CN112353827B - Vsm在制备治疗横纹肌肉瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供VSM在制备治疗横纹肌肉瘤的药物中的应用。VSM能够肌动蛋白细胞骨架，降低肿瘤细胞的运动性、侵袭性、集落形成、生长和增殖水平，进而导致代谢关闭，具有有效的肌动蛋白丝稳定性，且副作用低，可治疗小儿肺泡横纹肌肉瘤。

Description

VSM在制备治疗横纹肌肉瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及VSM在制备治疗横纹肌肉瘤的药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

横纹肌肉瘤(RMS)是最常见的儿童软组织肿瘤，约占所有儿童恶性肿瘤的6-8％。RMS肿瘤类型源于骨骼肌细胞，是由于肌源性分化程序失败而引起的。RMS在组织学上可分为几个亚型。两种最常见的亚型是胚胎型(RME；70％)和肺泡(RMA；20％)。治疗RMS患者中最具挑战性的问题是预防和治疗转移。与大多数癌症病例一样，这些患者的预后要比没有转移事件的患者低得多。RMA表现出频繁的分子改变，与预后较差有关。例如，基因融合导致易位阳性(80％)和易位阴性(20％)的亚型。易位阳性亚型的特征是pax3/7-foxo1融合转录因子的表达，可促进这些癌症类型的发病机理，肿瘤发生和转移的形成以及耐药机制。既定的多模式治疗方法包括多化学疗法结合手术或者放疗的局部控制策略。然而，在晚期RMA和肿瘤复发病例中，既定的治疗方法通常会失败，因此有必要采用新的治疗策略。

发明内容

本发明提供了巴基斯坦夹竹桃科植物Vincetoxicum arnottianum(简称VSM)的药物应用，VSM具有肌动蛋白纤维稳定特性，能够降低肺泡横纹肌肉瘤细胞的运动性、侵袭性、集落形成、生长和增殖水平，进而导致代谢关闭并且副作用低，可治疗小儿肺泡横纹肌肉瘤，并且对原代细胞的活力影响很小。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，本发明提供了VSM在制备治疗肺泡横纹肌肉瘤(RMA)的药物中的应用。

在本发明的实施方式中，所述VSM为全植物提取物，在一些实施方式中，VSM为甲醇全植物提取物，全植物提取物中包含β-谷甾醇和羽扇豆醇，但绝不限于这两种物质。在本发明的一些实施方式中，所述VSM的浓度为10-100μg/mL。

如本发明背景技术中所述的，治疗RMA患者中最具挑战性的问题是预防和治疗转移，因为大多数癌症患者都倾向于转移而不是原发性肿瘤，RMA细胞因其高转移潜力而闻名。因而在RMA前期可能有效的治疗方法，在对晚期RMA和肿瘤复发的病例中通常会失败。本发明的VSM为自然来源的植物提取物，能够以自然来源的成分靶向细胞骨架能够稳定肌动蛋白细胞骨架来调节细胞的运动性，从而避免RMA细胞的转移性侵袭。因此，在本发明的实施方式中，本发明应用中所述药物为抗转移药物。

以及在本发明的实施方式中，本发明应用中所述药物为细胞迁移抑制剂。本发明对于连续的RMA细胞进行了运动检查，证实了本发明所述VSM具有有效的抗迁移效果，其中，在一些实施方式中，当VSM浓度为25μg/mL时，抗迁移效果即可达到50-60％(由相对迁移率定量确定)。

以及在本发明的一些实施方式中，本发明分别以VSM为全植物提取物，以及β-谷甾醇和/或羽扇豆醇处理RMA细胞系RH-30和HAOH1细胞，结果发现，VSM、以及β-谷甾醇和/或羽扇豆醇的处理能够降低肿瘤细胞的存活率，但β-谷甾醇和羽扇豆醇联用无法实现本发明所述VSM全植物提取物所实现的抗肿瘤细胞迁移的效果，因而无法对RMA细胞发挥其完全的抗肿瘤特性。

在本发明的实施方式中，本发明应用中所述药物为抗肿瘤细胞侵袭的药物。本发明测试了VSM对于RMA细胞侵袭能力的影响，结果发现当VSM的浓度为10μg/mL时，细胞侵袭能力降低了95％，当该浓度上升至25μg/mL，侵袭能力可降低达99％，而相同实验条件下，阳性对照药茉莉酰胺Jaspl.(10nM)仅能降低60％，异黄酮染料木素Geni(50μg/mL)仅能降低25％。实验表明VSM具有优异的抗RMA细胞侵袭的能力。

在本发明的实施方式中，本发明应用中所述药物为抗肿瘤细胞不依赖锚定的集落形成的药物。本发明测试了VSM处理下RMA细胞锚定非依赖性生长和集落形成的能力，其中，在一些实施方式中发现，当VSM浓度为25μg/mL时，能够减少约61％的集落形成，而相同条件下，阳性对照药茉莉酰胺Jaspl.(10nM)仅能降低约27％，异黄酮染料木素Geni(50μg/mL)仅能降低44％。实验表明VSM具有优异的抗RMA细胞不依赖锚定的集落形成能力。

在本发明的实施方式中，本发明应用中所述药物为肌动蛋白稳定剂，能够稳定肌动蛋白细胞骨架。本发明研究了VSM治疗下的细胞的形态学变化，结果发现，在共聚焦显微镜下，未经VSM处理的RMA细胞表现出活动性和侵袭性细胞骨架形状，而在经VSM处理48h，细胞中强烈诱导了应力纤维的形成，相对肌动蛋白丝数和相对肌动蛋白丝数均有增加。在一些实施方式中，VSM(10μg/mL)和VSM(25μg/mL)具有显著的肌动蛋白稳定特性，细丝长度和细丝数量分别增加1.7至2.6倍。

在本发明的实施方式中，所述药物在应用时能够引发RMA细胞的代谢变化，在本发明的一些实施方式中，与未经VSM处理的RMA细胞对照相比，经VSM处理后有25个明显改变的代谢物，而顺铂治疗中只有5个明显改变的代谢物(P≤0.01)，能够引起包括至少尿嘧啶，N-乙酰丝氨酸和磷酸丙酰的细胞代谢物的强烈变化。

以及，本发明所述药物应用时对生物标志物的表达产生影响，其中，甘氨酸脱羧酶(GLDC)、鞘氨醇-1磷酸裂解酶(SGPL1)、鞘氨醇-1-磷酸激酶1呈线性、浓度依赖性增加(SPHK1)、ezrin和趋化因子受体4型(CXCR4)和对比氨基甲基转移酶(AMT)、P-钙粘蛋白和syndecan-4转录物的线性下降；肿瘤干细胞标记物prominin(CD133)的转录水平在VSM浓度为10-100μg/mL时通常受到负面影响。最高VSM浓度为100μg/mL的处理显示甘氨酸裂解系统蛋白H(GCSH)、β-catenin和pax3-foxo1融合转录表达水平显著降低。二氢脂酰脱氢酶(DLD)和鞘氨醇-1-磷酸激酶2(SPHK2)的转录水平没有改变。

以及，本发明还证实了经VSM处理后，鞘氨醇-1-磷酸(S1P)代谢酶鞘氨醇-1-磷酸裂解酶(sphingosine-1-phosphate lyase,SGPL1)的转录本和蛋白表达水平呈浓度依赖性的显著升高，S1P是一种具有生物活性的鞘脂和第二信使，参与细胞信号转导和调节细胞运动、血管生成、增殖、生长、细胞骨架组织以及粘附依赖细胞存活的过程。此外，高浓度的S1P或SGPL1降解S1P的缺陷与癌细胞进展、定向化疗吸引和促进化疗耐药机制有关。S1P也被认为是促使RMA细胞转移侵袭的潜在趋化剂。在这种情况下，VSM处理下SGPL1表达的增加与RMA细胞迁移、侵袭和集落形成能力的降低呈正相关。

在本发明的实施方式中，本发明所述药物对健康细胞无毒性或低毒性，所述健康细胞包括人间充质干细胞、人类成纤维细胞、乳腺细胞、骨细胞。

以及，在本发明的一些实施方式中，与未经VSM处理的细胞相比，VSM的代谢谱分析和对顺铂的标准治疗的比较考虑证实，VSM和顺铂治疗仅对RMA细胞的初次代谢产生中等程度的影响，即VSM处理的细胞表现出相似的原代细胞代谢停滞。原代对照细胞不受VSM处理的影响。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种治疗肺泡横纹肌肉瘤的药物组合物，所述药物组合物中包括VSM。在本发明的实施方式中，所述VSM为全植物提取物，在一些实施方式中，VSM为甲醇全植物提取物，全植物提取物中包含β-谷甾醇和羽扇豆醇，但绝不限于这两种物质。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种治疗肺泡横纹肌肉瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的VSM。

在一些实施方式中，所述VSM为VSM的全植物提取物，尤其为VSM的全植物甲醛提取物。

术语“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。

术语“治疗有效量”是指包括本发明VSM在内的活性物质或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。在本发明的一些实施方式中，所述VSM的有效浓度10-100μg/mL。在该基础上，研究者、兽医、医生或其他医疗人员可在该已知范围内探索更为个性化的适宜浓度，而该探索的过程可采用本领域常用的方式实现。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1：两种植物提取物和五种植物源化合物(A-G)对RMA细胞株RH-30的抗肿瘤筛选。用两种植物提取物(VSM和LW)和五种植物源化合物(Geni,Seco,Mata,Daid andJaspl.)处理RH-30细胞，48h后，通过MTS法测定细胞活力。阴性对照采用0.1％DMSO溶剂，设置为100％。平均值±标准差，n＝6-8，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与对照组比较差异显著，未配对t检验。横坐标轴上划线的VSM、Geni、LW和Jaspl浓度被选择作进一步测试。

图2：筛选所选化合物对RH-30细胞的迁移效应(A)与对照组(0.1％DMSO)相比，RH-30细胞在扫描仪(10和25μg/mL)，LW(50μg/mL)、Geni(100μM)和Jaspl.(1nM)处理2天，来评价细胞的迁移能力和相对迁移速度(比率)。平均值±标准差，n＝6-8，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与对照组比较差异显著，未配对t检验。(B)与0.1％DMSO对照相比，VSM(10和25μg/mL)、LW(50μg/mL)、Geni(100μM)和Jaspl.(1nM)处理48h后RH-30细胞的相对侵袭能力测定。平均值±标准差，n＝3，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与对照组比较差异显著，未配对t检验。(C)经过VSM(25μg/mL)、Geni(50μM)和Jaspl(10nM)处理48小时后，与对照溶剂(0.1％DMSO)相比，测定RH-30细胞相对侵袭能力。平均值±标准差，n＝3，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与对照组比较差异显著，未配对t检验。

图3：VSM处理对RH-30细胞形态的影响。(A)与溶剂对照组(0.1％DMSO)相比，VSM浓度系列(1、10、25、50和100μg/mL VSM)处理的RH-30细胞48h后的明亮场图像。(B)在VSM治疗过程中泡状结构的数量相对定量的5个明亮视野显微镜个体图像。平均值±标准差，n＝5，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与对照组比较差异显著，未配对t检验。(C)与0.1％DMSO处理对照组相比，25μg/mL VSM处理48h后RH-30细胞骨架的变化。通过共聚焦显微镜分析F-actin组织，并用FilaQuant软件进行数学处理(罗斯托克大学数学研究所，数学优化软件)。F-actin纤维用Phalloidin Alexa 546标记(红色)，细胞核用Hoechst标记(蓝色)。经处理的图像中F-肌动蛋白丝显示为彩色线条。平均值±标准差，未配对t检验，n＝3，**P<0.01，*P<0.05。(D)用扫描电镜观察25μg/mL VSM提取物处理RH-30细胞48h后与0.1％DMSO对照的形态学改变。

图4：VSM浓度依赖性对RH30细胞转录水平的影响分析。表达因子均经过密度测定，并归一化到溶剂对照，设为1。用RT-PCR法对经VSM(1、10、25、50和100μg/mL)处理48小时的RH-30细胞进行转录表达分析，包括β-肌动蛋白和GAPDH(负荷控制)；pax3-foxo1(RMA标记)；GLDC、AMT、GCSH和DLD(甘氨酸切割系统的组成部分)；SGPL1、SPHK1和SPHK2(鞘脂代谢)；以及ezrin、CXCR4、P-cadherin、syndecan-4、prominin和β-catenin(转移和肿瘤信号标志物)。(三个独立实验的代表性图像，n＝3)。

图5：VSM和顺铂处理RH-30细胞的代谢谱。(A)p值排序依据Benjamini和Hochberg的原始FDR方法(Q＝5％)，(B)在48小时VSM治疗(25μg/mL)和顺铂(CP)治疗(3.3μM)过程中RH-30细胞中3种明显不同代谢物的箱形图表示，相对地表示为未处理对照组的中位数(代谢物注释是假定的)。经过处理的RH-30细胞的代谢谱显示，在三种代谢物中对VSM和顺铂治疗的反应相似。顺铂和VSM处理时尿嘧啶升高3.5～5倍，n-乙酰丝氨酸和磷酸丙酰中度降低40～50％。

图6：VSM对健康细胞治疗效果的评估以及纯VSM化合物β-谷甾醇和羽扇豆醇RMA细胞的代谢活动和迁移能力。用VSM提取液(1、10、25、50和100μg/mL)处理原代非致瘤对照细胞后，用MTS法测定细胞活力：(A)人间充质干细胞(hMSC)和(B)人成纤维细胞(NHDF)，以及RMA细胞系的：(C)HA-OH1.(D)对48小时VSM提取物处理过的RMA细胞系RH-30(见图1A)和HA-OH1以及健康的hMSCs和NHDF对照细胞计算IC₅₀值。

用分离的纯VSM化合物β-谷甾醇和羽扇豆醇(50μg/mL)处理RMA细胞系48小时后通过MTS测定细胞活力：(E)RH-30、(F)HA-OH1.以溶剂(0.1％DMSO的羽扇豆醇溶液和0.1％CHCl₃的β-谷甾醇)作为阴性对照，设置为100％。平均值±标准差，n＝6-8，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与对照相比差异显著，未配对t检验。

图7：经VSM、Geni和Jaspl处理后的形态变化。(A)与溶剂对照组(0.1％DMSO)相比，VSM浓度系列(1、10、25、50和100μg/mL VSM)处理48小时后的RH-30细胞的明亮场图像。(B)与对照组(0.1％DMSO)相比，25μM Geni和10nm Jaspl处理48h后的RH-30细胞肌动蛋白细胞骨架的荧光显微镜成像。F-actin纤维用Phalloidin Alexa 546(红色)标记，细胞核用Hoechst(蓝色)标记。

图8：VSM对RH-30细胞蛋白水平的浓度依赖性作用。表达因子均经过密度测定，并归一化到溶剂对照，设为1。不同浓度VSM处理(1、10、25、50和100μg/mL)对RH-30细胞β-actin、PCNA、AMT、GCSH、SGPL1、ezrin、CXCR4、P-cadherin和stathmin蛋白表达的浓度依赖性影响。(三个独立实验的代表图像，n＝3)聚丙烯酰胺凝胶的无染色图像具有加载控制功能(每个通道向蛋白质凝胶施加10μg蛋白质)。

图9：在VSM处理下进一步影响代谢物。在48小时VSM(25μg/mL)处理的过程中，RH-30细胞中另外12种显著不同代谢物用额外的箱形图表示，相对地表示为未治疗对照的中位数(代谢物注释是假定的)。

图10：计算IC₅₀值原始的VSM剂量-反应曲线。48h提取处理的RMA细胞系(A)RH-30，(B)HA-OH1，原发的非致瘤细胞，(C)人间充质干细胞(hMSC)，(D)人类成纤维细胞(NHDF)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明的实施例通过三种不同的显微镜技术，RT-PCR和蛋白质印迹分析以及代谢谱分析，以确定待检测植物源化合物的减少体外RMA的迁移，侵袭和不依赖锚定的菌落形成能力。

化学品：异黄酮染料木素(4',5,7-三羟基异黄酮；缩写为“Geni”)和黄豆苷元(4',7-二羟基异黄酮7-葡糖苷；缩写为“Daid”)，木脂素((αR,βR)-α,β-双(4-羟基-3-甲氧基苄基)丁内酯；缩写为“Mata”)和开环异落叶松树脂酚((2R,3R)-2,3-双(4-羟基-3-甲氧基苄基)-1,4-丁二醇；缩写为“Seco”)以及购自西格玛·奥尔德里奇的肌动蛋白特异性试剂和阳性对照茉莉花环素(茉莉酰胺；缩写为“Jaspl.”)。所有源自植物的单一化合物均在20℃黑暗下以浓溶液形式在二甲基亚砜(DMSO)中一次性等分试样保存。抗癌化学疗法药物顺铂在代谢谱研究中用作阳性对照。根据人体内的等毒制剂(3.3mM含10mg/mL甘露醇的0.9％盐水)制备其储备溶液。

植物材料的收集和鉴定：Vincetoxicum arnottianum(VSM)植物提取物由伊夫蒂哈尔·阿里(Iftikhar Ali)博士(巴基斯坦吉尔吉特，喀喇昆仑国际大学化学系)提供，VSM从俾路支斯坦收集，并由植物分类学家Rasool Bakhsh Tareen和Sher Wali Khan教授进行鉴定。将VSM植物样品在甲醇中提取，将其50mg干样品溶解在1mL二甲基亚砜中，形成50mg/mL的储备溶液。亚麻植物(Linum usitatissimum L.，LW)材料的种子是从农业研究所获得，植物在罗斯托克大学培育。天然亚麻根提取物的制备包括将干浸膏粉溶解在乙醇中，形成100mg/mL的储备溶液。将上述两种植物提取物的储备溶液进一步稀释至不同浓度，用于生物学研究和抗肿瘤活性测试。先通过核磁共振和液相色谱-质谱分析，根据保留时间确定了VSM和LW的主要次生植物化合物，并列于表1。单一的植物雌激素：开环异落叶松树脂酚(Seco)、罗汉松脂素(Mata)、大豆苷元(Daid)和染料木黄酮(Geni)从农业研究所获得。

表1用核磁共振和液质联用法分析了VSM和LW的主要次生植物化合物及其保留时间

细胞培养和提取处理：RMA细胞系RH-30(ACC-489)获取自德国DSMZ生物资源银行，在含有10％胎牛血清和1％抗生素抗真菌溶液的杜尔贝科改良鹰氏培养基中加超谷氨酰胺中培养。RH-30细胞保持在37℃和5％的CO₂中。每隔一天更换一次培养基，用0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸处理汇合的癌细胞。在测定条件下，将胎牛血清替换为木炭剥离的胎牛血清，将杜尔贝科改良鹰氏培养基替换为不含酚红的杜尔贝科改良鹰氏培养基以避免培养基的非特异性刺激。在处理之前，将RH-30细胞在试验培养基中适应48小时。将植物提取物和植物来源的化合物以不同的浓度应用于分析介质中48小时。载体0.1％二甲基亚砜用作阴性对照。作为主要的非致瘤性对照细胞，人成纤维细胞(NHDF，C-12385)和间充质干细胞(hMSC，C-12977)购自德国海德堡的PromoCell有限公司，并也在Promocell提供的合适培养基中培养。

细胞活力测定：与用媒介物对照处理(0.1％DMSO)相比，用不同浓度的植物提取物(VSM和LW)和植物衍生的化合物(Geni、Seco、Mata、Daid和Jaspl.)处理48h后，RH-30细胞的细胞活力。如前所述，根据制造商的说明手册，使用

AQueousOne Solution细胞增殖测定试剂盒(MTS)进行定量。使用MRX启示4.06酶标仪在λ＝490nm处读取光度吸收，对照λ＝600nm处的参考值，并且至少进行了8次具有校正的背景吸光度的重复。

细胞迁移试验：根据Ibidi规程和Ibidi培养插入物，对不同浓度的植物提取物(VSM和LW)和植物衍生的化合物(Geni、Seco、Mata、Daid和Jaspl.)处理的RH-30细胞迁移能力和间隙闭合进行了分析。用明场显微镜拍摄间隙闭合期间的图像，并使用CellSensEntry软件评估间隙面积[μm²]。

细胞侵袭测定：使用12孔组织培养(TC)插入物(

孔径)进行细胞侵袭测定，并用10μg/mL MaxGel^TM细胞外基质包被过夜。RH-30细胞在分析培养基中适应48小时，用不同浓度的植物提取物(VSM和LW)和植物衍生的化合物(Geni、Seco、Mata、Daid和Jaspl.)预处理48小时，并接种在膜插入物的上部腔室中每毫升15×103个细胞的密度。之后，将RH-30细胞暴露于浓度梯度下24小时(上室：不含酚红且FCS为10％的DMEM；下室：FCS为20％的DMEM)。固定侵入的RH-30细胞，并用PBS中的0.5％结晶紫和6％戊二醛染色30分钟。用明场显微镜拍摄侵袭RH-30细胞的图像，并用CellSens Entry软件对细胞计数。

菌落形成试验：将RH-30细胞在测定培养基中适应48小时，并用不同浓度的植物提取物(VSM和LW)和植物衍生的化合物(Geni、Seco、Mata、Daid和Jaspl.)进一步处理48小时。用1.5mL的1％琼脂在测定培养基中制成6孔板的每个孔中的底层，并用1.5mL的0.6％琼脂制成顶层。琼脂和5000个RH-30细胞在测定培养基中(即0.75毫升含有5,000个细胞的测定培养基和0.75毫升0.6％琼脂糖溶液)。生长3-4周后，将RH-30细胞集落固定，并用PBS中的6％戊二醛和0.5％结晶紫染色。用明场显微镜拍摄菌落的图像。计数含有超过25个细胞的菌落。

细胞形态的明场显微镜可视化：用CXK53反向明场显微镜分析了VSM浓度系列(100、50、25、10和1μg/mL)处理的RH-30细胞的细胞形态变化。图像是通过CellSens Entry软件拍摄的。

通过荧光显微镜和定量观察肌动蛋白：为了对经48h VSM(25μg/mL)处理的RH-30细胞进行荧光标记，将细胞在Ibidi皿中生长，并固定在4％多聚甲醛中进行透化处理。用0.1％Triton X-100和F-肌动蛋白抗体Phalloidin-Alexa 596标记。之后，与Hoechst进行了反染。标记过程之前也有描述。在共焦激光扫描显微镜Leica DMi8上捕获荧光显微图像。如前所述，为了随后对肌动蛋白纤维进行定量(应力纤维诱导)，用FilaQuant软件对共焦图像进行数学处理。

细胞形态变化的扫描电镜观察：为了进行扫描电子显微镜(SEM)，使RH-30细胞在玻璃盖玻片上生长，并在25μg/mL VSM处理条件下孵育48小时。将细胞用2％戊二醛和1％多聚甲醛固定，在0.1M磷酸盐缓冲液中洗涤，并用分级乙醇系列脱水，最后使用CO₂作为中间介质处理临界点干燥。盖玻片用碳素胶带安装在SEM存根上，并使用Bal-Tec SCD004溅射镀膜机用金层(约15-20nm厚度)进行溅射镀膜。在5kV下操作的场发射SEM中观察样品，并记录尺寸为1024×768像素的图像。

转录表达分析：根据产品方案，使用来自Bio-Rad的Aurum^TM总核糖核酸迷你试剂盒进行核糖核酸分离，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(#K1622)进行cDNA合成。如前所述，使用表2中列出的引物对和Dream Taq^TM绿色聚合酶链反应主混合物在ppendorf

′Mastercycler gradient′中进行逆转录聚合酶链反应。

表2逆转录聚合酶链反应转录物扩增中使用的所有引物对的概述和序列。

蛋白质印迹：对于蛋白质检测，一抗-β-Actin((C4)#sc-47778)、抗PCNA((PC10)#sc-56)、抗AMT(#10633-1-AP)、抗GCSH(#16726-1-AP)、抗SGPL1((H-300)#sc-67368)、抗Ezrin((3C12)#sc-58758)、抗CXCR4(#11073-2-AP)、P-钙黏着蛋白(#13773-1-AP)和胞浆磷蛋白(#3352)在4℃孵育过夜，然后在室温下用辣根过氧化物酶(HPR)偶联的二抗(小鼠#7076；兔子#7074P2)标记1小时。最后，使用Clarity^TMWestern ECL化学发光底物将蛋白质信号可视化。污点游离图像和β-肌动蛋白被用作加载对照。使用Molecular Imager ChemiDocXRS和Image Lab 6.0.1软件以光度法对带强度进行了分析。用来自独立传代细胞的单独制备的细胞裂解液重复蛋白质检测至少3次。

代谢分析：通过气相色谱-质谱法(GC-MS)对48h VSM(25μg/mL)和顺铂(3.3μM)处理的RH-30细胞进行了代谢谱分析。对于每个样品，用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA收获600000个RH-30细胞，用冰冷的0.9％氯化钠洗涤3次，并在4℃下以14,000rpm离心2分钟。之后，将细胞沉淀物在液氮中冷冻。300μL细胞提取物用于整体代谢物谱分析。代谢物的衍生和分析是通过气相色谱与四极杆飞行时间质谱仪一起通过大气压化学物质进行的电离离子源(APCI)。相比于Golm代谢组数据库，可以鉴定出代谢物。

统计分析：蛋白质印迹、逆转录聚合酶链反应和免疫荧光实验在分别传代的细胞中重复至少3次，数据集以平均值±标准差(SD)表示。使用未配对的t检验比较了统计学上的显著差异。P值：***P≤0.001；**P<0.01；*P<0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用软件Microsoft Excel 2017和Graphpad Prism版本5进行。所有有关代谢物谱的统计测试均已在R(www.r-project.org)中使用相应的功能进行。对于主成分分析，本发明使用了pcaMethods软件包，将nipals算法应用于pareto标准化数据。对于方差分析(ANOVA)，本发明将基因型和治疗视为因素并考虑了相互作用。根据原始的Benjamini-Hochberg FDR方法(所需FDR(Q)＝5％)和GraphPad Prism 8对所得的P值进行排名和校正。

结果

1、初步筛选细胞活力，迁移，侵袭和集落形成

为了检查植物雌激素包括VSM植物提取物、LW植物提取物和四种单一植物雌激素(异黄酮：Geni和Daid；木脂素：Seco和Mata)以及阳性对照茉莉花环素(Jaspl.)对儿科RMA的抗肿瘤特性，选择了肌动蛋白稳定化合物(Jaspl.)。通过细胞活力测定法(图1)在人和已建立的RMA细胞株RH-30上筛选了它们的抗癌潜力，随后用测定法进行了分析，以分析细胞迁移，侵袭和不依赖锚定的集落形成的能力(图2)。

为了初步筛选，将RH-30细胞用一系列浓度的VSM(100、50、25、10和1μg/mL)，Geni(100、50、25、10和1μM)和Daid(100、50、25、10和1μM)，以及LW(100和50μg/mL)，Jaspl.(1000、100、10、1nM)，Seco(1和0.1μM)和Mata(100、10、1和0.1μM)处理48h(图1A-G)。VSM提取物处理导致存活率显著降低，分别降低10％至30％(图1A)。用50μg/mL LW提取物处理会导致活力显著降低20％(图1B)。此外，异黄酮Geni的处理分别导致存活率显著降低，幅度降低了25％至50％(图1C)。阳性对照Jaspl.(1μM)的最高浓度导致活力降低40％(图1D)。相比之下，Seco处理对细胞活力没有影响(图1E)，而高浓度(100μM)的Mata和Daid处理分别显示活力显著降低40％(图1F)和25％(图1G)。

根据筛选结果，将VSM和LW提取物，单一化合物Geni和Jaspl.以及对照用于连续的细胞运动检查(图2A)。Geni100和VSM25表现出最有希望的抗迁移效果(50-60％，由相对迁移率定量确定)。进一步测试了这两种药物对RH-30细胞侵袭能力的影响(图2B)。阳性对照(10nM Jaspl.)介导降低了60％，VSM10和VSM25分别降低了95％和99％。Geni50治疗将侵袭性降低了约25％。与阴性对照和阳性对照相比，还测定了在VSM25和Geni50处理下锚定非依赖性生长和集落形成的能力(图2C)。阳性对照(10nM Jaspl.)减少了约27％的集落形成，而Geni50和VSM25分别减少了约44％和61％。

2、VSM治疗下的形态学改变

初步筛选显示，VSM具有很强的抗迁移和抗侵入作用(图2)。因此，选择VSM进行针对细胞形态，细胞骨架和细胞区室的研究(图3)。首先，在VSM处理下的明场显微镜分析显示，核周围的内部细胞区域中囊泡结构的浓度依赖性显著增加(图3A-3B，图7A)。RMA细胞因其高转移潜力而闻名，因此，在共聚焦显微镜下，未经处理的RH-30细胞表现出活动性和侵袭性细胞骨架形状，这在图3C中明确定义的皮质肌动蛋白中得到了证明。相比之下，共聚焦和扫描电子显微镜成像显示，在暴露48h VSM25(图3C和3D)下，RH-30细胞中强烈诱导了应力纤维形成(图3C和3D)，这也通过相对肌动蛋白丝数和相对肌动蛋白丝数的数学定量验证。使用软件“FilaQuant”(图3C)确定长度。定量显示，VSM10和VSM25具有显著的肌动蛋白稳定特性，细丝长度和细丝数量分别增加1.7至2.6倍。此外，还通过共聚焦显微镜检查了在Geni25和Jaspl.10(阳性对照)处理的RH-30细胞下肌动蛋白细胞骨架的稳定性(图7B)。

3、VSM处理对选定生物标志物表达的影响

为了深入了解作用的基本模式，不同浓度的VSM(1、10、25、50和100μg/mL)加到RH-30细胞，通过RT-PCR(图4)和western blotting(图8)评估其对选定的分子、代谢、转移和肿瘤信号标志物转录本以及蛋白表达水平的影响。转录分析显示甘氨酸脱羧酶(GLDC)、鞘氨醇-1磷酸裂解酶(SGPL1)、鞘氨醇-1-磷酸激酶1呈线性、浓度依赖性增加(SPHK1)、ezrin和趋化因子受体4型(CXCR4)和对比氨基甲基转移酶(AMT)、P-钙粘蛋白和syndecan-4转录物的线性下降(图4)。肿瘤干细胞标记物prominin(CD133)的转录水平在VSM浓度为10-100μg/mL时通常受到负面影响。最高VSM浓度为100μg/mL的处理显示甘氨酸裂解系统蛋白H(GCSH)、β-catenin和pax3-foxo1融合转录表达水平显著降低。二氢脂酰脱氢酶(DLD)和鞘氨醇-1-磷酸激酶2(SPHK2)的转录水平没有改变。蛋白质表达分析显示，当VSM浓度≥10μg/mL时，RH-30细胞的增殖率降低，这是由减少的增殖细胞核抗原(PCNA)和stathmin(细胞周期和细胞骨架调节器；癌基因)蛋白质表达所占据(图8A)。

4、VSM暴露下的代谢变化

经过48h 25μg/mL VSM或3.3μM处理过的RH30细胞代谢水平与未处理的对照组细胞比较(图5)。顺铂是中高危RMS肿瘤化疗中常用的一种烷基化细胞毒药物，为了分析VSM和顺铂(CP)对RH-30细胞代谢谱的影响，本发明使用气相色谱-大气压化学电离-质谱(GC-APCI-MS)对甲烷萃取后小极性化合物的细胞内代谢产物池进行了非靶向研究。总共分析了109个不同的化合物，其中80个通过与参考化合物的光谱库的比较得到了鉴定。对原始代谢物数据矩阵进行了无监督主成分分析(PCA)，并揭示了代谢剖面之间的系统性差异。CP和VSM处理细胞的个体代谢差异相当中等。因此，每个代谢物在治疗组和对照组之间进行进一步的比较，并根据BenjaminiHochberg的FDR方法(Q＝5％)进行ANOVA分析和多重检测校正。分析结果显示，与未处理的RH-30细胞对照相比，VSM中有25个明显改变的代谢物，而顺铂治疗中只有5个明显改变的代谢物(P≤0.01)(图5B和图9)。与未处理的对照细胞相比，这两种处理在RH-30细胞中诱导了相似的代谢产物变化。但是，由于CP处理值的散布增加(可能是由于技术成像原因)，与VSM处理相比，代谢物的显著改变较少。在VSM和CP处理下显示出最强变化的三种鉴定出的代谢物被标注为尿嘧啶，N-乙酰丝氨酸和磷酸丙酰，因此引起了对细胞代谢物的类似反应(图5B)。

5、VSM对健康细胞的作用

为了测试VSM对健康细胞的影响，一系列浓度的VSM(100、50、25、10和1μg/mL)应用于人间充质干细胞(hMSC)以及人类成纤维细胞(NHDF)，功能作为主要控制线(图6A-B)。VSM处理对人间充质干细胞hMSCs无影响(图6A)，而NHDF对照细胞的细胞活力受双向轻微影响(图6B)。另外，VSM提取液在RMA HA-OH1细胞株上孵育，以验证RH-30的结果。VSM提取物处理HA-OH1 RMA细胞后，诱导细胞存活率在10-30％范围内显著下降，与图1A中RH-30细胞的结果类似(图6C)。此外，通过剂量-反应曲线(图10)计算VSM浓度系列过程中的IC₅₀值，这使得RMA细胞系RH-30(188.75μg/mL)和HA-OH1(220.54μg/mL)以及非致瘤原代细胞的IC₅₀值略强(图6D)。

6、VSM纯化合物的分析

此外，在两种RMA细胞系RH-30和HA-OH1上示例性地测试了两种主要VSM组分(β-谷甾醇和羽扇豆醇)的治疗效果。因此，首先评估用50μg/ml单物质处理48h后代谢活性作为细胞生存力的间接标志(图6E和6F)。然后，测试了单物质效应与VSM提取物对RH-30细胞迁移能力的影响(图6G)。用β-谷甾醇处理能诱导两种RMA细胞系的活性均显著下降20％。(图6E和6F)。羽扇豆醇处理导致RH-30细胞活力显著下降10％(图6E)，HA-OH1细胞活力显著下降20％(图6F)。此外，联合处理使RH-30细胞的存活率下降了30％，HAOH1细胞的存活率下降了35％(图6E和6F)。仅用50μg/ml羽扇豆酚进行的处理才显示出对RH-30细胞具有明显的抗迁移作用(图6G)。

7、结论

结果显示VSM提取物是最有潜力的抗转移药物，可显著减少RH-30细胞的迁移、侵袭和集落形成(图2)。VSM处理后，通过显著增强的肌动蛋白应激纤维形成，证明RMA细胞已稳定(图3C和3D)。此外，随着VSM浓度(1100g/ml)的增加，在RH-30细胞核周围发现呈圆形分布的囊泡结构积累(图3A和3B图7A)。这可能是由于溶酶体网络的刺激，导致溶酶体的聚集或活性诱导增加。值得注意的是，VSM暴露显示对健康的乳腺和骨细胞以及人间充质干细胞的细胞毒性较低(图6A)。由于VSM在RMA细胞中也具有很强的抗转移特性(图1-3)，因此VSM可能对多种不同类型的癌症具有抗癌潜力。VSM甲醇全植物提取物中的主要化合物为最近被鉴定出的β-谷甾醇和羽扇豆醇，本发明实施例进一步测试了这两种化合物对RMA细胞的细胞活力和细胞迁移的影响(图6E-G)。然而，分析显示这两种物质并未对RMA细胞发挥其完全的抗肿瘤特性(图6E-G)。仅在自然环境中，即使用VSM提取物的多物质混合物，才能实现这些迁移效果。

通过分析选定的肿瘤生物标志物(图4、图8)和代谢产物水平(图5)，从转录水平和蛋白表达水平确定VSM的分子机制。高浓度的VSM浓度≥50μg/mL会轻微降低pax3-foxo1融合转录本的表达(图4C)，这可能是由于VSM直接或间接影响上游激活物/激酶的磷酸化活性。pax3-foxo1表达的降低明显导致了肌源性分化、生长停滞和诱导凋亡。此外，通过甘氨酸裂解酶系(GCS)组分GLDC、AMT、GCSH和DLD(图4B和图8B)的甘氨酸脱羧作用，PCNA蛋白表达(图8C)线性降低以及用于增殖作用的C1-体生成能力降低，表明VSM处理后RH-30细胞的增殖能力下降。癌细胞表现出增加甘氨酸消耗的偏好，以满足其对C1体的高需求，来确保高增殖能力和持续生长。此外，本发明还证实了鞘氨醇-1-磷酸(S1P)代谢酶鞘氨醇-1-磷酸裂解酶(sphingosine-1-phosphate lyase，SGPL1)的转录本和蛋白表达水平呈浓度依赖性的显著升高(图4D及图8D)。S1P是一种具有生物活性的鞘脂和第二信使，参与细胞信号转导和调节细胞运动、血管生成、增殖、生长、细胞骨架组织以及粘附依赖细胞存活的过程。此外，高浓度的S1P或SGPL1降解S1P的缺陷与癌细胞进展、定向化疗吸引和促进化疗耐药机制有关。S1P也被认为是促使RMS细胞转移侵袭的潜在趋化剂。在这种情况下，VSM处理下SGPL1表达的增加与RH-30细胞迁移、侵袭和集落形成能力的降低呈正相关。这是由于不可逆的sgpl1介导的S1P裂解导致对非鞘脂分子十六烯醛和乙醇胺磷酸的S1P定向化学吸引能力降低。进一步的观察表明，VSM暴露可通过降低syndecan-4和突起蛋白的转录水平以及CXCR4和stathmin的蛋白表达水平来降低RH-30细胞的转移行为(图4A和图8A)。趋化因子受体CXCR4和突起蛋白(CD133)的表达已经被发现影响RMA细胞的转移潜能，而syndecan-4和stathmin的表达可以预测许多癌症类型的临床结果。最后，与未处理的细胞相比，VSM的代谢谱分析和对顺铂的标准治疗的比较考虑证实，VSM和顺铂治疗仅对RH30细胞的初次代谢产生中等程度的影响(图5)。有意思的是，在两种处理中，尿嘧啶、n-乙酰丝氨酸和磷酸丙酰三种代谢物都受到影响(图5B)。尿嘧啶水平升高，可能表明嘧啶稳态受损，由于不正确的替代和负细胞毒性作用，可能导致DNA链断裂。n-乙酰丝氨酸水平的降低可能是蛋白质降解的一种指示。这两种代谢物的改变也在本发明之前的研究中发现涉及使用具有抗癌特性的植物源提取物即小檗(Berberis orthobotrys，BORM)的甲醇根提取物对RH-30细胞进行处理时发现。在VSM，顺铂和BORM的处理下，类似的代谢物谱可能表明对治疗有积极反应。综上所述，本发明结果表明，VSM处理稳定了肌动蛋白细胞骨架，降低了RH-30细胞的运动性、侵袭性、集落形成、生长和增殖水平，进而导致代谢关闭。进而表明，Vincetoxicum arnottianum(VSM)的甲醇全植物提取物具有有效的肌动蛋白丝稳定性，且副作用低，可治疗小儿肺泡横纹肌肉瘤。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.巴基斯坦夹竹桃科植物Vincetoxicum arnottianum甲醇全植物提取物在制备治疗肺泡横纹肌肉瘤的药物中的应用，其特征在于，所述巴基斯坦夹竹桃科植物Vincetoxicum arnottianum甲醇全植物提取物至少包括β-谷甾醇和羽扇豆醇。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抗转移药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物抗肿瘤细胞迁移的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为肌动蛋白稳定药物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抗肿瘤细胞侵袭的药物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抗肿瘤细胞不依赖锚定的集落形成的药物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物在应用时引起包括至少尿嘧啶，N-乙酰丝氨酸和磷酸丙酰的细胞代谢物的变化。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物降低GCSH、β-catenin和pax3-foxo1融合转录表达水平，但不影响DLD和SPHK2的转录水平。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物增加SGPL1的表达。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述巴基斯坦夹竹桃科植物Vincetoxicum arnottianum甲醇全植物提取物的浓度为25-100µg/mL。

Images