CN112386590B - 一种抑制多重耐药铜绿假单胞菌生物膜形成的化合物 - Google Patents

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Abstract

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是引起慢性感染和医院感染的常见病原菌之一，对免疫功能低下和囊性纤维化患者可以造成严重和持续性感染。抗生素的使用不仅不能根除PA感染，还会形成多重耐药菌株，这使得常规抗菌药物对PA感染治疗困难。本发明发现化合物N‑(3‑环丁内酯)‑4‑溴苯丁酰胺对耐药铜绿假单胞菌具有显著的生物膜抑制效果，可将其应用于防治PA感染。

Description

一种抑制多重耐药铜绿假单胞菌生物膜形成的化合物
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及将酰化高丝氨酸内酯类化合物用于抑制耐药铜绿假单胞菌(resistant Pseudomonas aeruginosa)生物膜形成，及其在防治创面感染、呼吸道、消化道感染等临床感染问题上的应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是引起慢性感染和医院感染的常见条件致病菌，是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌。2020年全国细菌耐药监测报告显示，铜绿假单胞菌的临床分离率居于第四位。对于机体免疫功能低下和囊性纤维化患者，铜绿假单胞菌可以造成严重和持续性的感染。尽管使用大量抗生素治疗可使90％的囊性纤维化患者在慢性铜绿假单胞菌肺部感染中存活超过10年，但使用抗生素并不能根除该慢性感染。
由于铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药性很强，对多种抗生素表现出天然耐药和获得性耐药，且近年来随着抗生素的广泛使用，导致多重耐药菌株的出现，这都给临床治疗铜绿假单胞菌感染带来困难。在2020年全国细菌耐药监测报告中显示，对临床分离得到的9530株铜绿假单胞菌进行药敏试验，发现其对多种常用抗生素耐药，其中：铜绿假单胞菌对替卡西林的耐药率为39.6％，对头孢他啶、哌拉西林、美罗培南、头孢哌酮、氨曲南和亚胺培南的耐药率为20-30％，对环丙沙星、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星的耐药率为15-20％。铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药形式越发严峻，PA感染已成为临床治疗的重点和难点。
多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制复杂，包括细胞膜通透性改变、产生灭活酶或修饰酶、药物作用靶点改变和生物膜形成等。其中，铜绿假单胞菌生物膜的形成是造成患者持续感染的主要原因。铜绿假单胞菌在接收外界信号后，在自身调控网络的协同作用下，会依附于固体表面，并产生胞外多糖、基质蛋白和胞外DNA等大分子物质形成高度结构化的膜状复合物。该生物膜可以帮助细菌定植、提高细菌对抗生素的抵抗性和对宿主免疫反应的抵抗能力等。铜绿假单胞菌形成生物膜后，可分泌胞外多糖，通过屏障作用阻碍抗生素的渗透，使抗生素无法作用于菌体，同时胞外多糖还可以阻止化学反应性杀菌剂的活化。研究发现，与浮游生物相比，生物膜中的细菌对抗生素的抗药性高达1000倍。因此，使用抗生素不仅不能根除铜绿假单胞菌感染，还会引起严重的耐药性。由于耐药铜绿假单胞菌菌株的增加，针对PA感染的常规抗菌药物疗法难以取得预期效果。抑制铜绿假单胞菌生物膜形成及其生物膜致病性成为防治PA感染的主要途径之一。
许多革兰氏阴性细菌利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作为信号分子调控群体感应(quorum sensing,QS)，形成生物膜来对抗抗生素或杀菌剂，铜绿假单胞菌的耐药性及致病性皆来源于此。铜绿假单胞菌中两种重要的QS系统是LasI/LasR和RhlI/RhlR，这两者都是依赖于AHL信号分子调控基因表达从而进行细胞间信息交流。Las系统合成LasI蛋白酶产生3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(N-3-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone,3-oxo-C12-HSL,OdDHL)，由LasR受体结合。RhlI系统以N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯(N-butyryl-L-homoserine lactone,C4-HSL,BHL)为信号分子，由RhlR受体结合。铜绿假单胞菌LasI/LasR和RhlI/RhlR系统通过调节相关基因表达，从而调控生物膜的形成、毒力因子包括绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和蛋白水解酶的产生及细菌群集运动等行为。Morkunas B等人基于天然铜绿假单胞菌信号分子OdDHL的结构合成了一系列类似物，通过其对野生型铜绿假单胞菌毒力因子绿脓菌素分泌的研究，发现该类化合物可以抑制野生型铜绿假单胞菌群体感应。因此，我们选择用AHL类似物作为群体感应抑制剂，通过抑制生物膜形成及其生物膜致病性来治疗铜绿假单胞菌感染。
本专利使用的多重耐药铜绿假单胞菌为临床分离菌株，对其进行药敏试验，发现该分离菌株对庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、头孢吡肟和亚胺培南等抗生素耐药，这导致为数不多的有效抗生素在临床使用上效果不佳。此外，生物膜是PA产生耐药的重要机制之一，细菌能够通过生物膜的形式生存,可免受抗菌药物的杀伤作用和机体免疫反应。研究发现，虽然铜绿假单胞菌对有些抗菌药物敏感性好，但由于生物膜的存在，无法根除嵌入生物被膜中的细菌，从而导致感染复发，临床治疗效果差。因此，本专利选用临床分离铜绿假单胞菌作为耐药菌株，评估化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺对其生物膜形成的抑制效果，从而将其应用于治疗由铜绿假单胞菌生物膜造成的感染。
本发明发现化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺对耐药铜绿假单胞菌具有显著的生物膜抑制效果。将本发明化合物与抗生素联用后，在抑制耐药菌生物膜形成后，可使有效的抗生素能够更好地抑制其生长繁殖，为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供重要的理论依据。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种酰化高丝氨酸内酯类化合物在抑制耐药铜绿假单胞菌(resistant Pseudomonas aeruginosa)生物膜形成中的应用，所述化合物的通式为：
Figure BDA0002789337310000021
其中n＝0，1，2；R＝CH3，或OCH3，或CF3，或Br，或F，或NO2。
所述酰化高丝氨酸内酯类化合物优选为：
Figure BDA0002789337310000031
本发明的目的之一是提供一种酰化高丝氨酸内酯类化合物在制备抑制和杀伤革兰氏阴性菌药物中的应用。
本发明的目的之一是提供一种酰化高丝氨酸内酯类化合物在制备抑制和杀伤耐药铜绿假单胞菌药物中的应用。
本发明的目的之一是提供一种酰化高丝氨酸内酯类化合物在制备抑制耐药铜绿假单胞菌生物膜的形成药物中的应用。
本发明的目的之一是提供一种酰化高丝氨酸内酯类化合物在制备耐药铜绿假单胞菌抑制剂中的应用。
本发明的目的之一是提供一种酰化高丝氨酸内酯类化合物在制备防治PA感染的靶向药物中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明公开的化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺能够有效抑制革兰氏阴性菌生物膜形成。(2)本发明化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺能够显著性地抑制耐药铜绿假单胞菌生物膜形成及其生物膜致病性，可应用于防治PA感染。
附图说明
图1为本发明的生物膜抑制剂对铜绿假单胞菌正常生长的影响
图2为本发明的生物膜抑制剂对耐药铜绿假单胞菌正常生长的影响
具体实施方式
以下提供具体实施例以实现本发明所述的技术方案，但不限于这些实施例。
实施例1化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺对耐药铜绿假单胞菌正常生长的影响
挑已复苏的耐药铜绿假单胞菌接种于LB液体培养基中培养24h后，用LB培养基将菌液浓度调整为2.0×107CFU/mL。向耐菌液中分别加入终浓度为10、50、100及200μM的化合物，加入96孔板中，150μL/孔，以不含生物膜抑制剂的菌液(含有终浓度为0.1％的DMSO)作为对照，放置于37℃的恒温培养中培养24h，用酶标仪检测600nm处的OD值，每组做6个平行孔。
从图2可以看出，与对照组相比，化合物在10-200μM的使用浓度范围内，对细菌的正常生长没有影响，说明化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用并不是通过抑制细菌生长实现的。
实施例2化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺对耐药铜绿假单胞菌生物膜形成的影响
按实施例1所述方法培养耐药铜绿假单胞菌结束后，将96孔板内的菌液吸掉，每孔加入280μL无菌水洗涤2次，以除去游离的菌体，之后用干净的滤纸将孔内残留的液体吸干，往每孔中加入1％的结晶紫溶液150μL，染色15min。染色结束后，将孔内的结晶紫溶液吸掉，加入280μL无菌水洗涤3次，用干净的滤纸将孔内残留的液体吸干。向每孔中加入33％的乙酸溶液150μL，溶解生物膜-结晶紫复合物后，用酶标仪检测570nm处的OD值，每组做6个平行孔。
数据采用mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
从表1中可以看出，化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺在10-200μM浓度范围内对铜绿假单胞菌生物膜形成具有显著的抑制作用(p＜0.05)。当化合物的浓度为200μM时，对耐药铜绿假单胞菌生物膜的抑制率达到51.59％。
表1本发明的生物膜抑制剂对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响
Figure BDA0002789337310000041
本发明通过实验证实了化合物N-(3-环丁内酯)-4-溴苯丁酰胺)对耐药铜绿假单胞菌具有显著的生物膜抑制效果，能够将其应用于防治多重耐药PA感染。

Claims (1)

1.酰化高丝氨酸内酯类化合物在制备抑制耐药铜绿假单胞菌resistant Pseudomonas aeruginosa生物膜形成的药物中的应用，其特征在于，所述酰化高丝氨酸内酯类化合物为：
Figure 708554DEST_PATH_IMAGE001
。
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Comparative Analyses of N-Acylated Homoserine Lactones Reveal Unique Structural Features that Dictate Their Ability to Activate or Inhibit Quorum Sensing;Grant D. Geske等;《ChemBioChem》;20080208(第9期);摘要，图1-2，表1-3 *
Grant D. Geske等.Comparative Analyses of N-Acylated Homoserine Lactones Reveal Unique Structural Features that Dictate Their Ability to Activate or Inhibit Quorum Sensing.《ChemBioChem》.2008,(第9期), *

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