CN112280075A - 一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，步骤依次包括1黑色素的提取：将山杏核壳废料粉碎过筛后干燥备用，然后用碱溶液提取山杏核壳黑色素粗提液，经过酸溶液沉降、纤维素酶酶解、糖化酶酶解、碱溶解及再次酸沉，获得黑色素粗提物；2黑色素的纯化：先将粗提物用有机溶剂洗涤，在进行二次碱溶解及酸沉，然后经过洗涤及干燥，获得纯化后的黑色素；3薄膜的制备：将聚乳酸、三氯甲烷溶液和黑色素混合，经过搅拌，超声辅助提取，离心机离心，最后制得黑色素/PLA薄膜。黑色素/PLA薄膜可用于果蔬的保鲜贮藏，在保证了聚乳酸可降解性的同时，赋予了薄膜黑色素所具备的抗紫外和抗氧化等特性，是一种理想的绿色包装材料。

Description

一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及高分子材料技术领域，尤其是指一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法及应用。

背景技术

为减少石油基塑料的使用，保护环境，缓解当下日益严峻的石油资源短缺问题，开发和利用生物基可降解的环保型塑料材料成了包装材料领域的研究重点。

聚乳酸(PLA)是由自然界广泛存在的植物资源发酵呈乳酸，再由乳酸聚合制备而成的，整个制备过程安全无害，若被丢弃可通过自然环境进行降解，不会造成环境污染，是公认的绿色高分子材料。聚乳酸材料是目前应用最为广泛的可降解塑料之一，作为包装薄膜材料，具有很好的透明度、机械性能和生物相容性，高强度、热塑性、成型加工容易、可完全降解，降解产物对人体无毒无害，来源于可再生资源，易于回收利用等优点，但是聚乳酸价格昂贵、高脆性、低韧性的缺陷影响了其在更广泛领域的应用。聚乳酸作为单一单体合成的可降解材料在机械性能，加工性能以及其他功能特性上不能达到社会对材料性能的广泛要求，所以我们要对生物可降解材料采取一些方法进行改性，对其不足的性能进行补强，从而使环境友好型的生物可降解材料使用范围更加广泛。

黑色素是含有酚羟基、氨基和亚氨基的一类大分子，在生物聚合物材料当中可以作为良好的交联剂，并可赋予聚合物良好的抗氧化、抗紫外等特性。天然黑色素来源广泛，常常可以从植物、微生物中提取。其中，山杏核壳中就含有丰富的黑色素、木质素和少量的黄酮类物质。然而，山杏核壳常被作为一种农业废料而丢弃或焚烧，不仅造成了极大的资源浪费还会造成了环境污染。

本发明提取山杏核壳中的黑色素与聚乳酸共混制成可降解塑料薄膜，综合了聚乳酸的高性能与黑色素的紫外屏蔽和抗氧化活性等特性，不但能够部分替代传统石油基塑料，还解决了单纯聚乳酸存在的缺陷，拓宽了聚乳酸的使用范围，同时，充分利用了山杏核壳，节省了成本，具有重要的经济和环保意义，为开发出一种新的食品保鲜薄膜提供了思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法及其应用，在保证了聚乳酸生物可降解性的同时，赋予了薄膜黑色素所具备的抗紫外和抗氧化等特性，是一种理想的绿色包装材料。

为达成上述目的，本发明的解决方案为：一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)黑色素的提取

用自来水将山杏核壳洗净，待干燥后，粉碎成粉末备用；称取适量粉末，按料液比1:20加入NaOH溶液，静置，离心收集上清液，即黑色素粗提液；然后，向黑色素粗提液中加入HCl溶液，离心除去上清液，所得沉淀物为黑色素粗提物；向黑色素粗提物中加入蒸馏水调节pH为5.00，按黑色素粗提物0.1％的质量比加入纤维素酶，水浴加热1h后，离心除去上清液；再向固体中加入蒸馏水调节pH为4.50，按固体0.1％的质量比加入糖化酶，水浴加热1h后，离心除去上清液；最后，按料液比1:30加入NaOH溶液，超声辅助提取30min后，加入HCl溶液，分离除去上清液，所得沉淀物为黑色素粗提物；

(2)黑色素的纯化

向步骤(1)所得黑色素粗提物中加入无水乙醇，经离心除去上清液，反复此步骤直至上清液无色后，除去上清液；然后，加入NaOH溶液，振荡30min，再加入HCl溶液，经离心除去上清液，反复此操作直至上清液无色，除去上清液；最后加入蒸馏水，离心除去上清液，反复此操作直至上清液无色，所得固体即黑色素；

(3)薄膜的制备

称取2g聚乳酸于烧杯中，加入30mL三氯甲烷溶液，放在磁力搅拌器上搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，加入步骤(2)所得黑色素于烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，离心5min，将溶液倒入聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后即成膜。

优选地，所述步骤(2)中无水乙醇和NaOH溶液的添加量约为黑色素粗提物质量的10倍；所述步骤(3)中溶液在25℃，5000r/min条件下充分搅拌，且搅拌过程中须将烧杯用保鲜膜封口；所述HCL溶液调节黑色素粗提物pH至2.20。

优选地，所述薄膜的制备过程中黑色素颗粒的添加量为：0～4mg。

优选地，所述薄膜的制备过程中准确称取0mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为纯PLA。

优选地，所述薄膜的制备过程中准确称取0.5mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.025％。

优选地，所述薄膜的制备过程中准确称取1mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.05％。

优选地，所述薄膜的制备过程中准确称取2mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.1％。

优选地，所述薄膜的制备过程中准确称取4mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.2％。

本发明还提供了一种黑色素/聚乳酸薄膜在果蔬保鲜中的应用。

采用上述方案后，本发明的增益效果在于：

为避免环境污染及农业废料的资源浪费，本发明充分利用了山杏核壳废料，通过黑色素溶于碱溶液而在酸中沉淀的特性，采用碱溶酸沉法对山杏核壳中黑色素进行提取纯化；纯化后的黑色素与聚乳酸利用溶剂挥发法制备成黑色素/聚乳酸薄膜，该薄膜不仅保留了聚乳酸的生物可降解性等高性能，还具备了黑色素的紫外屏蔽和抗氧化活性等特性，解决了单纯聚乳酸存在的缺陷，拓宽了聚乳酸的使用范围。

本发明的制备方法简单易行，制得的黑色素/聚乳酸薄膜属于食品级，不仅具有良好的韧性和可降解性，而且具有良好的水蒸气透过性，可作为保鲜包装材料使用，用于延长果蔬等食品的保存期，其韧性优于现有的保鲜膜，是一种理想的绿色包装材料。

附图说明

图1是PLA、黑色素/PLA薄膜的扫描电镜图；

图2是PLA、黑色素/PLA薄膜的红外光谱图；

图3是PLA、黑色素/PLA薄膜的DSC曲线图；

图4是PLA、黑色素/PLA薄膜的紫外-可见光谱图；

图5是PLA、黑色素/PLA薄膜的DPPH、H2O2自由基清除率条形图；

图6是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后在贮藏过程中感官测试图；

图7是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后在贮藏过程中失重变化趋势图；

图8是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后在贮藏过程中硬度变化趋势图；

图9是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后在贮藏过程中腐烂程度变化图；

图10是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后TSS在贮藏过程中的变化趋势图；

图11是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后TA在贮藏过程中的变化趋势图；

图12是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后Vc在贮藏过程中的变化趋势图；

图13是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后POD在贮藏过程中的变化趋势图；

图14是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后PPO在贮藏过程中的变化趋势图；

图15是黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组对圣女果保鲜处理后MDA在贮藏过程中的变化趋势图。

具体实施方式

本发明提供一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)黑色素的提取

S1，粉碎：用自来水将山杏核壳洗净，在70℃条件下干燥，待完全干燥后，用粉碎机将山杏核壳粉碎成粉末，过20目目筛后于干燥的环境中保存备用；

S2，碱溶液提取：称取适量步骤S1所得山杏核壳粉末，按料液比1:20加入2mol/LNaOH溶液，静置3h，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min，收集上清液，即为山杏核壳黑色素粗提液；

S3，酸溶液沉淀：向步骤S2所得山杏核壳黑色素粗提液中加入6mol/LHCl溶液，直至pH值为2.20，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min，除去上清液，所得沉淀物，即为山杏核壳黑色素粗提物；

S4，纤维素酶酶解：向步骤S3所得山杏核壳黑色素粗提物中加入蒸馏水，直至pH值为5.00，按山杏核壳黑色素粗提物0.1％的质量比加入纤维素酶，经55℃水浴1h，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min，分离除去上清液；

S5，糖化酶酶解：向步骤S4所得的固体中加入蒸馏水，直至pH值为4.50，按S4所得固体0.1％的质量比加入糖化酶，经60℃水浴1h，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min，分离除去上清液；

S6，碱溶解、再次酸沉：向步骤S5所得的固体，按料液比1:30加入2mol/LNaOH溶液，用超声辅助提取30min后，加入6mol/LHCl溶液，直至pH值为2.20，分离除去上清液，所得沉淀物即为黑色素粗提物，在60℃条件下烘干，4℃保存备用；

(2)黑色素的纯化

S1，有机溶剂洗涤：向步骤(1)所得黑色素粗提物中加入体积约为黑色素粗提物质量10倍的无水乙醇，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min，除去上清液，反复此步骤直至上清液无色后，分离除去上清液；

S2，二次碱溶解及酸沉：向步骤S1所得的固体中加入体积约为固体质量10倍的2mol/LNaOH溶液，充分混合，振荡30min后，再加入6mol/LHCl溶液直至pH值为2.20，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min，分离除去上清液，反复此操作直至上清液无色，分离除去上清液，所得沉淀物即为黑色素；

S3，洗涤及干燥：向步骤S3所得黑色素中加入蒸馏水，在离心机转速为8000r/min的条件下，离心5min后，分离除去上清液，反复此操作直至上清液无色，除去上清液，所得固体，即为纯化后的黑色素颗粒，在40℃条件下烘干，备用；

(3)薄膜的制备

S1，称取2g聚乳酸于烧杯中，再加入30mL三氯甲烷溶液，放在磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌1h；

S2，待溶液搅拌均匀后，准确称取0～4mg步骤(2)所得黑色素颗粒放入烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌7h；

S3，搅拌完成后，超声辅助提取10min，再以转速为8000r/min的条件下，离心5min；

S4，将溶液倒入20cm╳20cm的聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后即成膜。

为避免因三氯甲烷挥发造成实验误差，本案在整个搅拌过程中须用保鲜膜将烧杯封口。

以下结合附图及具体实施例对本发明做详细的说明。

实施例1：

称取2g聚乳酸于烧杯中，再加入30mL三氯甲烷溶液，然后，将烧杯放在磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，再将烧杯置于磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，再以转速为8000r/min的条件下，离心5min，最后，将溶液倒入20cm╳20cm的聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后得到PLA薄膜。

实施例2：

称取2g聚乳酸于烧杯中，再加入30mL三氯甲烷溶液，然后，将烧杯放在磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，准确称取0.5mg步骤(2)所得黑色素颗粒加入烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，再以转速为8000r/min的条件下，离心5min，最后，将溶液倒入20cm╳20cm的聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后得到黑色素/PLA_0.025％薄膜。

实施例3：

称取2g聚乳酸于烧杯中，再加入30mL三氯甲烷溶液，然后，将烧杯放在磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，准确称取1mg步骤(2)所得黑色素颗粒加入烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，再以转速为8000r/min的条件下，离心5min，最后，将溶液倒入20cm╳20cm的聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后得到黑色素/PLA_0.05％薄膜。

实施例4：

称取2g聚乳酸于烧杯中，再加入30mL三氯甲烷溶液，然后，将烧杯放在磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，准确称取2mg步骤(2)所得黑色素颗粒加入烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，再以转速为8000r/min的条件下，离心5min，最后，将溶液倒入20cm╳20cm的聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后得到黑色素/PLA_0.1％薄膜。

实施例5：

称取2g聚乳酸于烧杯中，再加入30mL三氯甲烷溶液，然后，将烧杯放在磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，准确称取4mg步骤(2)所得黑色素颗粒加入烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器上，在25℃，5000r/min条件下充分搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，再以转速为8000r/min的条件下，离心5min，最后，将溶液倒入20cm╳20cm的聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后得到黑色素/PLA_0.2％薄膜。

其中，实施例1为空白对照。

实验例1：

本实验例对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的膜表面进行观察。实验前将各薄膜放在50℃条件下，真空干燥12h，然后将薄膜剪成宽约2mm的细长方形条，用离子溅射仪在样品的表面上喷一层金或铂的薄层，随后将样品随后就可观察膜表面。

如图1所示，其中，a)PLA薄膜，b)黑色素/PLA_0.025％薄膜，c)黑色素/PLA_0.05％薄膜，d)、e)黑色素/PLA_0.1％薄膜，f)、g)黑色素/PLA_0.2％薄膜，由图可知PLA薄膜表面平整，黑色素含量为0.025％、0.05时％黑色素/PLA薄膜在形貌上没有太大改变，但当黑色素含量增加到0.1％、0.2％时，从图d)-g)可以看出黑色素形状大致为球形,且均匀分散在PLA基质中，说明黑色素与PLA之间形成了氢键，这一结果与红外结果一致。

实验例2：

本实验例对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜进行红外光谱实验。实验前将各薄膜剪成2cm╳2cm的正方形置于红外光谱仪内，并对样品的分子结构成分进行分析，通过红外光谱仪采集空气背景图谱后，分别测试各薄膜的红外光谱图，测试范围为400cm^-1～4000cm^-1。结果如图2所示，a)PLA薄膜，b)黑色素/PLA_0.025％薄膜，c)黑色素/PLA_0.05％薄膜，d)黑色素/PLA_0.1％薄膜，e)黑色素/PLA_0.2％薄膜。

从图中可以看出，纯PLA在大约3480cm^-1处有较弱的吸收峰归因于-OH的伸缩振动，说明有很少的-OH的存在，并且随着黑色素含量的增加，逐渐向低波数移动，说明二者之间有氢键的形成。3000cm^-1为PLA结构中—CH—的伸缩振动，1760cm^-1处为-C＝O伸缩振动，1460cm^-1、1380cm^-1处是-CH-弯曲振动，1200cm^-1、1100cm^-1附近是-C-O-伸缩振动，870cm^-1是-C-C-伸缩振动。对于黑色素/PLA薄膜来说，因为黑色素含有氨基，所以黑色素/PLA薄膜吸收峰在3500cm^-1～3400cm^-1附近不仅有-OH伸缩振动，还有-NH伸缩振动，3000cm^-1附近的吸收峰是因为-CH-的伸缩振动，-C＝O的伸缩振动出现在1750cm^-1附近，这是脂肪族的特征峰，随着黑色素的加入会减弱此处的吸收峰。在1450cm^-1、1370cm^-1左右的吸收峰是-CH-弯曲振动，1240cm^-1～1200cm^-1附近吸收峰为-C-O-吸收峰，875cm^-1附近则为-C-C-的吸收峰。所有黑色素/PLA薄膜的图谱与纯PLA薄膜基本一致。

实验例3：

本实验例对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的机械性能进行实验，以GB/T1040.3-2006为标准，用裁切刀将各薄膜裁剪成100*15mm的长方形样条，夹具间初始距离100mm，标距50mm，拉伸速度20mm/min，环境条件为温度(23±2)℃、相对湿度(50±5)％，测量各薄膜的拉伸强度和断裂伸长率，为了减少误差，每组测试3个平行样品，记录每次测试过程中试样的拉伸强度和断裂伸长率，结果取平均值；根据平均值分析受力变化程度；薄膜的厚度由螺旋千分尺测定，随机测定薄膜的中心位置和四个角方向上厚度，取其平均值，结果如表1所示。

表1为实施例1-5的PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的机械性能参数

从表1可以看出，黑色素的加入可以提高PLA的拉伸强度和弹性模量，其中对于拉伸强度来说，0.025％和0.5％的黑色素能在一定程度上提高PLA的拉伸强度(p＞0.05)，当含量达到0.1％和0.2％时可显著提高PLA的拉伸强度(p＜0.05)。同样随着黑色素的加入弹性模量也会增加，含量为0.025％的黑色素加入对弹性模量的影响不显著(p＞0.05)，当黑色素含量为0.05％、0.1％、0.2％时才有显著影响(p＜0.05)，而PLA薄膜的断裂伸长率会因为黑色素的加入而降低，与PLA薄膜相比，黑色素含量为0.025％、0.05％、0.1％时这种影响不显著(p＞0.05)，只有含量达到0.2％时这种影响才会显著(p＜0.05)。

实验例4：

本实验例对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的热性能进行DSC测试。称取5mg黑色素/PLA薄膜样品，封装于坩埚中在气体流速为50mL/min的氮气氛围下以10℃/min的速率从室温升至210℃，恒温5min消除热历史，再以相同的速率降至室温后二次升温210℃，记录二次升温时焓变随温度的变化情况，结果图表2所示。纯PLA薄膜和黑色素/PLA薄膜第二次加热扫描的热图，如图3所示，其中，a)PLA薄膜、b)黑色素/PLA_0.025％薄膜、c)黑色素/PLA_0.05％薄膜、d)黑色素/PLA_0.1％薄膜、e)黑色素/PLA_0.2％薄膜。材料的结晶度按如下公式计算：

结晶度XC(％)＝ΔH_m/ΔH_m0×100％

式中：ΔH_m为材料的熔融焓；ΔH_m0为聚乳酸100％结晶时的焓值93.6J/g

表2为实施例1-5的PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的热性能参数

从表2可以看出，PLA的玻璃转化温度(Tg)、结晶温度(Tc)、融融温度(Tm)的结晶度(％)的值，与纯PLA薄膜相比黑色素/PLA薄膜的Tg均有所下降，相反Tc和Tm均有所提高，说明黑色素的加入有提高聚乳酸薄膜结晶度的作用，其中0.2％山杏核壳黑色素DSC结晶度最高。

实验例5：

本实验例通过重量法对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的不透明度及水蒸气透过性能进行实验。实验利用无水氯化钙对水分进行吸附性，通过无水氯化钙质量增重来测定水蒸气透过系数(WVP)。首先，在内径为120mm的瓶内放入干燥无水氯化钙1g，用面积为113.04mm²薄膜封扣，再将其放入25℃干燥箱中，箱中放有饱和NaCl保证75％相对湿度，杯内放入的无水氯化钙保证0％湿度，每12h测量一次，每个容器都要测量通过薄膜吸收的水蒸气的量，结果以平均值±标准偏差表示，结果如表3所示。具体计算公式如下：

式中：Δm为t时间内质量的增加量，g；l为薄膜厚度，m；A为效面积，mm2；t为质量稳定后两次间隔时间，h；ΔP为杯内外水蒸气压差。注：25℃水的饱和蒸气压3170Pa

将试样剪成长方形，放入比色皿当中，做空白对照(什么不放)。在600nm处的测吸光度，每组测试3次取平均值，结果如表3所示。公式如下：

透光度＝A₆₀₀/d

式中：A₆₀₀为在600nm处的吸光度；d为膜的厚度mm。

表3为实施例1-5的PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜不透明度及水蒸气透过系数性能参数

从表3可以看出，纯PLA的WVP值达到1.34±0.05×10^-9g·m/h·pa·m²，加入黑色素后，当添加量为黑色素/PLA_0.025％薄膜的WVP值增加且与纯PLA薄膜存在显著性差异(p＜0.05)，当黑色素含量增加到0.05％时，黑色素/PLA_0.05％薄膜WVP值减小到1.63±0.05×10^{- 9}g·m/h·pa·m²，且与纯PLA之间无显著性差异(p＞0.05)。随着黑色素含量近一步增加，黑色素/PLA_0.1％、黑色素/PLA_0.2％薄膜的WVP值减小，均与纯PLA存在显著性差异(p＞0.05)。另外，各黑色素/PLA薄膜WVP值之间存在显著性差异(p＜0.05)，说明黑色素的加入对PLA膜的WVP值存在显著影响；随着黑色素的加入，薄膜不透明度降低，且随着黑色素含量的增加，导致不透明度进一步降低，说明黑色素的加入对PLA薄膜的不透明度存在显著影响，其中0.2％山杏核壳黑色素水蒸气透过性最小，不透明度最低。

实验例6：

本实验例对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜进行光谱测试。实验前，将薄膜剪成4cm╳2cm的长方形并置于酶标仪中，在200-800nm波长下对薄膜进行全波段扫描(光谱测试)。

紫外根据波长分为三个部分：UV-A(320～400nm)、UV-B(280～320nm)、UV-C(100～280nm)。波长越短对人伤害越大，但UV-C几乎可以被大气中的臭氧层阻隔，所以紫外防护主要分为UV-A和UV-B。如图4所示，薄膜约在250nm(UV-C)处出现一定透射强度，因为天然黑色素广泛存在于动植物和微生物中，能够有效抵抗紫外线，具备光保护特性，所以我们认为在UV-A和UV-B处的紫外辐射区域，黑色素对PLA薄膜起到一定防护作用。同时，薄膜的透射强度随着黑色素含量的增加而降低，在可见光区也能起到防护作用，说明黑色素的加入使PLA薄膜光阻隔性能得到改善，其中0.2％山杏核壳黑色素抗紫外效果最佳。

实验例7：

本实验对实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜的抗氧化性能进行测试。

(1)DPPH自由基清除试验

首先制备0.1mMDPPH溶液，准确称取3.9mgDPPH，用无水乙醇在棕色瓶中定容至100mL，摇匀置于室温下避光保存，需现配现用；然后制备薄膜提取液，分别称取500mg纯PLA和黑色素/PLA_0.025％、黑色素/PLA_0.05％、黑色素/PLA_0.1％、黑色素/PLA_0.2％薄膜溶于15mL无水乙醇溶液中并超声处理2h，8000r/min离心20min使其充分混合；最后将2mL薄膜提取液与2mLDPPH溶液混合置于室温下避光孵育1h，在517nm处测得吸光度重复测得三次，取平均值±标准差。通过公式计算抑制率：

I(％)＝[1-(A_sample/A_DPPH)]x100％

式中：I为抑制率；A_sample为含有膜提取液的DPPH溶液；A_DPPH为不含有膜提取液的DPPH溶液。

(2)H₂O₂自由基清除试验

首先制备0.1％H₂O₂储备液，准确量取0.333mLH₂O₂，用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液定容至100mL，需现配现用，然后制备薄膜提取液(步骤同上述)分别称取500mg纯PLA和黑色素/PLA_0.025％、黑色素/PLA_0.05％、黑色素/PLA_0.1％、黑色素/PLA_0.2％薄膜溶于15mL无水乙醇溶液中，超声处理2h，8000r/min离心20min。最后取1mL薄膜提取液与1mLH₂O₂、1mL邻二氮菲溶液、1mLFeSO₄混合置于室温下避光孵育30min，在230nm处测得吸光度(重复测得三次)。不含膜样品液的H₂O₂混合液为空白对照在230nm处测得吸光度(重复测得三次)。以不含膜样品溶液(1mL无水乙醇代替)的混合液溶液为空白对照。通过公式计算抑制率：

I(％)＝[1-(A_sample/A_DPPH)]x100％

式中：I为抑制率；A_sample为含有膜液的H₂O₂溶液混合物的吸光度；A_DPPH为不含有膜液的H₂O₂溶液混合物的吸光度。

如图5所示，其中，1-5分别为PLA、0.025％、0.05％、0.1％、0.2％黑色素/PLA薄膜，薄膜的自由基清除率与抗氧化程度呈正相关，经过DPPH自由基清除试验可知纯PLA薄膜与黑色素/PLA薄膜的DPPH自由基清除率分别为1.03％、12.43％、13.25％、15.43％、16.29％，纯PLA抗氧化性能几乎为0，黑色素/PLA薄膜，随黑色素含量的增加薄膜的抗氧化性能逐渐提高。在H₂O₂自由基清除试验中可知纯PLA薄膜与黑色素/PLA薄膜的DPPH自由基清除率分别为0.78％、4.2％、6.97％、8.83％、14.60％，同样地纯聚乳酸薄膜抗氧化性能几乎为零，黑色素/PLA薄膜，随黑色素含量的增加薄膜的抗氧化性能均有不同程度的提高。但与DPPH自由基清除率相比，对H₂O₂自由基清除率要弱一些。经过SPSS 25.0软件进行统计分析后，在DPPH和H₂O₂自由基清除试验中可以发现黑色素/PLA薄膜的抗氧化性能与纯PLA薄膜之间存在显著性(P＜0.05)。说明黑色素的加入能有效地改善PLA薄膜抗氧化性，其中0.2％山杏核壳黑色素抗氧化效果最佳。

实验例8：

本实验以圣女果为例，测试实施例1-5所得PLA薄膜、黑色素/PLA薄膜对圣女果的保鲜效果，同时增加一组对照组(CK)，该组的圣女果没有做任何防护措施。

A)感官评价

本试验采用10分制，由10名具有感官评价经验的评价员进行感官评分，具体评分细则见表4。

表4为圣女果感官评价标准

结果如图6所示，随着贮藏时间的延长，黑色素/PLA薄膜组、纯PLA组、CK组感官评分均逐渐下降。分值上黑色素/PLA薄膜组＞纯PLA组＞CK组，说明黑色素加入到PLA薄膜中可以在一定程度上维持圣女果新鲜程度，其中在贮藏整个期间黑色素/PLA_0.1％和黑色素/PLA_0.05％感官评分相对较高，说明这两浓度下的黑色素/PLA薄膜在贮藏圣女果中可以较好维持其新鲜度、色泽和口感等。

B)失重

果蔬中含有大量的水分，对于维持其外观、品质具有重要意义。水分的散失是造成果蔬重量减少的最重要原因之一，也直接影响到了果蔬质地、营养成分。本试验用重量法进行测定，其计算公式为：

失重率(％)＝(贮藏前质量-贮藏后质量)/贮藏后质量

结果如图7所示，圣女果的失重率随着贮藏时间的延长而增加，所有薄膜组失重率＜CK组，说明在贮藏过程中，圣女果的蒸腾作用和呼吸作用会造成水分散失使果实重量下降，而薄膜包装在一定程度上能有效抑制重量的下降，达到保鲜作用。CK组的圣女果由于没有任何防护措施，其自由水损失较为严重，仅在第7天CK组失重率就已达到22.2％。在贮藏21d后，薄膜组PLA、黑色素/PLA_0.025％、黑色素/PLA _0.05％、黑色素/PLA_0.1％、黑色素/PLA_0.2％失重率分别为8.40％、7.68％、8.25％、7.57％、7.93％。在相同贮存环境条件下，黑色素/PLA_0.1％薄膜失重率最低，相比其它浓度黑色素薄膜黑色素/PLA_0.1％薄膜更能保持圣女果中的水分不流失。

C)腐烂指数

腐烂率作为果蔬感官评价的重要指标之一，反映了果蔬在贮藏过程中的腐烂程度。本试验以果实表面出现水渍状病斑作为果实腐烂的判别依据，按果实腐烂面积，分为6级:0级，无腐烂；1级，果实腐烂面积小于25％；2级，腐烂面占果实面积的25％-50％；3级，腐烂面积大于果实面积的50％-75％；4级，腐烂面积大于75％；5级，完全腐烂；按下式计算腐烂指数：

如图8所示，在0-3dCK组与所有薄膜组均无出现腐烂现象，在第7d时CK组、纯PLA组和黑色素/PLA_0.025％薄膜分别出现10％、5％、5％的腐烂现象，其余各组均无腐烂现象。在贮藏后期第21d时，CK组腐烂率达23％，纯PLA组腐烂率为15％，各黑色素/PLA组腐烂率除了黑色素/PLA_0.1％腐烂率为5％以外，其余各组均在10％，说明0.1％黑色素的添加能够使薄膜更好的维持圣女果新鲜度，降低腐烂率。

D)硬度

本试验采用GY-3对果实硬度进行测定，结果如图9所示，CK组与所有薄膜组的硬度均随贮藏时间增加而降低。说明在贮藏期间，由于圣女果水分的流失直接导致其硬度下降，贮藏前圣女果的硬度为4.13kg/cm²，在贮藏21d后，CK组的硬度为1.00kg/cm²，纯PLA组的硬度为1.50kg/cm²，各黑色素/PLA组除了黑色素/PLA_0.1％的硬度为2.1kg/cm²，其余各组均低于2.00kg/cm²，说明0.1％黑色素的添加能够使薄膜更好的维持圣女果新鲜度，降低软化程度。

E)可溶性固形物(TSS)测定

本试验称取适量圣女果切碎，研磨并过滤得汁液，然后用阿贝折射仪进行试验，结果如图10所示，CK组与所有薄膜组TSS在贮藏期间变化趋势都是在贮藏初期骤然下降，在3d-14d出现小幅度增加,后期又呈现下降的趋势。贮藏前期下降，是因为圣女果为维持自身生理活性，要不断消耗可溶性糖这种营养物质来提供自身生理活性；贮藏中期小幅上升，是因为圣女果属于呼吸跃变型果蔬，在后熟过程中会不断有营养物质的转化和糖类的积累，使得可溶性固形物呈现上升趋势；贮藏后期下降，是因为维持自身呼吸消耗的营养物质会远大于自身所积累的营养物质，所以可溶性固形物又呈现小幅下降趋势。所有薄膜组TSS均高于纯PLA组，高于CK组，且变化趋势缓慢，其中黑色素/PLA_0.1％在贮藏期间一直保持较高水平，说明0.1％黑色素的添加可以较好维持圣女果TSS，降低营养物质消耗。

F)可滴定酸含量(TA)的测定

TA是构成果蔬风味品质的重要成分之一，圣女果在采摘后营养物质已不再从植物中获得，所以在贮藏过程中必须消耗自身营养物质维持其生理活性。本试验将1g圣女果切碎，用蒸馏水定容至20mL，过滤后，在滤液中滴入1～2滴酚酞指示剂，用0.1mol/LNaOH滴至微红色，30s内不褪色，记录消耗NaOH体积(V)，计算方式如下：

式中：C是标准滴定的浓度，mol/L；V是标定时所消耗NaOH标准溶液的体积，mL；K是主要酸的换算系数，即1mmolNaOH相当于主要酸的克数(本试验采用苹果酸为换算系数)；M为样品重量。

圣女果中的有机酸一部分转化为糖类，另一部分用于呼吸消耗，所以TA在贮藏过程中的变化趋势如图11所示，呈现整体下降趋势。在贮藏21d后，TA含量为黑色素/PLA_0.1％＞黑色素/PLA_0.05％＞黑色素/PLA_0.025％＞纯PLA组＞黑色素/PLA_0.2％＞CK组，其中黑色素/PLA_0.1％在整个贮藏过程中变化趋势缓慢，说明0.1％黑色素的添加较其他组保鲜效果更好。

G)维生素c含量的测定

圣女果中含有丰富的维生素，而维生素又是衡量果蔬营养价值的重要指标。本试验称取5g圣女果,加入50mL2％草酸溶液，将圣女果研磨成匀浆，过滤得滤液，滤饼可用少量2％草酸溶液洗几次，合并滤液，记录滤液体积后，准确吸取4mL0.1mg/mL滤液于锥形瓶中，加入16mL1％草酸溶液，用2,6-二氯酚靛滴定至淡红色(15内不褪色即为终点)，记录所用染料溶液的体积，并计算出1mL染料溶液所能氧化抗坏血酸的量。准确吸取样品提取液，滴定方法同2中操作，另取20mL草酸作空白对照。代入下式计算100g样品中还原型抗坏血酸的含量：

式中：V₁为滴定样品所耗用染料的体积，mL；V₂为滴定空白所耗用染料的体积，mL；V为样品提取液总体积；V₃为滴定所取样品的体积；m₁为1mL染料所能氧化的抗坏血酸的量，mg；m₂为测量样品的重量，g。

果蔬中维生素随着时间的延长和Vc本身稳定的特性，发生氧化分解，结果如图12所示，CK组与所有薄膜组在贮藏期间均呈现逐渐下降的趋势，在贮藏21d后，Vc的含量为各黑色素/PLA组＞纯PLA组＞CK组，其中黑色素/PLA_0.1％在整个贮藏过程中都保持较高含量，说明0.1％黑色素的添加较其他组保鲜效果更好。

H)POD酶活性测定

POD酶是一种在果蔬遭受到迫害时，对果蔬进行保护的一种酶促防御系统之一。

(1)酶提液的制备：称取3g圣女果于研钵中，并加入3mL提取液(1mMPEG、4％PVPP和1％Triton X-100)充分冰浴研磨成浆，于4℃、1200r/min离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

(2)酶活力测定：在试管中加入3mL25mmol愈创木酚溶液和0.5mL酶提液，最后加入200μL0.5mol/LH₂O₂迅速混合后酶反应体系迅速开启，同时立即开始计时。将反应液倒入比色皿中，置于分光光度计中，以15s时开始记录反应体系以OD470值为初始值，然后每隔60s记录一次，至少记录6个OD470值，重复三次。

(3)数据处理：以每克鲜重每60s吸光度值增加0.01为1个POD酶活性单位，计算公式如下：

式中：ΔOD₄₇₀为反应混合液吸光度变化值；Δt为酶促反应时间；m为样品质量，g；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL。

结果如图13所示，酶整体变化趋势为先上升再下降，最后又上升的趋势。这是因为在0-3d时，圣女果在离开植物母体后，因受到周围环境的胁迫，于是POD活性便增强以达到对果蔬机体的保护，其中黑色素/PLA_0.1％、黑色素/PLA_0.2％活性较其他组来说活性更高，在7-14d期间由于果蔬逐渐开始衰老，酶活性便开始降低，但相较于CK组与其他薄膜处理组来说黑色素/PLA_0.1％仍处于较高活性，在贮藏末期14-21d果蔬不仅衰老再加上POD催化H₂O₂产生的过氧化物会对细胞薄膜产生损伤，因此在后期又会出现POD活性增强的趋势，但此时黑色素/PLA_0.1％酶活性最低，说明这一组圣女果细胞质膜损伤较小。

I)PPO酶活性测定

PPO的活性在一定程度上反映了果实贮藏过程中的衰老程度。

(1)酶提液的制备：称取3g圣女果于研钵中，加入3mL提取液(1mMPEG、4％PVPP和1％Triton X-100)充分冰浴研磨成浆，于4℃、1200r/min离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

(2)酶活力测定：在试管中依次加入4.0mL50mmol的醋酸缓冲溶液、1mL50mmol邻苯二酚溶液、100μL酶提取液，迅速混合后酶反应体系迅速开启，同时立即开始计时。将反应液倒入比色皿中，置于分光光度计中，以15s时开始记录反应体系以OD420值为初始值，然后每隔60s记录一次，至少记录6个OD470值，重复三次。

(3)数据处理：以每克鲜重每60s吸光度值增加0.01为1个POD酶活性单位，计算公式如下：

式中：ΔOD₄₂₀为反应混合液吸光度变化值；Δt为酶促反应时间；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。

结果如图14所示，PPO在贮藏期间经不同组处理后整体呈现上升趋势，在0-7d贮藏期间PPO相对上升缓慢，因为在前期圣女果相对来说还处于新鲜阶段，所以圣女果果肉保持相对较低的PPO活性，随着时间的延长圣女果逐渐开始衰老PPO活性开始迅速上升。在整个贮藏期间相较于其他组来说CK组PPO一直处于较高活性，黑色素/PLA_0.1％酶活性最低并一直保持较缓慢上升趋势，说明此包装可以保持新鲜状态。

J)丙二醛(MDA)含量的测定

丙二醛(MDA)作为脂质过氧化的主要产物之一，通常可以通过测量MDA的含量，来反映细胞损伤程度。

(1)提取液的制备：称取1.0g圣女果样品，加入5mL10％三氯乙酸，研磨成匀浆，在4℃10000r/min离心20min，收集上清液，低温保存备用。

(2)MDA含量的测定：在试管中加入2mL上清液和0.67％硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中加热20min，冷却后再离心一次，然后在450nm、532nm和600nm处分别测定上清液的吸光度值。重复三次。

(3)数据处理：根据吸光度值，计算出每克圣女果中MDA含量，以μmol/g表示。计算公式如下：

式中：C为反应混合液中MDA含量，μmol/L；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。

结果如图15所示，MDA经不同组处理后在整个贮藏期间一直处于上升趋势，在前7d期间，CK组上升最为明显，但几组MDA含量差异不大。在7d后，各处理组MDA含量仍然不断上升，这是因为随着果实不断进行呼吸作用，活性氧自由基不断增加，造成果实内部活性氧的不断积累，促使果实内部发生脂质过氧化反应，从而MDA含量不断增加。在整个贮藏期间相较于其他组来说CK组MDA的含量一直领先，黑色素/PLA_0.1％MDA含量最低并一直保持较缓慢上升趋势，说明这一组圣女果细胞损伤较小。

从上述实验例1-7可以看出，山杏核壳黑色素的添加量不同其表面形貌和结构都有些许不同，再从性能来看，虽然0.2％山杏核壳黑色素DSC结晶度最高，水蒸气透过性最小，不透明度最低，抗紫外和抗氧化效果最佳，但其机械性能中断裂伸长率却明显下降，所以综合来看我们认为0.1％山杏核壳黑色素的添加量可以使PLA薄膜性能效果最佳。为此本案开展实验例8进一步验证，发现确实山杏核壳黑色素添加量为0.1％的PLA薄膜可以更好的维持圣女果良好的营养品质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本案设计的限制，凡依本案的设计关键所做的等同变化，均落入本案的保护范围。

Claims (10)

1.一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)黑色素的提取

用自来水将山杏核壳洗净，待干燥后，粉碎成粉末备用；称取适量粉末，按料液比1:20加入NaOH溶液，静置，离心收集上清液，即黑色素粗提液；然后，向黑色素粗提液中加入HCl溶液，离心除去上清液，所得沉淀物为黑色素粗提物；向黑色素粗提物中加入蒸馏水调节pH为5.00，按黑色素粗提物0.1％的质量比加入纤维素酶，水浴加热1h后，离心除去上清液；再向固体中加入蒸馏水调节pH为4.50，按固体0.1％的质量比加入糖化酶，水浴加热1h后，离心除去上清液；最后，按料液比1:30加入NaOH溶液，超声辅助提取30min后，加入HCl溶液，分离除去上清液，所得沉淀物为黑色素粗提物；

(2)黑色素的纯化

向步骤(1)所得黑色素粗提物中加入无水乙醇，经离心除去上清液，反复此步骤直至上清液无色后，除去上清液；然后，加入NaOH溶液，振荡30min，再加入HCl溶液，经离心除去上清液，反复此操作直至上清液无色，除去上清液；最后加入蒸馏水，离心除去上清液，反复此操作直至上清液无色，所得固体即黑色素；

(3)薄膜的制备

称取2g聚乳酸于烧杯中，加入30mL三氯甲烷溶液，放在磁力搅拌器上搅拌1h，待溶液搅拌均匀后，加入步骤(2)所得黑色素于烧杯中，再将烧杯置于磁力搅拌器搅拌7h，搅拌完成后，超声辅助提取10min，离心5min，将溶液倒入聚四氟乙烯板中，在通风处常温下干燥12h，撕下后即成膜。

2.如权利要求1所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中无水乙醇和NaOH溶液的添加量约为黑色素粗提物质量的10倍；

所述步骤(3)中溶液在25℃，5000r/min条件下充分搅拌，且搅拌过程中须将烧杯用保鲜膜封口；

所述HCL溶液调节黑色素粗提物pH至2.20。

3.如权利要求1所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述薄膜的制备过程中黑色素颗粒的添加量为：0～4mg。

4.如权利要求3所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述薄膜的制备过程中准确称取0mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为纯PLA。

5.如权利要求3所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述薄膜的制备过程中准确称取0.5mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.025％。

6.如权利要求3所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述薄膜的制备过程中准确称取1mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.05％。

7.如权利要求3所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述薄膜的制备过程中准确称取2mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.1％。

8.如权利要求3所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜的制备方法，其特征在于，所述薄膜的制备过程中准确称取4mg黑色素颗粒加入烧杯中，并标记为黑色素/PLA_0.2％。

9.一种黑色素/聚乳酸薄膜，其特征在于，通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。

10.一种黑色素/聚乳酸薄膜的应用，其特征在于，将权利要求8所述的一种黑色素/聚乳酸薄膜用于果蔬保鲜贮藏。

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