CN112359068A - 发酵防腐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵防腐剂及其制备方法和应用。本发明发酵防腐剂的制备方法包括如下步骤：将谷物粉料与水进行混合处理，得到浆料；所述浆料经淀粉酶液化处理、包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理，得到酶解液；将丙酸杆菌接种于所述酶解液中进行发酵培养后，经灭活处理，得到发酵防腐剂。所述发酵防腐剂制备方法以天然来源的谷物粉料作为发酵原料，通过将淀粉酶液化处理、蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理和丙酸杆菌发酵培养处理，使得获得的发酵防腐剂具有防腐效果和抗氧化效果，可以替代传统生产中的化学防腐剂和抗氧化剂。

Description

发酵防腐剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵防腐剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着人民生活水平的提升以及安全健康的持续关注，消费者逐渐摒弃添加化学添加剂的食品，越来越青睐新鲜天然的食品，越来越多的食品品牌倡导“天然”、“有机”、“不含人造成分”、“无化学/农药残留”等理念。采用天然提取和微生物发酵这类含有清洁标签的产物逐渐成为食品行业的大趋势，具有更好的发展前景。
随着人们生活节奏的加快和休闲食品的流行，食品一般需要一定的货架期。传统的一般是通过添加化学防腐剂以延长食品的保质期。虽然化学防腐剂复合食用安全要求，但是具有一定的安全使用量，长期食用可能存在安全危害。而且现有化学防腐剂的防腐抗菌一般只是针对某一方面，因此，往往需要多种复合使用防腐剂，这样往往导致食品添加剂不符合食品安全标准，也增加了成本和安全危害。
另外，含油食品的氧化酸败是食品变质的重要原因之一，食品氧化酸败不但会使食品营养大大降低，而且所生成的小分子醛、酮、酸等具有令人不愉快的气味即哈喇味，使食品的风味、外观劣变甚至失去商品价值，更重要的是对人体健康造成较大的危害，如增加各种炎症、衰老、过敏反应、动脉粥样硬化、癌症的发生机率等。
为了提高食品的抗氧化能力，往往在食品加工、贮存、保鲜过程添加抗氧化剂，目前使用比较多的是人工合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)和特丁基对苯二酚(TBHQ)，但其安全性已受到质疑，且存在很多缺点：BHA、BHT、PG和TBHQ热稳定性差，在80℃以上的热油中极易挥发失效；合成抗氧化剂(常用的BHA、BHT)毒副作用较大，对人体肝、脾、肺等均有不利影响；抗氧化效率低、抑菌效果差；应用范围有很多局限性，欧盟和日本等西方国家已经在食品进口相关检验方面限制进口使用人工合成抗氧化剂加工的食品等产品。因此安全性高、抗氧化能力强、无副作用的天然抗氧化产品倍受关注和期待。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵防腐剂及其制备方法和应用，旨在解决现有食用防腐剂和人工合成的抗氧化剂存在安全性差的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种发酵防腐剂的制备方法。所述发酵防腐剂的制备方法包括如下步骤：
将谷物粉料与水进行混合处理，得到浆料；
所述浆料经淀粉酶液化处理、包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理，得到酶解液；
将丙酸杆菌接种于所述酶解液中进行发酵培养后，经灭活处理，得到发酵防腐剂。
本发明另一方面，提供了一种发酵防腐剂，其是通过本发明发酵防腐剂的制备方法制备得到。
本发明最后一方面，提供了本发明发酵防腐剂在食品抗氧化和/或食品防腐中的应用。
与现有技术相比，本发明发酵防腐剂的制备方法具有以下优点：
首先，该方法以天然来源的谷物粉料作为发酵原料，该发酵原料含有丙酸杆菌生长代谢所需的多种元素和化合物，无需额外补充营养培养基，具有来源广泛、价格低廉的优点，可大大降低生产成本；其次，该方法通过将发酵原料进行淀粉酶液化处理、包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理，可以分解发酵原料中的碳水化合物和蛋白质，使其作为丙酸杆菌发酵培养所需的碳源和氮源，因此在发酵培养过程中无需额外补充碳源和氮源，简化了生产环节，而且能够充分利用天然原料中含有丰富的有机磷，减少额外无机磷的添加，充分提高原料的利用率，减少能耗，并减少磷污染；再次，该方法的发酵原料及处理方式均是针对丙酸杆菌特定的营养需求进行设计，可实现定向调控目标产物产量的效果；最后，该方法采用天然、绿色环保的生物酶处理发酵原料，且发酵过程中不需要严格厌氧，无需通入氮气保护和搅拌，具有高效、安全、节能、环保、可控性强的优点，可充分利用发酵原料，缩短生产时间，有利于实现工业化大量生产。
本发明提供的发酵防腐剂是通过丙酸杆菌对天然来源的谷物进行发酵得到，有发酵产品的特殊清香味，具备良好的防腐性和抗氧化性，且无有机溶剂残留，与传统的人工合成抗氧化剂和防腐剂相比安全性和稳定性更高。经检测，该发酵防腐剂的主要成分为维生素B12和短链的小分子活性肽物质、多种氨基酸，以及少量的有机酸盐(乳酸盐、乙酸盐等)，这些组分之间通过相互协同作用发挥防腐效果和抗氧化效果，可以对抗多种自由基离子对食品的氧化作用，具有良好的应用前景。
本发明提供的发酵防腐剂用于食品抗氧化和/或食品防腐，可以显著降低食品的氧化变质速度，可替代传统的化学抗氧化剂或防腐剂，用于延长食品的货架期。同时，本发明提供的发酵防腐剂是采用天然发酵方法得到，具有安全性高的优点。
附图说明
图1为本发明实施例1所得发酵防腐剂不同添加量和BHT、D-异抗坏血酸钠对河粉的抗氧化效果检测结果图；
图2为本发明实施例1所得发酵防腐剂不同添加量和脱氢乙酸钠对河粉的防腐效果检测结果图；
图3为本发明实施例2所得发酵防腐剂不同添加量和BHT、D-异抗坏血酸钠对河粉的抗氧化效果检测结果图；
图4为本发明实施例2所得发酵防腐剂不同添加量和脱氢乙酸钠对河粉的防腐效果检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本发明的描述中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
一方面，本发明实施例提供了一种发酵防腐剂的制备方法，其包括如下步骤：
S1.将谷物粉料与水进行混合处理，得到浆料；
S2.所述浆料经淀粉酶液化处理、包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理，得到酶解液；
S3.将丙酸杆菌接种于所述酶解液中进行发酵培养后，经灭活处理，得到发酵防腐剂。
本发明实施例提供的发酵防腐剂的制备方法具有以下优点：
首先，该方法以天然来源的谷物粉料作为发酵原料，该发酵原料含有丙酸杆菌生长代谢所需的多种元素和化合物，无需额外补充营养培养基，具有来源广泛、价格低廉的优点，可大大降低生产成本；其次，该方法通过将发酵原料进行蛋白酶解处理、糖化酶酶解处理和植酸酶酶解处理，可以分解发酵原料中的碳水化合物和蛋白质，使其作为丙酸杆菌发酵培养所需的碳源和氮源，因此在发酵培养过程中无需额外补充碳源和氮源，简化了生产环节，而且能够充分利用天然原料中含有丰富的有机磷，减少额外无机磷的添加，充分提高原料的利用率，减少能耗，并减少磷污染；再次，该方法的发酵原料及处理方式均是针对丙酸杆菌特定的营养需求进行设计，可实现定向调控目标产物产量的效果；最后，该方法采用天然、绿色环保的生物酶处理发酵原料，且发酵过程中不需要严格厌氧，无需通入氮气保护和搅拌，具有高效、安全、节能、环保、可控性强的优点，可充分利用发酵原料，缩短生产时间，有利于实现工业化大量生产。
具体地，S1中，谷物粉料作为发酵原料，可以为丙酸杆菌的生长代谢提供多种元素和化合物，无需额外补充营养培养基。在一些实施例中，谷物粉料选自小麦、大米、玉米、木薯中的至少一种制成的粉料。在一些具体实施例中，当以小麦制成的粉料(即面粉)作为谷物粉料时，由于面粉含有足够的蛋白质等营养成分供丙酸杆菌生长发酵，因此无需额外补充营养物，而且能够充分利用天然原料中含有丰富的有机磷，减少额外无机磷的添加，充分提高原料的利用率，减少能耗，并减少磷污染；当以大米、玉米、木薯中的至少一种制成的粉料作为谷物粉料时，通过补充含蛋白质的营养物，可为丙酸杆菌的生长发酵提供足够营养，补充的量占谷物粉料质量的0.2％-2％含蛋白质的营养物具体可选择酵母浸膏、大豆蛋白粕和/或豆饼粉，其中，由于酵母浸膏中营养成分较为丰富，其添加量可相对较少，可选地，酵母浸膏的添加质量占谷物粉料质量的0.2％-0.5％；大豆蛋白粕和豆饼粉的营养成分相对于酵母浸膏略少，因此其添加量应相对较多，可选地，大豆蛋白粕和/或豆饼粉的添加质量占谷物粉料质量的0.5％-2％。
通过将谷物粉料与水混合处理制成浆料，以便于对谷物粉料中的营养物质进行酶解以及后续的发酵、分离。在一些实施例中，所述谷物粉料在所述浆料中的质量浓度为2-20％，优选为3-17％；最优的6-12％。具体的如可以将谷物粉料与水的质量比控制在(1-10):50，优选(3-17):100，最优选(6-12.7):100配制成浆料。通过优化谷物粉料与水的质量比，可以得到固含量合适的浆料，有利于提升谷物粉料的利用率和丙酸杆菌发酵的效率，使发酵防腐剂的得率和品质得到提高。另外，优选使得配制所述浆料的80％可以通过60目筛，以提高浆料中谷物粉料的分散度和细度，从而提高步骤S02中的淀粉酶液化处理和复合酶酶解处理效果和效率。
S2中，通过将浆料进行蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理可以将谷物粉料中所含的淀粉、蛋白质和有机磷等大分子进行降解，得到丙酸杆菌生长发酵所需的碳源和氮源以及磷源等营养成分，使丙酸杆菌在发酵培养过程中无需额外补充碳源和氮源。
在一实施例中，所述淀粉酶液化处理的方法包括如下步骤：
将所述浆料的pH调节至6.0-6.4优选为6.0-6.2后加入耐高温淀粉酶，于80-94℃优选为90℃下进行液化处理。
在优选实施例中，所述耐高温淀粉酶是按照相对谷物粉料0.1-10g/kg的比例添加至所述浆料中。具体实施例中，所述淀粉酶液化处理中添加的所述耐高温淀粉酶为黑曲霉淀粉酶、地衣形芽孢杆菌淀粉酶、淀粉液化芽孢杆菌淀粉酶中的至少一种；其中，黑曲霉淀粉酶可以是安徽绿微康生物科技的ABK-B800。通过对淀粉酶的种类选择和添加量的优化控制，能够有效提高淀粉酶液化处理效果和效率将淀粉类成分分解成低糖。其次，所述淀粉酶液化处理的温度可以通过升温方式，也可以直接向所述浆料中通入热蒸汽，使得浆料温度升温至淀粉酶液化处理的温度。
在进一步实施例中，所述淀粉酶液化处理步骤中还添加有用于提供钙离子的钙盐，其中，钙盐添加量优选是在浆料中的浓度达为0.5-10mmol/L，钙盐可以但不仅仅为CaCl2。通过在浆料中添加钙盐，以提供钙离子提高淀粉酶以及后续酶的活性。
在另一实施例中，所述复合酶酶解处理的包括如下步骤：
将经所述淀粉酶液化处理后的所述浆料的pH调节至4.0-6.0优选为4.5-5.5后加入复合酶，在40-60℃优选50-60℃下进行酶解处理20-28h直至酶解体系中总糖80％以上，如酶解处理20-28h。
其中，所述复合酶包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶。在优选实施例中，所述蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶是按照所述蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶和所述谷物粉料按照(0.5-5g)：(0.2-2g)：(0.05-0.5g)：1kg的比例进行添加至所述浆料中。在具体实施例中，所述蛋白酶选用酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的至少一种，另外，该些蛋白酶和葡萄糖淀粉酶与植酸酶均可以选用安徽绿微康公司生产的相关酶制剂。通过对复合酶的种类选择和添加量的优化控制，能够有效提高复合酶酶处理效果和效率将多糖进一步酶解，蛋白酶解成适当的多肽和其他氮源，从而使其作为丙酸杆菌发酵培养所需的碳源和氮源，同时植酸酶可以分解原料中的有机磷，从而提供丙酸杆菌发酵培养所需的磷源，减少磷源的添加。因此在发酵培养过程中无需额外补充碳源和氮源，并赋予获得的酶解液具有生物防腐和抗氧等功能。
另外，判断所述复合酶酶解处理的终点可以检测所述复合酶酶解处理过程中溶液体系中的还原糖和总糖，当还原糖达到总糖80％以上即可停止反应，然后进入高温灭活工序。在一实施例中，待所述复合酶酶解处理的步骤之后和向所述酶解液中种接所述丙酸杆菌的步骤之前还包括对所述酶解液进行灭活杀菌的步骤。在具体实施例中，所述灭活杀菌是将所述酶解液于115-121℃下高压灭菌30min以上；以杀灭原料液中的酶制剂以及微生物，确保原料液的无菌环境。
S3中，将丙酸杆菌接种于S2所得酶解液中，通过发酵培养得到发酵液。该过程中无需严格厌氧，因此可不通入氮气进行保护，同时也无需搅拌处理，大大节约了生产工序和成本。可以理解的是，为了确保供丙酸杆菌的生长发酵，酶解液应为无菌环境。在一些实施例中，可通过对S2所得酶解液进行高温灭菌处理，该处理方式不仅杀灭了酶解液中的微生物，为丙酸杆菌提供良好的生长环境，同时高温条件也导致S2所添加的各种酶失活，避免酶对丙酸杆菌生长的影响，有利于获得纯度高、性能好的发酵液。
在一些实施例中，丙酸杆菌选择产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)、费氏丙酸杆菌舍氏亚种(Propionibacterium freudenreichiisubsp.shermanii)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)中的至少一种。
在一些实施例中，还包括对丙酸杆菌进行活化处理的步骤。这是因为菌种的保存条件往往与培养条件不同，需要通过活化处理使菌种复苏，以逐渐适应新的培养环境。本发明实施例采用的活化处理方法是专门针对丙酸杆菌发酵本发明实施例所提供的谷物粉料而设计，具体方法如下：将丙酸杆菌接种于种子培养基中，在30℃-34℃下培养48h。其中，以种子培养基的质量为100％计，种子培养基包括0.5％-1.0％甘油、1％-2％酵母膏、0.5％-1％蛋白胨、0.3％-0.5％磷酸氢二钾和0.25％-0.3％磷酸二氢钾，余量为水，且种子培养基的pH为7.0。
在一些实施例中，还包括对丙酸杆菌进行扩大培养的步骤。通过对丙酸杆菌进行扩大培养，可以使丙酸杆菌稳定生长，同时扩大了丙酸杆菌细胞浓度，缩短其在发酵培养过程中的延滞期，提升发酵培养的效率。在一些具体实施例中，可将扩大培养具体分为一级扩大培养和二级扩大培养，以进一步提升后续发酵培养的效率。其中，一级扩大培养的具体方法如下：将丙酸杆菌接入含种子培养基的三角瓶中，在30℃-34℃下培养24h。其中，以种子培养基的质量为100％计，种子培养基包括0.5％-1.0％甘油、1％-2％酵母膏、0.5％-1％蛋白胨、0.3％-0.5％磷酸氢二钾和0.25％-0.3％磷酸二氢钾，余量为水，且种子培养基的pH为7.0。二级扩大培养的具体方法如下：将经一级扩大培养的丙酸杆菌接入含种子培养基的种子罐中，在30℃-34℃下培养48h。
在一些实施例中，将丙酸杆菌接种于酶解液中进行发酵培养时，发酵培养的方法是：在30℃-32℃、pH为6.0-7.0的条件下进行培养，优选pH＝7.0。培养过程中可对还原糖和丙酸盐进行检测，当还原糖质量≤0.1％，且丙酸盐含量不再增加时发酵结束。在一些具体实施例中，可通过流加Ca(OH)2(无菌)的方式来控制发酵液的pH为6.0-7.0。此时，也可以通过检测丙酸钙含量不再增加时终止所述发酵培养。
由于所得发酵液中仍含有大量的丙酸杆菌活菌，因此应对丙酸杆菌进行灭活处理，以得到更加安全的发酵防腐剂产品。在一些实施例中，对丙酸杆菌进行灭活处理的方法是将发酵液加热至60℃进行灭活。
进一步地，还可以将灭活后的发酵液中的菌体和不溶物去除，以提升发酵防腐剂的纯度。去除方法是：将灭活后的发酵液经压滤机过滤或离心分离处理，所得上清液即为去除菌体和不溶物的发酵防腐剂。
此时所得发酵防腐剂为液态，可以理解是，根据其实际应用的需要，还可通过多种方法将该液态的发酵防腐剂制成其它形态，包括但不限于固态。
相应地，本发明实施例还提供了一种发酵防腐剂，其是通过上述发酵防腐剂的制备方法制备得到。
本发明实施例提供的发酵防腐剂是通过丙酸杆菌对天然来源的谷物进行发酵得到，有发酵产品的特殊清香味，具备良好的防腐性和抗氧化性，且无有机溶剂残留，与传统的人工合成抗氧化剂相比安全性和稳定性更高。经检测，该发酵防腐剂的主要成分为维生素B12、短链的小分子活性肽物质和多种氨基酸，以及少量的有机酸盐(如乳酸盐、乙酸盐等)，这些组分之间通过相互协同作用发挥防腐效果和抗氧化效果，可以对抗多种自由基离子对食品的氧化作用，具有良好的应用前景。
相应地，本发明实施例还提供了上述发酵防腐剂在食品抗氧化和/或食品防腐中的应用。
本发明实施例提供的发酵防腐剂用于食品抗氧化和/或食品防腐，可以显著降低食品的氧化变质速度，可替代传统的化学抗氧化剂或防腐剂，用于延长食品的货架期。同时，本发明实施例提供的发酵防腐剂是采用天然发酵方法得到，具有安全性高的优点。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例发酵防腐剂及其制备方法和应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
本发明实施例提供一种发酵防腐剂的制备方法，包括如下步骤：
S1:面粉和水按照12.7:100的质量比混合得到面粉浆料；
S2:调节面粉浆料的pH值为6.0±0.1，并补充CaCl2溶液，使Ca2+的浓度达到0.01mol/L左右，接入安徽绿微康生物科技的ABK-B800淀粉酶，淀粉酶添加量为0.5g/kg原料(以面粉干粉计)，搅拌状态下向所述面粉浆料中通入蒸汽控制温度在90℃进行液化20min，用稀碘液测试浆料至不再显蓝色即结束；
S3:将步骤S2中淀粉酶解的面粉浆料pH值调节至4.5，然后加入酸性蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶的复合酶，控制温度在50℃左右复合酶酶解处理28h，酶解过程中维持pH值在4.5-5.5；并在复合酶酶解处理过程检测还原糖和总糖，当还原糖达到总糖80％以上即可停止反应，然后进入高温灭活工序，获得酶解液；其中，所述酸性蛋白酶来源于安徽绿微康生物科技，添加量为1.0g/kg原料(以原料干粉计)；所述葡萄糖淀粉酶来源于安徽绿微康生物科技，添加量为1.0g/kg原料(以原料干粉计)；所述植酸酶来源于安徽绿微康生物科技，添加量为0.1g/kg原料(以原料干粉计)；
S4:对所述酶解液进行丙酸杆菌发酵培养：
S41:产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)保存在甘油管中，保存于-80℃的冰箱中备用；将5mL的菌种接种于装有200mL种子培养基的摇瓶中，在30℃条件下培养48h。种子培养基：1.0％甘油、2％酵母膏、1％蛋白胨、0.5％磷酸氢二钾、0.3％磷酸二氢钾，余量为水；pH值7.0；
S42:将步骤S41中活化好的菌种接入含种子培养基的2L的一级三角瓶中，在30℃下，静置培养24h。培养期间不需通入氮气，也不需搅拌；然后接入含种子培养基的200L的种子罐中，在30℃下，静置培养48h。培养期间不需通入氮气，也不需搅拌；
S43:将步骤S42所得培养好的丙酸杆菌菌种接入发酵罐中，在30℃下培养发酵；自动流加20％的Ca(OH)2无菌悬液控制发酵液pH值在7.0之间；当发酵罐中还原糖的量降至0.1％以下，且丙酸钙含量不再增加时发酵结束；所得发酵液加热至60℃将发酵菌灭活后，离心分离菌体及不溶物，得到上清液为发酵防腐剂。
对所得发酵防腐剂的成分进行检测，结果显示，该发酵防腐剂除水分以外的主要成分包括丙酸盐≥20％，其他有机酸盐(乳酸盐、乙酸盐等)<10％、维生素B12、小分子活性肽和氨基酸等成分＜10％。
实施例2
本发明实施例提供一种发酵抗氧剂的制备方法，包括如下步骤：
S1:玉米粉添加1％的大豆蛋白粕粉碎过筛，与水按照10:100的质量比混合得到面粉浆料；
S2:调节面粉浆料的pH值为6.1±0.1，补充CaCl2溶液，使Ca2+的浓度达到0.005mol/L，接入5g/kg原料(以面粉干粉计)淀粉酶，搅拌状态下向所述面粉浆料中通入蒸汽控制温度在80℃进行液化20min，用稀碘液测试浆料至不再显蓝色即结束；
S3:将步骤S2中淀粉酶解的面粉浆料pH值调节至5.0，然后加入蛋白酶(酸性蛋白酶/木瓜蛋白酶酶量比1:1)、葡萄糖淀粉酶、植酸酶的复合酶，控制温度在60℃左右复合酶酶解处理20h，酶解过程中维持pH值在4.8-5.2；并在复合酶酶解处理过程检测还原糖和总糖，当还原糖达到总糖80％以上即可停止反应，然后在115℃高温灭活30min以上，获得酶解液；其中，所述酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶来源于安徽绿微康生物科技，总蛋白酶添加量为2g/kg原料(以原料干粉计)；所述葡萄糖淀粉酶来源于安徽绿微康生物科技，添加量为1g/kg原料(以原料干粉计)；所述植酸酶来源于安徽绿微康生物科技，添加量为0.2g/kg原料(以原料干粉计)；
S4:对所述酶解液进行丙酸杆菌发酵培养：
S41:产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)保存在甘油管中，保存于-80℃的冰箱中备用；将5mL的菌种接种于装有200mL种子培养基的摇瓶中，在30℃条件下培养48h。种子培养基：1.0％甘油、2％酵母膏、1％蛋白胨、0.5％磷酸氢二钾、0.3％磷酸二氢钾，余量为水；pH值7.0；
S42:将步骤S41中活化好的菌种接入含种子培养基的2L的一级三角瓶中，在34℃下，静置培养24h。培养期间不需通入氮气，也不需搅拌；然后接入含种子培养基的200L的种子罐中，在34℃下，静置培养48h。培养期间不需通入氮气，也不需搅拌；
S43:将步骤S42所得培养好的丙酸杆菌菌种接入发酵罐中，在34℃下培养发酵；自动流加20％的Ca(OH)2无菌悬液控制发酵液pH值在7.0左右；当发酵罐中还原糖的量降至0.1％以下，且丙酸钙含量不再增加时发酵结束；所得发酵液加热至60℃将发酵菌灭活后，离心分离菌体及不溶物，得到上清液为发酵防腐剂；
对所得发酵防腐剂的成分进行检测，结果显示，该发酵防腐剂的主要活性成分为：丙酸盐≥20％，其他有机酸盐(乳酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐等)<10％，维生素B12、小分子活性肽和氨基酸等成分＜10％，其余为水分；
应用实验例1
将实施例1所得发酵防腐剂和市面上抗氧化剂分别添加到河粉中进行处理，检测它们对河粉的抗氧化效果。
制作河粉的步骤如下：原料混合→调浆→调节浆料pH值→蒸粉器浅盘上涂油→涂布浆料(厚度一般控制在1.2mm左右)→蒸熟(蒸1min)冷却→切条→密封包装。放置冷藏条件下，定期检测。其中，各组分比例如下：大米粉100、小麦淀粉25、水500、大豆油1.32、待测添加剂；
本实验例设置五个组别，区别在于添加配料的配方中的抗氧化剂的选择。第一组为空白组，即不添加抗氧化剂；第二组中，配料中的抗氧化剂为实施例1所得发酵防腐剂，添加量为8g/kg(即有效成分的添加量为2g/kg)；第三组中，配料中的抗氧化剂为实施例1所得发酵防腐剂，添加量为16g/kg(即有效成分的添加量为4g/kg)；第四组中，配料中的抗氧化剂为BHT，添加量为0.2g/kg；第五组中，配料中的抗氧化剂为D-异抗坏血酸钠，添加量为1.0g/kg。
本实施例抗氧化实验结果如图1所示，通过图1可以看出，在冷藏储存条件下，本发明实施例1所得发酵防腐剂对河粉进行处理后，TBA值有明显的抑制效果，且抑制效果优于以D-异抗坏血酸钠和BHT作为抗氧化剂处理后的河粉，说明本发明实施例1所得发酵防腐剂可显著提高食品的抗氧化性能，延长其保存时间。
应用实验例2
将实施例1所得发酵防腐剂和市面上化学防腐剂分别添加到河粉中进行处理，检测它们对河粉的防腐效果。制作河粉的步骤如下：原料混合→调浆→调节浆料pH值→蒸粉器浅盘上涂油→涂布浆料(厚度一般控制在1.2mm左右)→蒸熟(蒸1min)冷却→切条→密封包装。放置冷藏条件下，定期检测。其中，各组分比例如下：大米粉100、小麦淀粉25、水500、大豆油1.32、待测添加剂；本实验例设置三个组别，区别在于添加配料的配方中的防腐剂选择。第一组为空白组，即不添加防腐剂；第二组中，配料中的防腐剂为实施例1所得发酵液，添加量为8g/kg(有效成分约2g/kg)；第三组中，配料中的防腐剂为实施例1所得发酵液，添加量为16g/kg(有效成分约4g/kg)；第四组中，配料中的防腐剂为化学防腐剂脱氢乙酸钠，添加量为1.0g/kg(国标规定的最高添加量)；
本实施例防腐实验结果如图2所示，通过图2可以看出，在冷藏储存条件下，本发明实施例1所得发酵防腐剂对河粉进行处理后，菌落总数显著降低，与添加有化学防腐剂的防腐效果一致，说明通过在食品中添加本发明实施例1所得发酵防腐剂的防腐效果更好，延长其保存时间。
应用实验例3
将实施例2所得发酵防腐剂和市面上抗氧化剂分别添加到河粉中进行处理，检测它们对河粉的抗氧化效果。
制作河粉的步骤如下：原料混合→调浆→调节浆料pH值→蒸粉器浅盘上涂油→涂布浆料(厚度一般控制在1.2mm左右)→蒸熟(蒸1min)冷却→切条→密封包装。放置常温25℃条件下，定期检测。其中，各组分比例如下：大米粉100、小麦淀粉25、水500、大豆油1.32、待测添加剂。
本实验例设置五个组别，区别在于添加配料的配方中的抗氧化剂的选择。第一组为空白组，即不添加抗氧化剂；第二组中，配料中的抗氧化剂为实施例2所得发酵防腐剂，添加量为8g/kg(即有效成分的添加量为2g/kg)；第三组中，配料中的抗氧化剂为实施例2所得发酵防腐剂，添加量为16g/kg(即有效成分的添加量为4g/kg)；第四组中，配料中的抗氧化剂为BHT，添加量为0.2g/kg；第五组中，配料中的抗氧化剂为D-异抗坏血酸钠，添加量为1.0g/kg。
本实施例抗氧化实验结果如图3所示，通过图3可以看出，在常温条件下，本发明实施例2所得发酵防腐剂对河粉进行处理后，TBA值有明显的抑制效果，发酵液添加量大于8g/kg时抑制效果优于以D-异抗坏血酸钠和BHT作为抗氧化剂处理后的河粉，说明本发明实施例2所得发酵防腐剂可显著提高食品的抗氧化性能，延长其保存时间。
应用实验例4
将实施例2所得发酵防腐剂和市面上化学防腐剂分别添加到河粉中进行处理，检测它们对河粉的防腐效果。
制作河粉的步骤如下：原料混合→调浆→调节浆料pH值→蒸粉器浅盘上涂油→涂布浆料(厚度一般控制在1.2mm左右)→蒸熟(蒸1min)冷却→切条→密封包装。放置常温25℃条件下，定期检测。其中，各组分比例如下：大米粉100、小麦淀粉25、水500、大豆油1.32、待测添加剂。
本实验例设置三个组别，区别在于添加配料的配方中的防腐剂选择。第一组为空白组，即不添加防腐剂；第二组中，配料中的防腐剂为实施例2所得发酵液，添加量为8g/kg(有效成分约2g/kg)；第三组中，配料中的防腐剂为实施例2所得发酵液，添加量为16g/kg(有效成分约4g/kg)；第四组中，配料中的防腐剂为化学防腐剂脱氢乙酸钠，添加量为1.0g/kg(国标规定的最高添加量)；
本实施例防腐实验结果如图4所示，通过图4可以看出，在常温25℃储存条件下，本发明实施例2所得发酵防腐剂对河粉进行处理后，菌落总数显著降低，发酵液添加量8g/kg时与添加有化学防腐剂的防腐效果一致，说明通过在食品中添加本发明实施例2所得发酵防腐剂的防腐效果更好，可大大延长其保存时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种发酵防腐剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将谷物粉料与水进行混合处理，得到浆料；
所述浆料经淀粉酶液化处理、包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶和植酸酶的复合酶酶解处理，得到酶解液；
将丙酸杆菌接种于所述酶解液中进行发酵培养后，经灭活处理，得到发酵防腐剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉酶液化处理的方法包括如下步骤：
将所述浆料的pH调节至6.0-6.4后加入耐高温淀粉酶，于80-94℃下进行液化处理；
和/或
所述复合酶酶解处理的包括如下步骤：
将经所述淀粉酶液化处理后的所述浆料的pH调节至4.0-6.0后加入复合酶，并添加钙盐，在40-60℃下进行酶解处理直至酶解体系中还原糖占总糖80％以上；其中，所述复合酶包括蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶；
和/或
待所述复合酶酶解处理的步骤之后和向所述酶解液中种接所述丙酸杆菌的步骤之前还包括对所述酶解液进行灭活杀菌的步骤。
3.根据权利要求2项所述的制备方法，其特征在于，所述耐高温淀粉酶为地衣形芽孢杆菌淀粉酶、淀粉液化芽孢杆菌淀粉酶中的至少一种；
所述耐高温淀粉酶是按照相对谷物粉料0.1-10g/kg的比例添加至所述浆料中；
所述蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶是按照所述蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶和所述谷物粉料按照(0.5-5g)：(0.2-2g)：(0.05-0.5g)：1kg的比例进行添加至所述浆料中；
所述钙盐添加至所述浆料中的终浓度达到0.5-10m mol/L；
所述灭活杀菌包括将所述酶解液于115-121℃下高压灭菌处理的步骤。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为30℃-32℃、pH为6.0-7.0，所述发酵培养处理直至酶解液还原糖的量降至0.1％以下结束。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将丙酸杆菌接种于所述酶解液中进行发酵培养的步骤之前，还包括对所述丙酸杆菌经过活化处理的步骤：将所述丙酸杆菌接种于种子培养基中，在30℃-34℃下培养40-50h；以所述种子培养基的质量为100％计，所述种子培养基包括0.5％-1.0％甘油、1％-2％酵母膏、0.5％-1％蛋白胨、0.3％-0.5％磷酸氢二钾和0.25％-0.3％磷酸二氢钾，余量为水，且所述种子培养基的pH为6.0-7.0。
6.根据权利要求1-3、5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述谷物粉料选自小麦、大米、玉米、木薯中的至少一种制成的粉料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述谷物粉料选自大米、玉米、木薯中的至少一种制成的粉料时，还添加有含蛋白质的营养物，所述含蛋白质的营养物的质量占所述谷物粉料的质量的0.2％-2％。
8.根据权利要求1-3、5、7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述将谷物粉料与水进行混合处理得到所述浆料的步骤中，所述谷物粉料在所述浆料中的质量浓度为2-20％。
9.一种发酵防腐剂，其特征在于，所述发酵防腐剂由权利要求1-8任一项所述发酵防腐剂的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的发酵防腐剂在食品抗氧化和/或食品防腐中的应用。
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