CN112280801A - 一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物学领域,更具体地,涉及一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒。其通过对携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞瞬时转染包含编码AAV病毒Cap、Rep蛋白的基因质粒以及腺病毒辅助质粒的外源质粒,以该待测rAAV作为种子病毒,在转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度,不需引入辅助病毒,通过质粒辅助即可高效简单实现rAAV感染滴度的检测,由此解决现有技术rAAV感染滴度检测方法需要引入辅助病毒存在安全风险,且需要配合包装特定细胞系操作复杂等技术问题。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域,具体地,涉及一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒。
背景技术
腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科,是一类小颗粒、复制缺陷、无包膜的单链DNA(ssDNA)病毒,通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的协助,才能进行复制。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点。近年来,用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点,并已有Glybera和Luxturna两款药物获批上市,但rAAV作为基因治疗载体也存在明显缺点,首先其装载外源基因的容量较小,装载上限约为4.7kb,随着装载外源基因尺寸的增加,病毒颗粒包装的完整性随之下降;其次天然存在的诸如AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9等多种血清型体内实验虽对不同组织和细胞存在不同的感染偏好性和感染效率,但各种血清型AAV感染体外培养细胞效率整体偏低,研究者们尝试对决定AAV血清型的蛋白衣壳进行改造,获得诸如能够感染多种细胞类型的AAVDJ血清型(Dirk Grimm et al.,2008)等多种血清型,但整体而言,AAV病毒感染体外培养细胞效率仍然较低,从而限制了AAV在细胞水平的各种实验,如分子细胞筛选、感染滴度测定等。
在不加辅助病毒和其他辅助因子的情况下,对于体外培养细胞,AAV病毒感染效率一般较低。目前较常使用的促进AAV体外感染方法是通过腺病毒及单纯疱疹病毒辅助AAV进行感染,这主要是因为AAV病毒的基因组为单链DNA(ssDNA),进入细胞后必须变成双链DNA(dsDNA)才能转录和翻译外源基因,在没有辅助病毒或其他辅助因子的情况下,AAV单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程很慢,而辅助病毒可以明显促进单链DNA复制成双链DNA,从而可以将外源基因的表达水平提高5-10倍。
研究表明也存在多种辅助因子能够促进AAV感染体外培养的细胞。丁酸盐是一种组蛋白去乙酰酶抑制因子,能诱导染色体的超乙酰化,从而导致沉默基因的诱导表水平。AAV体外感染细胞时也常使用10-50mM丁酸钠作为促感染试剂,使外源基因的表达能够提高5-10倍。zLLL(MG132)、LLnL(MG101)、bortezomib(硼替佐米)等蛋白酶体抑制剂(PI)通过抑制蛋白酶体对进入细胞中AAV的降解,也能够一定程度促进AAV的体外细胞感染(Kristi Jet al.,2004;Anne M D et al.,2001;Paul E M et al.,2010;Jonathan D F et al.,2010)。另外,也有研究报道羟基脲(HU)、聚凝胺(Polybrene)、siRNA敲降核仁素以及使用微球体等方法也能在一定程度促进AAV的体外感染,但促进效果有限(Jarrod S J et al.,2009;Cathryn M et al.,2001)。
rAAV载体的滴度测定通常分为物理滴度和感染滴度。物理滴度通常采用定量PCR测定rAAV的病毒基因组拷贝数(vector genome,vg),或是用不同血清型的ELISA试剂盒测定rAAV衣壳的含量(capsid particle,cp)。目前常用的还是Q-PCR测定法。感染滴度测定方法较为复杂,由于rAAV是缺陷型病毒,本身是不会像腺病毒等病毒那样感染细胞产生细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),因此无法用噬斑法测定rAAV的感染滴度。目前常用rAAV感染滴度的测定方法,包括用rAAV携带荧光基因或者luciferase报告基因,在腺病毒或者疱疹病毒的辅助下进行梯度稀释感染,通过计算报告基因的表达量,确定rAAV转导滴度(有时也称作感染滴度)。但是这种方法受限于待测rAAV必须是携带报告基因,方能进行检测。迄今为止,国际通用的关于AAV感染滴度的测定主要在Hela RC32细胞中进行,HelaRC32细胞系是在Hela细胞中稳转AAV2的cap和rep基因构建而成的细胞系(GillianeChadeuf et al.,2001)。在野生型腺病毒5型(wtAd5)的辅助下,将AAV进行10倍梯度稀释感染Hela RC32细胞,通过观察荧光或RT-PCR的方法计算AAV基因组拷贝数,使用TCID50的方法测定感染滴度(Lock M et al.,2010)。该种方法限定了细胞系,并且野生型Ad5辅助感染,存在安全风险,需要在安全级别更高的实验室中进行,从而限制了其广泛使用。
有研究者将cap和rep稳转到细胞中,做成包装细胞系,如最常见的是将cap和rep稳转进Hela细胞系(Clark et al,1995;Tamayose et al,1996;Gao et al,1998;Inoueand Russell,1998;Chadeuf et al,2000;Cao et al,2002;Mathews et al,2002)。Hela细胞中的human papilloma virus(HPV)基因E6和E7的表达产物对rAAV的扩增有促进作用(Ogston et al,2000;You et al,2006;Cao et al,2011)。考虑到Hela细胞中HPV片段的残留所带来的安全性隐患,研究者又开发出A549细胞系(Gao et al,2002;Farson et al,2004)。但是无论是稳转AAV的cap和rep的Hela细胞系还是A549细胞系,它们都需要野生型Ad5进行辅助感染,才能产生AAV。这对实验环境和操作者的安全是一个挑战。为了避免使用野生型辅助病毒,研究者选择HEK293细胞进行稳转cap和rep,因为该细胞本身含有Ad病毒的E1基因(包括E1A和E1B)。E1A是p5和p19启动子的转录因子,可以启动rep蛋白的转录和翻译。而rep蛋白产物包括rep78、rep68、rep54、rep40,这些蛋白会抑制细胞生长(Yang etal,1994),对细胞甚至具有毒性(Schmidt et al,2000),在建立稳转细胞系时是无法在HEK293细胞中长期过量表达。因此,有研究者在HEK293细胞采用cre控制的诱导表达系统(Qiao et al,2002)制备含有rep-cap的稳转细胞系,并且也在之后优化了克隆构建的方法(Yuan et al,2011)。但是仍然无法解决的是多种辅助病毒的添加,繁琐的细胞系筛选过程和细胞系稳定性的评估。
2020版中国药典中《人用基因治疗制品总论》中要求检测基因治疗病毒载体的感染性滴度。2020年9月14日发布的《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿)》中亦明确指出,“建立基因治疗产品物理数量和生物数量的检测指标,如:颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组DNA/RNA或质粒DNA浓度、细菌数等。病毒载体应对总颗粒数与感染性滴度或感染性颗粒数的比例进行控制,病毒载体类制剂建议以物理滴度计算临床计量。”之所以要监测病毒载体的总颗粒数与感染性滴度或感染性颗粒数的比例,主要是随着各种条件的变化,比如制剂缓冲液、保存温度、保存时间、pH等的变化,物理滴度变化不大,但是感染滴度(有效感染细胞的病毒载体数)会发生改变。如果无法有效的检测感染滴度,会出现同一批次生产的病毒,在保存超过1年,或是冻融几次后,病毒的使用效果变差的情况。这对动物试验的工作人员造成了非常大的困扰。通常一个动物有效性实验的时间需要几个月甚至长达1年,等实验数据出来以后需要再用到这批病毒时,该病毒的感染活性是否降低需要进行有效评估。如果换其他新生产的批次病毒,如何确定感染性能和上一批的一致呢?因此,如何简单快速的检测rAAV的感染滴度,能够解决现有的关于rAAV病毒保存时间、冻融次数、高低pH对病毒活力的影响等问题。需要建立通用、简单、实用、可信的rAAV感染滴度检测方法。
提高AAV感染体外培养细胞的效率,对进行AAV体外细胞实验,建立通用、简单、实用、可信的rAAV感染滴度检测方法等具有重要意义,本发明旨在开发一种新的AAV感染体外培养细胞的高效简便方法并将其予以运用。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒,其通过对携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞瞬时转染包含编码AAV病毒Cap、Rep蛋白的基因质粒以及腺病毒辅助质粒的外源质粒,以该待测rAAV作为种子病毒,在转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度,该方法不需引入辅助病毒,通过质粒辅助即可高效简单实现rAAV感染滴度的检测,由此解决现有技术rAAV感染滴度检测方法需要引入辅助病毒存在安全风险,且需要配合包装特定细胞系操作复杂等技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法,包括如下步骤:
(1)对携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞进行瞬时转染外源质粒,得到转染外源质粒的HEK细胞;其中,所述外源质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因;所述E1a基因和E1b基因分别为编码腺病毒E1a蛋白的基因和编码腺病毒E1b蛋白的基因;
(2)在所述转染外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由该待测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;
(3)通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。
优选地,步骤(1)所述腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因包括编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。
优选地,所述外源质粒为一个或多个,所述编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因被导入所述一个或多个外源质粒中。
优选地,所述外源质粒包括RC质粒和腺病毒辅助Helper质粒,所述RC质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因和编码AAV病毒Rep蛋白的基因;所述Helper质粒中包含编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。
优选地,所述RC质粒的血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型、Rh10型、DJ型、PHPB型、PHPeB型、Anc80L65型、Retro型。
优选地,步骤(1)所述瞬时转染过程中还加入培养基DMEM和转染试剂PEI-MAX,瞬时转染外源质粒时,所述RC质粒和Helper质粒的添加质量比为1:0.5-2;所述质粒的添加总质量与转染试剂PEI-MAX的质量比值1:2-1:3。
优选地,所述HEK细胞为HEK293、HEK293F或HEK293T。
优选地,步骤(3)按照Reed-Mench法或者Karber法计算待测rAAV的TCID50感染滴度。
优选地,所述的方法,包括如下子步骤:
(1)将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于多孔板中静置贴壁培养;
(2)待步骤(1)所述细胞贴壁后,采用PEI瞬时转染所述外源质粒,转染后静置培养数小时;
(3)将待测rAAV进行10倍梯度稀释,加入到步骤(2)进行瞬时转染后的细胞孔中,进行细胞培养;
(4)通过测定每个稀释梯度每个细胞孔内所述待测rAAV中报告基因的表达量或目的基因的基因拷贝数,确定每个梯度的阳性孔数;
(5)根据步骤(4)确定的每个梯度的阳性孔数,计算待测rAAV的感染滴度。
优选地,步骤(1)具体为:将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于96孔板中置于35-38℃下3%-8%CO2培养箱中静置贴壁培养至少1小时,细胞铺设量为4E+4~6E+4cells/孔。
优选地,将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于96孔板中置于35-38℃下3%-8%CO2培养箱中静置贴壁培养1-2小时。
优选地,步骤(2)采用PEI瞬时转染外源质粒后于35-38℃下3-8%CO2培养箱中静置培养1-2小时。
优选地,步骤(3)所述细胞培养具体为:在35-38℃下3-8%CO2培养箱静置培养3-5天。
按照本发明的另一个方面,提供了一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的试剂盒,该试剂盒包括携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞以及外源质粒;
其中,所述外源质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因;所述E1a基因和E1b基因分别为编码腺病毒E1a蛋白的基因和编码腺病毒E1b蛋白的基因;
使用时,所述外源质粒用于瞬时转染携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞,在转染了该外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由待检测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合所需的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染了该外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;然后通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。
优选地,所述腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因包括编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。
优选地,所述试剂盒中还包括培养基和转染试剂;所述培养基优选为DMEM培养基,所述转染试剂优选为PEI-MAX。
优选地,所述试剂盒中还包括已知滴度的rAAV病毒,该rAAV病毒作为阳性标准品。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得下列有益效果:
(1)本发明提供了一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法,其通过对携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞瞬时转染包含编码AAV病毒Cap、Rep蛋白的基因质粒以及腺病毒辅助质粒的外源质粒,以该待测rAAV作为种子病毒,在转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖的基础上,检测rAAV的感染滴度,本发明提出的rAAV病毒滴度检测方法不需引入辅助病毒,通过质粒辅助即可高效简单实现rAAV感染滴度的检测,避免了引入辅助病毒带来的安全风险。
(2)本发明提供了一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法中采用大多数实验室都配备的HEK细胞进行瞬时转染,无需如现有技术采用辅助病毒时需要配合包装特定种类的细胞系,不需要繁琐的细胞系筛选过程和细胞系稳定性的评估,操作简便,快捷。
(3)本发明提出的利用质粒辅助进行rAAV感染滴度的检测方法,与目前较常使用的腺病毒辅助感染Hela RC32测定AAV感染滴度的方法相比,通过将cap_rep基因和腺病毒辅助感染相关的一些基因Helper质粒进行瞬时转染,这些质粒更加容易获得;避免了腺病毒的污染,操作更加安全,对实验室级别要求要低;同时包装细胞和感染滴度测定均可在293T细胞中操作,省去了购买和培养Hela RC32细胞的费用和时间。
(4)本发明提出的利用质粒辅助进行rAAV感染滴度的检测方法,优选实施例中利用cap_rep质粒(RC质粒)和辅助质粒(Helper)辅助rAAV感染293T细胞,利用两种质粒辅助转染293细胞,以待测滴度的rAAV为种子病毒,实现rAAV的大量复制和包装,且实验发现,同一个rAAV采用不同的血清型RC质粒,该方法检测出来的病毒滴度差别不大,说明采用本发明的方法适合于各种血清型rAAV的包装,进而说明本发明的两质粒辅助方法对于不同血清型的rAAV病毒滴度的检测具有良好的通用性。
(5)本发明实施例中发现在293T细胞中,无论是CMV这一类强启动子还是TTR这一类组织特异性启动子,采用本发明质粒辅助rAAV感染荧光最强,而重组腺病毒辅助与未质粒辅助组中,荧光虽然有一定程度增强,但与本发明实施例质粒辅助组增强效果相差较远,感染滴度大约差3-4个数量级。同时重组腺病毒对细胞毒性较大,感染3天后,293T细胞成团聚缩死亡,由此可推测出如果使用野生型腺病毒进行辅助感染,也会呈现出较大的细胞毒性。综合分析,本发明所述质粒辅助方法较腺病毒辅助具有如下几个较显著的优势:1)增强rAAV感染效果更强;2)实验操作更加安全;3)细胞毒性较小。
(6)本发明实施例中通过对该病毒滴度检测方法的重复性进行验证发现,三名不同操作者同时用质粒辅助感染检测同一个rAAV病毒感染滴度,分别重复3次,对结果进行分析,三名操作者CV在9%~20%之间,说明该方法重现性较好。
(7)本发明提供了一种利用质粒辅助进行行rAAV感染滴度检测的试剂盒,该试剂盒包括携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞以及外源质粒;该试剂盒使用时,外源质粒用于瞬时转染携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞,在转染了该外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由待检测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合所需的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染了该外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;然后通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。优选实施例中该试剂盒中还含有培养基、转染试剂以及阳性标准品,使用方便,而且该试剂盒可适用于各种血清型rAAV病毒滴度的检测。
附图说明
图1为本发明利用质粒辅助进行rAAV感染滴度测定方法流程图;
图2为实施例1293T细胞中质粒辅助当天感染rAAV和第二天感染rAAV效果对比。
图3内容a和内容b分别为实施例3中293T细胞中同一种病毒质粒辅助和不辅助滴度检测荧光对比。
图4为实施例4在强启动子启动下质粒辅助和重组腺病毒辅助感染的比较。
图5为实施例4在强启动子启动下质粒辅助和重组腺病毒辅助感染的比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
AAV病毒与腺病毒、慢病毒等病毒相比,感染体外培养细胞的能力较弱,使得其感染滴度的测定较为困难,并且需要腺病毒的协助,目前关于AAV感染滴度的测定主要使用Hela RC32细胞,Hela RC32细胞系是在Hela细胞中稳转AAV2的cap和rep基因构建而成的细胞系(Gilliane C et al.,2001)。在腺病毒的辅助下,将AAV进行10倍梯度稀释感染HelaRC32细胞,通过观察荧光或RT-PCR的方法计算AAV基因组拷贝数,使用TCID50的方法测定感染滴度(Lock M et al.,2010)。该种方法限定了细胞系和腺病毒的辅助感染存在安全问题,从而限制了其应用范围。
本发明提供的一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法,如图1所示,包括如下步骤:
(1)对贴壁或者悬浮的携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞进行瞬时转染外源质粒,得到转染外源质粒的HEK细胞;其中,所述外源质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因;所述E1a基因和E1b基因分别为编码腺病毒E1a蛋白的基因和编码腺病毒E1b蛋白的基因;
(2)在所述转染外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由该待测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;
(3)通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。
一些实施例中,步骤(1)所述腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因包括编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。
本发明所述外源质粒为一个或多个,所述编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因被导入所述一个或多个外源质粒中。本发明将编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因导入外源质粒中,可以将所有的这些基因导入同一个质粒中,也可以将这些基因导入多个不同的质粒中。
本发明外源质粒提供的基因可以由至少一个质粒提供,并且质粒上基因排列并无顺序要求。优选实施例中将AAV的cap和rep基因放在同一个质粒,将腺病毒E2a、E4orf6、VARNA放在同一个质粒。即一些实施例中,所述外源质粒包括RC质粒和腺病毒辅助Helper质粒,所述RC质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因和编码AAV病毒Rep蛋白的基因;所述Helper质粒中包含编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。一些实施例中,利用rAAV三质粒包装过程中的cap_rep质粒和腺病毒辅助质粒促进rAAV感染293T细胞。所述AAV cap和AAV rep由同一个RC质粒提供,所述腺病毒E2a、腺病毒E4orf6和腺病毒VA RNA同时由另一个质粒Helper质粒提供,E1a和E1b由HEK细胞提供。
一些实施例中RC质粒pAAV2_2购买自addgene,货号104963,即将野生型AAV2/2的两端ITR之间的序列构建到质粒载体上,用以表达AAV2的CAP蛋白和REP蛋白。该RC质粒也可自行制备,具体构建方法为:
1)选择合适的载体和合适的多克隆位点,使用限制性内切酶进行酶切,得到载体骨架;
2)通过PCR的方法扩增出cap_rep序列,设计扩增引物时添加酶切载体相同的限制性内切酶位点或者添加一段载体骨架上的同源臂;
3)载体和PCR扩增出的cap_rep序列通过酶切连接的方式或同源重组的方式进行连接;
4)连接产物或重组产物转化大肠杆菌感受态,涂带抗性LB固体平板,挑选单克隆摇菌提质粒,测序验证,得到正确质粒。
优选实施例中Helper质粒pAdDeltaF6购买自addgene,货号112867,即将野生型腺病毒Ad5E2a基因、E4orf6基因、VA RNA基因构建到载体上表达E2a蛋白,E4orf6蛋白和VARNA蛋白。该Helper质粒亦可自行制备,具体构建方法同RC质粒构建。
本发明提出的利用质粒辅助进行rAAV感染滴度测定的方法,该方法需要使用AAV的血清型质粒辅助待检AAV病毒从细胞中复制增殖释放到上清并感染周边的细胞,扩大报告基因的表达信号,同时增加细胞中AAV的基因组拷贝数。已有文献报道,不同AAV血清型体外感染细胞的能力不同,其中以AAVDJ和AAV2体外感染细胞的能力最优。通常会认为在体外感染细胞能力最好的血清型会比较适合做rAAV感染滴度辅助检测的血清型。本发明实施例中比较RC2、RCDJ、RC8、RC9 4种不同的血清型质粒对同一种病毒滴度检测的影响,发现采用本发明方法进行病毒滴度测定时,不同血清型质粒辅助在病毒包装以及病毒滴度测量结果上并无较大差异,表明本发明质粒辅助方法采用不同血清型Cap质粒辅助并不影响病毒滴度检测结果,说明本发明病毒滴度检测方法具有血清普适性。因此,本发明提出的rAAV感染滴度测定方法中采用的辅助质粒中的RC质粒(Cap-Rep)是没有血清型要求和限制的。本发明可根据需求选择相应的AAV cap和rep基因,对应编码的AAV血清型可以是2型,也可以是1型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型、Rh10型、DJ型、PHPB型、PHPeB型、Anc80L65型、Retro等各种血清型。相应地,一些实施例中采用的RC质粒的血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型、9型、Rh10型、DJ型、PHPB型、PHPeB型、Anc80L65型、Retro等。
本发明所述用于编码AAV病毒Cap蛋白的基因和用于编码AAV病毒Rep蛋白的基因可以为不同血清型AAV对应的rep基因,也可以为基于野生型AAV cap和rep基因改造后的rep基因。用于编码腺病毒E2a蛋白的基因、用于编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、用于编码腺病毒VA RNA蛋白的基因可以为不同血清型腺病毒对应的各种基因,如常用的人的2型及5型腺病毒对应的基因。
本发明一些实施例中,引入RC质粒和Helper质粒的比例和用量可根据系统中选择的细胞种类进行优化和选择。比如当将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于96孔板中静置贴壁培养至少1小时时,细胞铺设量为4E+4~6E+4cells/孔,每孔中RC质粒的添加量为0.05-0.5ug RC,RC质粒与Helper质粒的添加质量比为1:0.5-2,优选为1:1-2。瞬时转染过程中还加入培养基DMEM和转染试剂PEI-MAX,瞬时转染外源质粒时,RC质粒和Helper质粒的添加总质量与转染试剂PEI-MAX的质量比值1:2-1:3。一些实施例中,瞬时转染时,96孔板中每孔各原料加入量分别为:20-100ul DMEM、0.05-0.5ug RC质粒、0.05-0.5ug Helper质粒、转染试剂PEI-MAX(1mg/ml)0.2-2ul。如使用24孔板、12孔板、6孔板等,体系可根据细胞用量进行相应比例调整。
本发明提供的促进AAV感染体外培养细胞的系统,不仅仅局限于实施例中的293T细胞,还可适用于其他HEK细胞。适用的细胞可以是实验室常用的人源、大鼠、小鼠、仓鼠来源的细胞系,也可以是分离得到的原代细胞。
本发明所述HEK细胞可以为悬浮或贴壁HEK细胞,包括但不限于为HEK293、HEK293F或HEK293T。
本发明一些实施例中,步骤(3)按照Reed-Mench法或者Karber法计算待测rAAV的TCID50感染滴度.
本发明一些实施例中,上述方法包括如下子步骤:
(1)将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于多孔板中静置贴壁培养;
(2)待步骤(1)所述细胞贴壁后,采用PEI瞬时转染所述外源质粒,转染后静置培养数小时;
(3)将待测rAAV进行10倍梯度稀释,加入到步骤(2)进行瞬时转染后的细胞孔中,进行细胞培养;
(4)通过测定每个稀释梯度每个细胞孔内所述待测rAAV中报告基因的表达量或目的基因的基因拷贝数,确定每个梯度的阳性孔数;
(5)根据步骤(4)确定的每个梯度的阳性孔数,计算待测rAAV的感染滴度。
一些实施例中,步骤(1)具体为:将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于96孔板中置于35-38℃下3%-8%CO2培养箱中静置贴壁培养至少1小时,优选1-2小时,细胞铺设量为4E+4~6E+4cells/孔。
一些实施例中,步骤(2)采用PEI瞬时转染外源质粒后于35-38℃下3-8%CO2培养箱中静置培养1-2小时。
一些实施例中,步骤(3)所述细胞培养具体为:在35-38℃下3-8%CO2培养箱静置培养3-5天。
本领域技术人员应该明了,具体应用时,使用不同细胞,不同的转染试剂时,可根据需要对质粒用量进行优化调整,以达到质粒较优的转染效率,同时不至对细胞造成较大毒性。
本发明一些实施例中采用Reed-Muench两氏法进行TCID50计算,具体计算方法为:lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度,距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)。
本发明提出的利用质粒辅助进行rAAV病毒的包装,进而进行感染滴度的测定,与目前最常使用的rAAV包装系统三质粒转染HEK293T细胞法相比,本发明质粒辅助方法与三质粒转染方法相比,两者都包含cap_rep质粒(RC质粒)和辅助质粒(Helper),HEK293T细胞三部分,两者的区别在于,本发明方法以已有的小量rAAV病毒作为种毒(可以是纯化或者未经纯化的rAAV病毒)替换三质粒系统中的核心质粒。与传统三质粒转染的方法相比较,本发明方法大大降低了核心质粒的用量,以种毒替代核心质粒,只需要用于种毒包装的少量核心质粒,省去了核心质粒大提的时间和成本,考虑到在生产中RC质粒和Helper种类只有有限的几种,而核心质粒则各不相同,该种方法省去了核心质粒的大提,在成本和时间上的节省较为可观。
另一方面,现有的三质粒转染包装方法,认为AAV8型和AAV9型最容易包装,包装的病毒滴度也最高,而AAV2比较难包装,病毒多分布在细胞中,而不分泌到上清;但是本发明提出的质粒辅助方法,将以已有的小量rAAV病毒作为种毒(可以是纯化或者未经纯化的rAAV病毒)替换三质粒系统中的核心质粒,不仅大大降低了核心质粒的用量和大提时间,而且令人意想不到的是,实验证明采用本发明的方法不局限于传统三质粒方法中容易包装的AAV8型和AAV9型等病毒的包装,而是适用于所有血清型rAAV病毒的包装和滴度测定,不具有血清偏好性。
本发明利用质粒辅助进行rAAV感染滴度的测定适用于各种方法或系统包装生产的待测rAAV,比如使用HEK293T三质粒系统、sf9/bac系统,或者rHSV或rAd辅助系统包装的rAAV病毒。
本发明还提供了一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的试剂盒,该试剂盒包括携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞以及外源质粒;其中,所述外源质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因;所述E1a基因和E1b基因分别为编码腺病毒E1a蛋白的基因和编码腺病毒E1b蛋白的基因;使用时,所述外源质粒用于瞬时转染携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞,在转染了该外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由待检测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合所需的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染了该外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;然后通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。
一些实施例中,所述腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因包括编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。
本发明所述外源质粒可以为一个或多个,所述编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因被导入所述一个或多个外源质粒中。本发明将编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因导入外源质粒中,可以将所有的这些基因导入同一个质粒中,也可以将这些基因导入多个不同的质粒中。
一些实施例中,所述试剂盒中还包括培养基和转染试剂;所述培养基优选为DMEM培养基,所述转染试剂优选为PEI-MAX,便于用户直接使用。
优选实施例中,所述试剂盒中还包括已知滴度的rAAV病毒,该rAAV病毒作为阳性标准品,用于供用户在检测确保该试剂盒有效的情况下,进行待测rAAV滴度的测定。
本发明提供的试剂盒由于包括HEK细胞以及外源质粒,可按照常规细胞以及质粒保存方法进行保存,比如在-80℃下进行保存。在使用时,可按照上述检测方法进行使用。具体的质粒种类、组成以及构建方法参见本说明书的描述。另外,本发明经实验证明,外源质粒的血清型与待测rAAV血清型种类不同时,也不影响该待测rAAV的测定。比如,本发明试剂盒中包含血清型为2型的RC质粒,该试剂盒对于不同血清型的rAAV滴度测定均适用。
以下为实施例:
实施例1
293T细胞铺板后,辅助质粒转染后当天还是第二天进行AAV病毒的感染,需要进行确认。设计实验,辅助质粒转染后,第一组试验当天进行病毒感染,第二组试验第二天进行病毒感染。具体操作如下:
1)使用HEK293T系统三质粒包装AAV2/9血清型scAAV-CBh-GFP-BGHpolyA病毒(编号PB2-623,批号RC9-623-Z20190420),通过碘克沙醇密度梯度离心纯化法得到成品AAV病毒。并通过ITR引物进行Q-PCR定量,测定物理滴度为3.03E+13vg/ml。感染能力弱的更能看出辅助是否有效果,为此,本实验挑选了感染293T细胞较其他血清型低的AAV2/9血清型;2)6孔细胞板每孔铺2E+6个293T细胞;3)待细胞贴壁后,2块6孔板,选择1号板进行质粒转染,每孔转染体系RC9质粒(血清型为AAV9型,addgene,货号112865)和Helper质粒(addgene,货号112867)各0.8ug,转染试剂PEI-max(Polyscience,分子量40KDa,1mg/ml)3.2ul,DMEM培养基250ul,振荡混匀静置15min后加入细胞中。放入37℃5%CO2培养箱中静置培养2h;4)按照MOI=1E+5在其中1号板的3个孔中加入PB2-623病毒,2号板的3个孔中加入病毒。将培养板放回培养箱;5)第二天,拿出培养板,在1号板的另外3个孔中以MOI=1E+5加入PB2-623病毒。将培养板放回培养箱。继续培养。隔天在荧光显微镜下进行观察并拍照。
图2为293T细胞中质粒辅助当天感染rAAV和第二天感染rAAV效果对比。scAAV2/9-CBh-GFP-BGHpolyA病毒以MOI=1E+5感染293T细胞,不加质粒辅助,绿色荧光暗淡。加了质粒辅助后,荧光亮度显著增强。当天质粒辅助后加病毒比第二天加病毒,在同一天先加病毒的荧光更亮且细胞状态良好。从图2的结果来看,当天感染和隔天感染AAV对细胞的状态影响不大。从荧光的表现来看,在同一时间进行荧光比较,隔天感染的荧光亮度要比当天感染的弱。考虑到操作的简便性和缩短检测的时间,接下来的试验均选择转染后当天感染AAV。
实施例2
辅助质粒血清型质粒的选择
本实施例比较几种不同的Cap辅助质粒对检测结果的影响。设计如下实验:比较RC2、RCDJ、RC8、RC9 4种不同的血清型质粒对同一种病毒滴度检测的影响。具体操作如下:
(1)采用sf9/bac系统包装的AAV2/9血清型scAAV-CBh-GFP-BGHpolyA病毒(编号1-9KC-623,批号:9KC-623-Z20191202MIX)。96孔细胞板每孔铺4E+4个293T细胞,一共铺4个板,每块板测2个血清型质粒,2块板测4种血清型质粒,从-5稀释至-10。1名操作者同时检测4种血清型,重复检测2次。
(2)待细胞贴壁后,每孔转染体系RC质粒和Helper质粒(addgene,货号112867)各0.1ug,RC质粒血清型分别为AAV2(addgene,货号104963)、AAVDJ(馈赠获得)、AAV8型(addgene,货号112864)、AAV9型(addgene,货号112865);转染试剂PEI-max 0.4ul,DMEM培养基50ul,振荡混匀静置15min后加入细胞中。放入37℃5%CO2培养箱中静置培养2小时。
(3)将待测病毒用2%DMEM培养基10倍梯度进行稀释,6ul病毒原液稀释至60ul记为梯度-1,取梯度-1的50ul病毒稀释至500ul梯度记为-2,取-2梯度的50ul病毒稀释至500ul记为-3,以此类推,记为-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10等梯度,每个稀释梯度8个孔,每孔添加50ul稀释后病毒。一共4个板子,对应不同的辅助RC质粒。放入到37℃5%CO2培养箱中静置培养。
(4)第4天时计数荧光为阳性的细胞孔数,根据Reed-Muench两氏法进行TCID50计算,具体计算方法为:lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度,距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)。结果见表1。
从表1的结果来看,不同血清型质粒进行辅助感染,同种病毒的TCID50滴度检测结果差异较小,基本上在3倍以内。因此,RC质粒的选择范围包括各个血清型的质粒。
表1不同血清型质粒辅助感染滴度检测结果
实施例3
质粒(RC质粒和Helper)辅助和不辅助rAAV感染滴度检测
使用质粒辅助的方法测定rAAV的感染滴度,设计实验1)使用Sf9/bac系统包装AAV2/9血清型scAAV-CBh-GFP-BGHpolyA病毒(编号1-1-9KC-623,批号9KC-623-Z20190529),并通过ITR引物进行Q-PCR定量,测定物理滴度为5E+12vg/ml,需要强调的是,本实验挑选了感染293T细胞较其他血清型低的AAV2/9血清型;2)96孔细胞板每孔铺4E+4个293T细胞,将1-1-9KC-623病毒用2%DMEM培养基10倍梯度进行稀释,6ul病毒原液稀释至至60ul记为梯度-1,取梯度-1的50ul病毒稀释至500ul梯度记为-2,取-2梯度的50ul病毒稀释至500ul记为-3,以此类推,记为-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10等梯度,每个稀释梯度8个孔,每孔添加50ul稀释后病毒;3)rAAV感染同时质粒辅助组按照实施例2中方法添加质粒辅助rAAV的感染,对照组只添加50ul DMEM培养基。感染3天后进行荧光观察和拍照(图3)。从荧光结果来看,未进行质粒辅助时,-2梯度时,虽然大部分细胞均能表达荧光蛋白,但荧光亮度整体偏弱,随着稀释梯度的增加,荧光亮度几乎无法分辨。而进行质粒辅助后,荧光亮度显著增强,即使稀释至-8、-9时,哪怕只有一个细胞表现出荧光,该荧光亮度也非常亮,后续TCID50计算阳性细胞孔时,与阴性细胞孔较容易区分。将各个稀释梯度阳性孔进行计数,采用Reed-Muench两氏法进行TCID50计算。RC2质粒辅助的TCID50滴度计算结果见表2:
表2质粒辅助TCID50荧光孔数
距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)=(81.8-50)/(81.8-30)=0.614
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.614×(-1)+(-8)=-8.614
TCID50=108.614/50ul=8.2E+9/mL,GC/TU=610
不加质粒辅助的TCID50滴度计算结果见表3:
表3质粒不辅助TCID50荧光孔数
距离比例=(100-50)/(100-31.33)=0.728
lgTCID50=0.728×(-1)+(-6)=-6.728
TCID50=106.728/50ul=1.07E+8/mL,GC/TU=4.67E+4
从以上加辅助质粒和不加辅助质粒检测1-1-9KC-623病毒的GC/TU比值来看,加质粒辅助的GC/TU比值只有610,远远小于不加质粒辅助检测的GC/TU比值4.67E+4。
图3内容a和内容b分别为293T细胞中同一种病毒质粒辅助和不辅助滴度检测荧光对比。同一种病毒进行质粒辅助后,绿色荧光亮度明显增强,在高稀释倍数下,单个荧光的亮度仍然很强,轻松区分阳性和阴性孔。而不加质粒辅助的孔,低稀释度下,荧光仍然很暗淡,很难区分阳性孔和阴性孔。
实施例4
重组腺病毒辅助和质粒辅助感染效果的差异
前面的实施中使用的都是纯化好的成品rAAV,启动子也是广谱强启动子,本实施例将检测纯化至中间产品(氯仿处理法)的病毒rAAV2/DJ-CMV-mCherry-BGHpA(编号PB2-0948)和rAAV2/DJ-TTR-mCherry-BGHpA(编号GT-0065,物理滴度1.57E+12vg/mL)滴度差异。具体操作如下:1)选取广谱强启动子CMV和肝脏特异性启动子TTR,构建rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA和rAAV-TTR-mCHERRY-bGHpA载体;2)使用293T系统包装AAVDJ血清型rAAV-TTR-mCHERRY-bGHpA病毒和rAAV-CMV-mCHERRY-bGHpA病毒;3)使用辅助质粒RC2和helper,腺病毒使用rAd5-mCMV-EGFP(批号:20180328,TCID50滴度:3.16E+9/mL);4)96孔细胞板每孔铺4E+4个293T细胞,PB2-0948病毒以2E+4和2E+3两个MOI感染细胞,GT-0065病毒以MOI 4E+3感染细胞,感染同时质粒辅助组按照实施例2中所述方法进行质粒辅助,重组腺病毒辅助组在质粒辅助组进行质粒转染时以rAd5-mCMV-EGFP MOI=0.2进行辅助感染,37℃5%CO2培养箱静置培养1-2小时后进行rAAV的感染。感染3天后荧光显微镜观察荧光并拍照(图3)。
图4和图5为质粒辅助和重组腺病毒辅助感染的比较。从荧光情况来看,在293T细胞中,无论是CMV这一类强启动子(图4)还是TTR这一类组织特异性启动子(图5),质粒辅助rAAV感染荧光最强,而重组腺病毒辅助与未辅助组相比,荧光虽然有一定程度增强,但与质粒辅助组增强效果相差较远,感染滴度大约差3-4个数量级。而且在重组腺病毒的辅助下,虽然rAAV的荧光亮度增强,但是在弱启动子下,增强效果减弱。同时重组腺病毒对细胞毒性较大,感染3天后,293T细胞成团聚缩死亡,由此可推测出如果使用野生型腺病毒进行辅助感染,也会呈现出较大的细胞毒性。综合分析,本发明所述质粒辅助方法较腺病毒辅助具有如下几个较显著的优势:1)增强rAAV感染效果更强;2)实验操作更加安全;3)细胞毒性较小。
实施例5
为探究不表达荧光的rAAV病毒是否能够通过该种质粒辅助感染的方法进行感染滴度测定,本发明对Taqman TCID50测定rAAV感染滴度的方法(Lock et al,2010)进行改进,具体方法为:
挑选实施例3中的质粒辅助感染的每个梯度稀释的四个重复孔以《Taqman TCID50测定rAAV感染滴度》的方法进行病毒裂解;病毒裂解液10倍稀释,稀释后用RT-PCR方法使用EGFP引物对rAAV病毒基因组拷贝数进行定量,由于本实验室现有技术方法无法达到低至10个拷贝的灵敏度,随着稀释梯度的增加,测定Cq mean值基本趋于稳定并接近阴性对照ddH2O测得Cq mean值,选取Cq mean值基本维持不变时的最低Cq mean定为检测下限,本次选取检测下限Cq mean值记为29.63,低于该值的孔记为阳性孔,具体测定结果见表4。
表4 Q-PCR检测目的基因EGFP拷贝数
表5质粒辅助TCID50目的基因拷贝数阳性孔数
按照上述Reed-Muench两氏法测定TCID50,距离比例=(100-50)/(100-0)=0.5,lgTCID50=0.5×(-1)+(-8)=-8.5,计算结果为6.31E+9TU/ml。
分析通过EGFP荧光观察阳性孔和通过Q-PCR测定rAAV基因组拷贝数计算rAAVTCID50的结果,两者之间相差较小,分别为8.20E+9TU/ml和6.31E+9TU/ml,表明两者之间存在较好的一致性,说明质粒辅助rAAV用于感染滴度测定的方法不仅仅可以用于表达荧光的rAAV病毒感染滴度测定,也可以用于无荧光表达的rAAV感染滴度测定。
与目前较常使用的腺病毒辅助感染Hela RC32测定AAV感染滴度的方法相比,质粒辅助rAAV感染的方法通过将cap_rep基因和腺病毒辅助感染相关的一些基因以rAAV三质粒包装过程中的RC质粒和Helper质粒的进行瞬时转染,质粒更加容易获得;避免了腺病毒的污染,操作更加安全,对实验室级别要求要低;同时包装细胞和感染滴度测定均可在293T细胞中操作,省去了购买和培养RC32细胞的费用和时间。
实施例6
按实施3的质粒辅助方法,三个不同操作者同时用质粒辅助感染检测同一个rAAV病毒感染滴度,分别重复3次,对结果进行分析,结果见表6。三名操作者CV在9%~20%之间,小于30%。《中国药典》2020版中关于体外细胞测定试验的变异系数的要求是30%以内。
表6病毒滴度检测方法的精密度分析(TCID50/ml)
实施例7
目前最常使用的rAAV包装系统是三质粒转染HEK293T细胞法,三质粒分别为rAAV转移载体(核心质粒),cap_rep质粒(RC质粒)和辅助质粒(Helper)三部分,其中E1a和E1b由HEK293T细胞提供。三质粒转染HEK293T细胞法具有快速有效、避免辅助病毒的使用的优点,但同时存在质粒和细胞使用量较大,大量制备rAAV时耗时耗力的缺点。本实施例运用质粒辅助感染的方法提供一种新的rAAV病毒包装方法,大体思路是先通过现有技术方法(如三质粒包装、sf9系统包装等方法)获得少量rAAV病毒种毒,再利用质粒辅助感染的方法以合适的MOI对种毒进行接毒,通常不同血清型包装时MOI为1E+3~1E+4,72h后收毒。具体实施例步骤如下:
(1)使用三质粒转染HEK293T细胞法包装AAV2/2、AAV2/8、AV2/9、AV2/DJ四种血清型的rAAV-CMV-EGFP-pA病毒,收集上清并使用ITR引物RT-PCR方法进行滴度测定;
(2)将收集的病毒上清液以MOI 1E+4和1E+3重新感染HEK293T细胞,同时进行RC质粒和Helper质粒的转染进行辅助,对照组采用三质粒转染的方法进行包装,与对照组相比,质粒辅助感染组只是用病毒上清液替换了核心质粒,各包装10cm平皿2个皿。
(3)72h分别收集上清液,同组两皿合并,使用ITR引物RT-PCR方法进行滴度测定。测定结果见表7。
表7病毒包装上清物理滴度测定结果
注:MOI=0代表三质粒转染对照组
从RT-PCR定量滴度数据分析,四种血清型通过质粒辅助感染的方法进行病毒组装,均能够组装出rAAV,说明该种rAAV病毒包装的方式是可行的,整体来看,高MOI(1E+4)包装病毒滴度要高于低MOI(1E+3),高MOI包装病毒滴度与对照组相比,比值在0.48-3.08之间,低MOI包装病毒滴度与对照组相比,比值在0.39-1.98之间,高MOI包装病毒滴度与低MOI病毒包装滴度差异基本控制在2倍范围以内,说明接毒MOI存在一个相对较大的范围空间,为省去种毒滴度定量,依据经验进行盲接提供了可能(即根据经验预估种毒滴度,将MOI控制在1E+3以上进行接毒)。以高MOI 1E+4与质粒转染对照组进行计算,每10cm皿细胞数目为6E+6个,收10ml上清种毒,将质粒转染对照组的病毒上清液用于后续质粒辅助感染rAAV病毒包装,每皿种毒上清液可感染皿数目为:14.43皿(AAV2/DJ)、9.73皿(AAV2/9)、46.85皿(AAV2/8)、1.07皿(AAV2/2),除去AAV2/2血清型,其他三个种血清型单皿上清液种毒可二次感染10-50个皿,但考虑到AAV2/2血清型三质粒转染包装时较其他血清型困难,质粒辅助感染的单皿产量更高,优势更加明显。
综上所述,质粒辅助感染用于rAAV病毒包装的方法是可行的,并且可用于各种血清型的包装,包括三质粒转染包装方法较难包装的AAV2/2血清型。因此,该方法与传统三质粒转染的方法相比较,大大降低了核心质粒的用量,以种毒替代核心质粒,只需要用于种毒包装的少量核心质粒,省去了核心质粒大提的时间和成本,考虑到在生产中RC质粒和Helper种类只有有限的几种,而核心质粒则各不相同,该种方法省去了核心质粒的大提,在成本和时间上的节省较为可观。正是基于此,使得采用本发明质粒辅助的方法进行rAAV病毒滴度的测定也能够适用于各种血清型病毒,该方法具有良好的通用性。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)对携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞进行瞬时转染外源质粒,得到转染外源质粒的HEK细胞;其中,所述外源质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因;所述E1a基因和E1b基因分别为编码腺病毒E1a蛋白的基因和编码腺病毒E1b蛋白的基因;
(2)在所述转染外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由该待检测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;
(3)通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因包括编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VARNA蛋白的基因。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述外源质粒为一个或多个,所述编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因被导入所述一个或多个外源质粒中。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述外源质粒包括RC质粒和腺病毒辅助Helper质粒,所述RC质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因和编码AAV病毒Rep蛋白的基因;所述Helper质粒中包含编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VARNA蛋白的基因。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述瞬时转染过程中还加入培养基DMEM和转染试剂PEI-MAX,瞬时转染外源质粒时,所述RC质粒和Helper质粒的添加质量比为1:0.5-2;所述质粒的添加总质量与转染试剂PEI-MAX的质量比值1:2-1:3。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞铺于多孔板中静置贴壁培养;
(2)待步骤(1)所述细胞贴壁后,采用PEI瞬时转染所述外源质粒,转染后静置培养数小时;
(3)将待测rAAV进行10倍梯度稀释,加入到步骤(2)进行瞬时转染后的细胞孔中,进行细胞培养;
(4)通过测定每个稀释梯度每个细胞孔内所述待测rAAV中报告基因的表达量或目的基因的基因拷贝数,确定每个梯度的阳性孔数;
(5)根据步骤(4)确定的每个梯度的阳性孔数,计算待测rAAV的感染滴度。
7.一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞以及外源质粒;
其中,所述外源质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因、编码AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因;所述E1a基因和E1b基因分别为编码腺病毒E1a蛋白的基因和编码腺病毒E1b蛋白的基因;
使用时,所述外源质粒用于瞬时转染携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞,在转染了该外源质粒的HEK细胞中进行待检测rAAV的梯度稀释,由待检测rAAV提供野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合所需的顺式作用元件-基因组两端的ITR序列,在所述转染了该外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖;然后通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的rAAV基因组拷贝数,计算待测rAAV的感染滴度。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述腺病毒中对rAAV包装起辅助功能的基因包括编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。
9.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括培养基和转染试剂;所述培养基优选为DMEM培养基,所述转染试剂优选为PEI-MAX。
10.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括已知滴度的rAAV病毒,该rAAV病毒作为阳性标准品。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113308492A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-27 | 北京中因科技有限公司 | 一种用于复制性aav的检测方法 |
CN114574523A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-06-03 | 济南宜明医疗科技有限公司 | 用于aav病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法和应用 |
WO2023039936A1 (zh) | 2021-09-18 | 2023-03-23 | 劲帆生物医药科技(武汉)有限公司 | 一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用 |
WO2023092643A1 (zh) | 2021-11-26 | 2023-06-01 | 劲帆生物医药科技(武汉)有限公司 | 一种包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其在昆虫细胞中的应用 |
CN116376843A (zh) * | 2023-05-24 | 2023-07-04 | 济南宜明医疗科技有限公司 | 腺相关病毒易感性细胞株及其应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002014526A2 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Neurologix, Inc. | Replication competent aav helper functions |
US6509150B1 (en) * | 1999-03-05 | 2003-01-21 | Universite De Nantes | Compositions and methods for recombinant Adeno-Associated Virus production |
US20030175974A1 (en) * | 1994-12-06 | 2003-09-18 | Allen James M. | Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors |
CN101386891A (zh) * | 2007-09-13 | 2009-03-18 | 本元正阳基因技术有限公司 | 一种重组腺相关病毒载体感染滴度的测定方法 |
CN103114152A (zh) * | 2013-02-04 | 2013-05-22 | 许瑞安 | 一种测定重组腺相关病毒滴度的定量pcr方法 |
CN108179137A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-19 | 武汉枢密脑科学技术有限公司 | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 |
CN108330147A (zh) * | 2017-01-20 | 2018-07-27 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立 |
-
2020
- 2020-10-30 CN CN202011196673.0A patent/CN112280801A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030175974A1 (en) * | 1994-12-06 | 2003-09-18 | Allen James M. | Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors |
US6509150B1 (en) * | 1999-03-05 | 2003-01-21 | Universite De Nantes | Compositions and methods for recombinant Adeno-Associated Virus production |
WO2002014526A2 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Neurologix, Inc. | Replication competent aav helper functions |
CN101386891A (zh) * | 2007-09-13 | 2009-03-18 | 本元正阳基因技术有限公司 | 一种重组腺相关病毒载体感染滴度的测定方法 |
CN103114152A (zh) * | 2013-02-04 | 2013-05-22 | 许瑞安 | 一种测定重组腺相关病毒滴度的定量pcr方法 |
CN108330147A (zh) * | 2017-01-20 | 2018-07-27 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立 |
CN108179137A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-19 | 武汉枢密脑科学技术有限公司 | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
YONG HONG CHEN等: "Adeno-Associated Virus Production, Purification, and Titering", 《CURR PROTOC MOUSE BIOL.》 * |
ZHU ZHEN等: "Infectious Titer Assay for Adeno-Associated Virus Vectors with Sensitivity Sufficient to Detect Single Infectious Events", 《HUMAN GENE THERAPY》 * |
肖桂清等: "重组腺相关病毒质量控制的qPCR技术研究进展", 《华侨大学学报(自然科学版)》 * |
褚颖豪等: "重组人核糖核酸酶抑制因子腺相关病毒的构建及表达", 《中国生物制品学杂志》 * |
雷求刚: "重组AAV(rAAV)杆状病毒生产系统的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113308492A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-27 | 北京中因科技有限公司 | 一种用于复制性aav的检测方法 |
WO2023039936A1 (zh) | 2021-09-18 | 2023-03-23 | 劲帆生物医药科技(武汉)有限公司 | 一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用 |
WO2023092643A1 (zh) | 2021-11-26 | 2023-06-01 | 劲帆生物医药科技(武汉)有限公司 | 一种包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其在昆虫细胞中的应用 |
CN114574523A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-06-03 | 济南宜明医疗科技有限公司 | 用于aav病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法和应用 |
CN116376843A (zh) * | 2023-05-24 | 2023-07-04 | 济南宜明医疗科技有限公司 | 腺相关病毒易感性细胞株及其应用 |
CN116376843B (zh) * | 2023-05-24 | 2023-08-18 | 济南宜明医疗科技有限公司 | 腺相关病毒易感性细胞株及其应用 |
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