CN112426565A - 一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物纳米材料技术领域，具体来说是一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法和应用，本发明先在硫酸钙素镁颗粒表面包覆纳米聚多巴胺，然后在纳米聚多巴胺表面接枝透明质酸，最后将透明质酸与羟丙基甲基纤维素进行交联反应，得到能够做为软骨支架的透明质酸修饰的载药复合纳米材料。本发明制备得到的载药复合纳米材料能够被注射至软骨组织内，达到修复重建组织或器官、恢复软骨组织功能，且随着细胞增殖，支架材料不断降解，继而使得药物释放并起到药物治疗的目的。

Description

一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物纳米材料技术领域，具体来说是一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸是广泛分布在软结缔组织细胞外基质中的主要蛋白多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，在临床医学中具有广泛的应用。在医药领域，透明质酸及其衍生物作为优良的药物载体，能够达到药物增稠、药物缓释、促进药物透皮能力及靶向性的目的；透明质酸作为眼用制剂的媒介，能够明显提高药物生物利用度，且具有保湿润滑、抗炎和促修复作用；作为药物缓释载体，能够延缓药物释放速度，且对一些生物大分子药物还具有生物黏附作用；作为抗肿瘤药物的靶向载体，能够增加抗肿瘤药在肿瘤和淋巴结中的吸收和滞留时间，提高药物的疗效，因此透明质酸的应用逐渐受到广泛关注。
透明质酸是由β-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键交替接连的D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰葡萄胺构成，既是软骨细胞外基质的重要糖胺聚糖，也是滑液的主要成分，透明质酸现已成为软骨组织的理想材料，其优势在于：(1)可显著抑制软骨溶解，具有抗炎作用；(2)透明质酸为天然软骨中蛋白聚糖的主要组成成分，在蛋白聚糖聚集体形成中发挥重要作用；(3)能够经酶、透明质酸酶和自由基降解。
现有技术公开了发明名称为“一种硫酸软骨素镁透明质酸水凝胶及其制备方法与应用、一种凝胶产品”，申请号为“202010378644.X”，申请日为“2020.05.07”的专利申请，并具体提出了一种硫酸软骨素镁透明质酸水凝胶的制备方法，通过交联剂将透明质酸与硫酸软骨素镁进行交联，硫酸软骨素镁负载于透明质酸凝胶上，通过较纯硫酸软骨素镁对关节炎软骨损伤等起到更优的效果。现有技术仅是通过透明质酸实现硫酸软骨素镁的缓释效果；而组织工程中，组织细胞依附于由生物材料所制备的支架上，将支架植入体内的病损部位后，使之最终达到修复重建组织或器官、恢复功能的目的，随着细胞增殖，支架材料不断降解，被细胞外基质代替，逐渐形成具有正常功能的组织，因此需要一种能够降解的载药支架，不仅实现组织的修复，而且能够对损伤部位进行治疗。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供了一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法和应用，本发明制备得到的载药复合纳米材料能够被注射至软骨组织内，达到修复重建组织或器官、恢复软骨组织功能，且随着细胞增殖，支架材料不断降解，继而使得药物释放并起到药物治疗的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的制备：
按质量比0.01-0.1：1称取硫酸钙素镁和多巴胺，并将多巴胺制成0.3-0.6mg/mL的水溶液，于45-55℃、pH为9-10条件下搅拌6-8h，然后经冷却、过滤并水洗至中性，得到纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(2)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的修饰：
将透明质酸与亚硫酰氯于无水惰性溶剂中搅拌2-3h，水洗至中性并干燥后加入至二氯甲烷中，再加入10wt％的NaOH溶液，于冰水浴中加入步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒并搅拌2-3h，后室温下搅拌3-4h，水洗至中性，得到透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
其中，透明质酸与亚硫酰氯的物质的量之比为1-1.3：1，纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和透明质酸的质量之比为1:1-2；
(3)透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备：
将步骤(2)制得的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素溶液催化交联，制备得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
优选的，所述步骤(2)的无水惰性溶剂为无水乙醚或无水四氢呋喃。
优选的，所述步骤(3)的催化交联方法为：
将步骤(2)的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素溶液加入至pH为12-13的NaOH溶液中并搅拌4-6h，向反应体系中加入催化剂，再于45-55℃下继续反应24-36h，反应结束后调节pH至中性，洗涤、干燥，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料；
其中，所述羟丙基甲基纤维素溶液的浓度为40-80mg/mL，纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的质量与羟丙基甲基纤维素溶液的体积之比为1mg：2-4mL；所述催化剂为1,2,7,8-环氧辛烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚，且透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和羟丙基甲基纤维素的总量与催化剂的质量之比为1：0.5-0.6。
优选的，所述步骤(3)的洗涤、干燥条件为：依次采用乙醇、丙酮和水清洗3-5次，再于40-50℃下恒温干燥至恒重。
优选的，所述透明质酸为1000-1800KDa。
优选的，所述透明质酸修饰的载药复合纳米材料的粒径为200-300nm。
本发明还保护了制备方法制备得到的透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
本发明还保护了透明质酸修饰的载药复合纳米材料在做为软骨支架对软骨修复中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1、本发明先制备得到了纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒，聚多巴胺是一种能够粘附在各种材料表面的蛋白，多巴胺在碱性水溶液中于氧气环境下，邻苯二酚基团去质子化并氧化生成具有邻苯二醌结构的多巴胺-苯醌，然后多巴胺-苯醌发生内环化，接着进一步氧化、重排、交联反应得到聚多巴胺纳米颗粒，聚多巴胺纳米颗粒连接到硫酸钙素镁材料表面，由于聚多巴胺具有丰富的表面官能团(-OH，-NH2)，表现出特殊的表面活性，具有很强的吸附能力，因此其在硫酸钙素镁材料表面成膜，将硫酸钙素镁包覆于聚多巴胺纳米颗粒内部，得到纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒，采用聚多巴胺包覆硫酸钙素镁的原因是：聚多巴胺具有良好的亲水性、生物相容性、稳定性以及生物可降解性，因此将其作为对硫酸钙素镁表面修饰的材料，不仅改善硫酸钙素镁的突释而且延长体内的循环时间。
2、本发明在亚硫酰氯的作用下，使得透明质酸表面羧基酰化变为酰氯，再与聚多巴胺表面的酚羟基在碱性条件下进行反应，使得透明质酸接枝在聚多巴胺纳米颗粒的表面，透明质酸作为药物缓释载体具有诸多优点，但是其稳定性较差，对强酸、强碱、热、自由基及透明质酸酶敏感，容易发生降解，限制其在药物载体中的应用，而将其通过化学改性后能够有效提升其稳定性，因此在本申请中将其接枝在聚多巴胺纳米颗粒表面以提升透明质酸的稳定性。
3、为了得到支架，申请人还将透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素在催化剂作用下制备得到了非凝胶状态的透明质酸修饰的载药复合纳米材料，能够被注射至软骨组织内，而且随长期的使用逐渐发生降解，继而使得药物释放并起到药物治疗的目的，不仅实现了软组织的支撑，而且实现了药物的缓释。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，用以较佳的实施例配合详细的说明。
实施例1
一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的制备：
按质量比为0.01：1称取硫酸钙素镁和多巴胺，并将多巴胺制成0.3mg/mL的水溶液，于pH为9条件下，于55℃下搅拌6h，然后经冷却、过滤并水洗至中性，得到纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(2)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的修饰：
将步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和透明质酸按照1:1称取，按照透明质酸与亚硫酰氯的物质的量之比为1：1称取亚硫酰氯，将透明质酸与亚硫酰氯于无水乙醚中搅拌2h，水洗至中性并干燥后加入至二氯甲烷中，再加入10wt％的NaOH溶液，于冰水浴中缓慢加入步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒并搅拌2h，后室温下搅拌4h，水洗至中性，得到透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(3)透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备：
调节NaOH溶液的pH至12，将步骤(2)的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与浓度为40mg/mL的羟丙基甲基纤维素溶液按照1mg:2mL称取后与NaOH溶液混合均匀，搅拌4h，向反应体系中加入催化剂1,2,7,8-环氧辛烷，再于55℃下继续反应24h；
其中，透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素的总量与1,2,7,8-环氧辛烷的质量之比为1:0.5；
调节pH至中性后，依次采用乙醇、丙酮和水清洗3次，再于40℃下恒温干燥至恒重，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
实施例2
一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的制备：
按质量比为0.05：1称取硫酸钙素镁和多巴胺，并将多巴胺制成0.5mg/mL的水溶液，于pH为9条件下，于50℃下搅拌7h，然后经冷却、过滤并水洗至中性，得到纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(2)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的修饰：
将步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和透明质酸按照1:1.5称取，按照透明质酸与亚硫酰氯的物质的量之比为1.2：1称取亚硫酰氯，将透明质酸与亚硫酰氯于无水乙醚中搅拌2.5h，将透明质酸与亚硫酰氯混合回流，水洗至中性并干燥后加入至二氯甲烷中，再加入10wt％的NaOH溶液，于冰水浴中缓慢加入步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒并搅拌2.5h，后室温下搅拌3.5h，水洗至中性，得到透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(3)透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备：
调节NaOH溶液的pH至12，将步骤(2)的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与浓度为60mg/mL的羟丙基甲基纤维素溶液按照1mg:3mL称取后与NaOH溶液混合均匀，搅拌5h，向反应体系中加入催化剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚，再于50℃下继续反应30h；
其中，透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素的总量与1,4-丁二醇二缩水甘油醚的质量之比为1:0.55；
调节pH至中性后，依次采用乙醇、丙酮和水清洗4次，再于45℃下恒温干燥至恒重，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
实施例3
一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的制备
按质量比为0.1：1称取硫酸钙素镁和多巴胺，并将多巴胺制成0.6mg/mL的水溶液，于pH为10条件下，于45℃下搅拌8h，然后经冷却、过滤并水洗至中性，得到纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(2)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的修饰：
将步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和透明质酸按照1:2称取，按照透明质酸与亚硫酰氯的物质的量之比为1.3：1称取亚硫酰氯，将透明质酸与亚硫酰氯于无水乙醚中搅拌3h，将透明质酸与亚硫酰氯混合回流，水洗至中性并干燥后加入至二氯甲烷中，再加入10wt％的NaOH溶液，于冰水浴中缓慢加入步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒并搅拌3h，后室温下搅拌3h，水洗至中性，得到透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(3)透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备：
调节NaOH溶液的pH至13，将步骤(2)的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与浓度为80mg/mL的羟丙基甲基纤维素溶液按照1mg:4mL称取后与NaOH溶液混合均匀，搅拌6h，向反应体系中加入催化剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚，再于45℃下继续反应36h；
其中，透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素的总量与1,4-丁二醇二缩水甘油醚的质量之比为1:0.6；
调节pH至中性后，依次采用乙醇、丙酮和水清洗5次，再于50℃下恒温干燥至恒重，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
本发明实施例1-实施例3制得的透明质酸修饰的载药复合纳米材料均能够做为软骨支架并具有一定的稳定性，且效果相近，下面以实施例2为例，对实施例2的样品进行体外有效性评价和缓释作用评价，具体如下：
一、体外有效性评价
动物实验研究
方法；
以小型猪作为动物模型，小型猪双侧膝关节均进行制作模型，在小型猪膝关节股骨负重部位，使用软骨打孔装置制作膝关节直径为10mm的全层软骨缺损，同时使用本发明制得的透明质酸修饰的载药复合纳米材料填充软骨缺损处，逐层缝合手术切口，允许实验动物在笼内自由活动。
于术后6个月、12个月、18个月和24个月，抽取实验动物外周血进行生化指标检测；对实验动物膝关节进行核磁共振扫描检测软骨缺损填充情况，修复组织与宿主组织的结合以及修复软骨与软骨下骨的结合情况；处死实验动物取股骨标本，分别对软骨缺损区域以及正常软骨区域的弹性模量、最大压缩强度和修复组织边界状态进行分析，以检测修复组织的生物力学特性；使用MicroCT检测软骨下骨重塑情况；并进行组织学切片进行番红O染色研究。
结果：
生化指标检测结果表明：小型猪体内未见周围组织坏死、明显炎症反应和感染等症状；
核磁共振扫描检测结构表明：六个月有软骨再生，直至个24月，软骨没有蜕变，术后18个月软骨缺损填充接近90％，术后18-24个月软骨缺损填充达到96％，说明18-24个月时药物大量释放，促进胶原合成；修复组织均为透明软骨组织；修复组织与宿主组织无缝连接，修复组织中软骨层与软骨下骨层无缝连接。
MicroCT结果表明：通过关节镜和开放手术在小型猪关节软骨缺损植入透明质酸修饰的载药复合纳米材料，术后2月组织表面光滑、无纤维化，术后6个月实现诱导关节软骨形成并维持其表型，术后12个月后再生软骨在负重和力学刺激下无退变。
生物力学特性结果表明：修复软骨组织最大压缩强度4.25±0.79，为正常软骨的最大压缩强的43.8％，关节软骨修复组织的折合弹性模量为1.0-1.2MPa，为正常软骨的33-40％，伸展强度达到10-25Mpa；猪膝关节全层软骨完全修复，组织内无裂痕、表面平整、软骨限窝明显且与宿主组织整合良好。
番红O染色结果表明：术后4周，番红O染色显示软骨上1/2失染；术后8周，番红O染色显示软骨上1/3失染；术后16周，番红O染色显示软骨1/4失染，结果表明，术后软股组织在逐渐修复，软骨表层纤维化逐渐消失。
二、降解作用评价
将120只平均体重为100g的小鼠，平均分为12组，每组10只，均于皮下注射给药100mg实施例2的载药复合纳米材料，每间隔1个月随机选取其中1组小鼠，共选取6组，将其皮下药物取出，称重，测量药物降解的程度，并得出如下结果：
表1 1-6个月皮下取药测量药物降解的程度
Figure BDA0002842090950000151
通过上述对比可知，随药物在体内时间的延长，载药复合纳米材料逐渐进行降解，并在经历6个月之后，其含剩余89.6g，说明制备得到的载药复合纳米材料能够做为稳定的软骨支架，并且在体液环境中逐渐降解。
将剩余的6组每间隔1个月随机选取其中1组小鼠，将其皮下药物取出，称重，测量药物降解的程度，并得出如下结果：
表2 7-12个月皮下取药测量药物降解的程度
Figure BDA0002842090950000161
随小鼠的生长，药物降解的程度逐渐增加，并在12个月的残留量仅剩6.4％，聚多巴胺、透明质酸均降解完全，仅剩余药物，说明本发明能够进行降解并缓慢释放。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的制备：
按质量比0.01-0.1：1称取硫酸钙素镁和多巴胺，并将多巴胺制成0.3-0.6mg/mL的水溶液，于45-55℃、pH为9-10条件下搅拌6-8h，然后经冷却、过滤并水洗至中性，得到纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
(2)纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的修饰：
将透明质酸与亚硫酰氯于无水惰性溶剂中搅拌2-3h，水洗至中性并干燥后加入至二氯甲烷中，再加入10wt％的NaOH溶液，于冰水浴中加入步骤(1)的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒并搅拌2-3h，后室温下搅拌3-4h，水洗至中性，得到透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒；
其中，透明质酸与亚硫酰氯的物质的量之比为1-1.3：1，纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和透明质酸的质量之比为1:1-2；
(3)透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备：
将步骤(2)制得的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素溶液催化交联，制备得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的无水惰性溶剂为无水乙醚或无水四氢呋喃。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的催化交联方法为：
将步骤(2)的透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒与羟丙基甲基纤维素溶液加入至pH为12-13的NaOH溶液中并搅拌4-6h，向反应体系中加入催化剂，再于45-55℃下继续反应24-36h，反应结束后调节pH至中性，洗涤、干燥，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料；
其中，所述羟丙基甲基纤维素溶液的浓度为40-80mg/mL，纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒的质量与羟丙基甲基纤维素溶液的体积之比为1mg：2-4mL；所述催化剂为1,2,7,8-环氧辛烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚，且透明质酸修饰的纳米聚多巴胺包覆硫酸钙素镁颗粒和羟丙基甲基纤维素的总量与催化剂的质量之比为1：0.5-0.6。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的洗涤、干燥条件为：依次采用乙醇、丙酮和水清洗3-5次，再于40-50℃下恒温干燥至恒重。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述透明质酸为1000-1800KDa。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述透明质酸修饰的载药复合纳米材料的粒径为200-300nm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的透明质酸修饰的载药复合纳米材料。
8.根据权利要求7所述的透明质酸修饰的载药复合纳米材料在做为软骨支架对软骨修复中的应用。
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