CN112351800A

CN112351800A - 承载用的聚集胶原蛋白构建体

Info

Publication number: CN112351800A
Application number: CN201980044389.0A
Authority: CN
Inventors: H·阿拉维; Y·郭
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 2018-07-02
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: US20200000962A1; EP3817783A1; WO2020009903A1; CN112351800B

Abstract

可以通过聚集胶原蛋白原纤维来形成供用于工程化组织的承载用的聚集胶原蛋白材料。可以通过渗析执行所述聚集。可以通过中和包含胶原蛋白单体的酸性溶液来形成所述原纤维。

Description

承载用的聚集胶原蛋白构建体

相关申请案

本申请案要求2018年7月2日提交的第62/693,089号美国临时申请案的权益，所述申请案以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开内容涉及承载用的聚集胶原蛋白构建体的产生和使用。具体来说，聚集胶原蛋白可以用作用于植入患者体内的工程化组织，作为组织工程或药物筛选应用等的基底。

背景技术

胶原蛋白是由可溶性单体形成的自组织蛋白，且充当高度专用的结缔组织膜(如心脏瓣膜)的主要承载组分。作为三螺旋自组织蛋白的原胶原可以在适当的条件下(通常是酸性条件)溶解成单体，且当恢复到生理条件(例如，pH 7.4和37℃的缓冲盐水)时可以自组装形成胶原蛋白原纤维。然而，关于单一胶原蛋白原纤维自组装以形成与体内观察到的相似的负载支链胶原蛋白原纤维、超原纤维或胶原蛋白纤维的报道受到限制。因此，组织工程师经常将胶原蛋白用作可降解的细胞转运载体，而不是机械上坚固的结缔组织。

美国专利第9,518,106号描述(除其它事项外)在可以耐受组织在体内可经受的负载的工程化结缔组织方面缺乏成功。美国专利第9,518,106号也描述方法，其中将包含浓缩的胶原蛋白单体的溶液约束在三维模板内，并使其在模板内聚合形成胶原蛋白原纤维。尽管可以通过美国专利号9,518,106中描述的方法形成更高密度的胶原蛋白材料，但仍然存在一些关于通过这类方法形成的胶原蛋白材料是否仅是缠结的单一原纤维的网络，而不是支链原纤维状、超原纤维状或纤维性网络。另外，所形成的材料可无法承受结缔组织在体内可经受的负载。

发明内容

本公开内容描述(除其它事项外)形成承载用的聚集胶原蛋白构建体的方法。尽管不欲受理论限制，但据信本文所描述的方法通过大分子聚集来实现。大分子聚集是与生理相关的过程，其引起已占体积效应(EVE)，其可诱导胶原蛋白自组装。与先前描述的浓缩胶原蛋白单体且然后使浓缩的单体聚合以形成胶原蛋白原纤维的方法不同，本申请描述已经聚合的胶原蛋白原纤维的聚集(体积排阻)。通过聚集已经形成的原纤维，而不是浓缩胶原蛋白单体，所得的胶原蛋白可以产生更稳定坚固材料，其含有支链原纤维状、超原纤维状或纤维性网络。

当浓缩的胶原蛋白单体被中和且聚合时，据信一旦原纤维开始形成，由于中和剂的迁移性降低，可导致不相容的原纤维形成。当由浓缩的单体形成原纤维时，可以防止或抑制中和剂进入其它胶原蛋白单体的能力，这可导致不相容的原纤维形成。在小单体或较弱的原纤维可不具有抵抗EVE的足够强度的这类过程期间，也存在胶原蛋白单体、原纤维或单体和原纤维的大量损失。另外，在所得胶原蛋白材料的表面到所得胶原蛋白材料的核心，聚合速率可以变化。举例来说，由于外部加热引起的在核心处的生理温度的温度升高的相对延迟，表面可比核心更快地开始聚合。其中浓缩的胶原蛋白单体被中和且聚合以形成单一胶原蛋白纤维的现有公开内容并未描述导致单一原纤维转移到坚固支链原纤维的网络或甚至更成熟的阶段(如更厚的超纤维状网络或纤维性结构)的过程或机理。本文所描述的方法可(除其它事项外)提供更均匀、生理上聚集和坚固的胶原蛋白材料。

本文描述的聚集胶原蛋白材料可适用于工程化机械坚固的结缔组织。由于其压缩的结构，本文所描述的胶原蛋白材料可用于产生结缔组织，其具有优于天然结缔组织或先前工程化组织的优点。举例来说，包含本文所描述的聚集胶原蛋白的工程化组织可以具有以下各项中的一或多个：相对于先前工程化结缔组织，更耐久；或更不易钙化；更不易形成血栓；更不太可能诱发免疫反应；并能够在制造之前调整结构。由于其压缩和聚集胶原蛋白结构以及单一原纤维/超原纤维/纤维之间的更坚固结合中的一个或多个，相比于天然和先前人工组织，承载用的聚集胶原蛋白组织可更耐用。由于形成原纤维/纤维的经聚集的额外堆积和支链网络，胶原蛋白构建体的表面可抵抗钙沉积和扩散(外在和固有钙化)，并可减少细胞(活的或死的)诱导的固有和外在钙化。由于这些构建体的表面光滑，它们可对红细胞和血栓造成的损害较小。另外，这些构建体可较不易诱发免疫反应，因为它们的聚集结构可以阻断由单核细胞分化引起的巨噬细胞渗透。阻断巨噬细胞的渗透将减少炎症诱导的钙化，纤维性囊的形成，并因此减少内在、外在或内在和外在的钙化。

在本文公开的一些实施方案中，方法包括形成胶原蛋白原纤维和聚集胶原蛋白原纤维以形成胶原蛋白密度为100mg/ml或更大的胶原蛋白构建体。举例来说，胶原蛋白构建体可以具有约250mg/ml或更大或约700mg/ml或更大的胶原蛋白密度。在一些实施方案中，胶原蛋白构建体具有约700mg/ml至约1000mg/ml的胶原蛋白密度。可通过渗析来聚集原纤维。

优选地，原纤维由浓度为约50mg/ml或更小的胶原蛋白单体溶液形成。举例来说，原纤维可以由浓度为约40mg/ml或更小，约35mg/ml或更小，约30mg/ml或更小，约25mg/ml或更小的，约20mg/ml或更小，约15mg/ml或更小，约10mg/ml或更小，或约5mg/ml或更小的胶原蛋白单体溶液形成。可以通过中和溶液的pH(并降低浓度)，然后进行聚合来形成原纤维。通过在包含这类相对较低浓度的胶原蛋白单体的溶液中形成原纤维，中和剂应能够更均匀地影响所有单体并产生更均匀的原纤维形成。

一旦形成，可通过例如渗析将原纤维聚集以形成原纤维的分支网络、超原纤维或纤维中的一个或多个。在一些实施方案中，预温育可以在聚合阶段之前进行，以进一步增强自组装并允许产生更厚的超原纤维、纤维网络或更厚的超原纤维和纤维网络。

在一些实施方案中，例如经由渗析的聚集可以与施加负载结合以产生厚的超原纤维或纤维的坚固网络。在聚集期间，可以将任何合适的负载施加到构建体。举例来说，可以将剪切应力、弯曲应力和法向(拉伸/压缩)应力中的一种或多种施加到构建体。聚集可以在多于一个阶段中执行。举例来说，可以在聚合之前(单级温育)和聚合之后执行聚集。胶原蛋白单体可以与蛋白质如但不限于纤连蛋白和层粘连蛋白结合，以进一步增强自组装过程并产生杂合构建体。

在本文公开的一些实施方案中，工程化组织包括胶原蛋白构建体，其包含密度为约100mg/ml或更大的胶原蛋白原纤维、超原纤维或纤维。举例来说，包含多个胶原蛋白原纤维、超原纤维或纤维的构建体可以具有约250mg/ml或更大的密度或可以具有约700mg/ml至约1000mg/ml的密度。可将构建体中的多个胶原蛋白原纤维、超原纤维或纤维交联，以进一步增强构建体的强度和寿命，并避免体内降解。这些构建体也可以“按原样”用作传统的体外、原位或现成的组织工程化应用的基底/支架。通过体外组织工程，可以在植入前在基底上培养细胞。在原位组织工程应用的情况下，可以无细胞植入支架，以被体内的细胞填充。在现成的组织工程应用中，可以体外在支架上培养细胞以形成基质，然后可以在植入前将支架脱细胞，并且一旦植入，身体可以重新填充支架。以其原始形式的胶原蛋白构建体可以基本上不含细胞或不含细胞。

胶原蛋白构建体如工程化组织可以用于任何合适的目的。在一些实施方案中，工程化组织用于形成整个心脏瓣膜(例如，包括内腔、小叶和裙部的全部或组合)、瓣膜小叶、瓣膜裙部、瓣膜内腔或其一部分，以用于人工心脏瓣膜。在一些实施方案中，工程化组织用于形成瓣周包裹物，以防止在人工心脏瓣膜植入后的渗漏。在一些实施方案中，工程化组织用于形成血管或动脉移植物。在一些实施方案中，工程化组织用于形成心脏补片。在一些实施方案中，工程化组织用于形成皮肤补片。在一些实施方案中，工程化组织用于伤口愈合或组织修复应用。在一些实施方案中，工程化组织用于面部重建应用，如但不限于耳鼻重建。

附图说明

图1是说明胶原蛋白纤维形成的过程中的阶段的示意图。

图2-5是说明本文描述的方法的实施方案或方法的方面的流程图。

图6A-C是根据本文描述的实施方案的包含胶原蛋白构建体的工程化人工心脏瓣膜的示意图。图6A是俯视图；图6B是剖视透视图，且图6C是透视图。

图7是根据本文描述的实施方案的包含胶原蛋白构建体的工程化瓣周包裹物的示意性透视图。

图8是各种测试的胶原蛋白材料和组织的应力-应变曲线图。

图9A-D是各种测试的胶原蛋白材料和组织的拉伸模量(9A)、弹性模量(9B)、最大或极限张应力(9C)以及最大应力下的应变(9D)的曲线图。

图10是根据本文提出的教导制备的猪胶原蛋白组织、牛胶原蛋白组织和胶原蛋白材料对酶促(链霉蛋白酶)降解的抗性的图示。

图11A-D是胶原蛋白材料和胶原蛋白组织的多个显微图像：11A(150mg/ml胶原蛋白材料，放大6000倍)；11B(Evolut Pro胶原蛋白组织，放大3000倍)；11C(150mg/ml胶原蛋白材料，冲洗后，放大6000倍)；和11D(250mg/ml胶原蛋白材料，冲洗后，6000X放大率)。

图12A-B是中和后在4℃下预温育四小时的胶原蛋白材料的显微镜图像：12A(未冲洗，放大6000倍)；和12B(冲洗后，放大6000倍)。

图13A-B是在聚集期间以(13A，放大10倍)和没有(13B，放大10倍)双向流动的情况下产生的胶原蛋白材料的显微镜图像。

具体实施方式

以下详细描述在本质上是说明性的，且不旨在以任何方式限制本文所公开的本发明实施方案的范围、适用性或配置。相反，以下描述提供实际实例，并且本领域技术人员将认识到，一些实例可以具有合适的替代方案。下文中将结合不是按比例绘制的(除非另有说明)的附图来描述实施方案，其中相同的数字/字母表示相同的元件。然而，将理解，在给定附图中使用数字来指代部件并非旨在限制另一附图中用相同数字标记的部件。另外，使用不同数字指代不同附图中的部件并非旨在指示不同编号的部件不能与其它编号的部件相同或类似。提供用于选择元件的结构、材料、尺寸和制造过程的实例，并且所有其它元件采用本领域技术人员已知的那些。

现在将更详细地参考本公开的主题的各种实施方案，本公开的一些实施方案在附图中说明。

本公开内容描述(除其它事项外)用于形成承载用的聚集胶原蛋白构建体的方法，以及包括该聚集胶原蛋白构建体的制品，如工程化组织。形成聚集胶原蛋白构建体的方法包括：由胶原蛋白单体形成胶原蛋白原纤维；以及聚集(体积排阻)所形成的胶原蛋白原纤维，以形成负载聚集胶原蛋白构建体。该方法可任选地包括胶原蛋白原纤维的约束(应变稳定)和应力诱导自组装中的一者或两者。

如本文所用，“胶原蛋白”是具有三级结构的细胞外基质的蛋白组分，其包括缠结形成三螺旋的多肽链或具有包含GLY-X-Y重复单元的特征性氨基酸组成或其片段。X可以是脯氨酸，并且Y可以是羟脯氨酸。胶原蛋白可以是本领域已知的任何胶原蛋白，如1-29型胶原蛋白中的一种。优选地，胶原蛋白是原纤维状胶原蛋白，如I、II、III、V和XI型，其充当承载胞外基质(ECM)的主要结构组分。

如本文所用，“胶原蛋白原纤维”是直径在约10nm至约500nm范围内的胶原蛋白分子的集合体。多个原纤维可以缠结以产生比由非缠结原纤维组成的结构具有更高强度的结构。在本文所述的一些实施方案中，胶原蛋白可包含支链胶原蛋白原纤维的网络。可以经由显微镜观察“支链胶原蛋白原纤维的网络”。在本文描述的一些实施方案中，胶原蛋白构建体包含胶原蛋白超原纤维。如本文所用，“胶原蛋白超原纤维”是局部组织和定向的胶原蛋白原纤维。在一些实施方案中，胶原蛋白构建体包含胶原蛋白纤维。如本文所用，“胶原蛋白纤维”是纤维结构中的多个胶原蛋白原纤维的集合体，其直径在约1微米至约500微米范围内的。胶原蛋白纤维形成的各个阶段在图1的示意图的形式中描绘。

如图1所示，前体α链400在步骤1中组装以形成具有松弛末端410的原胶原三螺旋。在步骤2中，原胶原肽酶切割具有松弛末端410的原胶原三螺旋，以产生胶原蛋白分子420。在步骤3中，胶原蛋白分子420被组装以产生直径为约10nm至约500nm的胶原蛋白原纤维430。在步骤4中，较小的胶原蛋白原纤维430组装以形成直径为约1微米至约500微米的较大直径的胶原蛋白纤维440。

任何已知的胶原蛋白可用于本文所述的方法。胶原蛋白可以分离自或衍生自天然来源，或者可以以任何合适的方式制造。举例来说，胶原蛋白可以以生化方式或合成方式制造，通过基因工程来制造等。胶原蛋白也可以从许多商业供应商中的任一家购买。

胶原蛋白可以获自任何合适的哺乳动物组织。举例来说，胶原蛋白可以从肌腱、骨头、软骨、皮肤或任何其它合适的器官获得。在一些实施方案中，胶原蛋白获自大鼠尾肌腱、猪或小牛皮肤。

无论来源如何，胶原蛋白都可以经纯化。纯化的胶原蛋白可以呈任何合适的形式，如粉末。粉末状胶原蛋白从例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)和赛默飞世尔(Thermo Fisher)商购。

纯化的胶原蛋白可以在合适的溶液中经复水。溶液优选是酸性的。更优选地，溶液是pH为约4或更小，如约2至约3.5的水溶液。在这类酸性溶液中，复水的胶原蛋白包含胶原蛋白单体。优选地，溶液包含足够量的乙酸或盐酸以达到约2至约3.5的pH。复水的胶原蛋白可从例如西格玛-奥德里奇公司商购。

复水的酸性胶原蛋白溶液可以被中和以引起由胶原蛋白单体形成胶原蛋白原纤维。如本文所用，“胶原蛋白原纤维”意指结构中的若干胶原蛋白单体的缔合物，其在合适放大倍数的情况下呈现纤维状，其中原纤维的厚度通常在10nm至500nm之间。原纤维可以自组装以形成超原纤维、纤维或超原纤维和纤维。胶原蛋白纤维的厚度通常在约1微米至约500微米的范围内。

复水的胶原蛋白溶液可以任何合适的方式中和。举例来说，可以通过向溶液中加入碱来中和复水的胶原蛋白溶液。可以使用任何合适的碱。举例来说，碱可以是氢氧化钠。优选地，通过将溶液的pH调节至5或更大的pH来中和溶液。举例来说，可以将溶液的pH调节至约5至约10，如约5.5至约9.5，约6至约9，约6.5至约8.5或约6.5至约8。将溶液中和允许原纤维形成。

经过中和的溶液也可以任何其它合适的方式改变。举例来说，可以将合适的缓冲液如磷酸盐缓冲盐水等添加到溶液中。通过改变溶液以更紧密地模拟体内流体，可以促进原纤维形成。可以将经过中和的溶液添加或注射到密闭空间(例如盒子)，其具有待由胶原蛋白形成的所需组织的形状。密闭空间的尺寸可调节。

经过中和的溶液可以被加热以有助于由胶原蛋白单体形成胶原蛋白原纤维。在一些实施方案中，将经过中和的溶液加热至约37℃。在一些实施方案中，在加热溶液之前，将经过中和的溶液保持在低于37℃的温度下。相比在较高的温度(例如37℃)下，原纤维形成的速率在较低的温度下可更低。不打算受理论限制，据信更低的原纤维形成速率可提供更均匀的原纤维形成和更完整的原纤维形成。

在一些实施方案中，经过中和的溶液在约4℃下保持一段时间以允许缓慢的原纤维形成。举例来说，经过中和的溶液可以在4℃下保持约4小时至约48小时，例如约8小时至约36小时或约24小时。将中和后的溶液保持在约4℃后，可任选地将经过中和的溶液在37℃下温育任何合适的时间，以完成聚合和原纤维形成。举例来说，经过中和的溶液可以在37℃下温育约15分钟至约4小时，如约30分钟至约2小时，或约1小时。

在一些实施方案中，使用pH受控的渗析执行中和。控制渗析剂的pH可以如通过滴定来手动执行，或者如使用pH控制器来自动执行。可在低温(例如4℃)或更高温度(例如37℃)下或依次执行pH受控的渗析。在此阶段期间的渗析可或可不诱导分子聚集。

经过中和的溶液可以包含任何合适浓度的胶原蛋白。优选地，经过中和的溶液包含浓度为约50mg/m或更低的胶原蛋白，如约30mg/ml或更小，约25mg/ml或更小，约20mg/ml或更小，约15mg/ml或更小，或约10mg/ml或更小。与具有更高浓度的胶原蛋白单体的中和溶液相比，通过在包含这类浓度的胶原蛋白单体的溶液中形成原纤维，可引起单体的更均匀和完全消耗以形成原纤维。在一些实施方案中，胶原蛋白单体溶液可以首先与其它分子如但不限于聚乙二醇或糖胺聚糖如透明质酸结合，且然后经中和以实现双或三分子聚集。

然后可以对原纤维进行渗析以浓缩和聚集原纤维。渗析可以在密闭空间如盒子中执行，该空间具有待由胶原蛋白形成的所需组织的形状。在渗析之前，期间或之后，原纤维可以自组装以形成超原纤维、纤维或超原纤维和纤维。

渗析可以在任何合适的条件下执行。举例来说，可以适应地变化渗析的持续时间和温度。优选地，渗析在约4℃至约37℃的温度下执行。渗析(其可包括用来渗析聚集胶原蛋白的溶液)的持续时间优选约30分钟至48小时，如约2小时至约36小时，约12小时至约30小时，或约24小时。任何合适的膜均可用于执行渗析。举例来说，膜的截留分子量可以在约1000Da至约20,000Da，如约2000Da至约10,000Da，或约7000Da的范围。可以通过任何合适的溶液渗析胶原蛋白。举例来说，胶原蛋白可以通过聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、水溶性聚合物、糖胺聚糖、透明质酸或任何其它含有大分子的合适溶液来渗析。优选地，通过PEG渗析胶原蛋白。PEG可具有任何合适的分子量。举例来说，PEG的数均分子量(Mn)可为约2000Da至约30,000Da，如约4000Da至约25,000，或约8000Da至约20,000Da。另外，渗析溶液可具有任何合适的浓度。举例来说，在水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中约10％(w/v)至约50％(w/v)，或约20％(w/v)至约40％(w/v)。

优选地，渗析膜的截留分子量(MWCO)低于渗析胶原蛋白所用的溶液中的分子如PEG的分子量(MW)。如果MWCO高于PEG的MW，则可发生过度聚集。

优选地，渗析引起胶原蛋白浓度为100mg/ml或更大，如250mg/ml或更大，或700mg/ml或更大。在一些实施方案中，胶原蛋白浓度为约700mg/ml至约1000mg/ml。胶原蛋白密度可以通过任何合适的生化或生物物理方法来测量，如任何合适的分光光度法或量热法。另外，可以通过计算构建体的总体积及其与初始体积的比率来测量胶原蛋白密度。

本文描述的聚集胶原蛋白材料可适用于工程化机械坚固的结缔组织。由于其经聚集的结构，本文所描述的胶原蛋白材料可用于产生结缔组织，其具有优于天然结缔组织或先前工程化组织的优点。举例来说，包含本文所描述的聚集胶原蛋白的工程化组织可以具有以下各项中的一或多个：相对于先前工程化结缔组织，更耐久；或更不易钙化；更不易形成血栓；更不太可能诱发免疫反应；并能够在制造之前调整结构。由于其密实和聚集胶原蛋白结构以及单个原纤维/超原纤维/纤维之间的更坚固结合或密实和聚集结构以及更坚固键结中的一个或多个，相比于天然和先前人工组织，承载用的聚集胶原蛋白组织可更耐用。由于形成经聚集的额外堆积和支链的原纤维/纤维网络，胶原蛋白构建体的表面可抵抗钙沉积和扩散(外在和固有钙化)，并可减少细胞(活的或死的)诱导的固有和外在钙化。由于这些构建体因由PEG覆盖而具有的光滑表面，它们可对红细胞造成更小损害，并且由于胶原蛋白与血液的相互作用而降低血栓形成。另外，构建体可较不易诱发免疫反应，因为它们的聚集结构可以阻断由单核细胞分化引起的巨噬细胞渗透。阻断巨噬细胞的渗透可减少炎症诱导的钙化，纤维性囊的形成，并因此减少内在、外在或内在和/或外在的钙化。

在一些实施方案中，通过溶液的动态流动执行渗析，通过该溶液对胶原蛋白渗析。来自流体流的喷射料流会产生剪切力，其可影响胶原蛋白原纤维的排列和方向，并加速自组装过程，从而形成较厚且细长的原纤维、超原纤维和纤维。可以通过任何合适的方法来产生流。在一些实施方案中，使用浸没在渗析溶液中或连接到渗析溶液容器的泵的一个或多个来产生流，其中喷射料流经过平坦构建体的表面。在一些实施方案中，当构建体具有复杂的形状如心脏瓣膜形状时，使用流动模拟器系统产生该流。循环中的流体的流速可以变化以模拟高和低剪切速率。可以通过泵相对于盒子的空间位置来调节流速。循环的方向可以通过定向泵及其喷射料流的方向来变化。在一些实施方案中，可使用一个潜水泵产生平行于平坦胶原蛋白片材的流动。泵的放置方式应使流动仅经过一个表面(顶部或底部)或两个表面。在一些实施方案中，两个潜水式泵可以相对于彼此成一定角度地使用以产生双向流动料流。流动料流可以彼此垂直。在一些实施方案中，可以以一种方式放置泵，以使得产生经过胶原蛋白片材的顶表面的喷射料流，以及来自另一泵的经过胶原蛋白片材的底表面的流。这些流动料流可以相对于彼此成角度，如彼此成90度。这样，片材的一侧中的胶原蛋白原纤维/纤维具有与片材的另一侧中的胶原蛋白纤维垂直(或成角度)的方向。这可产生具有各向异性行为的胶原蛋白构建体。可以在聚集的胶原蛋白期间的任何阶段施加动态流动(剪切力)，如复水、中和、预温育、单级温育、聚合、渗析、交联或其组合。

如上所述，纤维或原纤维的排列或取向可以用于增强构建体的长期耐久性和机械性能，就像天然胶原蛋白组织中胶原蛋白纤维在某些方向上排列的情况一样。此外，在渗析期间施加剪切负载可以加快并增强自组装过程。在承载组织如心脏瓣膜小叶的情况下，胶原蛋白纤维和弹性蛋白纤维可以在它们自身的亚层中不同地排列以提供各向异性特性。产生排列的胶原蛋白纤维/纤维的另一种方式是施加弯曲应力/应变或施加法向(拉伸或压缩)应力/应变。在一些实施方案中，可以通过悬挂重物拉胶原蛋白构建体或将其放置在张力板上以诱导方向性。与动态流动(剪切力)一样，在聚集胶原蛋白期间任何阶段(如复水、中和、预温育、单级温育、聚合、渗析、交联，或其组合)都可以施加其它负载方案或这类负载的组合。

聚集胶原蛋白材料可以与其它材料(如但不限于织物、聚合物、生物材料和金属)结合使用，以形成杂合结构。这些材料可以提供额外功能，以改善最终杂合结构的化学、机械或生物学性能。它们可以进一步增强构建体或改善生物相容性和血液相容性。添加的材料可以呈任何合适的形式，如溶液、凝胶、固体颗粒、织造或非织造材料或其组合。它们可以均匀分布在整个聚集胶原蛋白中，仅以不均匀的分布应用于特定区段，或作为表面涂层施加。在一些实施方案中，添加的材料可以是弹性蛋白。弹性蛋白可以任何比例用胶原蛋白中和，如胶原蛋白与弹性蛋白的比例为约20:1至约1:20；或约10:1至约1:1；或约5:1到约2:1。在一些实施方案中，添加的材料可以是纤连蛋白或层粘连蛋白。在一些实施方案中，添加的材料可用于加强构建体的某些部分。举例来说，以心脏瓣膜小叶的形式，可以加强小叶的基部部分，在基部中将小叶缝合到织物或附接到框架。本文档中描述的任何结构调整过程也可以应用于杂合结构。

在聚集和浓缩之后，所得的胶原蛋白材料可以任选地与合适的交联剂交联。举例来说，所得的胶原蛋白材料可以用以下一种或多种进行交联：戊二醛、二异氰酸酯、聚环氧化合物、γ射线照射、紫外线照射、转谷氨酰胺酶、醚、环氧化物、碳二亚胺、天然交联剂如京尼平等，或其组合。可以采用的交联剂和方法的一些实例包括戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰亚胺(EDC)、孟加拉玫瑰红、核黄素、核糖、葡萄糖、京尼平、橄榄苦苷、转谷氨酰胺酶等。

纤维或原纤维的交联可用于为所得胶原蛋白材料提供一种或多种有利性质。举例来说，交联可增强所得胶原蛋白材料的强度，可引起组织不易被细胞或钙渗透，可引起组织不易降解等。在一些实施方案中，所得胶原蛋白材料不交联。胶原蛋白材料可以“原样”用于体外、原位或现成的组织工程。在一些实施方案中，胶原蛋白材料用于药物筛选应用。

可以通过调节与形成胶原蛋白材料有关的参数来调节所得胶原蛋白材料的结构、浓度和纤维取向，该胶原蛋白材料可以用作或用于产生工程化组织。举例来说，可以视需要调节由胶原蛋白单体形成原纤维的时间和温度。可以适当地调节用于形成胶原蛋白原纤维或纤维的中和溶液的pH、重量摩尔渗透浓度和其它溶液性质。可以视需要调节使原纤维浓缩的渗析持续时间，渗析温度，渗析膜的截留分子量，对胶原蛋白渗析的溶液等。纤维取向、杂合结构或交联可以视需要执行或可不执行。可以调节这些和其它参数以产生具有期望性质的工程化胶原蛋白组织。

胶原蛋白材料可以具有任何合适的机械性质。优选地，胶原蛋白材料具有约20MPa或更大的弹性模量。当以10mm/min的速率单轴向拉伸40mm×10mm胶原蛋白材料的试样块并且当峰值负载百分比降低40％时结束时，可以测量弹性模量。优选地，胶原蛋白材料具有约40MPa或更大，约60MPa或更大，约80MPa或更大，或约100MPa或更大的拉伸模量。

优选地，胶原蛋白材料具有约1MPa或更大，如约10MPa或更大的拉伸模量。在一些实施方案中，胶原蛋白材料可具有约25MPa或更大或约50MPa或更大的拉伸模量。拉伸模量是在低应变或生理应变时软组织(粘弹性)材料的应力-应变曲线的切线的斜率。弹性模量的计算类似于拉伸模量；但是，它属于较高的应变量，其中应力-应变曲线位于弹性区段。

聚集胶原蛋白材料可以具有任何合适的厚度。在一些实施方案中，胶原蛋白材料具有约0.05mm至约1mm，如约0.1mm至约0.4mm的厚度。可以根据胶原蛋白材料的预期用途来调节胶原蛋白材料的厚度。

通过本文描述的方法产生的胶原蛋白材料可以用于工程化任何合适的组织。举例来说，胶原蛋白材料可用于工程化软组织结构、软骨结构、结缔组织、血管组织、骨组织等。胶原蛋白材料可用于工程化气管、会厌、声带等的软组织。胶原蛋白材料可用于工程化关节软骨、鼻软骨、跗骨板、气管环、甲状腺软骨、关节软骨。胶原蛋白材料可用于工程化血管移植物及其组件。胶原蛋白材料可用于工程化片材，该片材用于局部应用或用于修复器官如肝、肾和胰。胶原蛋白材料可用于工程化骨骼、牙齿结构、关节、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、肌腱、半月板、韧带、血管、支架、心脏瓣膜、角膜、鼓膜、神经导引器、组织补片或密封剂、用于缺失组织、皮肤的填充剂等。

在一些实施方案中，产生具有预定形状的胶原蛋白，该预定形状例如由用于渗析的盒子或密闭容器的形状约束。举例来说，盒子可引起以如下形状形成胶原蛋白组织：具有管状内腔和连续附着的小叶的完整心脏瓣膜(不需要缝合小叶)，没有内腔的整个心脏瓣膜，心脏瓣膜小叶，心脏瓣膜裙部，心脏瓣膜框架，瓣周包裹物或血管。

在一些实施方案中，胶原蛋白可以通过手工加工来成形，如缝合、密封、钉合、切割等。在心脏瓣膜的情况下，形成的瓣膜可以压力固定或可以不压力固定。

现在参考图2-7，描绘说明性方法和制品。

图2说明其中形成胶原蛋白原纤维(100)并且形成的胶原蛋白原纤维被聚集(200)的方法。胶原蛋白原纤维可在足以使胶原蛋白具有100mg/ml或更大的密度(如250mg/ml或更大，700mg/ml或更大，或700mg/ml至1000mg/ml)的条件下聚集。优选地，胶原蛋白原纤维在使原纤维形成缠结的原纤维、支链原纤维的网络、超原纤维或纤维的条件下聚集。

可以以任何合适的方式引起或控制缠结的原纤维、支链原纤维的网络、超原纤维或纤维的形成。举例来说，当原纤维被聚集时，可将负载施加于胶原蛋白构建体。在聚集期间，可以将任何合适的负载施加到构建体。举例来说，可以将剪切应力、弯曲应力和法向(拉伸/压缩)应力中的一种或多种施加到构建体。

当胶原蛋白被聚集以形成杂合构建体时，可以包括一种或多种额外组分。合适的额外组分的实例包括织物、聚合物、生物材料和金属。在一些实施方案中，额外组分包括弹性蛋白。在一些实施方案中，额外组分包含纤连蛋白或层粘连蛋白。

胶原蛋白原纤维可以在任何合适的时间和以任何合适的方式交联。在一些实施方案中，胶原蛋白原纤维不交联。

图3说明方法，其中通过中和包含胶原蛋白单体的溶液形成胶原蛋白原纤维(110)，并且通过对原纤维进行渗析(210)来使胶原蛋白纤维聚集。包含胶原蛋白单体的溶液可以任何合适的方式中和。举例来说，溶液可以是酸性的，并且可以通过添加碱来中和。优选地，将溶液中和至约5至约10范围的pH以形成胶原蛋白原纤维。溶液可以包含任何合适浓度的胶原蛋白单体。举例来说，溶液可以包含浓度为50mg/ml或更小的胶原蛋白单体，如30mg/ml或更小，25mg/ml或更小，20mg或更小，15mg/ml或更小，或10mg/ml或更小。

可以形成任何合适的渗析方案以聚集胶蛋白原纤维。优选地，将通过包含聚乙二醇(PEG)的溶液对原纤维渗析。PEG可具有任何合适的分子量。举例来说，PEG可具有在约2000至约30,000的范围内的数均分子量(Mn)。优选地，使用截留分子量为约1000至约20,000的膜执行渗析。

图4说明方法，其中通过中和包含胶原蛋白单体的溶液来形成胶原蛋白原纤维(113)，将经过中和的溶液在4℃下预温育(115)，且然后将经过中和的溶液在高于4℃的温度下温育(117)。举例来说，温育(117)的温度可以为约37℃。温育(117)可以持续任何合适的时间，如约15分钟至约4小时。在4℃下的预温育可以持续任何合适的时间，如约4小时至约48小时。

图5说明方法，其中胶原蛋白原纤维在盒子(213)中被浓缩，并且胶原蛋白构建体从盒子(215)中移出。如本文所用，“盒子”是其中胶原蛋白原纤维可被聚集的任何合适的三维结构。优选地，盒子具有与胶原蛋白构建体的期望形状相对应的内部形状。举例来说，如果胶原蛋白构建体用作人工心脏瓣膜，则盒子的内部形状和尺寸是人工心脏瓣膜的形状和尺寸。

图6A、6B和6C说明包含胶原蛋白构建体的工程化人工心脏瓣膜。具体来说，图6A示出具有三个瓣膜窦的闭合瓣膜的俯视图，图6B示出闭合瓣膜的透视截面图，而图6C示出外部视图。

人工心脏瓣膜设计中的一个考虑因素是瓣膜窦的结构。瓣膜窦12是围绕天然瓣膜小叶的脉管壁的扩张。通常，在主动脉瓣中，每个天然瓣膜小叶具有单独的窦状隆起12或腔，其允许在峰值流量下小叶的最大打开而不允许小叶与脉管壁之间的接触。如图6A、图6B和图6C所说明，窦12的范围通常由接合部11、人工心脏瓣膜13的壁、流入端14和流出端15限定。窦腔之间的近端相交限定接合部11。

图6B和6C还示出在流入端14和流出端15处窦的变窄直径，因此形成窦区域的流入和流出环状体。因此，瓣膜窦形成天然的区室，以通过防止小叶与脉管壁之间的接触来支持瓣膜运行，这继而可引起小叶的粘附和/或引起小叶的有害磨损和撕裂。瓣膜窦还被设计成当闭合的小叶上的流体压力最大时分担在闭合期间施加在瓣膜小叶上的应力条件。瓣膜窦通过电流进一步产生有利的流体动力学，该电流软化在高回流压力条件下原本突然的小叶闭合。最后，窦确保恒定流量流向位于窦腔内的任何脉管。

图7说明包含如本文所述的胶原蛋白构建体的瓣周包裹物300。包裹物300包括壁310，其限定穿过壁的长度的内腔135。包裹物300可以放置在发生或可发生泄漏的患者脉管周围。举例来说，包裹物300可以围绕其中人工瓣膜的脉管放置，如关于图6A-C描绘和描述的瓣膜。

除非内容另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书所用的单数形式“一个”和“所述”涵盖具有复数指示物的实施方案。

除非内容另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用，术语“或”通常在其意义上用来包括“和/或”。术语“和/或”意味着所列要素中的一个或全部或者所列要素中的任何两个或两个以上的组合。单词之间使用斜杠“/”意指“和/或”。

如本文中所使用，“具有(have/having)”、“包含(include/including)”、“包括(comprise/comprising)”等等以其开放意义使用，且通常意指“包含但不限于”。应理解，“基本上由…组成”、“由…组成”等归入“包括”等中。如本文所用，“基本上由...组成”(在涉及制品时)意指制品的部件限于列举的部件和不实质性影响制品的一个或多个基本和新颖特性的任何其它部件。

词语“优选”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的实施方案。然而，其它实施方案在相同或其它情形下也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的叙述并不暗示其它实施方案不适用，并且不旨在从本公开(包括权利要求)的范围内排除其它实施方案。

在以下实例中说明制造承载胶原蛋白材料的方法和所得的胶原蛋白材料。提供这些实例是为了说明性而非限制性目的。

实例

胶原蛋白材料是由酸溶性10.4mg/ml胶原蛋白溶液制备的。将溶液中和，然后在37℃下在10X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用NaOH(0.1M)在1小时下聚合，然后在37℃下用PEG渗析过夜且在0.2％戊二醛中交联1小时。切出尺寸为40mm x 10mm的矩形试样，并通过以10mm/min的速度拉伸并在峰值负载百分比降低40％时结束来测试试样的模量。组织的机械性质源自市售的人工心脏瓣膜(美敦力公司(Medtronic，Inc.)的Evolut^TM经导管主动脉瓣置换系统)，且在基部到顶点的方向又被称为“EvolutR BA”，且在圆周方向又被称为“EvolutRC”。所得的应力-应变曲线在图8中示出，并且拉伸模量、弹性模量、最大或极限张应力，和最大应力下的应变的曲线图在图9A-D中示出。示出胶原蛋白材料、预洗的胶原蛋白和新鲜胶原蛋白的结果，以及EvolutR BA和EvolutR C更换瓣膜的结果。“胶原蛋白材料”是通过上述相同方法制备的胶原蛋白。“预洗涤胶原蛋白”通过与胶原蛋白材料相同的方式制备；然而，片材先在1X PBS中浸泡30分钟，然后再在0.2％戊二醛中交联。最后，新鲜胶原蛋白是胶原蛋白材料，但没有交联。通常，胶原蛋白材料的模量大于市售替换瓣膜的组织的模量。

差示扫描量热法(DSC)用于确定胶原蛋白材料的收缩(变性)温度，该温度为83.73℃。高于80℃的收缩温度可与商业瓣膜中使用的固定牛组织和固定猪组织相当，且表示该材料与0.2％戊二醛的有效交联。使用容量法确定胶原蛋白材料的胶原蛋白浓度，其为约150mg/ml。

还测试所得组织的抵抗酶促(链霉蛋白酶)降解的能力。抗性被定义为消化前的重量除以消化后的重量。对胶原蛋白材料、牛胶原蛋白组织和猪胶原蛋白组织进行链霉蛋白酶降解。对链霉蛋白酶降解的抗性在图10中示出，其示出根据本文呈现的教示制备的胶原蛋白材料与猪和牛胶原蛋白组织的抗链霉蛋白酶降解能力至少相同，如果不是更强的话。

还制备较高浓度的胶原蛋白材料(约250mg/ml和约700mg/ml)。该材料具有更高的弹性模量和最大应力值(数据未示出)。

经由显微镜目测评价所得的胶原蛋白材料。图11A-D示出在放大6000倍下的150mg/ml胶原蛋白材料(在冲洗之前和之后)，在放大6000倍下的250mg/ml胶原蛋白材料(在冲洗之后)和在放大3000倍下的Evolut^TM Pro组织。可以看出，250mg/ml胶原蛋白材料比150mg/ml的胶原蛋白材料更致密，并且它们都包含支链原纤维的网络。

基本上如上所述制备胶原蛋白材料，但是中和后在4℃下温育四小时，然后在37℃下温育1小时。图12A-B示出所得胶原蛋白材料的放大6000倍的未冲洗(左)和冲洗(右)图像。如右图所示，更大直径的纤维明显表示此方法产生胶原蛋白纤维的能力。

在具有和不具有300L/小时双向流动的渗析盒子中形成胶原蛋白材料。在双向流动的情况下，使用两个潜水式泵在片材的每个表面上产生流动，其中流动方向彼此垂直。所得胶原蛋白材料的图像示出在图13A-B中。如右图(双向流动)与左图(无流动)所示，通过流动可以实现增强的纤维取向和增加的纤维厚度。单轴向测试的结果示于下表1中。如图13A-B和表1所指示，可以通过调节形成胶原蛋白材料的工艺来修改胶原蛋白材料的性质。

表1：在聚集期间经受流动的胶原蛋白材料的机械性质

胶原蛋白材料在其结构上可包括不同程度的纤连蛋白或层粘连蛋白或骨膜素或任何其它天然心脏瓣膜蛋白或其组合。举例来说，在中和阶段期间将40ug/ml纤连蛋白添加到胶原蛋白材料溶液。通过选择针对膜的10K MWCO和针对PEG的8K MW，在渗析期间，相同材料经历过度聚集。所得片材示出增强的机械性质，如下表2所示。所添加纤连蛋白的量可以处于1ug/ml或更大的浓度，如10ug/ml或更大，40ug/ml或更大，或100ug/ml或更大。

表2：在纤连蛋白和过度聚集情况下的胶原蛋白材料的机械性质

n	弹性模量(MPa)	最大应力或UTS(MPa)	最大应力下的应变	厚度(mm)
					3	78.02	7.65	0.14	0.191

形成胶原蛋白材料，并使其在各种浓度的各种不同交联剂下进行交联，持续各种时间量。测试的交联剂包括戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)和京尼平。各种试剂和条件影响所得的胶原蛋白材料的所得机械性质和收缩温度(数据未示出)。

在前面的详细描述中，已经参考特定实施方案描述本发明。然而，可以理解，在不背离所附权利要求书所阐述的本发明的范围的情况下，可以做出各种修改和改变。此外，例如，根据所附权利要求，以上结合具体实施方案描述的元件的各种组合在本发明的范围内。

Claims

1.一种方法，包括：

形成胶原蛋白原纤维；和

聚集或过度聚集所述胶原蛋白原纤维以形成具有100mg/ml或更大的胶原蛋白密度的胶原蛋白构建体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原蛋白构建体具有250mg/ml或更大的胶原蛋白密度。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原蛋白构建体具有700mg/ml至1000mg/ml的胶原蛋白密度。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述胶原蛋白原纤维经由渗析被浓缩、聚集或过度聚集。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述胶原蛋白原纤维通过使用截留分子量在约1000至约20,000范围内的膜进行渗析而被浓缩。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述胶原蛋白原纤维通过用包含聚乙二醇(PEG)的溶液进行渗析而被聚集或过度聚集。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述PEG具有约2000至约30,000的数均分子量(Mn)。

8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括提供包含胶原蛋白单体的酸性溶液，和将所述酸性溶液中和至约5至约10的pH以形成所述胶原蛋白原纤维。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述溶液中的胶原蛋白单体的浓度为约50mg/ml或更小。

10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括将保持在约4℃的经过经过中和的溶液加热至约37℃的温度，持续约15分钟至约4小时。

11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在约4℃下将经过中和的溶液预温育约4小时至48小时。

12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述胶原蛋白原纤维的所述聚集期间向所述胶原蛋白原纤维施加负载。

13.根据权利要求1所述的方法，其中使所述胶原蛋白原纤维聚集包括将所述原纤维与额外组分一起聚集以形成杂化结构，其中所述额外组分选自由织物、聚合物、生物材料和金属组成的组。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述额外组分包括弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或骨膜素。

15.一种包括胶原蛋白构建体的工程化组织，所述胶原蛋白构建体具有多个缠结的单一胶原蛋白原纤维、支链胶原蛋白原纤维的网络、胶原蛋白超原纤维或胶原蛋白纤维，其中所述胶原蛋白构建体具有100mg/ml或更大的密度。

16.根据权利要求15所述的工程化组织，其中所述胶原蛋白构建体具有250mg/ml或更大的密度。

17.根据权利要求15所述的工程化组织，其中所述胶原蛋白构建体包括交联的原纤维、超原纤维或纤维。

18.根据权利要求15所述的工程化组织，其中所述胶原蛋白构建体不含细胞。

19.一种包括人工瓣膜小叶的人工心脏瓣膜，其中所述人工瓣膜小叶包括根据权利要求15所述的工程化组织。

20.一种瓣周包裹物，其包括根据权利要求15所述的工程化组织。