CN112292130A - β-葡聚糖和CD40激动剂组合免疫疗法 - Google Patents

β-葡聚糖和CD40激动剂组合免疫疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于癌症免疫疗法的β‑葡聚糖和CD40激动剂组合。该组合疗法显示出T细胞依赖性的协同抗肿瘤活性。令人惊讶地，该组合疗法针对弱免疫原性肿瘤有效。

Description

β-葡聚糖和CD40激动剂组合免疫疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月13日提交的美国临时专利申请序列号62/642,210的优先权，其通过引用并入本文。
发明内容
在一方面，本公开内容提供了可溶性β-葡聚糖和CD40激动剂的组合物及其用于癌症免疫疗法的用途。CD40激动剂可以为激动性CD40抗体，并且可溶性β-葡聚糖可以源自酵母。
本发明的上述内容不旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每个实施方式。下面的描述更具体地举例了说明性实施方案。在整个申请中的多个地方，通过实例列表提供了指导，这些实例可以各种组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅用作代表组，而不应解释为排他性列表。
附图说明
图1A至图1E.包含可溶性β-葡聚糖和FGK45的治疗组合的肿瘤生长曲线。
图2A至图2E.包含可溶性β-葡聚糖和吉西他滨化学疗法的治疗组合的肿瘤生长曲线。
图3A至图3B.比较治疗组之间肿瘤生长的图。
图4.比较治疗组之间总生存率的图。
图5A.比较治疗组之间应答的图。
图5B.比较治疗组之间总生存率的图。
图5C至图5E.比较治疗组之间药效学变化的图表。
发明详述
设计用于利用免疫系统治疗癌症的药物已显示出有前途的结果，但是当单独使用时，许多患者对这些药物无应答或应答是短暂的。因此，某些免疫治疗药物可以组合以桥接免疫系统的先天性和适应性臂并且驱动增强的癌症疗法。具体地，本发明涉及β-葡聚糖和CD40激动剂的组合物及其在癌症免疫疗法中的用途。
β-葡聚糖是源自多种微生物和植物来源的葡萄糖的聚合物，包括例如酵母、细菌、藻类、海藻、蘑菇、燕麦和大麦。其中，已广泛评估酵母β-葡聚糖的免疫调节特性。酵母β-葡聚糖可以以多种形式存在，例如完整的酵母、酵母聚糖、纯化的全葡聚糖颗粒、经溶解的酵母聚糖多糖或不同分子量的高度纯化的可溶性β-葡聚糖。在结构上，酵母β-葡聚糖由葡萄糖单体组成，该葡萄糖单体组织为β-(1,3)-连接的吡喃葡萄糖骨架以及通过β-(1,6)糖苷键与主链连接的其周期性β-(1,3)吡喃葡萄糖支链。不同形式的酵母β-葡聚糖的功能可能彼此不同。酵母β-葡聚糖发挥其免疫调节作用的机制可能受不同形式的β-葡聚糖之间结构差异的影响，例如其颗粒或可溶性性质、叔构象、主链长度、侧链长度和侧链频率。酵母β-葡聚糖的免疫刺激功能还取决于参与不同物种的不同细胞类型的受体，这又可能取决于β-葡聚糖的结构特性。
通常，β-葡聚糖免疫疗法可以包括向受试者施用任何合适形式的β-葡聚糖或者两种或更多种形式的β-葡聚糖的任何组合。合适的β-葡聚糖和从其天然来源的合适β-葡聚糖的制备在例如美国专利号9,610,303中描述。在一些情况下，β-葡聚糖可以源自酵母，例如酿酒酵母。在某些情况下，β-葡聚糖可以是或源自β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖，在本文中也称为PGG(IMPRIME PGG，Biothera，Eagan，MN)，一种高度纯化且特征明确形式的可溶性酵母来源的β-葡聚糖。β-葡聚糖是一种PAMP(病原相关的分子模式)，能够触发先天免疫细胞功能，从而导致一系列的免疫激活和增强的抗肿瘤杀伤。已知酵母可溶性β-葡聚糖在存在靶向肿瘤的抗体的情况下增强先天免疫效应细胞对肿瘤细胞的直接杀伤。然而，酵母可溶性β-葡聚糖还通过两种机制增强基于T细胞的癌症疗法。具体地，酵母可溶性β-葡聚糖触发髓样功能的重新极化，以抵消由肿瘤建立的免疫抑制性微环境。另外，酵母可溶性β-葡聚糖激活抗原呈递细胞(即巨噬细胞和树突状细胞)的成熟，使得T细胞能够扩增和激活以及表达IFN-γ。与全身施用经常导致毒性副作用的其他PAMP不同，Imprime PGG已通过静脉灌注安全地施用给多于400个人受试者。此外，基于β-葡聚糖的免疫疗法可以涉及例如使用经修饰的和/或衍生的β-葡聚糖，例如国际专利申请号PCT/US12/36795中描述的那些。在另一些情况下，β-葡聚糖免疫疗法可以涉及施用例如可溶于颗粒的β-葡聚糖或可溶于颗粒的β-葡聚糖制剂，每个在例如美国专利号7,981,447中描述。
生物标志物研究表明受试者之间在中性粒细胞和单核细胞结合酵母可溶性β-葡聚糖的能力上的差异。酵母可溶性β-葡聚糖与这些细胞的结合与受试者对酵母可溶性β-葡聚糖的免疫调节应答有关。此外，与中性粒细胞和单核细胞结合的酵母可溶性β-葡聚糖涉及特定水平的天然抗β-葡聚糖抗体的存在。在国际公开申请号WO2013165591A1和WO2015084732A1中描述了用于定量测量患者血清样品中的抗β-葡聚糖IgG和IgM抗体(ABA)的生物标志物测定方法。生物标志物测定的临界水平将受试者分为生物标志物阳性和生物标志物阴性亚组，这些临界点与结合、功能和临床结果相关。
如果由于受试者的ABA水平低于选定的预定临界水平而将受试者鉴定为生物标志物阴性，则可以施用能够将受试者从生物标志物阴性状态转变为生物标志物阳性状态的抗体配制品，以改善受试者对免疫疗法的应答。因此，在一些情况下，β-葡聚糖和CD40激动剂组合免疫疗法也可以包括施用抗体配制品以改善受试者对免疫疗法的应答。用于改善受试者对免疫疗法应答的组合物和方法在国际公开申请号WO2013165593A1中描述。
在一些情况下，抗体配制品可以包括来自生物标志物阳性受试者的血清。在一些情况下，抗体配制品可以包括特异性结合β-葡聚糖的单克隆抗体或抗体片段。在一些情况下，抗体配制品可以包括静脉内免疫球蛋白。
CD40分子是TNF受体超家族的成员，并且由多种细胞类型表达，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、血小板、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和某些恶性上皮细胞。CD40的配体CD40配体(CD 154)在多种细胞上表达，包括激活的CD4 T细胞、激活的B细胞、记忆CD8 T细胞、激活的自然杀伤细胞、粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和激活的血小板。CD40途径的激活是“许可”抗原呈递细胞的关键步骤，该细胞具有有效呈递抗原和刺激抗原特异性T细胞的能力。CD40在树突状细胞(DC)上的连接增强了共刺激(例如CD80和CD86)和主要组织相容性(MHC)分子的表达，诱导了免疫刺激性细胞因子的释放和激活的抗原呈递机制。随后在多项研究中证明了CD40在肿瘤免疫中的重要性，其中针对CD40的激动性抗体的施用在癌症的鼠模型中产生了保护性T细胞免疫。这是开发目前临床研究中的临床级CD40激动剂的基础。
可用于本发明的CD40激动剂可以为重组人CD40配体，例如Avrend(Immunex Corp，西雅图，华盛顿)；CD40配体基因疗法，例如携带由Rous肉瘤病毒启动子(AdCD40L)驱动的人CD40L基因的腺病毒血清型5(在德克萨斯州休斯敦贝勒医学院的细胞和基因治疗中心的载体生产设备)；或者激动剂CD40抗体。激动性CD40抗体可以为各种同种型的多克隆抗体、抗体片段或单克隆抗体，例如完全人IgG2、人源兔IgG1、完全人IgG1、嵌合IgG1和非岩藻糖基化的人源IgG1同种型。
在一些情况下，具有IgG1 Fc结构域的激动性CD40抗体可能是有益的，因为IgG1Fc结构域增强了与Feγ受体II-B(FcγRIIB)的结合，这潜在地通过交联增加了CD40激动剂的效力。可替代地，激动性CD40抗体可以化学交联以获得增强的Fc非依赖性活性。在另一些情况下，具有IgG2 Fc结构域的激动性CD40抗体可能通过IgG2同种型的独特铰链特性介导FcγR非依赖性激动活性。可替代地，在一些情况下，激动性CD40抗体刺激CD40既不需要抗体的Fc结构域，也不需要Fc受体交联。该发现的确切机制不清楚，但是可以通过某些Fab区与人CD40上产生有效信号转导活性的特定表位结合来解释。
FcγRIIB是唯一的抑制性Fc受体，并且编码该蛋白的基因变异或多态性长期以来与自身免疫性疾病的易感性相关。这些多态性可能具有与经IgG1修饰的CD40激动剂的功效有关的治疗意义，使得各种FcγRIIBIB多态性与特定CD40抗体的施用相关。例如，具有FcγRIIB多态性与经IgG1修饰的CD40激动剂的功效降低相关的受试者仅被施用IgG2CD40激动剂或缺乏Fc结构域的激动性CD40抗体。
另外，在鼠模型中，IgG1 CD40激动剂的增强效力与瞬时血小板减少症的风险增加有关。与IgG2同种型相比，降低IgG1 CD40激动剂的剂量减少了血小板的水平，同时仍然保持改善的激动剂活性。因此，在一些情况下，对于β-葡聚糖和激动性CD40抗体组合免疫疗法，IgG1 CD40激动剂的剂量降低或给药频率减少可能是优选的。
已经开发出可用于本发明的用于临床用途的数种激动性CD40单克隆抗体。每种抗体具有由以下定义的独特特性：(i)对CD40的结合亲和力、(ii)同种型、(iii)对交联活性的依赖性以及(iv)阻断CD40配体结合的能力。这些包括：
(1)CP-870,893(Pfizer和VLST)是一种抗CD40 IgG2抗体，具有弱的FcR结合，不阻断CD40配体与CD40的相互作用；可以在不存在交联的情况下介导CD40刺激；并且具有3.48x 10-10M的结合亲和力(Kd)。
(2)APX005(Apexigen)是一种识别CD40的IgG1抗体，阻断CD40配体结合；通过交联显示出增强的体外活性；并且Kd为9.6 x 10-10M。
(3)ADC-1013(Alligator Bioscience)是一种识别CD40的IgG1抗体，甚至在酸性条件(pH 5.4)下具有高结合亲和力(Kd 1 x 10-11M)，活性取决于FcR结合和交联。
(4)达西珠单抗(Dacetuzumab)(也称为SGN-40，前称SGN-14)(西雅图遗传学)是一种识别CD40的人源IgG1抗体，Kd为1 x 10-9M。达西珠单抗是一种局部激动剂，在刺激B细胞增殖上显示出弱的活性；对B细胞淋巴瘤细胞系显示有效的抗增殖和促凋亡特性，并且增强CD40配体与CD40的结合。
(5)SEA-CD40(西雅图遗传学)是一种源自达西珠单抗(SGN-40)的非岩藻糖基化的人源IgG1抗CD40抗体，Kd为1×10-9M。SEA-CD40由于与FcgRIIIa的结合增强而显示出改善的激动剂活性。
(6)ChiLob 7/4(南安普敦大学)是嵌合IgG1抗体，Kd为2 x 10-10M，需要交联以刺激抗原呈递细胞中的CD40。
在许多患者中看到的对免疫疗法的不良应答可能是由于缺乏对免疫疗法取得成功所必需的针对癌症的正在进行的免疫应答。这样，本发明包括新的方法，例如使用免疫激动剂，能够调用有效的抗肿瘤免疫力以扩大和增强癌症免疫疗法的治疗作用。
CD40激动剂的功效已报道取决于肿瘤抗原的存在，肿瘤抗原是CD40激活的抗原呈递细胞来诱导抗原特异性T细胞免疫所必需的。然后，后续研究集中于将CD40激动剂与疫苗和化学疗法组合，以引发肿瘤细胞死亡的免疫原性形式。然而，即使与化学疗法组合，也未观察到T细胞依赖性抗肿瘤活性的证据，并且进一步的研究确定了肿瘤微环境中的免疫抑制巨噬细胞。除了其他免疫抑制机制外，这些巨噬细胞还可能解释了缺乏T细胞依赖性抗肿瘤活性的原因。
可溶性β-葡聚糖与髓样来源的细胞(即中性粒细胞和单核细胞)上的CD11b结合，并且增加了N1中性粒细胞和M1巨噬细胞的免疫刺激功能，并且降低了髓样来源的抑制细胞(N2中性粒细胞和M2巨噬细胞)的免疫抑制功能。该调节导致肿瘤微环境中各种先天性细胞和适应性细胞之间的串扰，这使条件转向免疫刺激。可溶性β-葡聚糖直接影响M2重新极化至M1表型并驱动Th1极化，并且可溶性β-葡聚糖引发的先天免疫细胞甚至在存在T调节细胞的情况下，产生细胞因子以间接影响CD4和CD8 T细胞增殖，并最终驱动Th1极化。
为此，可以将可溶性β-葡聚糖与CD40激动剂组合。例如，可溶性β-葡聚糖可以与激动性CD40抗体组合用于治疗癌症，包括例如黑色素瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、间皮瘤、晚期实体肿瘤等。可溶性β-葡聚糖触发髓样功能的重新极化以抵消由肿瘤建立的免疫抑制微环境并激活抗原呈递细胞的成熟，从而导致T细胞扩增和激活以及IFN-γ表达。这些条件对于CD40激动剂诱导T细胞依赖性抗肿瘤免疫力是理想的。CD40激动剂和可溶性β-葡聚糖的组合产生协同作用，即使对弱免疫原性的肿瘤也能大大提高治疗结果。
在某种程度上，本发明包括将β-葡聚糖与CD40激动剂共施用。如本文所用，“共施用”是指施用两种或更多种组分的组合，使得组合的治疗或预防作用可以大于单独施用任一组分的治疗或预防作用。两种组分可以同时或依次共施用。同时共施用的组分可以以一种或更多种药物组合物提供。两种或更多种组分的依次共施用不依赖时间，并且包括如下情况：施用这些组分使得在两种组分同时给药后，两种组分可同时生物利用。无论组分是否同时或依次共施用，可以在单个位点或在不同位点共施用这些组分。
可以将β-葡聚糖、CD40激动剂和/或两种组分的组合与“载体”一起配制在组合物中。如本文所用，“载体”包括任何溶剂、分散介质、介质、包衣、稀释剂、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这样的介质和/或试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。考虑其在治疗组合物中的用途，只要任何常规介质或试剂与β-葡聚糖或CD40激动剂不相容。也可以将补充活性成分并入组合物中。
“药学上可接受的”意指不是生物学或其他方面不期望的材料，即，该材料可以与β-葡聚糖和/或药剂一起施用于个体，而不起任何不期望的生物学作用或与含有其的药物组合物的任何其他组分以有害方式相互作用。
可以将β-葡聚糖、CD40激动剂和/或两种组分的组合配制成药物组合物。在一些实施方案中，β-葡聚糖和CD40激动剂可以以单一制剂提供。在另一些实施方案中，β-葡聚糖和CD40激动剂可以以分开的制剂提供。可以将药物组合物配制成适于一种或更多种优选施用途径的各种和/或多种形式。因此，药物组合物可以通过一种或更多种已知途径施用，包括例如经口、肠胃外(例如皮内、经皮、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、肿瘤内等)或局部(例如鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、皮内、经皮、经直肠等)。可以将药物组合物或其一部分施用至粘膜表面，例如通过施用至例如鼻或呼吸道粘膜(例如，通过喷雾剂或气雾剂)。药物组合物或其一部分也可以通过持续释放或延迟释放来施用。
制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域众所周知的方法制备。用药学上可接受的载体制备组合物的方法包括使β-葡聚糖和/或Cd40激动剂与构成一种或更多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，可以通过使活性化合物与液体载体、细分的固体载体或两者均匀地和/或紧密地结合在一起，然后如果需要的话，将产品成型成期望的制剂来制备制剂。
β-葡聚糖、CD40激动剂和/或两种组分的组合可以以任何合适的形式提供，包括但不限于溶液、混悬液、乳液、喷雾剂、气雾剂或任何形式的混合物。组合物可以在具有任何药学上可接受的赋形剂、载体或介质的制剂中递送。例如，可以以常规的局部剂型递送制剂，例如乳剂、软膏剂、气雾制剂、非气雾剂、凝胶剂、洗剂等。制剂还可以包含一种或更多种添加剂，包括例如佐剂、皮肤渗透促进剂、着色剂、香料、调味剂、保湿剂、增稠剂等。
在一些实施方案中，本发明可以包括施用足够的β-葡聚糖以向受试者提供例如约100ng/kg至约50mg/kg的剂量，尽管在一些实施方案中，β-葡聚糖可以以超出该范围的剂量施用。剂量可以取决于受试者的ABA水平。在一些实施方案中，β-葡聚糖的剂量范围为约0.5mg/kg至约6mg/kg，包括0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg和6.0mg/kg。β-葡聚糖可以仅施用一次，或者施用之间的时间间隔可以例如为在治疗过程中每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周或每7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84天。施用时间表除了其他事情外，根据待治疗的癌症和受试者的ABA水平而不同。可溶性β-葡聚糖给药在国际专利申请号PCT/US18/19412中描述。
可替代地，可以使用在治疗过程开始之前刚刚获得的实际体重来计算剂量。对于以此方式计算的剂量，在治疗过程开始之前，使用Dubois方法计算体表面积(m2)：m2＝(wtkg0.425 x身高cm0.725)x 0.007184。因此，在一些实施方案中，该方法可以包括施用足够的β-葡聚糖以提供例如约0.01mg/m2至约10mg/m2的剂量。
本发明包括施用足够的CD40激动剂。CD40激动剂的剂量可以为0.01mg/kg至20mg/kg，包括0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10.0mg/kg、10.5mg/kg、11.0mg/kg、11.5mg/kg、12.0mg/kg、12.5mg/kg、13.0mg/kg、13.5mg/kg、14.0mg/kg、14.5mg/kg、15.0mg/kg、15.5mg/kg、16.0mg/kg、16.5mg/kg、17.0mg/kg、17.5mg/kg、18.0mg/kg、18.5mg/kg、19.0mg/kg、19.5mg/kg和20.0mg/kg。CD40激动剂可以仅施用一次，或者施用之间的时间间隔可以例如为在治疗过程中每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周或每7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84天。
可替代地，可以使用在治疗过程开始之前刚刚获得的实际体重来计算β-葡聚糖或CD40激动剂剂量。对于以此方式计算的剂量，在治疗过程开始之前，使用Dubois方法计算体表面积(m2)：m2＝(wt kg0.425 x身高cm0.725)x0.007184。因此，在一些实施方案中，该方法可以包括施用足够的β-葡聚糖和/或CD40激动剂以提供例如约0.01mg/m2至约10mg/m2的剂量。
通过以下实施例说明本发明。应理解的是，具体的实施例、材料、量和程序按照本文所述的本发明的范围和精神来广义地解释。
实施例1
可溶性β-葡聚糖与CD40激动剂组合增强肿瘤消退：评价了可溶性β-葡聚糖在诱导针对胰管腺癌(PDAC)的有效抗肿瘤免疫中的作用，一种以T细胞排斥和强烈的炎症免疫反应为特征的弱免疫原性癌症。在该研究中，将C57BL/6小鼠皮下植入源自KPC的PDAC细胞系(7940B，P9)。用卡尺每周2至3次监测小鼠的肿瘤生长。在第-2天，小鼠接受吉西他滨(120mg/kg)或PBS。在第0天，用或不用FGK45(0.1mg)、IMPRIME PGG(1.2mg)或两者治疗小鼠。FGK45是针对CD40的大鼠抗小鼠单克隆激动剂，通过腹膜内注射施用。IMPRIME PGG通过静脉内注射施用。
跟踪小鼠的肿瘤生长和总体存活率(即直到肿瘤达到＞1000mm3或动物表现出与肿瘤相关的不适/痛苦)。在图1A和图1B中示出了仅IMPRIME PGG治疗相对于对照对肿瘤生长的影响。在此，单一剂量IMPRIME PGG的治疗在10只小鼠中的1只中产生了肿瘤生长延迟。在先前的实验中，IMPRIME PGG在9只小鼠中的3只中产生了肿瘤生长延迟(数据未显示)。这些实验表明，在该肿瘤模型中IMPRIME PGG作为单一疗法具有有限活性。只用FGK45治疗观察到相似的结果，如图1C所示，其中10只小鼠中的4只观察到肿瘤生长延迟。先前的实验显示9只小鼠中的5只的肿瘤生长延迟(数据未显示)。
相反，将IMPRIME PGG和FGK45组合在10只小鼠中的9只产生肿瘤消退(图1D)。10只小鼠中的6只观察到肿瘤完全消退，没有随后复发。
实施例2
可溶性β-葡聚糖与激动性CD40抗体组合针对弱免疫原性的肿瘤唤起T细胞依赖性抗肿瘤活性：在第-3、0、4、7和11天，用或不使用消耗GK1.5(抗CD4)和2.43(抗CD8)的抗体(0.2mg/剂量)治疗实施例1的小鼠。2.43和GK1.5是大鼠抗小鼠单克隆抗体，分别消耗表达CD8a和CD4的T细胞。两种抗体均通过腹膜内注射施用。
如图1E所示，当CD4和CD8 T细胞耗尽时，使用IMPRIME PGG和FGK45的组合消除了协同治疗活性。因此，该数据表明，在小鼠胰管腺癌的弱免疫原性模型中IMPRIME PGG和FGK45组合产生显著的T细胞依赖性抗肿瘤活性。
实施例3
可溶性β-葡聚糖与化学疗法组合增强肿瘤消退：将C57BL/6小鼠皮下植入源自KPC的PDAC细胞系(7940B，P9)。用卡尺每周2至3次监测小鼠的肿瘤生长。在第-2天，小鼠接受吉西他滨(120mg/kg)或PBS。
同样，仅IMPRIME PGG表现出最小的活性(图2A、图2B)。相似地，如图2C所示，吉西他滨化学疗法对肿瘤生长未产生显著影响。相反，在IMPRIME PGG之前48小时用吉西他滨化学疗法治疗产生了显著的抗肿瘤活性，在10只小鼠中的5只观察到肿瘤生长延迟(图2D)。在先前的实验中，该治疗组合在9只小鼠中的6只产生了抗肿瘤活性。
实施例4
可溶性β-葡聚糖与激动性CD40抗体组合针对弱免疫原性的肿瘤唤起T细胞依赖性抗肿瘤活性：在第-3、0、4、7和11天，用或不使用消耗GK1.5(抗CD4)和2.43(抗CD8)的抗体(0.2mg/剂量)治疗实施例3的小鼠。在治疗之前，当T细胞耗尽时使用IMPRIME PGG和吉西他滨的组合的协同治疗作用取决于CD4和CD8 T细胞(图2E)。因此，化学疗法与IMPRIME PGG组合可以在鼠胰管腺癌弱免疫原性模型中产生显著的T细胞依赖性抗肿瘤活性。
图3A和图3B分别示出了每个吉西他滨和FGK45治疗组的平均肿瘤生长曲线。使用双向Anova和Tukey的多重比较测试确定了第26天的肿瘤生长比较的统计学显著性。治疗组之间的统计数据示于表1中。
表1
比较的治疗 P值
对照vs IMPRIME 0.9944
对照vs FGK45 ＜0.0001
对照Vs吉西他滨 0.9750
对照vs FGK45+IMPRIME ＜0.0001
对照vs吉西他滨+IMPRIME ＜0.0001
IMPRIME vs FGK45 ＜0.0001
IMPRIME vs吉西他滨 >0.9999
IMPRIME vs FGK45+IMPRIME ＜0.0001
IMPRIME vs吉西他滨+IMPRIME ＜0.0001
FGK45 vs吉西他滨 0.0001
FGK45 vs FGK45+IMPRIME 0.0008
FGK45 vs吉西他滨+IMPRIME 0.7767
吉西他滨vs FGK45+IMPRIME ＜0.0001
吉西他滨vs吉西他滨+IMPRIME ＜0.0001
FGK45+IMPRIME vs吉西他滨+IMPRIME 0.0601
图4示出了每种治疗对总生存率的影响。表2中显示了治疗组之间生存率比较的统计数据示于表2中。使用对数秩检验确定统计学显著性。
表2
Figure BDA0002726169150000111
在以下治疗组之间观察到统计学上的显著差异：(i)对照vs吉西他滨+IMPRIME(p＝0.0002)、(ii)吉西他滨vs吉西他滨+IMPRIME(p＝0.0012)、(iii)IMPRIME vs吉西他滨+IMPRIME(p＝0.0029)、(iv)对照vs FGK45+IMPRIME(p<0.0001)、(v)FGK45 vs FGK45+IMPRIME(p<0.0001)、(vi)IMPRIME vs FGK45+IMPRIME(p<0.0001)和(vii)吉西他滨+IMPRIME vs FGK45+IMPRIME(p＝0.0048)。总之，这些数据显示当吉西他滨或FGK45与IMPRIME PGG组合时具有显著的治疗活性，并且两种治疗组合的治疗活性均取决于T细胞。总体而言，与化学疗法相比，当将IMPRIME PGG与FGK45组合时分别观察到更高的应答率(90％相对于50％)和改善的总生存率(60％相对于0％)。
将可溶性β-葡聚糖与CD40激动剂组合比单独治疗更有效，并且在60％的小鼠中产生了完整且持久的肿瘤消退。另外，可溶性β-葡聚糖加CD40激动剂的抗肿瘤作用取决于CD4和CD8 T细胞。
实施例5
吞噬性髓样细胞是可溶性β-葡聚糖与激动性CD40抗体组合的抗肿瘤应答的持久性所必需的：不同的髓样细胞亚群对由IMPRIME PGG和CD40激动剂诱导的抗肿瘤活性的作用。施用靶向髓样的化合物以消耗肿瘤外巨噬细胞(即氯膦酸盐脂质体)，消耗Ly6C+外周血单核细胞(即抗-Ly6C抗体)，消耗肿瘤相关巨噬细胞/肿瘤外巨噬细胞(即集落刺激因子1受体(CSF1R)抑制剂)，并阻断由抗原呈递细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)表达的CD70(抗-CD70抗体)。
将C57BL/6小鼠(n＝10/组)皮下植入KPC衍生的PDAC细胞系。用卡尺每周2至3次监测小鼠。当肿瘤直径达到约4至5mm时，小鼠接受以下治疗：
组1：对照
组2：FGK45+IMPRIME PGG
组3：FGK45+IMPRIME PGG+氯膦酸盐脂质体(Gastroenterology.2015 Jul；149(1):201-210.)
组4：FGK45+IMPRIME PGG+抗-Ly6C(Cancer Discov.2016 Apr；6(4):400-413.)
组5：FGK45+IMPRIME PGG+CSF1R抑制剂
组6：FGK45+IMPRIME PGG+CD70阻断抗体(Nat Commun.2012 Jul l0；3:948.)
使用以下给药方案来施用化合物：
1.在第0天通过腹膜内(i.p.)注射以0.1mg施用FGK45。
2.在第0天以1.2mg静脉内(i.v.)施用IMPRIME PGG。
3.在第-2、2、5和9天以10mg/kg腹膜内施用氯膦酸盐包封的脂质体。
4.在第-1、0、1、5、9天以0.5mg/剂量腹膜内施用抗-Ly6C抗体(Monts1)。
5.在第-2至2天和第5至9天通过经口管饲法以160mg/kg每天施用CSF1R抑制剂(GW2580)。
6.在第-1、0、1、5天以0.25mg/剂量腹膜内施用抗-CD70抗体(克隆FR70)。
图5A和图5B示出了每组对治疗的应答和生存率数据。数据表明吞噬性髓样细胞是应答持久性所必需的，因为通过氯膦酸盐包封的脂质体消耗巨噬细胞抑制了组合疗法。
另外，在治疗的第-2、0和1天通过尾静脉出血在每只小鼠上收集外周血，并通过流式细胞术分析CD19+B细胞、CD3+T细胞和CD3+CD8p+T细胞的存在。结果示于图5C、图5D和图5E中，并且表明这些细胞类型离开外周血循环。
出于至少三个原因，用CD40激动剂/可溶性β-葡聚糖组合疗法观察到的协同作用是出乎意料且引人注目的。首先，不需要化学疗法。如上所讨论的，据报道CD40激动剂的功效取决于肿瘤抗原的存在，这是CD40激活的抗原呈递细胞诱导抗原特异性T细胞免疫所必需的。实施例2表明组合疗法对未经化学疗法的弱免疫原性肿瘤表现出显著的活性。实施例5表明，吞噬性髓样细胞的需求表明可溶性β-葡聚糖改变了肿瘤浸润性髓样细胞的吞噬能力，并且在此过程中改善了其对肿瘤抗原的捕获。其次，不仅CD40激动剂/可溶性β-葡聚糖组合疗法在没有化学疗法的情况下观察到显著的活性，而且超过了使用化学疗法然后用CD40激动剂所观察到的活性。第三，出乎意料且引人注目的是两种髓样靶向剂，CD40激动剂和可溶性β-葡聚糖的组合产生协同活性。实施例1表明，用任一试剂的疗法显示出有限的活性，但是CD40激动剂/可溶性β-葡聚糖组合疗法显示出超过加和的显著活性。
本文中引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可用材料的全部公开内容(包括例如，例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissSwt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及GenBank和RefSeq中带注释的编码区的翻译)通过引用整体并入本文。在本申请的公开内容与通过引用并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何不一致的情况下，以本申请的公开内容为准。仅出于清楚理解的目的给出了前述的详细描述和实施例。由此应理解没有不必要的限制。本发明不限于所示出和所述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变体将包括在由权利要求书限定的本发明之内。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示组分定量、分子量等的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非另有相反说明，否则说明书和权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的期望特性而变化。至少，并非试图将等同原则限制在权利要求书的范围之内，每个数字参数至少应根据所报道的重要数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值被尽可能精确地报道。然而，所有数值固有地都包含一个范围，该范围必然是由它们各自的测试测量结果中的标准偏差得出的。
所有标题都是为了方便读者，并且除非有说明，否则不应将其用于限制标题后面的内容的含义。

Claims (20)

1.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用可溶性β-葡聚糖和CD40激动剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症为弱免疫原性的癌症。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症为黑色素瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、间皮瘤或晚期实体肿瘤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖和所述CD40激动剂在单一制剂中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖和所述CD40激动剂在分开的制剂中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖源自酵母。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酵母为酿酒酵母。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖为β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD40激动剂为激动性CD40抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述激动性CD40抗体为非补体激活抗体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述激动性CD40抗体为IgG1或IgG2抗体。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述激动性CD40抗体为CP-870,893、APX005、ADC-1013、达西珠单抗(Dacetuzumab)、SEA-CD40或ChiLob 7/4。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括施用抗-β-葡聚糖抗体组分。
14.一种用于刺激受试者对癌细胞的免疫系统的方法，所述方法包括施用可溶性β-葡聚糖和激动性CD40抗体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述可溶性β-葡聚糖和激动性CD40抗体的施用产生协同作用。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述癌症细胞是弱免疫原性的。
17.一种用于癌症免疫疗法的组合物，其包含：
可溶性β-葡聚糖；和
激动性CD40抗体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述可溶性β-葡聚糖为β(1,6)-[聚-(1,3)-D-吡喃葡萄糖基]-聚-β(1,3)-D-吡喃葡萄糖。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述激动性CD40抗体为IgG1或IgG2抗体。
20.根据权利要求17所述的组合物，其中所述可溶性β-葡聚糖和激动性CD40抗体对弱免疫原性的癌症具有协同作用。
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