CN112439468A - 旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，包含6个模块，分别为中心控制与计算模块、系统支撑平台、热循环模块、多尺度液滴生成模块、激发光源模块以及荧光图像探测模块。多尺度液滴生成模块通过离心力驱动在各个体积的液滴室中生成不同体积的液滴。热循环模块实现热循环PCR扩增过程。中心控制与计算模块对整个系统的运行进行控制，并通过分子液滴数字PCR产物的荧光图像计算目标核酸分子的浓度等信息。提供多尺度液滴生成方案以及旋转热循环方案，可以对多种样本同步进行液滴数字PCR检测，在增加数字PCR检测的灵敏度与动态范围的同时使仪器更加集成化、小型化。

Description

旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统

技术领域

本发明属于PCR仪器设备技术领域，涉及一种用于基因分析与检测等领域研究的液滴数字聚合酶链式反应(PCR)系统，尤其是涉及一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统。

背景技术

基因分析与检测已经成为当前生命科学研究的最重要的内容之一，在基因的数字化检测与分子计数等定量技术中，数字PCR技术由于其大规模平行单分子量级荧光PCR扩增的技术本质可实现核酸分子的绝对定量，较实时定量PCR技术等具有多种独特的优势，如无需标准曲线与参考、对反应抑制物不敏感、高检测灵敏度、精确度、鲁棒性等。数字PCR技术在痕量核酸分子检测，极微量靶核酸分子浓度检测，拷贝数变异，等位基因不平衡表达等诸多应用中具有其他技术不可替代的优势，因此数字PCR技术目前已经广泛应用于临床诊断，转化医学与精准医学，食品安全检测，基因编辑等研究应用之中。

由于其重要的应用价值，数字PCR技术得以不断地发展与提升，其中基于液滴的数字PCR技术作为一种新型技术具有其独特的应用优势。液滴数字PCR技术通过将反应试剂划分成大规模微小液滴作为反应室，在每个液滴中同时独立地进行PCR反应，通过对扩增后液滴的荧光分析计算目标基因的拷贝浓度。由于微流控技术的发展，可通过大尺度的纳升甚至皮升液滴的生成为液滴数字PCR技术提供更高的通量、灵敏度与动态范围，并且液滴数字PCR具有极大的灵活性与可扩展性，方便仪器系统的集成化、小型化与自动化控制。

本发明所提出的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，将数字PCR的样品划分、热循环、荧光检测等流程高度集成化、小型化，采用离心力驱动阶梯乳化方式生成大规模不同尺度的液滴，通过旋转液滴于不同温度场之内实现热循环过程，可实现多种核酸分子高灵敏度与高动态范围的同步PCR扩增与检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种多样本高动态范围检测、高集成化、小型化的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，该仪器包括中心控制与计算模块、系统支撑平台、热循环模块、多尺度液滴生成模块、激发光源模块、荧光图像探测模块等6个功能模块。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其中心控制与计算模块，为仪器系统的运行提供调度算法，为其他功能模块工作提供控制驱动信号，包括：对液滴圆盘液滴生成过程及热循环过程的转速的计算与控制，对热循环模块中铜板层温度的计算与控制，对光学系统支撑组件的机械系统进行控制转换滤光片，以及对所探测荧光图像进行分析计算。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其系统支撑平台，为其他功能模块提供物理支撑，底部中心处具有支撑轴结构，支撑轴上具有步进电机驱动多尺度液滴生成模块中的液滴圆盘旋转，步进电机的转速受中心控制与计算模块所提供的驱动信号控制。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，可通过系统支撑平台中的激光光源模块支撑组件切换对应荧光激发波长的滤光片并固定光源位置，通过系统支撑平台中的荧光图像探测模块支撑组件切换对应荧光发射波长的滤光片，并可支撑荧光图像探测模块进行线性扫描。在荧光探测过程中，通过旋转液滴圆盘中特定液滴室至探测区域，可通过线性调节荧光图像探测模块的位置探测液滴分区中不同液滴室中的液滴图像。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，可通过系统支撑平台中的激光光源模块支撑组件二维调整光源照射区域，通过系统支撑平台中的荧光图像探测模块支撑组件二维调整荧光图像探测模块的位置。在荧光图像探测过程中，可调整激光光源与探测器组件至液滴圆盘的任意区域，探测相应液滴阵列的荧光图像。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其热循环模块，底部采用铝制圆盘作为基底。基底之上为热电制冷片层，在PCR过程结束后对仪器进行散热。在圆盘上精细划分多个独立的温度区域，分别提供PCR热循环过程所需的不同温度场。温度区域包括覆有绝缘涂层的加热丝，通过电场控制加热至特定温度，其上为导热铜板层。在不同温度分区之间填充隔热材料防止温度场之间的耦合，隔热材料包括但不限于：玻璃纤维、气凝胶毡等。可根据热循环反应时间及液滴圆盘转速来调节和设计圆盘上温度区域的数量及各个温度区域的面积(即圆心角)，液滴圆盘旋转一周可经历多个热循环。在热循环首个阶段所对应的铜板区域之前放置有光电二极管，用以启动热循环过程以及检测液滴所经历的热循环次数。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其多尺度液滴生成模块，基底圆盘由热塑性塑料如COC、PS、PMMA等材料制成，圆盘之上为液滴分区，通过旋转圆盘产生离心力，利用流体通道与储液腔之间的尺寸差异，通过阶梯乳化产生液滴。基底圆盘下面装载一个发光二极管，与热循环模块中的光电二极管配合启动热循环过程以及检测液滴所经历的热循环次数。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其多尺度液滴生成模块，包含多个液滴分区，可通过在不同液滴分区中添加的不同核酸分子目标模板及相应反应物，大规模并行产生阶梯乳化液滴，提高液滴生成效率，同时实现多种核酸分子的液滴数字PCR检测。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其多尺度液滴生成模块中的液滴分区，包括试剂入口、试剂腔、主流路、支流路以及多尺度的液滴室等部分。试剂腔通过主流路、支流路与多个尺度的液滴室相连。其中每条支流路中均包括多个流体通道，试剂在流体通道与液滴室接口处通过阶梯乳化形成液滴，可以通过设计支流路中流体通道的尺寸参数产生特定体积的液滴。每个支流路连接一个液滴室，由此便可实现在多尺度液滴室中生成多尺度体积的液滴，满足不同浓度核酸样品中单分子检测的需求，以适应不同核酸样品分子的数字PCR检测。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其多尺度液滴生成模块中的液滴室包含气体腔与PCR腔。液滴室的内部为六边形结构PCR腔，腔内深度由中心向边缘递减，且中心处深度大于液滴尺寸，边缘处深度小于二倍液滴尺寸，以防止液滴重叠并达到依靠腔室内部的压力差排出气泡的功能。液滴室的外部为六边形结构气体腔，收集从PCR腔中排出的气体。液滴室顶部采用热封膜进行密封。PCR腔与气体腔的结构包括但不限于六边形结构。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其激发光源模块，包括白光光源，聚焦透镜，以及多个滤光片。可通过中心控制及计算模块控制输出光的光强，并通过控制激发光源模块的支撑组件的机械转动调解控制滤光片的转换，进而调制激发光的波长。

本发明所提出的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，其荧光图像探测模块，包括不同滤光片，显微成像透镜组以及电荷耦合元件(CCD)。通过中心控制及计算模块控制荧光图像探测模块的支撑组件，根据PCR过程所添加探针的荧光发射波长转换对应的滤光片。所探测得到荧光图像传输至中心控制及计算模块，通过图像处理算法提取目标值，计算待检测DNA的初始浓度等信息。

本发明旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的控制方法，步骤如下：

1)添加试剂后，控制液滴圆盘高速转动，通过离心力驱动液体产生阶梯乳化液滴；液滴生成完成后，控制热循环模块中各个温度区域中的加热丝加热至指定温度，并匀速旋转液滴圆盘，使其在指定温度区域持续对应热循环过程时间，进行PCR扩增；

2)在液滴圆盘旋转时，光电二极管接收发光二极管所发射光信号，对液滴圆盘的热循环过程进行计数；

3)荧光图像探测过程中，控制光源输出强度，并调节支撑组件转换对应波长的滤光片；

4)二维调节光学探测器指定探测区域，转换对应波长的滤光片，对液滴阵列进行荧光成像；

5)在荧光图像分析中，首先读取液滴荧光图像，之后对荧光图像放射变换进行校正，通过滤波的方法去除荧光图像背景噪声，之后对图像进行分割，提取荧光点像素区域，进而提取连通域，通过统计连通区域计算荧光液滴数量，最后通过泊松分布模型计算核酸分子的初始浓度。

本发明中的一种旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，具有如下特点：

1.将数字PCR的样品划分、热循环、荧光检测等流程高度集成化、小型化、自动化，便于仪器小型化，降低仪器操作难度，减低仪器成本。

2.划分圆盘提供不同的温度场，通过同轴旋转液滴圆盘实现热循环过程。

3.通过多个液滴分区的设置可以实现多样本同步检测。

4.采用离心力驱动阶梯乳化方式生成大规模不同尺度的液滴，适用于不同样本的数字PCR检测分析，且对于一种样本划分不同尺度的液滴可提高检测动态范围。

附图说明

图1是本发明公开的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的整体结构图；

图中：

1：中心控制与计算模块2：系统支撑平台3：热循环模块4：多尺度液滴生成模块5：激发光源模块6：荧光图像探测模块。

图2是本发明公开的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的热循环模块结构图；

图中：

201：温度区域202：光电二极管203：隔热填充区域。

图3是本发明公开的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的多尺度液滴生成模块结构图；

图中：

301：基底302：液滴分区303：发光二极管(底部)。

图4是本发明公开的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的多尺度液滴生成模块中液滴分区结构图；

图中：

401：PCR反应试剂试剂入口402：试剂腔403：主流路404：支流路405：其他试剂入口406：气体腔407：PCR腔408：一级液滴室409：二级液滴室410：三级液滴室411：四级液滴室。

图5是本发明公开的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的多尺度液滴生成模块中阶梯乳化液滴生成示意图；

图中：

501：支流路通道502：液滴室。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统做出详细说明。

如图1所示，旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，包括中心控制与计算模块1、系统支撑平台2、热循环模块3、多尺度液滴生成模块4、激发光源模块5、荧光图像探测模块6个功能模块。

本发明公开的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统的工作过程是：

如图4所示，用户将PCR反应试剂从PCR反应试剂入口401加入到试剂腔402中，反应试剂包括：待扩增的DNA模板，引物，DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸，二价金属阳离子，TaqMan探针或荧光染料等。从其他试剂入口405向液滴室408中加入油相液体及表面活性剂，油相液体包括但不限于：全氟烷烃，二甲基硅油，液体石蜡。旋转液滴圆盘通过离心力驱动液体流入主流路403中，进而分散进入到各个支流路404中的并行流体通道。如图5所示，试剂通过支流路中的并行流体通道分别进入到不同尺度的液滴室408-411中，形成阶梯乳化液滴。液滴进入到液滴室中的PCR腔407中，PCR腔407中的气泡可通过腔内的压力差排出到气体腔406中，进而在每个液滴室的PCR腔407中均匀分布对应体积的单层液滴阵列。如图3所示，在一个液滴圆盘上可以分布多个液滴分区，因此可提供多种样本同时进行液滴数字PCR扩增。

在各个液滴室形成液滴之后便进行热循环过程。由中心控制与计算模块计算得到在每个温度下所需的时间，进而调节液滴圆盘的转速。

如图2所示，对热循环模块中加热圆盘的铜板区域通过电场进行温度控制，使之达到预设温度。基底301上设置有液滴分区303，之后匀速旋转液滴圆盘，光电二极管202接收到液滴圆盘中发光二极管303的信号时启动热循环过程。液滴圆盘旋转一周，分别通过多个独立的温度区域201，在不同的温度场中依次完成“高温变性——低温退火——引物延伸”等PCR扩增过程，203为隔热填充区域，之后每当光电二极管202再次接收到发光二极管303的信号时，即液滴分区302中的液滴完成了一次或多次热循环过程，以此对PCR循环过程进行计数。

热循环PCR扩增完成之后，通过调节激发光源模块5中的滤光片与光源的发光强度出射特定波长及强度的激发光，激发液滴中PCR扩增产物产生荧光，进而使用荧光图像探测模块6通过调节滤光片接受特定波长的荧光图像，进而通过荧光图像处理提取每个液滴中是否含有目标核酸分子，最终通过统计学分析计算目标核酸分子的初始浓度等信息。

本发明所提出的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应(PCR)仪器系统，将数字PCR的样品划分、热循环、荧光检测等流程高度集成化、小型化，采用离心力驱动阶梯乳化方式生成不同尺度的大规模液滴，通过旋转液滴于不同温度场之内实现热循环过程，可实现多种核酸分子高灵敏度与高动态范围的同步PCR扩增与检测。

本发明公开和揭示的所有组合可以通过借鉴本文公开内容产生，尽管本发明的组合已通过详细实施过程进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的装置进行拼接或改动，或增减某些部件，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容之中。

Claims (10)

1.旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，包括中心控制与计算模块、系统支撑平台、热循环模块、多尺度液滴生成模块、激发光源模块、荧光图像探测模块6个功能模块；

所述中心控制与计算模块为控制仪器系统的运行：

1)控制系统支撑平台中的组件进行激发光源模块及荧光图像探测模块中的光路调制；

2)控制热循环模块中温度区域的加热；

3)控制多尺度液滴生成模块中液滴生成以及热循环过程的圆盘旋转转速；

4)荧光图像探测模块所探测液滴中的核酸分子产物的荧光图像经中心控制模块计算分析后得到核酸样品信息。

2.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，所述中心控制与计算模块，为仪器系统的运行提供调度算法，为其他功能模块工作提供控制驱动信号，包括：对液滴圆盘液滴生成过程及热循环过程的转速的计算与控制，对热循环模块中铜板层温度的计算与控制，对光学系统支撑组件的机械系统进行控制转换滤光片，以及对所探测荧光图像进行分析计算。

3.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，所述系统支撑平台，为其他功能模块提供物理支撑，底部中心处具有支撑轴结构，支撑轴上具有步进电机驱动多尺度液滴生成模块中的液滴圆盘旋转，步进电机的转速受中心控制与计算模块所提供的驱动信号控制。

4.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，通过系统支撑平台中的激光光源模块支撑组件切换对应荧光激发波长的滤光片并固定光源位置，通过系统支撑平台中的荧光图像探测模块支撑组件切换对应荧光发射波长的滤光片，并支撑荧光图像探测模块进行线性扫描：在荧光探测过程中，通过旋转液滴圆盘中特定液滴室至探测区域，通过线性调节荧光图像探测模块的位置探测液滴分区中不同液滴室中的液滴图像。

5.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，通过系统支撑平台中的激光光源模块支撑组件二维调整光源照射区域，通过系统支撑平台中的荧光图像探测模块支撑组件二维调整荧光图像探测模块的位置：在荧光图像探测过程中，调整激光光源与探测器组件至液滴圆盘的任意区域，探测相应液滴阵列的荧光图像。

6.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，所述热循环模块，基底之上为热电制冷片层；在圆盘上精细划分若干个独立的温度区域，分别提供PCR热循环过程所需的不同温度场；温度区域包括覆有绝缘涂层的加热丝，通过电场控制加热至特定温度，其上为导热铜板层；在不同温度分区之间填充隔热材料；根据热循环反应时间及液滴圆盘转速来调节和设计圆盘上温度区域的数量及各个温度区域的面积(即圆心角)；在热循环首个阶段所对应的铜板区域之前放置有光电二极管，用以启动热循环过程以及检测液滴所经历的热循环次数。

7.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，所述多尺度液滴生成模块，基底圆盘之上为液滴分区，通过旋转圆盘产生离心力，利用流体通道与储液腔之间的尺寸差异，通过阶梯乳化产生液滴；基底圆盘下面装载一个发光二极管，与热循环模块中的光电二极管配合启动热循环过程以及检测液滴所经历的热循环次数。

8.根据权利要求1所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，所述多尺度液滴生成模块，包含若干个液滴分区，可通过在不同液滴分区中添加的不同核酸分子目标模板及相应反应物，并行产生阶梯乳化液滴。

9.根据权利要求8所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，包括试剂入口、试剂腔、主流路、支流路以及多尺度的液滴室，试剂腔通过主流路、支流路与多个尺度的液滴室相连；其中每条支流路中均包括多个流体通道，试剂在流体通道与液滴室接口处通过阶梯乳化形成液滴，通过设计支流路中流体通道的尺寸参数产生特定体积的液滴；每个支流路连接一个液滴室，实现在多尺度液滴室中生成多尺度体积的液滴。

10.根据权利要求9所述的旋转热循环式多尺度液滴数字聚合酶链式反应仪器系统，其特征在于，液滴室包含气体腔与PCR腔，液滴室的内部为六边形结构PCR腔，腔内深度由中心向边缘递减，且中心处深度大于液滴尺寸，边缘处深度小于二倍液滴尺寸；液滴室的外部为六边形结构气体腔，收集从PCR腔中排出的气体。

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