但不限于单氨基酸接头，例如L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸等；基于肽的接头，包括但不限于L-缬氨酸-L-瓜氨酸、L-Phe-L-Lys、L-谷氨酸-L-缬氨酸-L-瓜氨酸等；包含氨基酸的接头，包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯(VC-PABC)等；和基于马来酰亚胺的接头，包括但不限于马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯等；以及这样的接头的组合，例如马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯，以及含氨基和羧基的接头，例如6-氨基己酸等。技术人员将理解，基于马来酰亚胺的接头可以使用L-半胱氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-半胱氨酸的硫，或者可以使用L-赖氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-赖氨酸的氮。在包含基于马来酰亚胺的接头的实施方案中，所述肽可以还包含与基于马来酰亚胺的接头(例如马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯)键合的C-末端L-半胱氨酸残基或L-赖氨酸残基。
在某些实施方案中，在根据本发明第八方面的肽中，R1和R2之一是-CH3，并且R1和R2之一是氢。
优选地，在根据本发明第八方面的肽中，R1和R2是氢。
在第九方面，本发明提供了包含式II的肽
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R10是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，
其中当R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OZ3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z4；
Z3是C1-C6烷基或芳基，优选地Z1是-CH2CH3；
Z4是C1-C6烷基或芳基，优选地Z2是-CH3；
其中R9和R10可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R14是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
可以任选地被糖基化的L-氨基酸残基包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。
根据本发明第九方面的肽包括其中R16是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第九方面的肽包括其中Y3是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第九方面的肽，其中R16是1个L-氨基酸残基的肽，其中所述L-氨基酸残基优选地是可以任选糖基化的残基。
在根据本发明第九方面的包含生物可逆部分的的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第八方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第九方面的肽中，R9或R10之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
在某些实施方案中，在根据本发明第九方面的肽中，R14是氨基酸的侧链。在某些实施方案中，R14是苏氨酸的侧链。
优选地，在根据本发明第九方面的肽中，R9和R10是氢。
在第十方面，本发明提供了包含式II的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R10是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，
其中当R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OZ3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z4；
Z3是C1-C6烷基或芳基，优选地Z1是-CH2CH3；
Z4是C1-C6烷基或芳基，优选地Z2是-CH3；
其中R9和R10可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R14是C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
可以任选地被糖基化的L-氨基酸残基包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。
根据本发明第十方面的肽包括其中R16是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第十方面的肽包括其中Y3是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第十方面的肽，其中R16是1个L-氨基酸残基的肽，其中所述L-氨基酸残基优选地是可以任选糖基化的残基。
在根据本发明第十方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第十方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第十方面的肽中，R9或R10之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第十方面的肽中，R9和R10是氢。
在第十一方面，本发明提供了包含式II的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R10是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，
其中当R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OZ3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z4；
Z3是C1-C6烷基或芳基，优选地Z1是-CH2CH3；
Z4是C1-C6烷基或芳基，优选地Z2是-CH3；
其中R9和R10可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)；
R11、R12和R13是氢；
R14是C1-C4烷基，优选-CH(CH3)2；
R15是-OH；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
Y3是-OH或-NH2；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第十一方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十一方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第十一方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第十一方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第十一方面的肽中，R9或R10之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第十一方面的肽中，R9和R10是氢。
在第十二方面，本发明提供了包含式II的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R10是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，
其中当R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OZ3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z4；
Z3是C1-C6烷基或芳基，优选地Z1是-CH2CH3；
Z4是C1-C6烷基或芳基，优选地Z2是-CH3；
其中R9和R10可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)；
R11、R12和R13是氢；
R14是-CH(CH3)2；
R15是-OH；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
Y3是-OH或-NH2；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第十二方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十二方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第十二方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第十二方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第十二方面的肽中，R9或R10之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。
优选地，在根据本发明第十二方面的肽中，R9和R10是氢。
在第十三方面，本发明提供了包含式II的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9、R10、R11、R12和R13是氢；
R14是C1-C4烷基，优选-CH(CH3)2；
R15是-OH；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
Y3是-OH或-NH2；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第十三方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十三方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在第十四方面，本发明提供了包含式II的肽，其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢、单键或C1-C3烷基，优选氢或-CH3；
R10是氢、单键或C1-C3烷基，优选氢或-CH3；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或-O(C1-C3)烷基；
R14是氨基酸的侧链，优选苏氨酸残基的侧链，或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
1至约30个L-氨基酸残基、或接头；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化；
其中当R16是接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R9或R10之一是单键时，R9或R10之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化。
可以任选地被糖基化的L-氨基酸残基包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。
根据本发明第十四方面的肽包括其中R16是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第十四方面的肽包括其中Y3是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基的肽。
根据本发明第十四方面的肽，其中R16是1个L-氨基酸残基的肽，其中所述L-氨基酸残基优选地是可以任选糖基化的残基。
在根据本发明第十四方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第十四方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在某些实施方案中，在根据本发明第十四方面的肽中，R14是氨基酸的侧链苏氨酸残基的侧链。
在某些实施方案中，在根据本发明第十四方面的肽中，R9和R10之一是-CH3，并且R9和R10之一是氢。
在根据本发明第十四方面的包含作为R16的接头的肽中，所述接头没有特别限制，并且可以是本领域中任何已知的。合适的接头包括基于氨基酸的接头，包括但不限于单氨基酸接头，例如L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸等；基于肽的接头，包括但不限于L-缬氨酸-L-瓜氨酸、L-Phe-L-Lys、L-谷氨酸-L-缬氨酸-L-瓜氨酸等；包含氨基酸的接头，包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯(VC-PABC)等；和基于马来酰亚胺的接头，包括但不限于马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯等；以及这样的接头的组合，例如马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯，以及含氨基和羧基的接头，例如6-氨基己酸等。技术人员将理解，基于马来酰亚胺的接头可以使用L-半胱氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-半胱氨酸的硫，或者可以使用L-赖氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-赖氨酸的氮。在包含基于马来酰亚胺的接头的实施方案中，所述肽可以还包含与基于马来酰亚胺的接头(例如马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸)键合的C-末端L-半胱氨酸残基或L-赖氨酸残基酯。
优选地，在根据本发明第十四方面的肽中，R9和R10是氢。
在第十五方面，本发明提供了分离的肽，包含式III
X1-X2-X3-X4
(III)
其中：
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X1是选自L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的L-氨基酸残基，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，任选地该残基在4-位以生物可逆部分进行O-取代；
X2是D-氨基酸残基，优选D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸或D-异亮氨酸，更优选D-缬氨酸；
X3是甘氨酸或L-氨基酸残基，其中当X3是L-氨基酸残基时，X3优选地是L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，更优选L-缬氨酸；
X4是选自D-酪氨酸或D-苯丙氨酸的D-氨基酸残基，其中当X4是D-酪氨酸时，任选地该残基在4-位以生物可逆部分进行O-取代；
R17和R18独立地选自氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，或者R17和R18一起形成任选地包含糖部分的生物可逆部分，并且
其中所述肽是MOPr激动剂。
根据本发明第十五方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十五方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第十五方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第十五方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。在某些实施方案中，在根据本发明第十五方面的肽中，R17或R18之一是被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。在某些实施方案中，在根据本发明第十五方面的肽中，R17和R18一起形成被糖部分、优选二糖部分糖基化的生物可逆部分。在某些实施方案中，在根据本发明第十五方面的肽中，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，该残基在4-位以生物可逆部分进行O-取代，并且此外，生物可逆部分被糖基化。
在根据本发明第十五方面的某些实施方案中，X2是D-苏氨酸残基和/或X3是L-苏氨酸残基。在某些实施方案中，X2是D-苏氨酸残基，并且X3是L-苏氨酸残基。在某些实施方案中，X2是D-苏氨酸残基并且X3是L-缬氨酸残基，或者X2是D-缬氨酸残基并且X3是L-苏氨酸残基。
优选地，在根据本发明第十五方面的肽中，R17和R18是氢。
在第十六方面，本发明提供了包含式III的肽，其中
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
R17和R18各自是氢；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X2是D-缬氨酸残基；并且
X3是甘氨酸残基或L-缬氨酸残基。
根据本发明第十六方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十六方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在第十七方面，本发明提供了包含式III的分离的肽，其中：
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
或接头的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X1是选自L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的L-氨基酸残基，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，任选地该残基在4-位以C1-C3烷基进行O-取代；
X2是D-氨基酸残基，优选D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸或D-异亮氨酸，更优选D-苏氨酸或D-缬氨酸；
X3是甘氨酸或L-氨基酸残基，其中当X3是L-氨基酸残基时，X3优选地是L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，更优选L-苏氨酸L-缬氨酸；
X4是选自D-酪氨酸或D-苯丙氨酸的D-氨基酸残基，其中当X4是D-酪氨酸时，任选地该残基在4-位以生物可逆部分进行O-取代；
R17和R18独立地选自氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；
其中当X4包含接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R17或R18之一是单键时，R17和R18之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化；并且
其中所述肽是MOPr激动剂。
根据本发明第十七方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十七方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。所述肽任选地包含另外的可以任选糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。C-末端任选地被酰胺化。
在根据本发明第十七方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分可以是本领域中任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在根据本发明第十七方面的包含生物可逆部分的肽中，生物可逆部分任选地包含糖部分，优选二糖。
在根据本发明第十七方面的某些实施方案中，X2是D-苏氨酸残基和/或X3是L-苏氨酸残基。在某些实施方案中，X2是D-苏氨酸残基，并且X3是L-苏氨酸残基。在某些实施方案中，X2是D-苏氨酸残基并且X3是L-缬氨酸残基，或者X2是D-缬氨酸残基并且X3是L-苏氨酸残基。
在根据本发明第十七方面的肽中，当X4包含接头时，所述接头没有特别限制并且可以是本领域中任何已知的。合适的接头包括基于氨基酸的接头，包括但不限于单氨基酸接头，例如L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸等；基于肽的接头，包括但不限于L-缬氨酸-L-瓜氨酸、L-Phe-L-Lys、L-谷氨酸-L-缬氨酸-L-瓜氨酸等；包含氨基酸的接头，包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯(VC-PABC)等；和基于马来酰亚胺的接头，包括但不限于马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯等；以及这样的接头的组合，例如马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯，以及含氨基和羧基的接头，例如6-氨基己酸等。技术人员将理解，基于马来酰亚胺的接头可以使用L-半胱氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-半胱氨酸的硫，或者可以使用L-赖氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-赖氨酸的氮。在包含基于马来酰亚胺的接头的实施方案中，所述肽可以还包含与基于马来酰亚胺的接头(例如马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯)键合的C-末端L-半胱氨酸残基或L-赖氨酸残基。
在根据本发明第十七方面的某些实施方案中，R17和R18之一是氢，并且R17和R18之一是-CH3。
优选地，在根据本发明第十七方面的肽中，R17和R18是氢。
在第十八方面，本发明提供了包含式IV的肽，
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R19或R20之一是氢，并且R19或R20之一是包含糖部分、优选二糖部分的生物可逆部分，或者R19和R20一起形成包含糖部分、优选二糖部分的生物可逆部分；
R21和R22独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R23是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R24是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R25是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R26是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；并且
R27是-OH、-O(C1-C3烷基)或-NH2。
在根据第十八方面的肽中，生物可逆部分可以是本领域任何已知的，包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。
在根据第十八方面的肽中，R19或R20所包含的糖部分优选地是二糖部分。
在某些实施方案中，在根据第十八方面的肽中，R19或R20包含另外的N-末端糖基化的L-氨基酸残基，包括可以N-糖基化(也称为N-连接的糖基化)的残基，例如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸；O-糖基化(也称为O-连接的糖基化)的残基，例如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸；S-糖基化(也称为S-连接的糖基化)的残基，例如L-半胱氨酸；C-糖基化(也称为C-连接的糖基化)的残基，例如L-色氨酸；和Se-糖基化(也称为Se-连接的糖基化)的残基，例如L-硒半胱氨酸。在某些实施方案中，R19或R20之一是
其中Y7是糖部分，优选二糖部分。
根据本发明第十八方面的肽任选地在肽的C-末端包含另外的L-氨基酸残基，其中所述另外的L-氨基酸残基任选地被糖基化。优选地，本发明第十八方面的肽任选地在C-末端包含约5个、约8个、约11个、约12个、约20个或约26个另外的L-氨基酸残基。C-末端任选地被酰胺化。
本发明的肽的实例包括以下：
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)；
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)；
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(肽2d)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-N H2(肽11)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基(肽9)。
本发明的肽的其它实例包括以下：
L-AA-L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Tyr-D-Thr-L-Thr-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Dmt-D-Val-L-Val-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Dmt-D-Thr-L-Thr-D-Phe-接头-糖部分；
其中L-AA是任选地包含至少一个N-末端-CH3的任何L-氨基酸残基；
其中L-Tyr或L-Dmt的羟基任选地被烷基化；并且
其中所述接头优选地是L-Ser或L-Thr。
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)是
(1)式I的肽，其中R1、R2、R3、R4和R5是氢，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-OH；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是L-苯丙氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)OH部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)是
(1)式I的肽，其中R1、R2、R3、R4和R5是氢，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是L-苯丙氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)是
(1)式I的肽，其中R1、R2、R3和R4是氢，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-OH；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)OH部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)是
(1)式I的肽，其中R1、R2、R3和R4是氢，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)是
(1)式I的肽，其中R1和R2是氢，R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)是
(1)式I的肽，其中R1和R2是氢，R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是
Y1是-NH2并且Y2是糖部分，其为二糖乳糖部分，其中所述乳糖部分通过β键连接；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢，并且X4包含C-末端
其中Y5是-NH2并且Y6是糖部分，其为二糖乳糖部分，其中所述乳糖部分通过β键连接。
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(肽2d)是
(1)式II的肽，其中R9、R10、R11、R12和R13是氢；R14是-CH(CH3)；R15是-OH；并且R16是-NH2；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是L-苯丙氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是甘氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-酪氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)是
(1)式I的肽，其中R1和R2是氢，R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-O(CH2CH3)；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)OCH2CH3部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-N H2(肽11)是
(1)式I的肽，其中R1和R2是氢，R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是11个另外的L-氨基酸残基并且C-末端被酰胺化；
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18各自是氢，并且该肽包含11个另外的L-氨基酸残基并且C-末端被酰胺化。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)是
(1)式I的肽，其中R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2，并且R1或R2之一是氢且R1或R2之一是生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17或R18之一是氢且R17或R18之一是生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)是
(1)式I的肽，其中R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2，并且R1和R2一起形成生物可逆部分
或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18一起形成生物可逆部分
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)是
(1)式I的肽，其中R1和R2是氢，R3和R4是-CH3，R5是生物可逆部分-OC(＝O)CH3，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2，或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，其中4-羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3；X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-C(＝O)NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18是氢。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)是
(1)式I的肽，其中R1和R2是氢，R3和R4是-CH3，R5是生物可逆部分-OC(＝O)CH3，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-OCH2CH3，或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，其中4-羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3；X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-OCH2CH3部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18是氢。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)是
(1)式I的肽，其中R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2，并且R1或R2之一是氢且R1或R2之一是生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3；或
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17或R18之一是氢且R17或R18之一是生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH。
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基(肽9)是
(1)式I的肽，其中R3和R4是-CH3，R5是-OH，R6和R7是-CH(CH3)2，并且R8是-NH2，并且R1和R2一起形成生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基团；
(2)式III的肽，其中X1是N-末端氨基酸，X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸残基，X2是D-缬氨酸残基，X3是L-缬氨酸残基，X4是具有C-末端-NH2部分的D-苯丙氨酸残基，X1具有N-末端-NR17R18部分，其中R17和R18一起形成生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基团。
产生本发明的肽的方法没有特别限制，并且可以是本领域已知的任何方法。本发明的肽可以使用周知的溶液相技术或固相方法合成。本发明的肽可以使用Fmoc化学合成，其中氨基酸残基的N-末端被芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团保护。本领域中已知的方法包括但不限于Schnolzer等人.Int J Pept Prot Res(1992)40:180-193和Alewood等人.Methods in Enzymology(1997)289:14-29中描述的方法，两者均通过引用并入本文。
本发明的肽可以被糖部分如单糖、二糖或三糖糖基化。优选地，糖部分是二糖。用于将糖部分连接至本发明的肽的合适方法是本领域周知的。优选地，糖部分用β键连接。然而，是首先将糖部分连接至氨基酸残基然后将其并入本发明的肽中还是首先将氨基酸组装成本发明的肽然后将其糖基化并不是关键的。通常的做法是使氨基酸残基糖基化，然后将糖基化的氨基酸残基并入肽中。本发明的肽可以包含一个或多个具有N-糖基化、O-糖基化、S-糖基化、C-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。N-连接的糖基化包括氨基酸残基如L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-精氨酸的糖基化。O-连接的糖基化包括氨基酸残基如L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-羟赖氨酸和L-羟脯氨酸的糖基化。S-连接的糖基化包括氨基酸残基如L-半胱氨酸的糖基化。C-连接的糖基化包括氨基酸残基如L-色氨酸的糖基化；并且Se-连接的糖基化包括氨基酸残基如L-硒半胱氨酸的糖基化。优选地，本发明的肽包含O-连接的糖基化，优选L-丝氨酸残基的O-连接的糖基化。
在本发明的一个实施方案中，本发明的肽被单糖部分糖基化。用于本发明的肽的糖基化的合适的单糖包括但不限于二羟基丙酮、甘油醛、丙醛糖(aldotriose)、赤藓酮糖(erythrulose)、赤藓糖、苏糖、核酮糖(ribulose)、阿洛酮糖(psicose)、木糖、葡萄糖(Glc)、果糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、核糖、塔格糖、阿拉伯糖、鼠李糖、景天庚酮糖(sedoheptalose)和壬糖如神经氨酸、唾液酸。葡萄糖是优选的单糖。
在本发明的一个实施方案中，本发明的肽被三糖部分糖基化。用于本发明的肽的糖基化的合适的三糖包括但不限于麦芽三糖和棉子糖。
在本发明的优选实施方案中，本发明的肽被二糖部分糖基化。用于本发明的肽的糖基化的合适的二糖包括但不限于蔗糖(sucrose)、海藻糖、甘蔗糖(saccharose)、麦芽糖、乳糖(Lac)、纤维二糖、龙胆二糖(gentibiose)、异麦芽糖、蜜二糖和樱草糖(primeveose)。用于本发明的肽的糖基化的优选的二糖包括乳糖和蜜二糖。最优选地，二糖是乳糖。
本发明的肽是MOPr激动剂。肽MOPr激动剂是选择性结合并激活MOPr的肽，即其在结合时刺激G蛋白或其它第二信使活性。通过筛选毛喉素诱导的cAMP形成的抑制，可以将肽鉴定为MOPr的激动剂。毛喉素抑制测定可以在任何合适的细胞系中进行，所述细胞系包括但不限于表达MOPr、优选哺乳动物MOPr如鼠MOPr、更优选人MOPr(hMOPr)的HEK细胞。测定MOPr激动剂活性的其它方法是本领域已知的，包括但不限于表达MOPr的细胞中35S GTP-γ-S结合的模拟(例如McPherson J等人(2010)Molecular Pharmacology 78:756-766)，表达MOPr的细胞中电压门控钙通道电流的抑制(例如Borgland SL等人(2003)J Biol Chem278:18776-18784)，或表达MOPr的细胞中GIRK型钾电流的激活(例如Yousuf A等人(2015)Molecular Pharmacology 88:825-835)。所有参考文献通过引用并入。优选地，本发明的肽能够在使用hMOPr的毛喉素抑制测定中在约10μM的浓度下与载剂相比提高对cAMP形成的抑制，或者在表达MOPr的细胞中激活GIRK电流。
还可以在使用已知MOPr激动剂、优选[3H]DAMGO([D-Ala2,N-MePhe4,Gly5-ol]-脑啡肽)的竞争性结合测定中筛选本发明的肽的MOPr激动剂活性。在合适的条件下(例如22℃下120分钟)用[3H]DAMGO(0.5nM)加多种浓度的未标记的肽孵育由HEK-293细胞(人胚肾细胞系)中表达的人重组MOPr制备的膜之后，可以使用过滤分离然后进行液体闪烁计数程序来确定竞争性MOPr结合。与受体的特异性配体结合可以定义为在过量的未标记的阿片样物质配体(例如纳洛酮(10μM))的存在下测定的总结合与非特异性结合之间的差异。结果可以表示为在未标记的目的肽的存在下获得的对照特异性结合的百分比((测量的特异性结合/对照特异性结合)×100)。IC50值(引起对照特异性结合的半数最大抑制的浓度)和希尔系数(nH)可以通过使用希尔方程曲线拟合对利用平均重复值产生的竞争曲线进行非线性回归分析来确定(Y＝D+[(A-D)/(1+(C/C50nH)]，其中Y＝特异性结合，D＝最小特异性结合，A＝最大特异性结合，C＝化合物浓度，C50＝IC50，并且nH＝斜率)。优选地，本发明的肽显示出对MOPr的Ki小于约5μM、小于约3.5μM、或小于约1μM。更优选地，本发明的肽显示出Ki小于约0.8μM、小于约0.5μM、或小于约0.3μM。
类似地，可以使用在[3H]DADLE(0.5nM)中于22℃下孵育120分钟来评估对与CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系中表达的人重组DOPr(hDOPr)的结合的抑制。类似地，使用在[3H]U69593(2nM)中于22℃下孵育60分钟来进行与CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系中表达的人重组KOPr(hKOPr)的结合。
可以筛选本发明的肽引导偏倚G蛋白信号传导的能力。MOPr C-末端磷酸化、β-抑制蛋白募集和内化被认为有助于靶上阿片样物质镇痛副作用，因此避免了β-抑制蛋白信号传导的G蛋白偏倚阿片样物质可以表现出改善的副作用谱。优选地，本发明的肽表现出比吗啡更低的MOPr的C-末端磷酸化的诱导。优选地，本发明的肽表现出比吗啡更低的β-抑制蛋白募集的诱导。优选地，本发明的肽表现出比吗啡更低的MOPr内化的诱导。更优选地，本发明的肽表现出以下至少两种：比吗啡更低的MOPr的C-末端磷酸化的诱导；比吗啡更低的β-抑制蛋白募集的诱导；和比吗啡更低的MOPr内化的诱导。最优选地，本发明的肽表现出比吗啡更低的MOPr的C-末端磷酸化的诱导，比吗啡更低的β-抑制蛋白募集的诱导，和比吗啡更低的MOPr内化的诱导。
激动剂诱导的MOPr的丝氨酸375(Ser375)的磷酸化驱动β-抑制蛋白募集和内化(Williams等人,Pharmacol Rev.(2013)65(1):223-54)。确定通过本发明的肽对MOPr的丝氨酸375(Ser375)的磷酸化的诱导的测定没有特别限制，并且可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，本发明的肽诱导MOPr的丝氨酸375(Ser375)的磷酸化的能力可以在使用Ser375-磷酸位点特异性抗体的测定中评估，例如Just等人“Molecular Pharmacology(2013)83(3):633-639中所述的，其通过引用并入本文。已知吗啡诱导MOPr在Ser375处的弱磷酸化，并且可用于比较目的以评估由本发明的肽诱导的MOPr在Ser375的磷酸化。已知甲硫氨酸脑啡肽和内吗啡肽2比吗啡更强地诱导MOPr在Ser375处的磷酸化，并且其各自可以独立用于比较目的以评估由本发明的肽诱导的MOPr在Ser375的磷酸化。奥塞利定(TRV130)是已确定的小分子G蛋白偏倚性MOPr激动剂，并且可用于比较目的以评估由本发明的肽诱导的MOPr在Ser375处的磷酸化。
确定本发明的肽对通过MOPr激活的β-抑制蛋白募集的影响的测定没有特别限制，并且可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，可以在生物发光共振能量转移(BRET)测定中使用MOPr-萤光素酶和β-抑制蛋白2-YFP构建体来评估本发明的肽对β-抑制蛋白募集的影响。也可以使用用于确定β-抑制蛋白募集的市售试剂盒。已知吗啡弱地诱导β-抑制蛋白募集，并且可以用作比较目的以评估由本发明的肽诱导的β-抑制蛋白募集。已知甲硫氨酸脑啡肽和内吗啡肽2比吗啡更强地诱导β-抑制蛋白募集，并且其各自可以独立用于比较目的以评估由本发明的肽诱导的β-抑制蛋白募集。奥塞利定(TRV130)是已确定的小分子G蛋白偏倚性MOPr激动剂，并且可用于比较目的以评估通过本发明的肽的β-抑制蛋白的募集。
确定本发明的肽对MOPr内化的影响的测定没有特别限制，并且可以通过本领域已知的任何方法来确定。例如，可以以免疫细胞化学的方式评估本发明的肽对MOPr内化的影响。例如，将表达MOPr的细胞用一抗预标记，然后用本发明的肽刺激。通过与未用本发明的肽处理的相应对照比较来确定刺激后MOPr的表面表达的变化。已知吗啡诱导弱的MOPr内化，并且可以用作比较目的以评估由本发明的肽诱导的MOPr内化。已知甲硫氨酸脑啡肽和内吗啡肽2比吗啡更强地诱导MOPr内化，并且其各自可以独立用于比较目的以评估由本发明的肽诱导的MOPr内化。奥塞利定(TRV130)是已确定的小分子G蛋白偏倚性MOPr激动剂，并且可用于比较目的以评估由本发明的肽诱导的MOPr内化。
确定本发明的肽穿透中枢神经系统(也称为穿过血脑屏障(BBB))的能力的测定没有特别限制，并且可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，一种评估肽穿过血脑屏障(BBB)的能力的方法是在镇痛评估的体内模型中比较本发明肽的外周(例如皮下)和鞘内注射。评估穿过血脑屏障(BBB)的能力的体外方法是已知的，并且包括但不限于使用具有单脑上皮细胞层的半透性腔室等的方法。(Wilhelm I等人Molecular Pharmaceutics(2014)11(7):1949-63，通过引用并入)。在一个实施方案中，本发明的肽穿过血脑屏障。
本发明肽的体内镇痛作用的评估没有特别限制，并且可以通过本领域已知的任何方法确定。评估镇痛作用的已知方法包括甩尾试验(tail flick test)和热板试验(hotplate test)，其中动物对热的疼痛反应。
本发明的肽可以配制成包含本发明的肽和至少一种药学上可接受的辅料的药物组合物。
优选地，本发明涉及本发明的肽在医学中的用途。本发明包括用于药物的本发明的肽。
在一个实施方案中，本发明涉及疼痛的治疗，包括最广泛意义上的减轻、改善或抑制疼痛。在某些实施方案中，本发明提供了治疗疼痛的方法，包括向受试者施用本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了治疗疼痛的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。在某些实施方案中，本发明提供了用于在治疗疼痛的方法中使用的本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。
可以用本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物治疗的疼痛可以是任何类型的疼痛，包括但不限于手术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛、与创伤相关的疼痛，短期、长期、间歇性或持续性，躯体疼痛、内脏疼痛或神经性疼痛。在某些实施方案中，可以用本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物治疗的疼痛可以是手术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。在某些实施方案中，可以用本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物治疗的疼痛可以是短期、长期、间歇性或持续性，躯体疼痛、内脏疼痛或神经性疼痛。
在某些实施方案中，本发明的肽涉及递送镇痛的方法。在某些实施方案中，本发明提供了递送镇痛的方法，包括向受试者施用本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了递送镇痛的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物在制备用于递送镇痛的药物中的用途。在某些实施方案中，本发明提供了用于在递送镇痛的方法中使用的本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。
“不利副作用”是指除化合物或治疗预期的结果以外的医学上不希望的结果。在某些实施方案中，本发明涉及用具有降低的与阿片样物质治疗相关的不利副作用的MOPr激动剂来治疗疼痛。特别地，具有降低的不利副作用的MOPr激动剂是本发明的肽。在某些实施方案中，本发明提供了治疗疼痛或递送镇痛的方法，该方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用，包括向受试者施用本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了治疗疼痛或递送镇痛的方法，该方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物在制备药物中的用途，治疗疼痛或递送镇痛的方法，该方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。在某些实施方案中，本发明提供了用于在治疗疼痛或递送镇痛的方法中使用的本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物，该方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。与阿片样物质治疗(包括MOPr激动剂)相关的不利副作用包括耐受性、胃肠道(GI)抑制和便秘、呼吸抑制、运动障碍、阿片样物质诱导的痛觉过敏、滥用可能性和/或依赖性。优选地，本发明的肽降低与阿片样物质治疗相关的一种或多种不利副作用。更优选地，本发明的肽降低与阿片样物质治疗相关的胃肠道(GI)抑制和/或呼吸抑制。评估不利副作用降低的方法没有特别限制，并且可以通过本领域已知的任何方法确定。吗啡的不利副作用谱是本领域周知的。与阿片样物质治疗相关的一种或多种不利副作用的降低可以通过在合适的测定中比较本发明的肽的和吗啡的不利副作用来确定，包括但不限于：疼痛治疗的体内动物模型、胃肠道(GI)抑制的体内动物模型和呼吸抑制的体内动物模型。
可以将本发明的肽配制用于任何合适的施用方法。本发明的肽可以口服、肠胃外、局部、直肠、鼻、颊、阴道、透皮、透粘膜或通过植入的储库施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在某些实施方案中，本发明的肽优选配制用于注射。当本发明的肽配制用于注射时，该制剂可以皮下、腹膜内、静脉内或鞘内施用。在某些实施方案中，将制剂的肽配制成用于口服施用。
本发明的糖基化的肽优选配制用于口服、通过注射或鞘内施用。本发明的非糖基化的肽优选配制用于经鼻或鞘内施用。
定义
除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应理解为包含性含义，而不是排他性或穷举性含义；也就是说，在“包括但不限于”的意义上。
如本文中所使用，术语“约”根据本领域的实践可表示在1个或多个标准偏差内。替代地，“约”可以意指多至20％的范围。例如，包含另外1至约35个氨基酸残基的肽包括了包含1至约33、34、35或36个另外的氨基酸残基的肽。
如本文所用，术语“L-氨基酸”是指氨基酸的L异构体。技术人员将理解，这是指氨基酸的α-碳的立体化学。本领域技术人员将熟悉公知的缩写，包括L-丙氨酸(L-Ala)、L-缬氨酸(L-Val)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-异亮氨酸(L-Ile)、L-丝氨酸(L Ser)、L-苏氨酸(L-Thr)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-组氨酸(L-His)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Arg)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-甲硫氨酸(L-Met)、L-色氨酸(L-Trp)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-硒半胱氨酸(L-Sec)、L-羟赖氨酸(L-Hyl)和L-羟脯氨酸(L-Hyp)。如本文所用，术语“L-氨基酸残基”是指引入肽中的L-氨基酸。如本文所用，术语“L-Dmt”是指2,6-二甲基-L-酪氨酸。
如本文所用，术语“D-氨基酸”是指氨基酸的D异构体。技术人员将理解，这是指氨基酸的α-碳的立体化学。本领域技术人员将熟悉周知的缩写，包括D-丙氨酸(D-Ala)、D-缬氨酸(D-Val)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(L-Thr)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-酪氨酸(D-Tyr)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-组氨酸(D-His)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-精氨酸(D-Arg)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-色氨酸(D-Trp)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-硒半胱氨酸(D-Sec)、D-羟赖氨酸(D-Hyl)和D-羟脯氨酸(D-Hyp)。如本文所用，术语“D-氨基酸残基”是指引入肽中的D-氨基酸。
如本文所用，术语“氨基酸残基”是指包含在肽中的氨基酸。氨基酸残基的氨基和/或羧基将是肽键的一部分。本领域技术人员将理解，可以通过在肽和另外氨基酸之间形成肽键，通过添加另外的氨基酸残基来延长肽的N-或C-末端。
在提及本发明的肽时，所述肽中包含的氨基酸或氨基酸残基由具有“L-”或“D-”指示的周知的单字母氨基酸代码或三字母氨基酸代码来指代。技术人员理解，由于氨基酸甘氨酸的α碳不是不对称的，因此甘氨酸在三字母代码中被指定为Gly。例如，“L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe”是指由L-苯丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D苯丙氨酸组成的四肽。或者，在使用周知的单字母氨基酸代码指代本发明的肽时，通过使用大写字母表示L-氨基酸残基和小写字母表示D-氨基酸残基来区分D或L立体化学。例如，FvVf是指由L-苯丙氨酸-D-缬氨酸-L缬氨酸-D-苯丙氨酸组成的四肽。由于氨基酸甘氨酸没有不对称的α碳原子，因此在单字母代码中用大写字母G表示。为了区分C-末端没有被修饰的肽(具有C-末端羧基(-C(＝O)OH)部分)的肽)和C-末端被通过酰胺化被修饰的肽(具有C-末端酰胺基(-C(＝O)NH2部分)的肽)，在单字母氨基酸代码和三字母氨基酸代码二者中，肽显示为具有末端-NH2例如FvVf-NH2和L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2以指示C-末端被酰胺化。相反，当C-末端没有被修饰时，可以将肽描述为具有或不具有末端-OH，例如FvVf-OH或FvVf或者L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe或L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-OH。
如本文所用，术语“氨基酸的侧链”是指氨基酸或氨基酸残基的从β原子开始的部分。技术人员熟悉氨基酸的结构，其可以被描述为H2N-CαH(Raa)-C(＝O)OH，其中Raa是氨基酸的侧链。当使用术语“氨基酸的侧链”是指具有“D”或“L”立体化学的氨基酸残基时，技术人员应理解，氨基酸甘氨酸的侧链被排除在外，即当Raa是氢时被排除，因为氨基酸甘氨酸是不对称的。在本发明的肽中，氨基酸的侧链包括天然存在和非天然存在的氨基酸的侧链。优选地，侧链是疏水氨基酸的侧链，包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸和异亮氨酸的侧链。
如本文所用，术语“单糖”是指基础碳水化合物单元。如本文所用，术语“单糖部分”是指与本发明的肽连接的单糖。用于本发明的肽的糖基化的合适的单糖包括但不限于二羟基丙酮、甘油醛、丙醛糖、赤藓酮糖、赤藓糖、苏糖、核酮糖、阿洛酮糖、木糖、葡萄糖(Glc)、果糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、核糖、塔格糖、阿拉伯糖、鼠李糖、景天庚酮糖和壬糖如神经氨酸、唾液酸。优选的单糖是葡萄糖。
如本文所用，术语“二糖”是指当两个单糖通过糖苷键连接时形成的碳水化合物。如本文所用，术语“二糖部分”是指与本发明的肽连接的二糖。用于本发明的肽的糖基化的合适的二糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘蔗糖、麦芽糖、乳糖(Lac)、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、蜜二糖和樱草糖。用于本发明的肽的糖基化的优选的二糖包括乳糖和蜜二糖。在某些实施方案中，二糖是乳糖。
如本文所用，术语“三糖”是指当三个单糖通过两个糖苷键连接时形成的碳水化合物。如本文所用，术语“三糖部分”是指与本发明的肽连接的三糖。用于本发明的肽的糖基化的合适的三糖包括但不限于麦芽三糖和棉子糖。
如本文所用，术语“糖部分”是指与本发明的肽连接的单糖、二糖或三糖。优选地，糖部分通过O-连接的糖基化和通过β键连接至本发明的肽。如本文所用，包含糖部分的本发明的肽可替代地被称为包含糖基化的肽或糖基化肽。
如本文所用，术语“生物可逆部分”是指与本发明的肽连接的部分，其在体内施用后被代谢成或以其它方式转化成(例如通过血液中的水解、通过细胞中或脑脊液中的代谢、或通过这些途径的组合)生物学、药学或治疗活性形式的本发明的肽。适合于本发明的肽的生物可逆部分包括但不限于碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺、醚、酯和酰胺部分。在本发明的肽中，在肽的N-末端取代的生物可逆部分包括但不限于
(亚胺部分)或＝N＝N(叠氮基部分)、-C(＝O)OZ(1、3或5)或-C(＝O)OCH2OC(＝O)Z(1、3或5)。应理解，肽的N-末端氮结合至基团。Z(1、3或5)C1-C6烷基或芳基，优选-CH2CH3，并且Z(2、4或6)C1-C6烷基或芳基，优选-CH3。在本发明的肽中，可以在L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸的羟基上取代有生物可逆部分，包括但不限于-C(＝O)Z(7)。Z(7)C1-C6烷基或芳基，优选-CH3。
如本文所用，术语“烷基”是指饱和脂族基团的基团，包括直链烷基基团、支链烷基基团和环烷基(脂环族)基团。在某些实施方案中，烷基部分任选地通过本领域已知的任何方法被糖基化。应当理解，在其中烷基部分被糖基化的实施方案中，烷基部分具有替换烃骨架的一个或多个碳上的氢的取代基，以允许糖基化。如本文所用，术语“烷基化”或“烷基化的”等在肽和/或氨基酸残基的N-末端的情况下是指用烷基基团替换一个或两个N-末端氢，并且在-OH基团的情况下是指用烷基基团例如甲基(“甲基化的”；“甲基化”)、乙基(“乙基化的”，“乙基化”)等替换氢。单烷基化的或单烷基化等是指用烷基基团替换肽或氨基酸残基的一个N-末端氢。单甲基化是指用-CH3替换一个N-末端氢。
如本文所用，术语“芳基”包括5元、6元和7元单环芳族基团，其可包含零至四个杂原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。在某些实施方案中，通过本领域已知的任何方法任选地将芳基糖基化。
如本文所用，术语“接头”是指本领域已知的任何合适的接头。合适的接头包括基于氨基酸的接头，包括但不限于单氨基酸接头，例如L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸等；基于肽的接头，包括但不限于L-缬氨酸-L-瓜氨酸、L-Phe-L-Lys、L-谷氨酸-L-缬氨酸-L-瓜氨酸等；包含氨基酸的接头，包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯(VC-PABC)等；和基于马来酰亚胺的接头，包括但不限于马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯等；以及这样的接头的组合，例如马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基氨基甲酸酯，以及含氨基和羧基的接头，例如6-氨基己酸等。技术人员将理解，基于马来酰亚胺的接头可以使用L-半胱氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-半胱氨酸的硫，或者可以使用L-赖氨酸残基，使得马来酰亚胺键合至L-赖氨酸的氮。在包含基于马来酰亚胺的接头的实施方案中，所述肽可以还包含与基于马来酰亚胺的接头(例如马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯)键合的C-末端L-半胱氨酸残基或L-赖氨酸残基。在本文公开的肽中，接头还包含糖部分。
如本文所用，术语“选择性MOPr激动剂”是指相对于相关的κ-阿片样物质(KOPr)和/或δ-阿片样物质(DOPr)亚型中的至少一种，对MOPr具有选择性的激动剂。MOPr激动剂的选择性可以通过本领域周知的方法来确定。在一种示例性方法中，可以在与[2H]DAMGO的竞争性结合测定中确定肽对于MOPr、优选hMOPr的Ki，并且与相同肽对于以下的Ki进行比较：(2)DOPr，优选人DOPr(hDOPr)，其可以在与[3H]DADLE的竞争性结合测定中确定，和/或(3)KOPr，人KOPr(hKOPr)，其可以在与[3H]U69593的竞争性结合测定中确定。作为MOPr激动剂的本发明的肽也可以是选择性MOPr激动剂。优选地，本发明的肽是相对于κ-阿片样物质(KOPr)或δ-阿片样物质(DOPr)中的至少一种对MOPr具有选择性的MOPr激动剂。更优选地，本发明的肽是相对于κ-阿片样物质(KOPr)和δ-阿片样物质(DOPr)二者对MOPr具有选择性的MOPr激动剂。最优选地，本发明的肽表现出相对于KOPr对MOPr的50倍选择性和/或相对于DOPr对MOPr的50倍选择性。
如本文所用，术语G蛋白偏倚性MOPr激动剂是指差异性地激动G蛋白偶联受体(GPCR)以偶联至不同的下游信号传导途径的肽。相对于β-抑制蛋白募集，G蛋白偏倚性MOPr激动剂肽表现出通过G蛋白的信号传导增加。评估偏倚性G蛋白肽的测定是本领域已知的，并且包括但不限于对G蛋白活化测定、MOPr C-末端磷酸化、β-抑制蛋白募集和/或MOPr内化的比较。可以在MOPr C-末端磷酸化测定中将肽的G蛋白偏倚与吗啡(已知其在Ser375处使MOPr弱磷酸化)、内吗啡肽-2(已知其在Ser375处使MOPr强磷酸化)和/或甲硫氨酸脑啡肽(已知其在Ser375使MOPr强磷酸化)进行比较。可以在β-抑制蛋白募集测定中将肽的G蛋白偏倚与吗啡(已知其弱诱导β-抑制蛋白募集)、内吗啡肽-2(已知其强烈诱导β-抑制蛋白募集)和/或甲硫氨酸脑啡肽(已知其强烈诱导β-抑制蛋白募集)进行比较。可以在MOPr内化测定中将肽的G蛋白偏倚与吗啡(已知其弱诱导MOPr内化)、内吗啡肽-2(已知其强烈诱导MOPr内化)和/或甲硫氨酸脑啡肽(已知其强烈诱导MOPr内化)进行比较。可以在G蛋白活化测定中将肽的G蛋白偏倚与吗啡、内吗啡肽-2和/或甲硫氨酸脑啡肽进行比较，已知后者中的每一种均活化G蛋白。优选地，与吗啡相比，本发明的肽表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr的C-末端磷酸化诱导；和/或表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导；和/或表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr内化诱导。
如本文所用，术语“药学上可接受的辅料”涵盖任何载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于药物组合物的其它材料。用于组合物中的辅料的选择将取决于组合物的预期施用途径。药学上可接受的辅料和包含这些材料的组合物的制备描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第22版,ed.University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia Pa.,2012中。
如本文所用，术语“受试者”或“有此需要的受试者”是指哺乳动物，包括例如农场动物，例如绵羊、猪、牛和马；宠物，例如狗和猫；实验动物，例如大鼠、小鼠和兔，以及人。优选地，受试者是狗、猫或人。更优选地，受试者是人。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指本发明的肽或包含本发明的肽的药物组合物的量，其将在有此需要的受试者中引起研究人员、兽医、医生或其他临床人员追寻的生物学或医学反应。
附图说明
现在将参照如下的附图来仅通过举例的方式描述本发明的方案。
图1：竞争性结合测定。测试了肽[YvVf-OH(3a)、YvVf-NH2(3b)、[Dmt]-vVf-NH2(3c)]相对于MOPr激动剂[3H]DMAGO对hMOPr的竞争性结合。测试了[Dmt]-vVf-NH2(3c)相对于DOPr激动剂[3H]DADLE对hDOPr的竞争性结合以及相对于KOPr激动剂[3H]U69593对hKOPr的竞争性结合。图中符号：hMOPr：YvVf-OH(3a)圆中x；YvVf-NH2(3b)圆中圆，[Dmt]-vVf-NH2(3c)大圆；DOPr：[Dmt]-vVf-NH2(3c)圆中*；KOPr：[Dmt]-vVf-NH2(3c)圆中+。
图2：图2A：从大鼠LC神经元记录的响应于甲硫氨酸脑啡肽(1μM)，[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)(1μM)的GIRK电流及其通过共施用MOPr选择性拮抗剂CTAP((D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2)(1μM)的逆转的实例。比例尺：50pA，5min。图2B：[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)(1μM)对由超大(supramaximal)脱敏浓度的甲硫氨酸脑啡肽诱发的GIRK电流的部分拮抗作用(10μM，10分钟；与图2A相同的比例尺)。
图3：示例性阿片样物质和[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)对于在LC神经元中激活GIRK电流的激动剂浓度-响应关系，其相对于在每个细胞中用作探针的1μM甲硫氨酸脑啡肽进行归一化(每个数据点N＝4-13个细胞)。[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin，圆中*)与甲硫氨酸脑啡肽(圆中X)、吗啡(圆中+)和内吗啡肽-2(圆中圆)的比较。
图4：响应于生长抑素(SST)的mMOPr表达AtT20细胞中GGIRK的示例性记录。在通过不可逆的MOPr拮抗剂β-氯纳曲胺(β-chlornaltrexamine，β-CNA)使一部分受体烷基化后，所示浓度的阿片样物质及其持续时间标尺。比例尺0.2ns，1min。
图5：在通过β-CNA预处理减少受体储备以使得对甲硫氨酸脑啡肽的最大响应为通过生长抑素(SST)产生的响应的80％之后，AtT20细胞中由阿片样物质诱导的GGIRK的浓度-响应曲线。[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin，圆中*(紫色))与甲硫氨酸脑啡肽(圆中X)、吗啡(圆中+)、内吗啡肽-2(圆中圆)和奥塞利定(大圆)的比较。稳定表达FLAG标记的小鼠MOPr(mMOPr)的AtT20细胞中的膜片钳记录。
图6：使用磷酸位点特异性抗体，与甲硫氨酸脑啡肽、吗啡和内吗啡肽-2相比通过[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)的C-末端磷酸化诱导。孵育5min后，由饱和浓度(30μM)的甲硫氨酸脑啡肽、内吗啡肽2、吗啡和bilorphin诱导的AtT20细胞中丝氨酸375磷酸化的代表性图像。出于展示目的将颜色统一增强。
图7：与甲硫氨酸脑啡肽、吗啡和内吗啡肽-2相比通过[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)诱导的β-抑制蛋白募集，如通过MOPr萤光素酶和β-抑制蛋白2-YFP构建体确定的。配体诱导的BRET信号的时程(535nm/475nm的发光)指示激动剂暴露(箭头所示)后的β-抑制蛋白2募集。条带代表独立重复6次的实验的标准误差(每个实验一式三份)。
图8：MOPr内化。用30μM激动剂处理之后30分钟的MOPr内化的示例性图像。采用双重染色进行定量(膜受体为绿色(显示浅灰色)，内化受体为红色(显示深灰色)，出于展示目的将颜色统一增强)。
图9：内吗啡肽2、吗啡和bilorphin相对于甲硫氨酸脑啡肽对GIRK通道激活、丝氨酸375磷酸化、β-抑制蛋白2募集和归一化内化的最大功效值。[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)与吗啡、内吗啡肽-2和甲硫氨酸脑啡肽的比较，按从前景到背景的顺序显示。
图10：表达GRK2-YFP的细胞中的MOPr内化。过表达GRK2(黄色(显示灰色))和β-抑制蛋白2二者的细胞中由奥塞利定、bilorphin和吗啡产生的增强的内化(如图C中的绿色(显示浅灰色)和红色(显示深灰色))的实例。
图11：图11A：用GRK2和β-抑制蛋白2二者瞬时转染的细胞中每种激动剂的内化(绿色/[绿色+红色]通道中的荧光比率)(n＝来自2个实验的40个细胞)。图11B：bilorphin的由相对于甲硫氨酸脑啡肽归一化的GGIRK最大值(来自图5)和相对于甲硫氨酸脑啡肽归一化的内化(来自图11A)计算的偏倚比率指示比奥塞利定和吗啡二者更大的G-蛋白偏倚。图11C：用GRK2和β-抑制蛋白2二者瞬时转染的细胞中每种激动剂的内化(绿色/[绿色+红色]通道中的荧光比率)(n＝5个实验，每个实验中有大于10个细胞)。图11D：bilorphin的由相对于甲硫氨酸脑啡肽归一化的GGIRK最大值(来自图5)和相对于甲硫氨酸脑啡肽归一化的内化(来自图11C)计算的偏倚比率指示比奥塞利定和吗啡二者更大的G-蛋白偏倚。
图12：[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)类似物的体内镇痛测定。[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)在皮下施用后对54℃热板上的小鼠产生剂量依赖性镇痛，并且被纳曲酮拮抗。在括号表中指示了μmol/kg的剂量(除纳曲酮[n＝4]外，每个数据点n＝7-12)。载剂(具有＝的圆)，吗啡(具有+的圆)，[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin(14μmol/kg，具有1个星(*)的圆；28μmol/kg，具有2个星(**)的圆；56μmol/kg，具有3个星(***)的圆；112μmol/kg，具有4个星(****)的圆)；具有纳曲酮的[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)(具有x的圆)。
图13：在热板测试(n＝5-12)中，外周施用的[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)与吗啡等效。[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin，大圆(深灰色))和吗啡(圆中x(浅灰色))。
图14：指示MOPr表达AtT20细胞中响应于[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)和[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)和吗啡相对于1μM生长抑素探针的GIRK电流的时程的代表性迹线。比例尺代表0.2nS和1min。
图15：各个细胞中相对于用作探针的1μM生长抑素归一化的通过[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin，圆中x)和[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin，大圆)诱导的钾电导的浓度响应曲线。
图16：GRK2过表达之后由30μM[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)和[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)诱导的MOPr内化的示例性图像(膜和归一化的MOPr分别为绿色(显示浅灰色)和红色(显示深灰色)并且GRK2为黄色)。
图17：吗啡(绿色)、[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin，紫色)和[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin，深绿色)相对于甲硫氨酸脑啡肽(30μM激动剂暴露)产生受体内化的最大功效值。对于每组，吗啡在左侧，bilprophin在中间，而bilactorphin在右侧。
图18：从MD模拟预测的[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)(A和B)和内吗啡肽-2(C和D)的结合姿势。图18A和18C：预测的bilorphin(深灰色)(18A)和内吗啡肽-2(浅灰色)(18C)的结合姿势，以及从分子对接和1μs MD模拟获得的周围结合口袋残基(最浅灰色)的位置。配体的质子化胺与Asp1473.32之间的盐桥被标记为黑色虚线。为了清楚起见，已去除了TM7。图18B和18D：bilorphin(深灰色)(18B)和内吗啡肽-2(浅灰色)(18D)的预测结合姿势的不同于(18A/18C)的视角，以及从分子对接和1μs MD模拟获得的周围结合口袋残基(最浅灰色)的位置。配体的质子化胺与Asp1473.32之间的盐桥被标记为黑色虚线。为了清楚起见，这次已去除了TM4。
图19：[Dmt]-vVf-NH2(3c，Bilorphin)(A)和内吗啡肽-2(B)的RMSD图。图19A：与初始对接姿势相比对bilorphin的重原子进行的RMSD计算(深灰色)以及与MD刺激的第一帧相比受体跨膜结构域的α碳(浅灰色)。图19B：与初始对接姿势相比对内吗啡肽-2的重原子进行的RMSD计算(浅灰色)以及与MD刺激的第一帧相比受体跨膜结构域的α碳(灰色)。插图：MD模拟期间内吗啡肽-2中Phe4的波动，显示Phe4的3个不同位置。
图20：图20A：bilorphin-MOPr复合物(深灰色)和内吗啡肽-2-MOPr复合物(浅灰色)的配体-残基相互作用指纹。数据表示为每个残基距离配体
以内的模拟时间的百分比，点以20％增量从0％到100％向外辐射。图20B：在将每个模拟时间点的受体构象投影到PC1和PC2上之前，对受体跨膜结构域的α碳进行主成分分析。Bilorphin-MOPr复合物为紫色，内吗啡肽-2-MOPr复合物为橙色，并且黑点表示肽对接的无活性MOPr模型的构象。
图21：代表PC1极限的提取结构证明了bilorphin-MOPr复合物(深灰色)和内吗啡肽-2-MOPr复合物(浅灰色)之间的构象差异。从图像中去除了环，以仅描绘了执行PCA的受体部分。白色箭头指示从bilorphin结合的MOPr移动到内吗啡肽-2的结合的MOPr的螺旋的构象变化。
图22：使用CASTp计算正构结合位点的体积表明，与内吗啡肽2-MOPr复合物(浅灰色)相比，bilorphin-MOPr复合物(深灰色)的结合口袋更大。在每个模拟的最后100ns内平均的结构上执行CASTp计算。
图23：激动剂在每种信号传导中的最大作用以及相对于其它途径对G蛋白活化的偏倚的计算：未归一化最大功效(±SEM)用于A,GIRK、B,Ser375磷酸化、Cβ-抑制蛋白2募集和D内化的激活，其用于计算表9中所示的各比率，以及用于计算E中的Δ归一化EMax，或包括在F中的操作模型中。E和F中表示的数据是平均值和95％置信区间。甲硫氨酸脑啡肽以最浅灰色显示，内吗啡肽2以深灰色显示，吗啡以浅灰色显示，并且bilorphin(肽3c，[Dmt]-vVf-NH2)以最深灰色显示。
图24：口服bilactorphin和吗啡的镇痛作用：图24A：热板潜伏期中[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)和吗啡的经口管饲的时间响应(平均值±SEM)。载剂(大圆)；吗啡(具有+的圆)；[Dmt]-vVf-L-Ser(β-Lac)-NH2(3g，Bilactorphin)(100μmol/kg，6，具有1个星(*)的圆；300μmol/kg，6，具有2个星(**)的圆；1000μmol/kg，6，具有3个星(***)圆)。图24B：管饲后300分钟的图24A所示每只动物的完全时间响应数据的曲线下面积(AUC)。AUC数据的普通单因素ANOVA显示了高于100μmol/kg的bilactorphin和90μmol/kg的吗啡的全剂量之间的统计学显著差异。
图25：bilaid、bilorphin和bilactorphin的结构，包括
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)；
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)。
图26：Bilaid C的类似物，包括以下肽：
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基(肽9)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-N H2(肽11)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-D-Glc)-NH2(肽3h)。
图27：标记的肽的镇痛响应，表示为每种肽或盐水皮下注射后5、10、20、30和60分钟测量的热板响应的1小时内积分曲线下面积(以秒为单位的响应X以分钟为单位的时间的AUC)。星号显示出与盐水的显著差异的AUC响应(单因素ANOVA和Fisher的LSD事后检验)。
图28：用DAMGO进行的冷冻EM结构和分子动力学模拟：A.MOPr-Gi复合物的冷冻EM结构中DAMGO的结合姿势(Koehl Nature(2018)558:547-552)。DAMGO显示为深灰色，周围结合口袋残基和受体螺旋为浅灰色。B.DAMGO与BUDE对接后并且从非活动MOPr结构开始的1μsMD模拟的预测结合姿势(Manglik Nature(2012)485:321-326)。DAMGO显示为中间灰色，周围残基和螺旋为浅灰色。Koehl Nature(2018)558:547-552报告了MD模拟中DAMGO的C-末端部分的较差分辨率和该区域的高灵活性。省略了该灵活的C-末端乙醇胺后，冷冻EM结构中DAMGO的所有重原子与1μs MD后我们的最终姿态中DAMGO的所有重原子之间的RMSD为
因此，冷冻EM结构和模型中的DAMGO-MOPr相互作用几乎相同的。
优选实施方案的详细描述
以下是本发明的实施方案。
实施方案1.一种分离的肽，包含式I
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
实施方案2.根据实施方案1所述的肽，其中R6是C1-C6烷基，并且R7是C1-C6烷基。
实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的肽，其中R6和R7独立地选自丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或异亮氨酸的侧链。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的肽，其中R6和R7各自是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
实施方案5.根据实施方案1所述的肽，其中R6和R7各自是苏氨酸侧链。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的肽，其中R3和R4是-CH3；并且R5是-OH。
实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的肽，其中R1和R2各自是氢。
实施方案8.根据实施方案1至5中任一项所述的肽，其中R1、R2、R3、R4和R5各自是氢。
实施方案9.一种分离的肽，包含式I
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、单键或-C1-C3烷基；
R2是氢、单键或-C1-C3烷基；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或-O(C1-C3)烷基；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化；
其中当R8是接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R1或R2之一是单键时，R1和R2之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化。
实施方案10.根据实施方案9所述的肽，其中R1和R2之一是氢，并且R1和R2之一是-CH3。
实施方案11.根据实施方案9或实施方案10所述的肽，其中R5是-O(C1-C3)烷基，优选-OCH3。
实施方案12.根据实施方案11所述的肽，其中R3和R4是-CH3。
实施方案13.根据实施方案11所述的肽，其中R3和R4是氢。
实施方案14.根据实施方案9或实施方案10所述的肽，其中R3和R4是-CH3并且R5是-OH。
实施方案15.根据实施方案9至14中任一项所述的肽，其中R6和R7各自是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
实施方案16.根据实施方案9至14中任一项所述的肽，其中R6和R7各自是苏氨酸侧链。
实施方案17.根据实施方案9至16中任一项所述的肽，其中R1或R2之一是单键，R1和R2之一是氢，并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键。
实施方案18.根据实施方案17所述的肽，其中所述L-氨基酸残基具有至少一个N-末端甲基化。
实施方案19.根据实施方案17或实施方案18所述的肽，其中所述L-氨基酸残基是L-丙氨酸残基。
实施方案20.根据实施方案9至19中任一项所述的肽，其中R8是接头。
实施方案21.根据实施方案20所述的肽，其中所述接头包括基于氨基酸的接头、基于肽的接头、包含氨基酸的接头、和/或基于马来酰亚胺的接头，和/或其组合。
实施方案22.根据实施方案1至19中任一项所述的肽，其中R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案23.根据实施方案22所述的肽，其中R8是
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案24.根据实施方案22或实施方案23所述的肽，其中Y1是-NH2。
实施方案25.根据实施方案22或实施方案23所述的肽，其中Y1是1至约30个L-氨基酸残基。
实施方案26.根据实施方案25所述的肽，其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
实施方案27.根据实施方案26所述的肽，其中Y1是1至约11个L-氨基酸残基。
实施方案28.根据实施方案1至19中任一项所述的肽，其中R8是1至约30个L-氨基酸残基。
实施方案29.根据实施方案28所述的肽，其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
实施方案30.根据实施方案29所述的肽，其中R8是1至约11个L-氨基酸残基。
实施方案31.根据实施方案30所述的肽，其中所述1至约11个L-氨基酸残基包含至少一个糖基化的L-氨基酸残基，优选包含至少一个O-糖基化的L-丝氨酸残基。
实施方案32.根据实施方案1所述的肽，其中R1和R2是氢；R3、R4和R5是氢；R6和R7各自是-CH(CH3)2；并且R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案33.根据实施方案1所述的肽，其中R1和R2是氢；R3和R4都是氢或都是-CH3；R5是-OH；R6和R7各自是-CH(CH3)2；并且R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案34.根据实施方案32或实施方案33所述的肽，其中R8是-NH2、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案35.根据实施方案32至34中任一项所述的肽，其中R8是
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案36.根据实施方案32至34中任一项所述的肽，其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
实施方案37.根据实施方案36所述的肽，其中Y1是1至约11个L-氨基酸残基。
实施方案38.根据实施方案1至19、22、23和32至35中任一项所述的肽，其中Y2是糖部分，优选二糖部分。
实施方案39.根据实施方案38所述的肽，其中Y2的二糖部分是乳糖部分或蜜二糖部分。
实施方案40.根据实施方案38所述的肽，其中Y2的二糖部分是乳糖部分。
实施方案41.根据实施方案39或实施方案40所述的肽，其中所述二糖部分通过β键连接。
实施方案42.根据实施方案1所述的肽，其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
实施方案43.根据实施方案42所述的肽，其中R8是1至约11个L-氨基酸残基。
实施方案44.根据实施方案42或实施方案43所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、S-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。
实施方案45.根据实施方案44所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个O-糖基化的L-氨基酸残基。
实施方案46.根据实施方案45所述的肽，其中O-糖基化的氨基酸残基是L-丝氨酸残基。
实施方案47.根据实施方案1至6、22至31和38至36中任一项所述的肽，其中R1和R2一起形成生物可逆部分。
实施方案48.根据实施方案47所述的肽，其中所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)。
实施方案49.根据实施方案1至6、22至31和38至36中任一项所述的肽，其中R1或R2之一是氢并且R1或R2之一是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
实施方案50.根据实施方案1至5、7、22至31和38至46中任一项所述的肽，其中R5是生物可逆部分。
实施方案51.根据实施方案50所述的肽，其中所述生物可逆部分是-C(＝O)CH3。
实施方案52.根据实施方案1所述的肽，选自由以下组成的组：
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)；
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-N H2(肽11)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基(肽9)。
实施方案53.一种肽，包括：
L-AA-L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Tyr-D-Thr-L-Thr-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Dmt-D-Val-L-Val-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Dmt-D-Thr-L-Thr-D-Phe-接头-糖部分，
其中L-AA是任选地具有至少一个N-末端-CH3的任何L-氨基酸残基；
其中L-Tyr或L-Dmt的羟基任选地被烷基化；并且
其中所述接头优选地是L-Ser或L-Thr。
实施方案54.根据实施方案1至53中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比：
(a)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr的C-末端磷酸化诱导；和/或
(b)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导；和/或
(c)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr内化诱导。
实施方案55.根据实施方案1至53中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导。
实施方案56.根据实施方案1至55中任一项所述的肽，其中在使用hMOPr的测定中，所述肽在约10μM的浓度的下与载剂相比显示出cAMP形成的抑制提高。
实施方案57.根据实施方案1至56中任一项所述的肽，其中在使用[3H]DAMGO的竞争性结合测定中，所述肽显示出Ki小于约5μM、小于约3.5μM、小于约1μM、小于约0.8μM、小于约0.5μM或小于约0.3μM。
实施方案58.根据实施方案57所述的肽，其中所述肽显示出Ki小于约0.5μM或小于约0.3μM。
实施方案59.根据实施方案1至58中任一项所述的肽，其中所述肽穿过血脑屏障。
实施方案60.药物组合物，包含根据实施方案1至59中任一项所述的肽和至少一种药用辅料。
实施方案61.根据实施方案60所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于口服施用。
实施方案62.根据实施方案60所述的药物组合物，其中所述肽被糖基化，并且所述组合物被配制成用于口服施用、通过注射施用或鞘内施用。
实施方案63.根据实施方案60所述的药物组合物，其中所述肽未被糖基化，并且所述组合物被配制用于鼻腔施用或鞘内施用。
实施方案64.一种治疗疼痛的方法，包括向受试者施用根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物。
实施方案65.根据实施方案64所述的方法，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案66.根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
实施方案67.根据实施方案66所述的用途，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案68.根据实施方案1至59中任一项所述的肽，用于在治疗疼痛的方法中使用。
实施方案69.根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物，用于在治疗疼痛的方法中使用。
实施方案70.根据实施方案68所述的用于在所述方法中使用的肽或根据实施方案69所述的用于在所述方法中使用的药物组合物，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案71.一种递送镇痛的方法，包括向受试者施用根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物。
实施方案72.根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物在制备用于递送镇痛的药物中的用途。
实施方案73.根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物，用于在递送镇痛的方法中使用。
实施方案74.一种治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用，包括向受试者施用根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物。
实施方案75.根据实施方案74所述的方法，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案76.根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
实施方案77.根据实施方案76所述的用途，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案78.根据实施方案1至59中任一项所述的肽或根据实施方案60至63中任一项所述的药物组合物，用于在治疗疼痛或递送镇痛的方法中使用，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
实施方案79.根据实施方案78所述的用于在所述方法中使用的肽或根据实施方案78所述的用于在所述方法中使用的药物组合物，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案80.一种肽，包含式II
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R10是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，
其中当R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3；
其中R9和R10可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R14是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
实施方案81.根据实施方案80所述的肽，其中R14是C1-C6烷基。
实施方案82.根据实施方案80或实施方案81所述的肽，其中R14选自丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或异亮氨酸的侧链。
实施方案83.根据实施方案80至82中任一项所述的肽，其中R14是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
实施方案84.根据实施方案80所述的肽，其中R14是苏氨酸侧链。
实施方案85.根据实施方案80至84中任一项所述的肽，其中R11和R12是-CH3；并且R13是-OH。
实施方案86.根据实施方案80至84中任一项所述的肽，其中R9和R10各自是氢。
实施方案87.根据实施方案80至84中任一项所述的肽，其中R9、R10、R11、R12和R13各自是氢。
实施方案88.根据实施方案80至84中任一项所述的肽，其中
R9、R10、R11、R12和R13是氢；R14是C1-C4烷基；R15是-OH。
实施方案89.一种肽，包含式II
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；
R10是氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或-O(C1-C3)烷基；
R14是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
1至约30个L-氨基酸残基、或接头；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化；
其中当R16是接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R9或R10之一是单键时，R9或R10之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化。
实施方案90.根据实施方案89所述的肽，其中R9和R10之一是氢，并且R9和R10之一是-CH3。
实施方案91.根据实施方案89或实施方案90所述的肽，其中R13是-O(C1-C3)烷基，优选-OCH3。
实施方案92.根据实施方案91所述的肽，其中R11和R12是-CH3。
实施方案93.根据实施方案91所述的肽，其中R11和R11是氢。
实施方案94.根据实施方案89或实施方案90所述的肽，其中R11和R12是-CH3；并且R13是-OH。
实施方案95.根据实施方案89所述的肽，其中R9或R10之一是单键，R9或R10之一，并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键。
实施方案96.根据实施方案95所述的肽，其中所述L-氨基酸残基具有至少一个N-末端甲基化。
实施方案97.根据实施方案95或实施方案96所述的肽，其中所述L-氨基酸残基是L-丙氨酸残基。
实施方案98.根据实施方案89至97中任一项所述的肽，其中R14是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
实施方案99.根据实施方案89至97中任一项所述的肽，其中R14是苏氨酸侧链。
实施方案100.根据实施方案80至99中任一项所述的肽，其中R16是-NH2。
实施方案101.根据实施方案80至99中任一项所述的肽，其中
R16是
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
实施方案102.根据实施方案101所述的肽，其中R16是1至约30个L-氨基酸。
实施方案103.根据实施方案102所述的肽，其中R16是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
实施方案104.根据实施方案103所述的肽，其中R16是1至约11个L-氨基酸残基。
实施方案105.根据实施方案102至104中任一项所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、S-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。
实施方案106.根据实施方案105所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个O-糖基化的氨基酸残基。
实施方案107.根据实施方案106所述的肽，其中所述O-糖基化的氨基酸残基是L-丝氨酸残基。
实施方案108.根据实施方案89至99中任一项所述的肽，其中R16是接头。
实施方案109.根据实施方案108所述的肽，其中所述接头包括基于氨基酸的接头、基于肽的接头、包含氨基酸的接头、和/或基于马来酰亚胺的接头，和/或其组合。
实施方案110.根据实施方案101所述的肽，其中
R16是
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案111.根据实施方案80至99中任一项所述的肽，其中
R16是
Y3是-OH或-NH2；并且Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案112.根据实施方案80所述的肽，其中R9、R10、R11、R12和R13是氢；R14是-CH(CH3)2；R15是-OH；并且
R16是
Y3是-OH或-NH2；并且Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案113.根据实施方案80至99、101、110、111和112中任一项所述的肽，其中所述糖部分是二糖部分，优选地其中所述二糖部分通过β键连接。
实施方案114.根据实施方案113所述的肽，其中所述二糖部分是乳糖部分或蜜二糖部分，优选地其中所述二糖部分通过β键连接。
实施方案115.根据实施方案113或实施方案114所述的肽，其中所述二糖部分是乳糖部分，优选地其中所述乳糖部分通过β键连接。
实施方案116.根据实施方案80至85中任一项所述的肽，其中R9和R10一起形成生物可逆部分。
实施方案117.根据实施方案116所述的肽，其中所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)。
实施方案118.根据实施方案80至85中任一项所述的肽，其中R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
实施方案119.根据实施方案80至85中任一项所述的肽，其中R13是生物可逆部分。
实施方案120.根据实施方案119所述的肽，其中所述生物可逆部分是-C(＝O)CH3。
实施方案121.根据实施方案80所述的肽，为L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2。
实施方案122.根据实施方案80至121中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比：
(a)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr的C-末端磷酸化诱导；和/或
(b)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导；和/或
(c)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr内化诱导。
实施方案123.根据实施方案80至121中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导。
实施方案124.根据实施方案80至123中任一项所述的肽，其中在使用hMOPr的测定中，所述肽在约10μM的浓度的下与载剂相比显示出cAMP形成的抑制提高。
实施方案125.根据实施方案80至124中任一项所述的肽，其中在使用[3H]DAMGO的竞争性结合测定中，所述肽显示出Ki小于约5μM、小于约3.5μM、小于约1μM、小于约0.8μM、小于约0.5μM或小于约0.3μM。
实施方案126.根据实施方案125所述的肽，其中所述肽显示出Ki小于约0.5μM或小于约0.3μM。
实施方案127.根据实施方案80至126中任一项所述的肽，其中所述肽穿过血脑屏障。
实施方案128.药物组合物，包含根据实施方案80至127中任一项所述的肽和至少一种药用辅料。
实施方案129.根据实施方案128所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于口服施用。
实施方案130.根据实施方案128所述的药物组合物，其中所述肽被糖基化，并且所述组合物被配制成用于口服施用、通过注射施用或鞘内施用。
实施方案131.根据实施方案128所述的药物组合物，其中所述肽未被糖基化，并且所述组合物被配制用于鼻腔施用或鞘内施用。
实施方案132.一种治疗疼痛的方法，包括向受试者施用根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物。
实施方案133.根据实施方案132所述的方法，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案134.根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
实施方案135.根据实施方案134所述的用途，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案136.根据实施方案80至127中任一项所述的肽，用于在治疗疼痛的方法中使用。
实施方案137.根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物，用于在治疗疼痛的方法中使用。
实施方案138.根据实施方案136所述的用于在所述方法中使用的肽或根据实施方案137所述的用于在所述方法中使用的药物组合物，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案139.一种递送镇痛的方法，包括向受试者施用根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物。
实施方案140.根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物在制备用于递送镇痛的药物中的用途。
实施方案141.根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物，用于在递送镇痛的方法中使用。
实施方案142.一种治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用，包括向受试者施用根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物。
实施方案143.根据实施方案142所述的方法，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案144.根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疼痛或递送镇痛，具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
实施方案145.根据实施方案144所述的用途，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案146.根据实施方案80至127中任一项所述的肽或根据实施方案128至131中任一项所述的药物组合物，用于在治疗疼痛或递送镇痛的方法中使用，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
实施方案147.根据实施方案146所述的用于在所述方法中使用的肽或根据实施方案146所述的用于在所述方法中使用的药物组合物，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案148.一种分离的肽，包含式III
X1-X2-X3-X4
(III)
其中：
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X1是选自L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的L-氨基酸残基，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，任选地该残基在4-位以任选地包含糖部分的生物可逆部分进行O-取代；
X2是D-氨基酸残基，优选D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸或D-异亮氨酸，更优选D-缬氨酸；
X3是甘氨酸或L-氨基酸残基，其中当X3是L-氨基酸残基时，X3优选地是L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，更优选L-缬氨酸；
X4是选自D-酪氨酸或D-苯丙氨酸的D-氨基酸残基，其中当X4是D-酪氨酸时，任选地该残基以生物可逆部分进行O-取代；
R17和R18独立地选自氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，或者R17和R18一起形成任选地包含糖部分的生物可逆部分；并且
其中所述肽是MOPr激动剂。
实施方案149.根据实施方案148所述的肽，其中所述C-末端部分是-C(＝O)OH、
并且Y5是-OH，并且Y6是氢或糖部分；所述肽在C-末端还包含约5个、8个、11个、12个、20个或26个另外的L-氨基酸残基。
实施方案150.根据实施方案148或实施方案149所述的肽，其中R17和R18各自是氢，X2是D-缬氨酸残基，X3是甘氨酸或L-缬氨酸残基，X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案151.一种分离的肽，包含式III
X1-X2-X3-X4
(III)
其中：
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
或接头的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X1是选自L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的L-氨基酸残基，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，任选地该残基在4-位以C1-C3烷基进行O-取代；
X2是D-氨基酸残基，优选D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸或D-异亮氨酸，更优选L-苏氨酸或D-缬氨酸；
X3是甘氨酸或L-氨基酸残基，其中当X3是L-氨基酸残基时，X3优选地是L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，更优选为L-苏氨酸或L-缬氨酸；
X4是选自D-酪氨酸或D-苯丙氨酸的D-氨基酸残基，其中当X4是D-酪氨酸时，任选地该残基以生物可逆部分进行O-取代；
R17和R18独立地选自氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；并且
其中当X4包含接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，
其中当R17或R18之一是单键时，R17或R18之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化；并且
其中所述肽是MOPr激动剂。
实施方案152.根据实施方案151所述的肽，其中所述C-末端部分是-C(＝O)OH、
并且Y5是-OH，并且Y6是氢或糖部分；所述肽在C-末端还包含约5个、8个、11个、12个、20个或26个另外的L-氨基酸残基。
实施方案153.根据实施方案151或实施方案152所述的肽，其中X2是D-缬氨酸残基，X3是甘氨酸或L-缬氨酸残基，X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案154.根据实施方案151或实施方案152所述的肽，其中X2是D-苏氨酸残基，X3是L-苏氨酸残基的甘氨酸，X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分。
实施方案155.根据实施方案151至154中任一项所述的肽，其中R17和R18之一是氢，并且R17和R18之一是-CH3。
实施方案156.根据实施方案151至154中任一项所述的肽，其中R17或R18之一是单键，R17或R18之一是氢，并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键。
实施方案157.根据实施方案156所述的肽，其中所述L-氨基酸残基具有至少一个N-末端甲基化。
实施方案158.根据实施方案156或实施方案157所述的肽，其中所述L-氨基酸残基是L-丙氨酸残基。
实施方案159.根据实施方案151所述的肽，其中X4包含接头。
实施方案160.根据实施方案154所述的肽，其中所述接头包括基于氨基酸的接头、基于肽的接头、包含氨基酸的接头、和/或基于马来酰亚胺的接头，和/或其组合。
实施方案161.根据实施方案151至160中任一项所述的肽，其中X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸，并且其中所述L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸在4-位以C1-C3烷基进行O-取代。
实施方案162.根据实施方案161所述的肽，其中X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸，并且其中2,6-二甲基-L-酪氨酸在4-位以C1-C3烷基进行O-取代。
实施方案163.根据实施方案148至162中任一项所述的肽，其中X4包含选自
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是二糖部分，优选地其中所述二糖部分通过β键连接。
实施方案164.根据实施方案162所述的肽，其中所述二糖部分是乳糖部分，优选地其中所述乳糖部分通过β键连接。
实施方案165.根据实施方案149所述的肽，其中所述另外的L-氨基酸包含至少一个N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、S-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。
实施方案166.根据实施方案148、149和163至165中任一项所述的肽，其中R17和R18一起形成生物可逆部分。
实施方案167.根据实施方案166所述的肽，其中所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)。
实施方案168.根据实施方案148、149和163至165中任一项所述的肽，其中R17或R18之一是氢，并且R17或R18之一是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
实施方案169.根据实施方案148所述的肽，选自由以下组成的组：
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)；
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)；
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(肽2d)
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-N H2(肽11)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基(肽9)。
实施方案170.根据实施方案148至169中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比：
(a)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr的C-末端磷酸化诱导；和/或
(b)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导；和/或
(c)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr内化诱导。
实施方案171.根据实施方案148至169中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导。
实施方案172.根据实施方案148至171中任一项所述的肽，其中在使用hMOPr的测定中，所述肽在约10μM的浓度的下与载剂相比显示出cAMP形成的抑制提高。
实施方案173.根据实施方案148至172中任一项所述的肽，其中在使用[3H]DAMGO的竞争性结合测定中，所述肽显示出Ki小于约5μM、小于约3.5μM、小于约1μM、小于约0.8μM、小于约0.5μM或小于约0.3μM。
实施方案174.根据实施方案173所述的肽，其中所述肽显示出Ki小于约0.5μM或小于约0.3μM。
实施方案175.根据实施方案148至174中任一项所述的肽，其中所述肽穿过血脑屏障。
实施方案176.药物组合物，包含根据实施方案148至175中任一项所述的肽和至少一种药用辅料。
实施方案177.根据实施方案176所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于口服施用。
实施方案178.根据实施方案176所述的药物组合物，其中所述肽被糖基化，并且所述组合物被配制成用于口服施用、通过注射施用或鞘内施用。
实施方案179.根据实施方案176所述的药物组合物，其中所述肽未被糖基化，并且所述组合物被配制用于鼻腔施用或鞘内施用。
实施方案180.一种治疗疼痛的方法，包括向受试者施用根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物。
实施方案181.根据实施方案180所述的方法，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案182.根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
实施方案183.根据实施方案182所述的用途，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案184.根据实施方案148至175中任一项所述的肽，用于在治疗疼痛的方法中使用。
实施方案185.根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物，用于在治疗疼痛的方法中使用。
实施方案186.根据实施方案184所述的用于在所述方法中使用的肽或根据实施方案185所述的用于在所述方法中使用的药物组合物，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
实施方案187.一种递送镇痛的方法，包括向受试者施用根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物。
实施方案188.根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物在制备用于递送镇痛的药物中的用途。
实施方案189.根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物，用于在递送镇痛的方法中使用。
实施方案190.一种治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用，包括向受试者施用根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物。
实施方案191.根据实施方案190所述的方法，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案192.根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
实施方案193.根据实施方案192所述的用途，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案194.根据实施方案148至175中任一项所述的肽或根据实施方案176至179中任一项所述的药物组合物用于在治疗疼痛或递送镇痛的方法中使用，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
实施方案195.根据实施方案194所述的用于在所述方法中使用的肽或根据实施方案194所述的用于在所述方法中使用的药物组合物，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
实施方案196.根据权利要求1至59、80至127和148至175中任一项所述肽，用于药物。
现在将参照附图通过示例的方式描述本发明的实施方案。
实施例1：肽合成
使用Fmoc化学合成表1中的肽。
新肽合成：
一般合成细节：在由具有静态混合器、Shimadzu SPD-M10AVP二极管阵列检测器和Shimadzu SCL-10AVP系统控制器的两台Shimadzu LC-8A制备型液相色谱仪组成的系统上进行初始HPLC。使用配备有Agilent 1100系列二极管阵列和/或多波长检测器、PolymerLaboratories PL-ELS1000 ELSD和Agilent 1100系列级分收集器并运行ChemStation(版本9.03A或10.0A)的Agilent 1100系列分离模块进行进一步的HPLC。参考残留1H信号，在XWIN-NMR或Topspin控制下在Bruker Avance 500或Bruker Avance 600光谱仪上在DMSO-d6中获得NMR谱。使用配备有Agilent 1100系列LC/MSD质量检测器和Agilent 1100系列二极管阵列检测器的Agilent 1100系列分离模块获得电喷雾电离质谱(ESIMS)。在具有Finnigan API III源的Finnigan MAT 900XL-Trap仪器上获得高分辨率(HR)ESIMS测量。除非另有说明，否则所有HPLC分离均使用0.1％TFA的恒定水平。在Jasco P-1010IntelligentRemote Module型旋光仪上在100×2mm的小室中获得手性光学测量([α]D)。
Fmoc-L-和D-氨基酸获自Novabiochem(Laufelfingen,Switzerland)或PeptideInstitute(Osaka,Japan)。2-氯三苯甲基氯和Rinkamide树脂购自Novabiochem(Laufelfingen,Switzerland)。2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)获自Richelieu Biotechnologies(Quebec,Canada)。三氟乙酸(TFA)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(均为肽合成级)购自Auspep(Melbourne,Australia)。
bilaid AC的表征：
bilaid A(FvVf-OH)(1a).浅棕色油；[α]D+9(c 0.2,0.1％TFA/MeOH)；HRESI(+)MSm/z 533.2745[(M+Na),C28H38N4O5Na需要533.2740]；对于1H、13C和2D NMR(600MHz,DMSO-d6)，参见图25和表1。
bilaid B(FvVy-OH)(2a).浅棕色油；HRESI(+)MS m/z 549.2692[(M+Na)+,C28H38N4O6Na需要549.2689]；对于1H NMR(600MHz,DMSO-d6)，参见图25和表1。
bilaid C(YvVf-OH)(3a).浅棕色油；HRESI(+)MS m/z 527.2879[(M+H)+,C28H39N4O6需要527.2870]；对于1H NMR(600MHz,DMSO-d6)，参见图25和表1。
一般肽合成程序：通过逐步固相肽合成手动组装所有肽。将2-氯三苯甲基氯树脂(0.176g，0.25mmol；对于肽酸)或Rink酰胺树脂(0.176g，0.25mmol；对于肽酰胺)在DMF中溶胀2小时并排干。将第一Fmoc保护的氨基酸(1mmol)溶解在DMF(2mL)中，并添加DIEA(174μL，1mmol)。氨基酸完全溶解后，将混合物添加到反应容器中并振摇2小时。将树脂用DMF流动洗涤1分钟。通过将树脂与5％哌啶/DMF混合物(2×10mL，每个循环1分钟)振摇来除去Fmoc保护基团。脱保护后，将树脂再次流动洗涤1分钟。接下来的氨基酸(1mmol)用0.5M HBTU溶液(2mL)和DIEA(174μL，1mmol)活化，并且添加到反应容器中。将混合物振摇10分钟，并且进行茚三酮测试以计算偶联收率。每次偶联之后重复该测试。组装完成后，如上所述除去末端Fmoc基团，将树脂用DMF洗涤，然后用DCM洗涤，并且在氮气下干燥。通过与10mL裂解混合物(TFA:水：95:5)振摇2小时，从树脂上裂解肽。在N2气下蒸发TFA。
从固相合成中纯化合成肽酸：将合成肽的反应产物通过制备型HPLC纯化(ZorbaxSB-C18柱,250×21.2mm,7μm,等度45％H2O(0.1％TFA):MeOH用于bilaid A(FvVf-OH,35.3mg)(1a)和fVvF-OH,41.0mg(1b)；30％H2O(0.1％TFA):MeOH用于FVvf-OH,25.0mg(1c)和fvVF-OH,30.8mg(1d)；40％H2O(0.1％TFA)；bilaid B(FvVy-OH,44.8mg)(2a)和bilaid C(YvVf-OH,45.9mg)(3a)。
四肽酸至酰胺的溶液转化：向二碳酸二叔丁酯在1,4-二氧六环(29.3mg/mL)中的溶液中添加吡啶(10.5μL/mL)和碳酸氢铵(10.5mg/mL)。向1a、1b、1c和1d中添加300μL该溶液，并且向2a和3a中添加600μL，相当于4当量。在50℃搅拌3天后，将反应产物通过制备型HPLC纯化(Zorbax SB-C8 150×21.2mm柱；90％H2O(0.1％TFA):MeCN至MeCN的梯度，经过15分钟)，得到纯样品。
对合成肽的LC/MS分析：在Zorbax SB-C8 150×4.6mm,5μm柱上进行(流速1mL/min；梯度10-100％MeCN/H2O(+等度0.05％HCO2H)，经过15分钟。
对肽的手性HPLC分析：在Astec Chirobiotic T柱,150×4.6mm,5μm,0.5mL/min,等度MeOH(0.1％三乙胺，0.2％AcOH，pH 6.23)上进行。
Nα-(9-芴基甲氧基羰基)-3-O-[2,3,6-三-O-乙酰基-4-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-L-丝氨酸(Fmoc-L-Ser[β-Lac(Ac7)]-OH)
根据Xu等人Journal of Carbohyrate Chemistry(2012)31(9):711-720概述的程序制备β-乳糖过乙酸酯。简单地说，将α-乳糖一水合物(20.0g)分批添加到乙酸钠(5.0g)在乙酸酐(200mL)中的搅拌混悬液中，同时保持温度在135℃。1小时后，将溶液倒入冰水(1L)中并搅拌过夜。过滤收集得到的沉淀，再溶解于CH2Cl2中，用饱和NaHCO3洗涤，并且经MgSO4干燥。减压除去溶剂后，将其从CH2Cl2/MeOH中结晶(16.1g，42％)。ESI-MS(m/z):计算值619.2[M-OAc]+实测值619.3。
基于Salvador等人Tetrahedron(1995)51(19):5643-5656描述的程序，对Fmoc-L-Ser-OH进行O-β-乳糖基化。向β-乳糖过乙酸酯(5.0g)和Fmoc-L-Ser-OH(2.9g)在无水CH2Cl2(100mL)中的混合物中添加BF3·Et2O(2.8mL)，并在氮气下搅拌20小时。将溶液用1M HCl然后用水洗涤，并且经MgSO4干燥。通过硅胶色谱法(CH2Cl2中的1％AcOH/2％MeOH)然后通过RP-HPLC(50％B等度)纯化(1.9g，从β-乳糖过乙酸酯27％)。ESI-MS(m/z):计算值946.3[M+H]+实测值946.3。
H-[2,6-二甲基-L-酪氨酰]-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(Bilactorphin，3g)
使用Fmoc化学在Fmoc-Rink-酰胺聚苯乙烯树脂(取代值0.67mmol/g)上以0.5mmol规模进行肽组装。通过用50％哌啶/DMF(2×1分钟)处理来完成Fmoc脱保护。相对于树脂负载量使用三当量的Fmoc氨基酸/HBTU/DIEA(1:1:1)进行偶联(30分钟)。引入Nα-Fmoc-O-β-乳糖基-L-丝氨酸作为七-O-乙酸酯(如上所述制备)；使用没有侧链保护的Nα-Boc-2,6-二甲基-L-酪氨酸。通过在室温下用95％TFA/2.5％TIPS/2.5％H2O处理2小时实现从树脂上裂解和除去侧链保护基团。在氮气流下除去TFA，并将产物用冷二乙基醚/正己烷(1:1)沉淀，用Et2O洗涤，再溶于50％乙腈/0.1％TFA/H2O中并冻干。ESI-MS(m/z):计算值1259.5[M+H]+,实测值1259.7。通过用5％肼/30％乙腈/H2O溶液处理5小时使粗产物脱乙酰，然后通过RP-HPLC纯化(在40分钟内10至50％B)。(190mg，初始树脂负载量的39％)。ESI-MS(m/z):计算值965.5[M+H]+,实测值965.4。
一般材料和方法
RP-HPLC溶剂A为0.05％TFA/H2O，并且溶剂B为0.043％TFA/90％乙腈/H2O。在Shimadzu LC20AT系统上使用Thermo Hypersil GOLD C18 2.1×100mm柱以0.3mL/min的流速进行分析型HPLC。在214nm处记录吸光度。在Waters DeltaPrep 3000系统上使用Vydac208TP 50×250mm柱以80mL/min的流速进行制备型HPLC。在API 2000三重四极杆质谱仪(ABSCIEX,Framingham,MA,USA)上以正电离模式记录质谱。Fmoc氨基酸和O-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)来自Iris Biotech(Marktredwitz,Germany)，二甲基甲酰胺(DMF)和二异丙基乙胺(DIEA)来自Auspep(Melbourne,Australia)。Boc-2,6-二甲基-L-酪氨酸购自AstaTech Inc(Bristol PA,USA)。所有其它试剂均获自SigmaAldrich。
实施例2：毛喉素诱导的cAMP形成的抑制
测量由G蛋白偶联受体(GPCR)调节腺苷酸环化酶活性后产生的细胞内cAMP水平的程序。通过测量细胞内cAMP水平相对于基础水平的变化来测试阿片样物质和类阿片样物质化合物与特定阿片样物质GPCR之间的功能性相互作用。该测定可以通过刺激细胞提高或降低细胞内cAMP水平来测量GPCR的激动剂和拮抗剂活性。
材料
cAMP测定试剂盒中提供的试剂：抗cAMP受体珠、链霉亲和素包被的供体珠、生物素化的cAMP、cAMP标准品、3％吐温-20溶液。其它试剂：1M HEPES(Muticel)、10％吐温-20(Pierce)、BSA(Sigma)、1x PBS(Gibco BRL)、无菌蒸馏水(Gibco BRL)、毛喉素(Sigma)、10xHBSS(Hepes缓冲盐溶液，Gibco BRL)、IBMX溶液(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Sigma)、DMSO(Sigma)、95％乙醇(Sigma)、完全生长培养基、Versene(Gibco)。设备：Envision多标签读板器(Perkin Elmer)、Optiplate-384孔板(Perkin Elmer)、TopSeal粘合剂密封膜(PerkinElmer)、96孔板(Axigen，聚丙烯V底)、硅96孔板密封垫(Axigen)、单通道移液器、多通道移液器、离心机、涡旋器、75cm2排气组织培养瓶、50ml锥形管、15ml锥形管、电子移液器辅助、一次性无菌移液器、血球计数器、显微镜。
方法
在384孔板上进行测定，并且每个数据点重复三次。应在与对照和cAMP标准品相同的板上分析测试化合物。待筛选活性的化合物的数量决定了每个实验所需的试剂和细胞的体积。可以提前或在细胞与刺激缓冲液一起孵育时将测试化合物、对照和cAMP标准品添加到板中。板应用TopSeal粘合剂密封膜密封以避免蒸发。
测定背景：cAMP的检测基于细胞内cAMP与生物素化cAMP连接的链霉亲和素包被的供体珠之间对抗cAMP缀合的受体珠的竞争。当供体珠和受体珠紧密接近时，使用Envision多标签读板器检测到520-620nm处发射的信号。
试剂的制备
储备液：
500mM IBMX溶液：将100mg IBMX溶解在900μl DMSO中，得到500mM储备液。分装并储存在20℃下。
50mM毛喉素溶液：将5mg毛喉素溶解在244μl 95％乙醇中，得到50mM储备液。储存在20℃并根据需要使用。
新鲜试剂-在50ml锥形管中制备以下新鲜试剂：
刺激缓冲液(1x HBSS，0.1％BSA，1mM IBMX)：对于50ml，向50ml管中加入5ml10xHBSS，然后用水补足至50ml。加入50mg BSA，置于37℃直至BSA溶解，然后在缓冲液处于37℃的同时添加100μl IBMX以确保IBMX不会沉淀。
裂解缓冲液(0.3％吐温-20，5mM HEPES，0.1％BSA)：对于40ml，向50ml管中加入1.2ml 10％吐温-20和200μl 1M HEPES，然后用水补足至40ml。加入50mg BSA，置于37℃直至BSA溶解。
含毛喉素的刺激缓冲液(刺激缓冲液中*200μM)：将毛喉素加入来自50mM储备液的1:250稀释液至所需量的刺激缓冲液。应注意，测定板中的最终浓度将减半。*测定中毛喉素的最佳浓度是细胞系特异性的，并且应加以优化。
测试肽的制备：通常以10μM的终浓度测试测试肽。由于大多数测试肽都溶解在100％DMSO中，因此建议在细胞刺激过程中将DMSO浓度限制在2％v/v，以确保最大的细胞活力和响应。在适当的稀释剂中制备1mM和100μM的测试肽储备液，并在4℃下储存。对于肽文库，可以在用硅密封垫密封的96孔板上进行。将测试肽从储备溶液中新鲜稀释至具有毛喉素的刺激缓冲液中的工作浓度。应注意，由于在测定中用细胞将肽按1:1稀释，所以工作浓度应为最终所需浓度的两倍。可能有必要对从DMSO储备化合物中新鲜稀释的化合物进行测定，以避免实验差异。
对照化合物：具有已知活性的化合物用作对照。对照通常以1μM的浓度使用，并且在来自-20℃下储存的储备液的具有毛喉素的刺激缓冲液中新鲜稀释。为了进行测定，每孔添加5μl制备的对照化合物，一式三份。
细胞的制备：为了最佳结果，细胞应在70-90％汇合时低传代。为了制备用于测定的细胞，去除生长培养基，添加Versene，然后在37℃下孵育约5分钟，以使细胞从组织培养塑料上脱离。收集细胞并以275x g离心2分钟。倾出上清液并将细胞沉淀重悬于1x PBS中。使用血球计数器确定细胞浓度。将细胞以275x g再离心2分钟，并倾出上清液。将细胞重悬于刺激缓冲液中至终浓度为每毫升1-4x104个细胞。应注意，细胞数量将影响腺苷酸环化酶激活之前(基础)和之后普遍存在的cAMP水平。应进行细胞滴定以优化cAMP的基础水平和刺激水平之间的差异。将细胞在刺激缓冲液中于37℃孵育20至30分钟，然后添加5μl到含有测试化合物和对照化合物的孔中。应注意，未将细胞添加到cAMP标准品中。
cAMP标准曲线的制备：从试剂盒提供的50μM cAMP溶液制备标准cAMP稀释系列。使用前以最大强度涡旋5秒。连续稀释以提供5μM至0.5nM cAMP的最终浓度范围(例如：5μM、0.5μM、50nM、15nM、5nM、1.5nM和0.5nM cAMP)。阳性对照(无cAMP)也应包括在内。为了进行测定，每孔添加10μl标准稀释液，一式三份。
受体珠溶液和供体珠溶液的制备：抗cAMP缀合的受体珠和链霉亲和素包被的供体珠对光敏感，并且应在柔和的灯光下或在装有绿色滤光片的光下操作。将珠添加到测定板后，应将其包裹在箔片中以便在黑暗中进行孵育。在对细胞进行孵育的期间，将受体珠溶液和供体珠溶液分别制备在15ml锥形管中，并保持在黑暗中直至需要。对于受体珠溶液，每ml裂解缓冲液轻轻混合10μl珠混悬液。对于供体珠溶液，每ml裂解缓冲液使用10μl珠混悬液和0.75μl/ml的cAMP-生物素并且轻轻混匀。
cAMP测定程序
1.将标准品(10μl/孔)、对照化合物(5μl/孔)和测试肽(5μl/孔)添加到384孔板中，并用Top Seal粘合剂密封膜密封。置于室温下直至细胞孵育完成。
2.将在刺激缓冲液中孵育的5μl细胞添加到含有测试肽和对照化合物的各孔中，但不添加到含有标准品的孔中。在37℃下孵育细胞和化合物30分钟。
3.每孔添加10μl裂解缓冲液。
4.在柔和的灯光下，向每个孔中添加5μl受体珠溶液。将板包裹在箔中，并且在定轨摇床上轻轻混合在室温孵育60分钟。
5.同样在柔和的灯光下，向每个孔中添加5μl供体珠溶液，将板包裹在箔中，并且在定轨摇床上轻轻混合在室温孵育过夜。
6.在Envision多标签读板器上测量cAMP水平。
结果分析：使用PRISM软件分析结果，以计算每个一式三份数据点的细胞内cAMP水平以及这些数据点的标准偏差。
根据上述方法，针对表达人MOPr(hMOPr)的HEK细胞中的毛喉素诱导的cAMP形成的抑制来筛选肽。
Bilaid B(2a)或其C-末端羧酰胺类似物(2b)在10μM均未显示出活性，表明在第四个氨基酸位置的苯丙氨酸更有利。
如表1所示，bilaid A(肽1a，H-FvVf-OH)和bilaid C(肽3a，H-YvVf-OH)在10μM显示出活性。相反，具有DLDL(1b)立体化学或LLDD(1c)立体化学的bilaid A的类似物在10μM无活性，并且具有LLLL立体化学(1h)的bilaid A的类似物在10μM时具有很低活性，突出LDLD基序对于维持MOPr活性的重要性。
实施例3：竞争性结合测定(MOPr)
测试了肽相对于MOPr激动剂[3H]DAMGO对hMOPr的竞争性结合。Bilaid A(1a)表现出适度的亲和力(Ki＝3.1μM)，通过C-末端酰胺化反应改善了4倍(1e,Ki＝0.75μM)。含N-末端酪氨酸的Bilaid C(3a)在hMOPr处显示出亚微摩尔结合(Ki＝210nM)。C-末端酰胺化(3b)使MOPr亲和力增加了一倍(Ki＝93nM)，与1e相对于1a的结合增加一致。N-末端酪氨酸的二甲基化([Dmt]-vVf-NH2(3c))(Dmt＝2,6-二甲基-L-酪氨酸)，参见Zhao等人J PharmacolExp Ther(2003)307(3):947-54)导致进一步提高至产生Ki为1.1nM。肽3c(指定为bilorphin)相对于hDOPr以近200倍的选择性与hMOPr结合(Ki＝190nM)并且相对于hKOPr以700倍的选择性与hMOPr结合(Ki＝770nM)。参见图1和表1。
在22℃下用[3H]DAMGO(0.5nM)加多种浓度的未标记的肽孵育由HEK-293细胞(人胚肾细胞系)中表达的人重组MOPr制备的膜120分钟之后，使用过滤分离然后进行液体闪烁计数程序来确定竞争性MOPr结合。与受体的特异性配体结合定义为在过量的未标记的阿片样物质配体(纳洛酮10μM)的存在下测定的总结合与非特异性结合之间的差异。结果表示为在未标记的目的肽的存在下获得的对照特异性结合的百分比((测量的特异性结合/对照特异性结合)×100)。IC50值(引起对照特异性结合的半数最大抑制的浓度)和希尔系数(nH)通过使用希尔方程曲线拟合对利用平均重复值产生的竞争曲线进行非线性回归分析来确定(Y＝D+[(A-D)/(1+(C/C50nH)]，其中Y＝特异性结合，D＝最小特异性结合，A＝最大特异性结合，C＝化合物浓度，C50＝IC50，并且nH＝斜率)。
实施例4：竞争性结合测定(DOPr)
测试了肽相对于DOPr激动剂[3H]DADLE对hDOPr的竞争性结合。参见图1和表1。
除了在[3H]DADLE(0.5nM)中于22℃下孵育120分钟外，如对于MOPr结合(实施例3)中所述进行与CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系中表达的人重组DOPr(hDOPr)的结合的抑制。
实施例5：竞争性结合测定(KOPr)
测试了肽相对于KOPr激动剂[3H]U69593对hKOPr的竞争性结合。参见图1和表1。
除了在[3H]U69593(2nM)中于22℃下孵育60分钟外，如对MOPr结合(实施例3)中所述进行与CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系中表达的人重组KOPr(hKOPr)的结合的抑制。
实施例6：活化G蛋白的膜片钳记录
为了评估bilorphin的功能活性，在天然表达MOPr但是不表达DOPr或KOPr的大鼠蓝核(locus coeruleus，LC)神经元中进行G蛋白激活的内向整流钾通道(inwardlyrectifying potassium channel，GIRK)电流的膜片钳记录(North等人Proc Natl AcadSci U S A.(1987)84(15):5487-91)。Bilorphin充当了具有比吗啡更大的功效的激动剂。其作用被高MOPr选择性拮抗剂CTAP完全逆转(n＝9，图2A；表1)(Pelton等人J Med Chem(1986)29(11):2370-5)，确定了bilorphin不会作用于LC神经元表达的密切相关受体，例如NOPr或生长抑素受体(Connor等人Br J Pharmacol(1996)119(8):1614-8)。具有乙酰化N-末端(3d)或所有L-立体异构体(3e和3f)的Bilaid C类似物在10至30μM下在LC神经元中无活性，表明游离N-末端和天然LDLD基序对于维持MOPr活性是重要的(表1)。bilorphin在LC神经元中的次最大的部分激动剂样作用已经通过甲硫氨酸脑啡肽的全部激动剂作用的部分拮抗作用所证实。在对MOPr脱敏10分钟后进行测试，以在急性脱敏后产生稳定的活化反应，并降低功能性受体储备(n＝12，图2B)。
脑片电生理学：如先前所述(Sadeghi M等人Br J Pharmacol(2015)172(2):460-8，通过引用并入)从雄性Sprague Dawley大鼠(4-6周龄)制备含有蓝核LC神经元的脑切片。简单地说，将大鼠用异氟烷麻醉并断头。解剖脑并在振动切片机腔室(Leica biosystem,VT100,Wetzlar,Germany)中固定，以制备水平脑切片(280μm)。切下切片并保存在温暖(34℃)的人工脑脊髓液(ACSF)中，其包含以下物质(以mM为单位)：125NaCl、2.5KCl、2CaCl2、1MgCl2、1.25NaH2PO4、25NaHCO3和11葡萄糖，补充有0.01(+)MK801(95％O2-5％CO2)。在记录之前，将切片在温暖的含氧ACSF中孵育至少30分钟。将切片转移到记录室中，同时以约2mL/min的速度用温暖的ACSF(34℃)灌注。使用Multiclamp 700B放大器(Molecular Devices,CA,USA)以-60mV的钳制电位从LC神经元获取全细胞电压钳记录。记录移液管(2-4MΩ)填充有内部溶液，其包含(以mM为单位)：135葡萄糖酸钾、8NaCl、10HEPES、0.5EGTA、2Mg-ATP和0.3Na-GTP；pH 7.3，280-285mOsM。使用Axograph X(Axograph Scientific,Sydney,Australia)在图表模式下以500Hz采集连续电流记录，并且以20-50Hz进行过滤。在整个实验过程中监测串联电阻，并保持<15MΩ；否则，数据将被丢弃。将外向电流测量为基线电流与药物施用峰值电流之间的差异。
实施例7：相对功效和内在功效的评估
还在稳定表达FLAG标记的小鼠MOPr(mMOPr)的AtT20细胞中检查了bilorphin在其它信号传导途径中的相对功效和内在功效(最大响应)(图5)，以能够对偏倚进行分析。为了可靠地确定bilorphin激活G蛋白(GGIRK)的相对内在功效，确保没有MOPr激动剂达到上限作用。β-氯纳曲胺(β-chlornaltrexamine)用于不可逆地灭活足够数量的受体，以将甲硫氨酸脑啡肽的最大响应降低至作用于相同细胞中天然SST受体的超高浓度生长抑素所产生的响应的80％(图4、5)。SST受体的最大激活通常会产生相当于MOPr的最大激活的GGIRK增加(Yousuf等人Mol Pharmacol(2015)88(4):825-35)。在这些条件下，bilorphin、吗啡和内吗啡肽-2均显示出相似的最大响应，表明它们具有相似的内在功效。除了甲硫氨酸脑啡肽外，所有激动剂在脑切片和细胞系中均显示出相似的功效。已知脑切片中甲硫氨酸脑啡肽功效降低是由于通过脑啡肽酶和其它肽酶降解引起的(Williams等人J.Pharmac.Exp.Ther.(1987)243:397-401)。如从脑切片实验预期的，所有三种阿片样物质均具有适度的功效，但低于甲硫氨酸脑啡肽(图5、23A)。相比之下，G蛋白偏倚的小分子激动剂奥塞利定比吗啡或bilorphin显著更低效率地激活GGIRK(图5，23A)。
AtT20细胞中MOPr的表达：
将野生型mMOPr克隆到FLAG标记的pcDNA3.1质粒中，并且在AtT20细胞中以故意降低的表达水平稳定表达(8pmol/mg蛋白；2x105个受体/细胞，通过细胞计数法估计)，如先前Borgland等人J Biol Chem(2003)278(21):18775-84中所述的。对于膜片钳实验，将AtT20细胞在含有4.5g/L葡萄糖、青霉素-链霉素(100μl/ml)、G418(50mg/ml)(Gibco,Invitrogen)和10％FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco,Life Technologies,Australia)中接种到35-mm聚苯乙烯培养皿(Beckton,Dickinson Biosciences)上。将细胞培养物保持在37℃的5％CO2潮湿环境中。孵育24小时后，准备记录细胞。
培养细胞的电生理学：如先前所述进行穿孔的膜片钳记录(Yousuf等人.MolPharmacol.(2015)88(4):825-35)。将移液器从硼硅酸盐玻璃(AM Systems,Everett,WA,USA)中拉出，产生在3.5-4.5MΩ之间的输入电阻，并用含135mM葡萄糖酸钾、3mM MgCl2、10mM HEPES(用KOH调节至pH 7.4)的内部溶液填充。将记录电极首先用这种内部溶液填充，然后用含有200μg/ml两性霉素B(在0.8％DMSO中)的相同溶液重新填充。为了测量IGIRK，在开始测量之前将浴中的KCl浓度增加到20mM(代替NaCl)，并在整个实验过程中保持该状态，如Yousuf等人(2015)先前所述。液体接界电位经计算为+16mV，并且在每次记录开始之前进行调整。使用Axopatch 200B放大器和pCLAMP 9.2软件在37℃的全封闭、温度受控的记录室中记录电流，并使用Digidata 1320(Axon Instruments,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)进行数字化。电流以100Hz采样，以50Hz低通过滤，并记录在硬盘上以供以后分析。使用每2s 200ms的电压步进从-60mV的钳制电位到-120mV记录IGIRK。使用ValveLink 8.2加压夹管阀灌注系统(AutoMate Scientific,USA)将药物直接灌注到细胞上。
数据分析。所有数据显示为平均值±SEM，并使用GraphPad Prism v7进行分析。使用以下计算将所有数据点绘制为弦GIRK电导(GGIRK,nS)：[IGIRK(-60mV)-IGIRK(-120mV)]pA/60mV。
诱导C-末端磷酸化的评估
认为MOPr C-末端的磷酸化、β-抑制蛋白募集和内化有助于靶上阿片样物质镇痛副作用，因此避免了抑制蛋白信号传导的G蛋白偏倚性阿片样物质应显示出改善的副作用谱(Manglik等人Nature(2016)537(7619):185-190；Schmid等人Cell(2017)171(5):1165-1175；DeWire等人J Pharmacol Exp Ther(2013)344(3):708-17)。激动剂诱导的残基丝氨酸375(Ser375)的磷酸化驱动β-抑制蛋白募集和内化(El Kouhen等人J Biol Chem(2001)276(16):12774-80)。在用于确定G蛋白活化的相同AtT20细胞系中测定了bilorphin诱导C-末端磷酸化、β抑制蛋白募集和MOPr内化的活性。使用磷酸位点特异性抗体来确定bilorphin诱导的Ser375磷酸化的活性(图6、9；Doll等人Br J Pharmacol(2011)164(2):298-307)。出人意料的是，与其它阿片样肽(Thompson等人Biochem Pharmacol(2016)113:70-87)不同，bilorphin在饱和浓度(30μM，图6、9、23B)下产生非常低水平的pSer375免疫反应性。Bilorphin的最大磷酸化类似于通过吗啡产生的磷酸化并且显示出小于通过吗啡产生的磷酸化的倾向，已知吗啡在Ser375处仅弱地使MOPr磷酸化(图23)(McPherson等人(2010)Mol Pharmacol78:756-766)。
Ser375磷酸化测定：使稳定表达MOPr的AtT20细胞在盖玻片上生长至约50％汇合。使细胞血清饥饿至少30分钟，然后在不存在或存在指示配体的情况下在37℃下孵育5-10分钟。通过用-30℃甲醇固定细胞然后在冰上孵育10分钟来终止磷酸化作用。将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，然后在柠檬酸钠缓冲液(10mM，0.05％吐温20，pH.6)中于95℃加热20分钟。将细胞用抗磷酸Ser375抗体(1:200，Cell Signalling)在室温下孵育过夜。第二天，用Alexa-fluor 488抗体(1μg/ml，室温下1小时，Thermo Fisher Scientific)对标记的受体进行染色。成像如下所述进行。
成像：使用Zeiss 510Meta激光扫描共聚焦显微镜以1024×1024像素的分辨率使用60×油乳化物镜获取受体磷酸化和内化的图像(实例10)。对于每个实验，包括激光强度、光电倍增管(PMT)电压和偏移的成像参数保持恒定。使用ImageJ软件测量平均荧光强度，以计算单个细胞外部限定区域的平均灰度值。将每个实验归一化，未处理的细胞的平均值作为0％，并且用饱和浓度的Met-enk(30μM)处理的细胞的平均值为100％。
β-抑制蛋白2募集的评估
使用MOPr-萤光素酶和β-抑制蛋白2-YFP构建体，进行BRET测定以确定β-抑制蛋白2募集至受体(图7、9)(Thompson等人Biochem Pharmacol(2016)113:70-87)。与Ser375磷酸化相似，相对于已知的激动剂，饱和浓度的Bilorphin诱导非常低水平的BRET效率，并且也显著低于吗啡(最高30μM)(图7)。
抑制蛋白募集：使用基于BRET的方法检查激动剂诱导的β-抑制蛋白2募集至MOPr。将AtT20细胞铺在10cm的培养皿中，并用C末端标记有Rluc8的MOPr(MOPr-RLuc8)、β-抑制蛋白2-YFP和GRK2(分别为1μg、4μg和2μg)共转染。转染后24小时，将孔重新铺入白色不透明的96孔板(CulturPlate,PerkinElmer)中并使其贴壁过夜。实验前，将细胞用汉克平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)洗涤，并在HBSS中于37℃平衡30分钟。在LUMIstar Omega读板器(BMG LabTech)中进行双荧光/发光测量之前10分钟，将腔肠素h添加至终浓度为5μM。在添加指定的配体之前，测量基线BRET 30秒。将BRET信号计算为YFP在530nm处发射的光与海肾萤光素酶8(RLuc8)在430nm处发射的光之比。
MOPr内化的评估
在激动剂处理30分钟后，以免疫细胞化学的方式评估MOPr内化(图8、9)。与由吗啡诱导的低水平内化和由内吗啡肽-2和甲硫氨酸脑啡肽二者驱动的强劲内化相比，Bilorphin产生了几乎不可检测的MOPr内化(图9)。此外，将bilorphin(10μM)与有效内化的激动剂共孵育降低了内化(使用3μM DAMGO作为激动剂的3个独立实验，数据未显示)。总之，当相对于每种途径中甲硫氨酸脑啡肽的最大响应归一化时，bilorphin显示出与吗啡相似的最大G蛋白功效，并且在从Ser375磷酸化、β-抑制蛋白募集到内化的跨途径的相对功效方面进展性降低(图9)，提示bilorphin是G蛋白偏倚性阿片样物质。
内吞作用测定：使用膜和内化受体的比率染色定量受体内化。简单地说，将表达FLAG标记的MOPr的AtT20细胞用1μg/ml Alexa594缀合的M1单克隆抗FLAG(由具有琥珀酰亚胺酯部分的Alexa-fluor 594制备，Molecular Probes)孵育30分钟以标记膜受体。然后将细胞与指示的激动剂在37℃再孵育30分钟。为了使M1抗FLAG抗体与表面受体分离，将细胞用缺少Mg2+和Ca2+并补充有0.04％EDTA的冰冷PBS(pH 7.4)快速洗涤3次。将细胞在非渗透条件下用PBS中的4％多聚甲醛固定20分钟，然后用抗FLAG多克隆抗体(1μg/ml，室温下2小时，Sigma Aldrich)然后用Alexa-fluor 488山羊抗兔抗体(1μg/ml，室温下1小时，ThermoFisher Scientific)孵育。因此，用Alexa-fluor 488标记表面受体，而用Alexa-fluor594标记内化受体。内化受体的百分比计算为平均594nm荧光强度与594nm和488nm处的总平均荧光强度之比。
在表达GRK2-YFP和β-抑制蛋白2-HA的实验中，使用Alexa-fluor 405山羊抗兔(2μg/mL，室温下1小时，Abcam)作为二抗代替Alexa-fluor 488山羊抗兔，以避免与YFP荧光谱重叠。对于代表性图像，将405nm荧光伪着色为绿色。仅分析YFP阳性细胞的内化。
实施例8：ΔEMAX和Δlogτ确定
操作分析(Operational analysis)是用于量化偏倚信号的事实标准(KenakinCurr Protoc Pharmacol.(2016)74:2.15.1-2.15.15；；Kelly Br J Pharmacol(2013)169(7):1430-46)，其提示bilorphin相对于吗啡而言是G蛋白偏倚性的(图23)，并且其它激动剂(包括抑制蛋白偏倚性内吗啡肽-2)的相对偏倚值与先前报道的相似(Rivero等人MolPharmacol(2012)82(2):178-88)。然而，操作分析需要准确确定EC50，由于非常低的内化功效，准确确定EC50对于bilorphin而言是不切实际的，导致具有较大误差项的较差功能亲和力估计(图23)(Kelly Br J Pharmacol(2013)169(7):1430-46)。从每个途径的最大响应计算ΔEMax比值，并且Δlogτ在不存在上限的信号传导测定中提供偏倚的补充估计，即所有激动剂均为部分激动剂(
等人Sci Rep(2017)7(1):15389；Kelly Br J Pharmacol(2013)169(7):1430-46)。使高内在功效激动剂甲硫氨酸脑啡肽的最大可能GGIRK响应降低到最大可能响应的约80％的当前的测定条件满足此标准。这种方法及相关数据(图18-22；表2)证实了bilorphin相对于吗啡以及强内化肽甲硫氨酸脑啡肽(Thompson等人MolPharmacol(2015)88(2):335-346；McPherson等人(2010)Mol Pharmacol 78:756-766)和内吗啡肽-2(图23)的G蛋白偏倚性。
偏倚计算和统计：在GraphPad Prism 7中，将激动剂浓度响应曲线拟合于三参数浓度响应曲线(约束斜率为1的逻辑函数)，产生曲线位置(EC50)和渐近线(Emax)的估计。由于在所有途径中都减去了基础活性，因此曲线的底部被限制为0。
用于量化激动剂亲和力和准确确定偏倚性信号传导的功效的事实标准是激动的操作模型(Black and Leff Proc R Soc Lond B Biol Sci(1983)220(1219):141-62,Kenakin Mol Pharmacol(2015)88(6):1055-61)。将每种途径的激动剂浓度响应数据拟合于操作模型。系统中的最大作用由参考全激动剂甲硫氨酸脑啡肽定义，并且传感器曲线的斜率限制为1。从测试激动剂内吗啡肽2、bilorphin和吗啡的曲线拟合得出功效(τ)和亲和力(KA)估计值。通过减去每个途径内的参考激动剂甲硫氨酸脑啡肽log(τ/KA)值来将每种激动剂的log(τ/KA)值归一化，以产生Δlog(τ/KA)。跨途径的减法产生了ΔΔlog(τ/KA)，这是每种激动剂的信号传导偏倚的归一化估计值。先前关于操作模型的论文提倡应用合并方差，以增加这些比较的功效(Kenakin s al ACS Chem Neurosci(2012)3(3):193-203)。此方法不适用于此处，或者在任何情况下均具有可变曲线拟合质量，这是由于偏倚性激动剂非常低的信号传导功效，对计算的参数产生了更大的误差并使合并方差的假设无效(表2)。因此，参数的线性组合的标准误差正好在标准规则下传播(Farrance and FrenkelClin Biochem Rev(2012)33(2):49-75,ISO/IEC Guide to Uncertainty inMeasurement)。由于低信号传导功效导致的差的曲线拟合通常会降低ΔΔlog(τ/KA)方法的功效，并阻止对此方法的偏倚估计值进行可靠的解释(图23)。
在所有测试激动剂与参考激动剂进行部分比较的情况下，功效被单独用于量化偏倚(
等人Sci Rep(2017)7(1):15389)。在具有低受体储备的系统中，逻辑函数的渐近线Emax是一种可靠的、无假设且与亲和力无关的功效估计值，接近于操作功效的值。在激动剂占用与效应(例如此处研究的没有信号放大作用的β-抑制蛋白途径)之间存在线性关系的系统中，Emax近似为操作功效‘τ’。
将Emax相对于每个途径内的参考激动剂归一化，并跨比较途径减去以产生Δ归一化Emax，这是偏倚的功效度量。观察到接近于此处给出的跨测量途径的所有部分激动剂的操作亲和力的浓度-响应曲线位置，表明在这种情况下，由于保持排序效能，偏倚并未表现出亲和力驱动。
当相对于甲硫氨酸脑啡肽归一化时，通过首先保守地取两个样本大小中的较低者来计算自由度。在Δ归一化Emax的情况下，可以假设跨途径的方差相等，从而能够对自由度求和。在ΔΔlog(τ/KA)的情况下，使用Welch-Satterwaite方程(ISO/IEC Guide toUncertainty in Measurement)来估计β-抑制蛋白途径的低功效导致的方差和自由度的异质性。
在Δ归一化Emax和ΔΔlog(τ/KA)计算二者中，通过单因素t检验相对于参考激动剂的值0来测试每种激动剂的偏倚。然后使用双样本t检验(适当时相等或不相等的方差)将bilorphin的偏倚与吗啡进行比较。使用Holm-Sidak排序方法(GraphPad Prism 7)在检查的每对通路中对所有比较进行多重调整。
表2
实施例9：过表达GRK-YFP的细胞中的MOPr内化
为了将bilorphin的偏倚与已建立的小的非肽G蛋白偏倚性激动剂奥塞利定进行比较(两者均产生很少的内化)，对过表达GRK2-YFP和B-抑制蛋白2-HA的细胞中的MOPr内化进行检查，其用于增强麻吗啡的内化(Zhang等人Proc Natl Acad Sci U S A(1998)95(12):7157-62)。在GRK2阳性细胞中，吗啡、奥塞利定和bilorphin均产生清晰的内化信号(图10)。定量结果显示，即使在这些放大条件下，bilorphin也诱导与奥塞利定类似的MOPr内化，但是低于饱和浓度下的吗啡(图10、11A、11B)。用ΔEmax方法计算相对于吗啡的偏倚表明，bilorphin显示出与奥塞利定类似或更大的G蛋白偏倚，证明其是新的且潜在更安全的G蛋白偏倚性阿片样物质(图11B)。还参见图11C和11D。
实施例10：分子对接和分子动力学
为了研究是否存在偏倚的构象基础，用bilorphin和内吗啡肽-2在mMOPr处进行了分子对接和分子动力学(MD)模拟(Sutcliffe等人J Mol Biol(2017)429(12):1840-1851)。构象(10,000)来自水中每种肽的1微秒模拟。使用Bristol University Docking Engine(BUDE)(McIntosh-Smith等人Int J High Perform Comput Appl(2015)29(2):119-134)将这些组装体对接至非活性MOPr晶体结构的正构结合口袋(Manglik等人Nature(2016)537(7619):185-190)。目视检查最低能级结构，并根据配体的质子化胺与Asp1473.32之间的距离确定优先级(上标数字遵循针对GPCR残基的Ballesteros-Weinstein编号系统[Ballesteros and Weinstein Methods in Neurosciences(1995)25:366-428]小于
然后将选定的肽-MOPr复合物包埋在脂质和胆固醇双层中，并用于全原子MD模拟以评估结合姿势、残基相互作用和受体构象变化。以不同的初始速度进行了8x125ns的模拟，得到总计1μs的每种肽的轨迹数据。将内吗啡肽-2建模为顺式异构体，因为该构象在与BUDE对接和125ns的MD模拟后具有最稳定且最低的能量结合姿势。
图18A和18B显示了由MD模拟确定的预测的bilorphin的结合姿势。预计Bilorphin在正构结合位点内结合，Dmt-Tyr1朝向MOPr的细胞内侧。四肽链的其余部分向MOPr的细胞外侧延伸，与TM2和TM7顶部的残基接触。还预测内吗啡肽-2在正构位点结合(图18C、18D)，Tyr1的酚基团与His2976.52相互作用，并且肽链的其余部分向ECL1和ECL2以及TM2的顶部延伸。图19A中的RMSD图表明，在与对接姿势的初始偏差为约
之后，bilorphin的结合姿势在1μs的模拟时间内相对稳定。内吗啡肽-2的骨架在其结合姿势中是稳定的，具有由在3个主要姿势之间切换的Phe4芳香环的机动性引入的RMSD图中的一些波动(图19B)。
在整个模拟时间内，两种肽均与MOPr复合物的必需阿片样物质结合残基Asp1473.32保持离子相互作用，并与保守的旋转异构体拨动开关Trp2936.48相互作用(图20A)。两种肽也都与His2976.52相互作用；内吗啡肽-2直接相互作用，而bilorphin在直接相互作用和通过桥连的水分子的氢键合之间切换(图18A中的插图)。但是，这些肽与MOPr结合口袋的相互作用方式有所不同。例如，bilorphin与TM1中的Tyr751.39相互作用，而内吗啡肽-2没有。另一方面，内吗啡肽-2与细胞外环相互作用，在整个模拟时间内与ECL1中的W133ECL1接触，并且与ECL2的Cys217ECL2、Thr218ECL2和Leu219ECL2瞬时相互作用，但bilorphin没有这些相互作用。此外，与吗啡相比，内吗啡肽-2与TM3和TM5的接触数量更多。
主成分分析(PCA)用于检查受体跨膜螺旋的构象变化。拟合以除去系统的整体旋转和平移后，仅从MOPr跨膜结构域的α碳产生协方差矩阵，以避免在分析中包括高度动态的环。将每个时间点的受体构象投影到主要成分(PC)1和2上，并绘制在图20B中。PC1和PC2分别占方差的28.9％和10.9％。两种肽-MOPr复合物均跨PC2采样构象，但基于PC1不同地聚集。通过生成PC1的伪轨迹，并从代表PC1极限的实际模拟中提取结构，我们能够可视化对主成分有贡献的螺旋运动。
如图21所示，PC1主要描述了在接近正构结合位点的受体细胞外区域中的替代构象，并且在螺旋的细胞内部分中存在较小差异。相对于内吗啡肽-2结合受体，bilorphin结合后具有从TM1的中间部分的鼓出和从螺旋束向外的移动。TM2、TM6和TM7的各细胞外末端也有大量运动，并且在TM4中形成的扭结使该螺旋的细胞外部分向结合了内吗啡肽-2的TM3移动。在内吗啡肽2结合受体中，TM3向TM2的较小运动(从而Met1513.36从其初始位置偏移了约
)与在激动剂结合的晶体结构中观察到的TM3的活性构象一致(Huang等人Nature(2015)524(7565):315-21)。正构结合位点周围的螺旋结构的这些替代构象也反映在结合口袋的体积中，因为使用CASTp计算正构结合位点的体积显示bilorphin结合口袋体积是内啡肽-2结合平均1.6倍大(Dundas等人Nucleic Acids Res(2006)34(Web Server issue):W116-8)(图22)。
在MOPr的细胞内侧，PC1描述了与bilorphin结合的MOPr相比，结合有内啡肽-2的TM5、TM6和TM7的向内运动(图21)。
最近解析了与DAMGO结合的MOPr-Gi复合物的冷冻电子显微镜结构(Koehl Nature(2018)558:547-552)。在公开该结构之前，发明人使用此处对于bilorphin和内吗啡肽-2描述的方法在MOPr处用DAMGO进行了MD模拟(图28)。DAMGO的位置以及冷冻-EM结构和模型中的配体残基相互作用(图28)几乎相同，这使我们确信，我们对bilorphin和内吗啡肽-2的对接和MD策略可能与体内发生的配体-MOPr相互作用相关。
因此，对MD数据的分析表明，这些偏倚性相反的肽的不同配体-残基相互作用可能导致通过PCA描述的替代受体构象，并因此导致bilorphin和内吗啡肽-2的相反偏倚谱。
分子动力学：肽构象的产生：肽构象的产生：bilorphin和内吗啡肽-2(EM2)的3D构象异构体(Conformer)是在Chimera建立的(Petterson等人J Comput Chem(2004)25(13):1605-12)。使用了两种内吗啡肽-2构象异构体，其中Tyr1-Pro2肽键被建模为顺式或反式异构体并被视为不同的配体以用于MD模拟和对接。肽在N-末端酪氨酸处质子化并用Antechamber和一般Amber力场进行参数化(Wang等人J Mol Graph Model(2006)25(2):247-60；Wang等人J Comput Chem(2004)25(9):1157-74)。通过在Amber ff14SB力场下在显式溶剂(explicit solvent)(0.15M NaCl和TIP3P水)中对每种肽进行1μs MD模拟来进行构象异构体生成。使用cpptraj(Roe等人J Chem Theory Comput(2013)9(7):3084-95)分析这些轨迹数据，以对于每种肽提取10000个构象用于分子对接。
肽与MOPr的对接：使用Bristol University Docking Engine(BUDE)进行分子对接(McIntosh-Smith等人Int J High Perform Comput Appl.(2015)29(2):119-134)。将肽对接至从拮抗剂结合的MOPr(PDB:4DKL)的X射线晶体结构获得的非活性MOPr模型(Manglik等人Nature(2012)485(7398):321-6)。该蛋白质在Insight II(Accelrys)中如下制备：除去配体和T4溶菌酶，并进行环搜索以找到同源环以在缺失的细胞内环3中建模。通过目视检查选择环，并且将残基改变为正确的小鼠MOPr序列。独立地用bilorphin、顺式内吗啡呔-2和反式内吗啡呔-2三种肽中的每一种进行与该MOPr结构的分子对接。以下描述了一种肽的对接过程。进行多构象异构体对接，使得将肽的10000个构象视为独立分子。将以正构结合位点为中心的大小为15、15、
的盒指定为搜索空间。BUDE的遗传算法用于搜索可用的姿势空间，以获取最佳的能量姿势。对于10,000个肽构象异构体中的每一个，总共采样了105,000个姿势。每个构象异构体的总姿势数为1.57×108，对应于框中的x、y、z平移和所有轴上以10°增量的360°旋转。目视检查50个最低的能量结合姿势，并使配体的质子化胺与Asp1473.32之间的距离约束小于
如下所述，在收集完整的1μs轨迹数据之前，将选定的肽-MOPr复合物用于短(125ns)MD模拟中以评估结合姿势的稳定性。基于对接数据和初始125ns MD模拟，选择了顺式内吗啡肽-2构象异构体进行进一步的模拟。
MD模拟：使用替换方法将每种肽-MOPr复合物包埋在5:5:1比率的POPC:POPE:胆固醇脂质双层中，并且使用CHARMM-GUI软件(Jo等人J Comput Chem(2008)29(11):1859-65)用TIP3P水和NaCl(150mM)将模拟盒(初始尺寸：90、110、
)溶剂化。在LEaP中准备Amber参数拓扑和坐标文件。在10000个步长内将结构最小化，然后将系统在恒定体积和压力并且约束脂质下经过5ps从0K加热到100K，然后经过100ps从100K加热到310K。在恒定压力下进行10轮500ps的平衡，以平衡周期盒的尺寸。在Amber ff14SB和Lipid14力场下以8x125ns的并行步长进行模拟(Maier等人J Chem Theory Comput(2015)11(8):3696-713；Dickson等人J Chem Theory Comput(2014)10(2):865-79)，为每种肽-MOPr复合物产生1μs的模拟数据。使用Langevin恒温器和各向异性Berendsen恒压器控制温度和压力，时间步长为2fs，每100ps写入轨迹。轨迹在VMD(Humphrey等人J Mol Graph(1996)14(1):33-8,27-8)中可视化，使用cpptraj(Roe等人J Chem Theory Comput(2013)9(7):3084-95)进行分析，并在Chimera(Petterson等人J Comput Chem(2004)25(13):1605-12)中制备图像。
主成分分析：将轨迹对准在模拟时间内显示出最小的波动的一组“核心残基”，以去除分析中蛋白质的一般平移和旋转。对所有轨迹的跨膜结构域的α碳的3D笛卡尔坐标进行主成分分析，得出567个特征值。将每个模拟时间点的受体构象投影到前2个PC上，占方差的约40％。
实施例11：体内评估
在体内评估了bilorphin的作用。与载剂相比，皮下(100mg/kg,n＝4)或静脉内(50mg/kg n＝4)施用时，Bilorphin在热板测试中未能抑制伤害感受。相比之下，鞘内注射后bilorphin具有镇痛作用(5nmol/小鼠，峰值效应41±9％MPE n＝4，对比于载剂的0±1.5％，n＝4)，表明缺乏全身活性是由于差的血脑屏障(BBB)渗透性。利用被认为增强BBB渗透性的取代开发了多种bilorphin类似物，包括C-末端附近的糖基化。全身施用后，二糖基化类似物bilactorphin(3g)具有强效镇痛作用(皮下；ED50为34μmol/kg，95％CI＝28-40μmol/kg；图12、13)，与吗啡(ED50为27μmol/kg，95％CI＝24-30μmol/kg；图13)几乎等效，并且被阿片样物质拮抗剂纳曲酮的共施用拮抗(图12)。在静脉内(峰值效应为88.9±11.8，对比于载剂的14.4±1.8％MPE，n＝3-4)或口服施用之后，Bilactorphin也具有活性(图24A、24B)。相比之下，单糖基化类似物(3h)是全身无活性的，与相比于单糖修饰的阿片肽，二糖修饰的阿片肽的全身性施用引起更大镇痛作用一致(Li等人Future Med Chem(2012)4(2):205-26)。这些发现确定了LDLD阿片肽骨架是进一步开发G蛋白偏倚性阿片样物质镇痛剂的可行框架。像bilorphin一样，bilactorphin在AtT20细胞中是强效的部分阿片样物质激动剂(没有MOPr的部分失活)，但与bilorphin相比表现出很小的效能损失(图14、15)。然而，与bilorphin相比，Bilactorphin确实显示出适度的内化和β-抑制蛋白募集，这表明了不会破坏母体bilorphin的G蛋白偏倚的其它取代的潜在优势(图16、17)。
伤害感受(镇痛)测试：所有涉及动物的实验均由悉尼大学动物伦理委员会(University of Sydney Animal Ethics Committee)(AEC，协议号K00/12-2011/3/5650)批准。实验是根据澳大利亚用于科学目的的动物的护理和使用实施规程指南(guidelinesof the Australian code of practice for the care and use of animals forscientific purposes)(National Health and Medical Research Council,Australia,第7版)进行的。在这些实验中要格外小心以尽量减少动物遭受的痛苦，并减少所用动物的数量。将成年雄性C57BL/6小鼠(20-25g)在受控的光照(12:12h，6am开始照明)和气候(18-23℃，40-60％湿度)条件下以每个笼中5-6只圈养在各个通风笼中。食物和水可随意获得。在处理之前，给予小鼠至少7天以使其适应住所设施，并且在测试前由实验者处理4天。在安静、温度控制的房间(21±1℃)在8am至6pm之间进行实验。实验者对所有测试药物是盲性的。在54℃的热板上对动物进行测试，最长截止时间为20秒，以防止组织损伤。终点是后足舔、后足拍打或跳跃。在皮下注射总体积为200μL的吗啡、bilactorphin或载剂(20％PEG400/盐水v/v)之前即刻记录基线潜伏期。注射之后30、60、90、150、210、330和450分钟测试小鼠。最大可能作用的百分比(％MPE)的计算如下：％MPE＝(测试潜伏期-基线潜伏期)/(截止潜伏期-基线潜伏期)×100％。截止潜伏期为20秒。采用单因素ANOVA和Tukey事后多重比较测试评估了显著差异。使用30-90分钟之间每种剂量的最大响应计算bilactorphin和吗啡的剂量响应曲线。将剂量转化为μmol/kg的对数。使用双因素ANOVA比较等摩尔剂量下的数据。
实施例12：体内评估
完全按照上述实施例11中所述测试了图27的肽。实验是根据澳大利亚用于科学目的的动物的护理和使用实施规程指南(National Health and Medical ResearchCouncil,Australia,第7版)进行的。在这些实验中要格外小心以尽量减少动物遭受的痛苦，并减少所用动物的数量。将成年雄性C57BL/6小鼠(20-25g)在受控的光照(12:12h，6am开始照明)和气候(18-23℃，40-60％湿度)条件下以每个笼中5-6只圈养在各个通风笼中。食物和水可随意获得。在处理之前，给予小鼠至少7天以使其适应住所设施，并且在测试前由实验者处理4天。在安静、温度控制的房间(21±1℃)在8am至6pm之间进行实验。实验者对所有测试药物是盲性的。在54℃的热板上对动物进行测试，最长截止时间为20秒，以防止组织损伤。终点是后足舔、后足拍打或跳跃。在皮下注射总体积为200μL的吗啡、肽或载剂(20％PEG400/盐水v/v)之前即刻记录基线潜伏期。注射之后30、60、90、150、210、330和450分钟测试小鼠。最大可能作用的百分比(％MPE)的计算如下：％MPE＝(测试潜伏期-基线潜伏期)/(截止潜伏期-基线潜伏期)x 100％。截止潜伏期为20秒。对于在每种药物或盐水的皮下注射之后5、10、20、30和60分钟测量的热板响应，通过持续60分钟内在指定的时间对乘以测试时间(分钟)的三角形响应区域(秒)进行测量来计算每种药物的1小时内的积分曲线下面积(AUC：以秒为单位的响应X以分钟为单位的时间)。差异采用单因素ANOVA和FisherLSD事后检验进行分析。
讨论
本发明涉及可用于开发新的肽类G蛋白偏倚性阿片样物质的新型肽骨架的鉴定。产生的结果表明，该肽骨架可用于开发具有G蛋白偏倚性药理作用的口服活性阿片样物质激动剂。以前从未从真核生物中分离出这种新型LDLD结构。得到bilorphin的母体天然产物bilaid C(表1中的3a)是一种相对较弱的阿片样物质，并且对于这种河口酵母的阿片样物质激动剂活性的潜在天然功能尚不确定。LDLD结构出人意料的生物稳定性及其新颖的阿片样物质药理学可用于开发更安全的阿片样物质。
已经提出了G蛋白偏倚性阿片样物质激动剂作为改善治疗效果的途径。在已知的对β-抑制蛋白信号传导几乎没有偏倚或具有偏倚性的肽能阿片样物质激动剂中，bilorphin的药理学特征最为罕见，因为与其它天然阿片样肽相比，其具有非典型的G蛋白偏倚性，尽管最近报道了合成的具有G蛋白偏倚性的阿片样物质环肽。Bilorphin可比较地偏向III期候选药物奥塞利定。糖基化产生了通过皮下和口服施用在体内具有活性的类似物，从而验证了bilorphin四肽骨架是进一步开发偏倚性阿片样物质激动剂的平台。这种G蛋白偏倚性激动剂的临床前开发显示出令人惊讶的良好特征，减少了呼吸抑制和便秘。据报道，第一个进入临床试验的此类化合物奥塞利定(TRV130)在镇痛和呼吸抑制活性之间具有更大的窗口，并且在人中比相等镇痛剂量的吗啡似乎更安全。同样，观察到一系列取代的芬太尼类似物产生与增加的G蛋白相关的呼吸抑制相比于β-抑制蛋白2募集更大的治疗窗口。通过计算机筛选与新型受体相互作用开发的PZM21，当与吗啡相比时，似乎是G蛋白偏倚性激动剂。报道了其没有产生呼吸抑制，但是其他人没能重现(Hill等人Br J Pharmacol(26Mar 2018)epub PMID:29582414)。
为了研究偏倚是否可以由bilorphin和内吗啡肽-2与MOPr的差异性相互作用或由各自引发的明显的受体构象变化来解释，对bilorphin或内吗啡肽-2与MOPr结合进行了分子动力学模拟。两种肽都对接至MOPr的正构结合位点，并在配体-残基相互作用中显示出差异，这可能转化为它们不同的偏倚谱。值得注意的是，内吗啡肽-2与ECL2中的残基(包括保守残基Leu219)瞬时相互作用，被认为对于5HT2A和5HT2B受体和其它胺能GPCR处的抑制蛋白偏倚和配体停留时间很重要。相比之下，bilorphin不接触细胞外环。肽和MOPr结合口袋之间的相互作用似乎转化为通过PCA观察到的不同构象变化。具体而言，与内吗啡肽2结合时，TMD的细胞外部分向内移动，从而使正构结合口袋相对于bilorphin结合MOPr收缩。在受体TM5、TM6和TM7的细胞内侧，根据结合的肽采用不同的位置，主要是在存在内吗啡肽-2的情况下这些螺旋的向内移动。如先前所建议的，可能需要与G蛋白或抑制蛋白相互作用才能使MOPr达到完全活性状态，因此毫不奇怪的是，在受体和激动剂各自的这些MD模拟中，复合物的细胞内部分没有采样在激动剂和纳米抗体结合的晶体结构中捕获的完全活性构象。
虽然将配体诱导的GPCR构象与G蛋白或抑制蛋白的差异偶联相关联在目前仍然具有挑战性，但是我们在此处建模的配体-残基相互作用和MOPr螺旋构象之间的细微差异可能代表了由偏倚性相反的肽bilorphin和内吗啡肽-2诱导的初始变化，这导致它们不同的信号传导谱和可能的不利作用。
然而，尚不确定G蛋白偏倚本身是否是有助于改善诸如奥塞利定(TRV130)等药物的安全性的唯一性质(Singla等人J Pain Res(2017)10:2413-2424)。使用受体敲低，此处显示TRV130与吗啡相比具有非常低的G蛋白功效。对于据称比吗啡更安全的另一种阿片样物质PZM21已报道了相似的结果(Hill等人Br J Pharmacol(26Mar 2018)epub PMID:29582414)，并且在其它研究中很难评估新型偏倚性激动剂的G蛋白功效，因为测定对吗啡的相对较低的G蛋白功效不敏感(Schmid等人Cell(2017)171(5):1165-1175；DeWire等人JPharmacol Exp Ther(2013)344(3):708-17)。鉴于具有非常低G蛋白功效的激动剂(例如丁丙诺啡)没有强烈的偏倚性，但与高效激动剂如吗啡和美沙酮相比被良好表征为产生较少的呼吸抑制和过剂量死亡，因此极低的G蛋白功效可能确实是副作用谱的临床前和临床研究中的混淆因素。由于bilorphin是强烈G蛋白偏倚性的并且具有与吗啡几乎相等的G蛋白功效，因此其类似物将有助于直接测试偏倚性的影响，而不会因不同的G蛋白功效而被混淆。
序列表
<110> 悉尼大学
昆士兰大学
<120> 镇痛剂及其使用方法
<130> 99391WOP00
<150> AU 2018901944
<151> 2018-05-31
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 青霉菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 1
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<220>
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<220>
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<213> 青霉菌
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 10
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<223> C-末端羧酰胺
<400> 12
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 14
Phe Gly Val Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表1肽2f
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<223> C-末端羧酰胺
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 21
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 丝氨酸羟基糖基化 (β连接至D-葡萄糖部分)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 22
Xaa Val Val Phe Ser
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<211> 4
<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> C-末端羧酰胺
<400> 24
Xaa Val Val Phe
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽6
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 4-羟基酰化的2,6-二甲基-L-酪氨酸
<220>
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<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端乙氧基
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Xaa Val Val Phe
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽7
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 2,6-二甲基-L-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-末端氨基甲酸乙酯基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 26
Xaa Val Val Phe
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 2,6-二甲基-L-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-末端邻羟基苄叉亚胺基
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 27
Xaa Val Val Phe
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽9
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-末端叠氮基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 2,6-二甲基-L-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 28
Xaa Val Val Phe
1
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-末端乙酰氧基甲氧基羰基 (-CO2CH2OC(O)CH3) 基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 2,6-二甲基-L-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 29
Xaa Val Val Phe
1
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽11
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 2,6-二甲基-L-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> D-氨基酸 (D-Val)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 30
Xaa Val Val Phe Pro Asn Leu Ala Glu Lys Ala Leu Lys Ser Leu
1 5 10 15
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸 (D-Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> D-氨基酸 (D-Trp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> L-青霉胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> C-末端羧酰胺
<400> 31
Phe Cys Tyr Trp Arg Thr Xaa Thr
1 5
Claims (138)
1.一种分离的肽，包含式I
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R2是氢、C1-C3烷基或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
其中R1和R2可以一起形成一个生物可逆部分；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
2.根据权利要求1所述的肽，其中R6是C1-C6烷基，并且R7是C1-C6烷基。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的肽，其中R6和R7独立地选自丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或异亮氨酸的侧链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其中R6和R7各自是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
5.根据权利要求1所述的肽，其中R6和R7各自是苏氨酸侧链。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中R3和R4是-CH3；并且R5是-OH。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽，其中R1和R2各自是氢。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中R1、R2、R3、R4和R5各自是氢。
9.一种分离的肽，包含式I
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基和第三个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R1是氢、单键或-C1-C3烷基；
R2是氢、单键或-C1-C3烷基；
R3和R4独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R5是氢、-OH或-O(C1-C3)烷基；
R6是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R7是氨基酸的侧链或C1-C6烷基；
R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分；
其中当R8是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化；
其中当R8是接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R1或R2之一是单键时，R1和R2之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化。
10.根据权利要求9所述的肽，其中R1和R2之一是氢，并且R1和R2之一是-CH3。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的肽，其中R5是-O(C1-C3)烷基，优选-OCH3。
12.根据权利要求11所述的肽，其中R3和R4是-CH3。
13.根据权利要求11所述的肽，其中R3和R4是氢。
14.根据权利要求9或权利要求10所述的肽，其中R3和R4是-CH3并且R5是-OH。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的肽，其中R6和R7各自是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
16.根据权利要求9至14中任一项所述的肽，其中R6和R7各自是苏氨酸侧链。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的肽，其中R1或R2之一是单键，R1和R2之一是氢，并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键。
18.根据权利要求17所述的肽，其中所述L-氨基酸残基具有至少一个N-末端甲基化。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的肽，其中所述L-氨基酸残基是L-丙氨酸残基。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的肽，其中R8是接头。
21.根据权利要求20所述的肽，其中所述接头包括基于氨基酸的接头、基于肽的接头、包含氨基酸的接头、和/或基于马来酰亚胺的接头，和/或其组合。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的肽，其中R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
23.根据权利要求22所述的肽，其中R8是
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的肽，其中Y1是-NH2。
25.根据权利要求22或权利要求23所述的肽，其中Y1是1至约30个L-氨基酸残基。
26.根据权利要求25所述的肽，其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
27.根据权利要求26所述的肽，其中Y1是1至约11个L-氨基酸残基。
28.根据权利要求1至19中任一项所述的肽，其中R8是1至约30个L-氨基酸残基。
29.根据权利要求28所述的肽，其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
30.根据权利要求29所述的肽，其中R8是1至约11个L-氨基酸残基。
31.根据权利要求30所述的肽，其中所述1至约11个L-氨基酸残基包含至少一个糖基化的L-氨基酸残基，优选包含至少一个O-糖基化的L-丝氨酸残基。
32.根据权利要求1所述的肽，其中R1和R2是氢；R3、R4和R5是氢；R6和R7各自是-CH(CH3)2；并且R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
33.根据权利要求1所述的肽，其中R1和R2是氢；R3和R4都是氢或都是-CH3；R5是-OH；R6和R7各自是-CH(CH3)2；并且R8是-OH、-NH2、-O(C1-C3烷基)、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的肽，其中R8是-NH2、
Y1是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的肽，其中R8是
Y1是-OH或-NH2；并且
Y2是氢或糖部分，优选二糖部分。
36.根据权利要求32至34中任一项所述的肽，其中Y1是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
37.根据权利要求36所述的肽，其中Y1是1至约11个L-氨基酸残基。
38.根据权利要求1至19、22、23和32至35中任一项所述的肽，其中Y2是糖部分，优选二糖部分。
39.根据权利要求38所述的肽，其中Y2的所述二糖部分是乳糖部分或蜜二糖部分。
40.根据权利要求38所述的肽，其中Y2的所述二糖部分是乳糖部分。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的肽，其中所述二糖部分通过β键连接。
42.根据权利要求1所述的肽，其中R8是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
43.根据权利要求42所述的肽，其中R8是1至约11个L-氨基酸残基。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、S-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。
45.根据权利要求44所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个O-糖基化的L-氨基酸残基。
46.根据权利要求45所述的肽，其中O-糖基化的氨基酸残基是L-丝氨酸残基。
47.根据权利要求1至6、22至31和38至36中任一项所述的肽，其中R1和R2一起形成生物可逆部分。
48.根据权利要求47所述的肽，其中所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)。
49.根据权利要求1至6、22至31和38至36中任一项所述的肽，其中R1或R2之一是氢并且R1或R2之一是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
50.根据权利要求1至5、7、22至31和38至46中任一项所述的肽，其中R5是生物可逆部分。
51.根据权利要求50所述的肽，其中所述生物可逆部分是-C(＝O)CH3。
52.根据权利要求1所述的肽，选自由以下组成的组：
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)；
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(肽11)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N，以形成N-末端叠氮基(肽9)。
53.一种肽，包括：
L-AA-L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Tyr-D-Thr-L-Thr-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Dmt-D-Val-L-Val-D-Phe-接头-糖部分；
L-AA-L-Dmt-D-Thr-L-Thr-D-Phe-接头-糖部分，
其中L-AA是任选地具有至少一个N-末端-CH3的任何L-氨基酸残基；
其中L-Tyr或L-Dmt的羟基任选地被烷基化；并且
其中所述接头优选地是L-Ser或L-Thr。
54.一种肽，包含式II
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R10是氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，
其中当R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是生物可逆部分时，所述生物可逆部分优选地是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3；
其中R9和R10可以一起形成一个生物可逆部分，其中优选地所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或任选地包含糖部分的生物可逆部分；
R14是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
55.根据权利要求54所述的肽，其中R14是C1-C6烷基。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的肽，其中R14选自丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或异亮氨酸的侧链。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的肽，其中R14是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
58.根据权利要求54所述的肽，其中R14是苏氨酸侧链。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的肽，其中R11和R12是-CH3；并且R13是-OH。
60.根据权利要求54至59中任一项所述的肽，其中R9和R10各自是氢。
61.根据权利要求54至58中任一项所述的肽，其中R9、R10、R11、R12和R13各自是氢。
62.根据权利要求54至58中任一项所述的肽，其中
R9、R10、R11、R12和R13是氢；R14是C1-C4烷基；R15是-OH。
63.一种肽，包含式II
其中，从N-末端计数，第一个氨基酸残基是L-氨基酸残基，并且第二个氨基酸残基和第四个氨基酸残基是D-氨基酸残基；其中
R9是氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；
R10是氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；
R11和R12独立地选自氢或C1-C3烷基，优选-CH3；
R13是氢、-OH或-O(C1-C3)烷基；
R14是氨基酸的侧链或C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选-CH(CH3)2；
R15是氢、-OH或生物可逆部分；并且
R16是-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2、
1至约30个L-氨基酸残基、或接头；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化；
其中当R16是接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，并且
其中当R9或R10之一是单键时，R9或R10之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化。
64.根据权利要求63所述的肽，其中R9和R10之一是氢，并且R9和R10之一是-CH3。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的肽，其中R13是-O(C1-C3)烷基，优选-OCH3。
66.根据权利要求65所述的肽，其中R11和R12是-CH3。
67.根据权利要求65所述的肽，其中R11和R11是氢。
68.根据权利要求63或权利要求64所述的肽，其中R11和R12是-CH3；并且R13是-OH。
69.根据权利要求63所述的肽，其中R9或R10之一是单键，R9或R10之一，并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键。
70.根据权利要求69所述的肽，其中所述L-氨基酸残基具有至少一个N-末端甲基化。
71.根据权利要求69或权利要求70所述的肽，其中所述L-氨基酸残基是L-丙氨酸残基。
72.根据权利要求63至71中任一项所述的肽，其中R14是缬氨酸侧链(-CH(CH3)2)。
73.根据权利要求63至71中任一项所述的肽，其中R14是苏氨酸侧链。
74.根据权利要求54至73中任一项所述的肽，其中R16是-NH2。
75.根据权利要求54至73中任一项所述的肽，其中
R16是
或1至约30个L-氨基酸残基；
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分；并且
其中当R16是1至约30个L-氨基酸残基时，(1)所述L-氨基酸残基任选地是可以任选地被糖部分、优选二糖部分糖基化的残基，并且(2)C-末端任选地被酰胺化。
76.根据权利要求75所述的肽，其中R16是1至约30个L-氨基酸。
77.根据权利要求76所述的肽，其中R16是1至约25个L-氨基酸残基、1至约20个L-氨基酸残基、1至约15个L-氨基酸残基、1至约11个L-氨基酸残基、或1至约5个L-氨基酸残基。
78.根据权利要求77所述的肽，其中R16是1至约11个L-氨基酸残基。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、S-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。
80.根据权利要求89所述的肽，其中所述L-氨基酸残基包含至少一个O-糖基化的氨基酸残基。
81.根据权利要求80所述的肽，其中所述O-糖基化的氨基酸残基是L-丝氨酸残基。
82.根据权利要求63至72中任一项所述的肽，其中R16是接头。
83.根据权利要求82所述的肽，其中所述接头包括基于氨基酸的接头、基于肽的接头、包含氨基酸的接头、和/或基于马来酰亚胺的接头，和/或其组合。
84.根据权利要求54所述的肽，其中
R16是
Y3是-OH、-NH2、或1至约30个L-氨基酸残基；并且
Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
85.根据权利要求54至73中任一项所述的肽，其中
R16是
Y3是-OH或-NH2；并且Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
86.根据权利要求54所述的肽，其中R9、R10、R11、R12和R13是氢；R14是-CH(CH3)2；R15是-OH；并且
R16是
Y3是-OH或-NH2；并且Y4是氢或糖部分，优选二糖部分。
87.根据权利要求54至73、75和84至86中任一项所述的肽，其中所述糖部分是二糖部分，优选地其中所述二糖部分通过β键连接。
88.根据权利要求87所述的肽，其中所述二糖部分是乳糖部分或蜜二糖部分，优选地其中所述二糖部分通过β键连接。
89.根据权利要求87或权利要求88所述的肽，其中所述二糖部分是乳糖部分，优选地其中所述乳糖部分通过β键连接。
90.根据权利要求54至59中任一项所述的肽，其中R9和R10一起形成生物可逆部分。
91.根据权利要求90所述的肽，其中所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)。
92.根据权利要求54至59中任一项所述的肽，其中R9或R10之一是氢并且R9或R10之一是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
93.根据权利要求54至59中任一项所述的肽，其中R13是生物可逆部分。
94.根据权利要求93所述的肽，其中所述生物可逆部分是-C(＝O)CH3。
95.根据权利要求54所述的肽，其为
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2。
96.一种分离的肽，包含式III
X1-X2-X3-X4
(III)
其中：
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X1是选自L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的L-氨基酸残基，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，任选地所述残基在4-位以任选地包含糖部分的生物可逆部分进行O-取代；
X2是D-氨基酸残基，优选D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸或D-异亮氨酸，更优选D-缬氨酸；
X3是甘氨酸或L-氨基酸残基，其中当X3是L-氨基酸残基时，X3优选地是L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，更优选L-缬氨酸；
X4是选自D-酪氨酸或D-苯丙氨酸的D-氨基酸残基，其中当X4是D-酪氨酸时，任选地所述残基以生物可逆部分进行O-取代；
R17和R18独立地选自氢或任选地包含糖部分的生物可逆部分，或者R17和R18一起形成任选地包含糖部分的生物可逆部分；并且
其中所述肽是MOPr激动剂。
97.根据权利要求96所述的肽，其中所述C-末端部分是-C(＝O)OH、
并且Y5是-OH，并且Y6是氢或糖部分；所述肽在C-末端还包含约5个、8个、11个、12个、20个或26个另外的L-氨基酸残基。
98.根据权利要求96或权利要求97所述的肽，其中R17和R18各自是氢，X2是D-缬氨酸残基，X3是甘氨酸或L-缬氨酸残基，X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分。
99.一种分离的肽，包含式III
X1-X2-X3-X4
(III)
其中：
X1是包含N-末端部分-NR17R18的N-末端氨基酸残基；
X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C3烷基)-C(＝O)NH2、
或接头的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分；
X1是选自L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的L-氨基酸残基，其中当X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸时，任选地所述残基在4-位以C1-C3烷基进行O-取代；
X2是D-氨基酸残基，优选D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸或D-异亮氨酸，更优选L-苏氨酸或D-缬氨酸；
X3是甘氨酸或L-氨基酸残基，其中当X3是L-氨基酸残基时，X3优选地是L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸，更优选L-苏氨酸或L-缬氨酸；
X4是选自D-酪氨酸或D-苯丙氨酸的D-氨基酸残基，其中当X4是D-酪氨酸时，任选地所述残基以生物可逆部分进行O-取代；
R17和R18独立地选自氢、单键或-C1-C3烷基，优选-CH3；并且
其中当X4包含接头时，所述接头包含糖部分，优选二糖部分，例如乳糖，
其中当R17或R18之一是单键时，R17或R18之一是氢并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键，所述L-氨基酸残基可以任选地在N-末端烷基化，优选地单甲基化；并且
其中所述肽是MOPr激动剂。
100.根据权利要求99所述的肽，其中所述C-末端部分是-C(＝O)OH、
并且Y5是-OH，并且Y6是氢或糖部分；所述肽在C-末端还包含约5个、8个、11个、12个、20个或26个另外的L-氨基酸残基。
101.根据权利要求99或权利要求100所述的肽，其中X2是D-缬氨酸残基，X3是甘氨酸或L-缬氨酸残基，X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分。
102.根据权利要求99或权利要求100所述的肽，其中X2是D-苏氨酸残基，X3是L-苏氨酸残基的甘氨酸，X4包含选自-C(＝O)OH、-C(＝O)NH2、
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是氢或糖部分，优选二糖部分。
103.根据权利要求99至102中任一项所述的肽，其中R17和R18之一是氢，并且R17和R18之一是-CH3。
104.根据权利要求99至102中任一项所述的肽，其中R17或R18之一是单键，R17或R18之一是氢，并且所述单键是至L-氨基酸残基的肽键。
105.根据权利要求104所述的肽，其中所述L-氨基酸残基具有至少一个N-末端甲基化。
106.根据权利要求104或权利要求105所述的肽，其中所述L-氨基酸残基是L-丙氨酸残基。
107.根据权利要求99所述的肽，其中X4包含接头。
108.根据权利要求107所述的肽，其中所述接头包括基于氨基酸的接头、基于肽的接头、包含氨基酸的接头、和/或基于马来酰亚胺的接头，和/或其组合。
109.根据权利要求99至108中任一项所述的肽，其中X1是L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸，并且其中所述L-酪氨酸或2,6-二甲基-L-酪氨酸在4-位以C1-C3烷基进行O-取代。
110.根据权利要求109所述的肽，其中X1是2,6-二甲基-L-酪氨酸，并且其中2,6-二甲基-L-酪氨酸在4-位以C1-C3烷基进行O-取代。
111.根据权利要求96至106中任一项所述的肽，其中X4包含选自
的C-末端部分，其中Y5是-OH或-NH2，并且Y6是二糖部分，优选地其中所述二糖部分通过β键连接。
112.根据权利要求111所述的肽，其中所述二糖部分是乳糖部分，优选地其中所述乳糖部分通过β键连接。
113.根据权利要求97所述的肽，其中所述另外的L-氨基酸包含至少一个N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化、S-糖基化或Se-糖基化的氨基酸残基。
114.根据权利要求96、97和111至113中任一项所述的肽，其中R17和R18一起形成生物可逆部分。
115.根据权利要求114所述的肽，其中所述生物可逆部分是
或＝N＝N(叠氮基部分)。
116.根据权利要求96、97和111至113中任一项所述的肽，其中R17或R18之一是氢，并且R17或R18之一是-C(＝O)OCH2CH3或-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3。
117.根据权利要求96所述的肽，选自由以下组成的组：
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe(肽1a，Biliad A)；
L-Phe-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽1e)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe(肽3a，Bilaid C)；
L-Tyr-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3b)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2(肽3c；Bilorphin)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Ser(β-Lac)-NH2(肽3g；Bilactorphin)；
L-Phe-D-Val-Gly-D-Tyr-NH2(肽2d)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-OCH2CH3(肽4)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-L-Pro-L-Asn-L-Leu-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Ala-L-Leu-L-Lys-L-Ser-L-Leu-NH2(肽11)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2OC(＝O)CH3(肽10)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分
(肽8)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽5)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe--OCH2CH3，其中2,6-二甲基-L-酪氨酸上的羟基取代有生物可逆部分-C(＝O)CH3(肽6)；
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分-C(＝O)OCH2CH3(肽7)；和
2,6-二甲基-L-酪氨酸-D-Val-L-Val-D-Phe-NH2，其中N-末端取代有生物可逆部分＝N＝N以形成N-末端叠氮基(肽9)。
118.根据权利要求1至117中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比：
(a)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr的C-末端磷酸化诱导；和/或
(b)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导；和/或
(c)表现出对比于G蛋白活化的较低比率的MOPr内化诱导。
119.根据权利要求1至117中任一项所述的肽，其中所述肽与吗啡相比表现出对比于G蛋白活化的较低比率的β-抑制蛋白募集诱导。
120.根据权利要求1至119中任一项所述的肽，其中在使用hMOPr的测定中，所述肽在约10μM的浓度的下与载剂相比显示出cAMP形成的抑制提高。
121.根据权利要求1至120中任一项所述的肽，其中在使用[3H]DAMGO的竞争性结合测定中，所述肽显示出Ki小于约5μM、小于约3.5μM、小于约1μM、小于约0.8μM、小于约0.5μM或小于约0.3μM。
122.根据权利要求121所述的肽，其中所述肽显示出Ki小于约0.5μM或小于约0.3μM。
123.根据权利要求1至122中任一项所述的肽，其中所述肽穿过血脑屏障。
124.药物组合物，包含根据权利要求1至123中任一项所述的肽和至少一种药用辅料。
125.根据权利要求124所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于口服施用。
126.根据权利要求124所述的药物组合物，其中所述肽被糖基化，并且所述组合物被配制成用于口服施用、通过注射施用或鞘内施用。
127.根据权利要求124所述的药物组合物，其中所述肽未被糖基化，并且所述组合物被配制用于鼻腔施用或鞘内施用。
128.一种治疗疼痛的方法，包括向受试者施用根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
130.根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。
131.根据权利要求130所述的用途，其中所述疼痛是术后疼痛、与神经损伤相关的疼痛、与骨折相关的疼痛、与烧伤相关的疼痛或与创伤相关的疼痛。
132.一种递送镇痛的方法，包括向受试者施用根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物。
133.根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物在制备用于递送镇痛的药物中的用途。
134.根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物，用于在递送镇痛的方法中使用。
135.一种治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用，包括向受试者施用根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
137.根据权利要求1至123中任一项所述的肽或根据权利要求124至127中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，治疗疼痛或递送镇痛的方法，所述方法具有降低的不利副作用、优选地与吗啡相比降低的不利副作用。
138.根据权利要求137所述的用途，其中所述不利副作用是胃肠(GI)抑制和/或呼吸抑制。
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