CN109320993A

CN109320993A - 一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法

Info

Publication number: CN109320993A
Application number: CN201811220850.7A
Authority: CN
Inventors: 高莉; 杨柳; 赵英虎; 王芳; 史楠; 王海宾; 郭建峰; 任燕玲; 王林变; 郭丽晓
Original assignee: North University of China
Current assignee: North University of China
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109320993B

Abstract

本发明涉及一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法，是将从山杏核壳中提取的黑色素纯品溶于NaOH溶液中，在超声处理过程中调节pH值至5.0～7.0，并超声处理30～120min后，再以超声波细胞破碎机破碎2～10min，调节pH值至1.0～3.5，酸沉降得到黑色素纳米颗粒MNPs。进而将MNPs溶于NaOH溶液中，调节pH值为9，加入mPEG₂₀₀₀‑NH₂，于MWCO 2000D透析袋中透析得到水溶性黑色素纳米颗粒PEG‑MNPs。以本发明方法制备的天然黑色素纳米颗粒粒径均一，具有良好的水溶性和分散稳定性。

Description

一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料制备技术领域，涉及一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法。本发明所述黑色素来源于农副产品综合利用产业中的杏仁加工废弃物山杏核壳。

背景技术

黑色素是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称。研究表明，黑色素具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗蛇毒素、保肝、防电离辐射、抗紫外、免疫调节、螯合重金属等生物活性。此外，黑色素可以作为新型天然药物载体，用来治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病，还可作为典型的生物标志物，用于黑色素瘤和帕金森病的检测与成像。

黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氧化进行化学合成，也可以从动物和微生物中提取。但是黑色素在植物界的分布更为广泛，安全性更高，应用范围更广。研究表明，植物黑色素具有光热稳定性和安全无毒等优良性质，且富含人体必需的营养物质和对人体有益的微量元素如Fe、Cu、Mn等。因此，黑色素不仅是一种营养素，也可作为纳米载体应用于食品、生物医学等领域。

黑色素是一种生物大分子多聚体，平均粒度高达微米级别，不溶于水及常见的有机溶剂，仅溶于碱性水溶液中，在酸性溶液中沉淀。这些特殊性质在很大程度上限制了黑色素在食品添加剂、染色剂及医药领域的应用。

黑色素纳米颗粒(melanin nanoparticles，MNPs)是纳米级别的黑色素颗粒。然而，尚未见到直接利用生物大分子物质——黑色素制备MNPs的报道。

目前，仅有少数研究者通过模拟黑色素形成过程来合成MNPs。即在碱性条件下，通过化学氧化多巴胺或多巴胺盐酸盐，氧化自组装聚合形成球形MNPs。以化学方法合成的MNPs尺寸可控、粒径分布均一，在水和生物介质中具有良好的分散性。但是，化学合成物的生物安全性及可降解性始终受到人们的质疑。

随着纳米技术的发展，利用纳米材料的优势，将天然黑色素纳米化，是改善其相关生物活性及扩展黑色素应用范围的一个很好突破。

纳米技术是以小结构或小尺寸材料为研究对象的一种技术，当材料尺寸达到纳米量级时，表现出小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，从而使纳米粒子出现了许多新的特性和活性。研究证明，食品和营养素经纳米化后，能表现出更高的生物活性，甚至显现出常态物质没有的活性。

纳米颗粒的制备方法大致分为两种，即“自上而下”法和“自下而上”法。

“自上而下”法包括球磨或研磨法、高压均质法等。研磨可以使物质形成几十到几百纳米直径的粒子，但是制备的纳米粒子具有相对宽的粒子尺寸分布、形态以及几何形状的多种变化，并可能会包含许多研磨介质带来的杂质或其本身所导致的缺陷，所以，尽管该方法可以制备出尺寸较小的纳米粒子，但很难控制其形成预期的粒子大小及形貌。

“自下而上”法是更为普遍的纳米粒子合成途径，其又分为热力学平衡法和动力学方法。热力学平衡法中，纳米粒子的形成过程是先形成过饱和状态，析出粒子并成核，随后晶核进行后续生长。但是其溶液很难快速均匀混合，造成过饱和不均一，使大多数情况下得到的产品团聚严重，粒径一般都在lμm以上，且粒度分布不均。而动力学方法则可以通过限制用于生长的前驱物数量来形成需要的纳米粒子。

在动力学方法中，超声降解显示了巨大优势，非常适用于生物大分子物质的降解。利用超声波空化作用产生的瞬时高温高压和剪切力效应，作用于三维高度聚合结构或重复序列单元，可以迅速打破高分子的聚合状态，不仅反应速率高，反应可控性好，而且对物质的结构破坏小，不影响其生物活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种粒径均一，具有良好水溶性和分散稳定性的天然黑色素纳米颗粒的制备方法。

以下给出了本发明所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法。

1）、以干燥的山杏核壳粉末为原料，置于NaOH溶液中进行超声提取，除去不溶物得到黑色素粗提液。

其中，所述山杏核壳粉末与NaOH的质量比为1∶0.4～2。

进一步地，本发明将山杏核壳粉末在所述NaOH溶液中超声提取10～90min。

更进一步地，本发明优选采用60Hz、50～200W的超声波清洗装置进行超声提取。

2）、调节黑色素粗提液的pH值至1.0～3.5，进行酸沉降并收集沉淀物。

更优选地，本发明调节黑色素粗提液的pH值至1.5～2.0。

3）、将沉淀物用水稀释，调节pH值至4.5～5.0，加入纤维素酶进行酶解后，再次收集沉淀物。

其中，所述纤维素酶用量为沉淀物质量的0.05～0.4%。

更优选地，所述纤维素酶用量为沉淀物质量的0.1～0.3%。

所述酶解反应在50～55℃下水浴中进行，反应时间0.5～2.5h。

4）、再将沉淀物用水稀释，调节pH值至4.5～5.0，加入糖化酶进行酶解后，收集沉淀物。

其中，所述糖化酶用量为沉淀物质量的0.05～0.4%。

更优选地，所述糖化酶用量为沉淀物质量的0.2～0.3%。

所述酶解反应在55～60℃下水浴中进行，反应时间0.5～2.5h。

5）、将两种酶处理后的沉淀物用NaOH溶液溶解后，再次调节pH值至1.5～2.0进行酸沉降，收集沉淀物，得到黑色素粗提物。

进一步地，在所述NaOH溶液中加入沉淀物后，辅助以超声处理进行溶解，超声处理时间10～30min。

6）、将上述制备的黑色素粗提物加入HCl溶液中，加热至90～100℃进行酸解，收集沉淀物，以无水乙醇进行洗涤。

其中，优选使用浓度为2～8mol/L的HCl溶液对所述黑色素粗提物进行酸解。

进一步地，所述酸解时间为0.5～2.5h。

本发明将酸解后收集的沉淀物以无水乙醇进行反复洗涤，洗涤次数不少于6次，直至洗涤上清液清亮。

7）、将无水乙醇洗涤后的沉淀物以NaOH溶液溶解，调节pH值至1.5～2.0，酸沉降并收集沉淀物，重复进行碱溶和酸沉降，将得到的黑色素固形物以蒸馏水洗涤，得到黑色素纯品。

本发明所述碱溶和酸沉降的过程重复不少于6次，直至酸沉降后的上清液清亮。

8）、取黑色素纯品溶于NaOH溶液中，配制成10～200μg/mL的黑色素溶液，在200W、60Hz超声波处理条件下调节溶液的pH值至5.0～7.0，并超声处理30～120min后，再以超声波细胞破碎机破碎2～10min，调节溶液pH值至1.0～3.5，酸沉降并收集固体，制备得到黑色素纳米颗粒MNPs。

其中，所述NaOH溶液的浓度为0.05～1mol/L，优选为0.1mol/L。

进一步地，使用超声波细胞破碎机进行破碎时，超声波探头工作1s、停2s。

本发明上述方法中，优选采用离心分离的方式收集所述沉淀物或固体。所述离心转速为3000～11000r/min。

采用本发明上述方法能够制备得到粒径大小均一的MNPs，但是所制备MNPs的水溶性仍然较差。因此，本发明利用聚乙二醇修饰剂mPEG₂₀₀₀-NH₂对MNPs进行修饰，获得了水溶性良好的黑色素纳米颗粒PEG-MNPs。

具体地，是将MNPs溶于NaOH溶液中，配制成100～600μg/mL的黑色素纳米颗粒溶液，调节pH值为9，以MNPs与修饰剂的质量比为1∶0.5～3加入mPEG₂₀₀₀-NH₂，搅拌均匀，于MWCO2000D透析袋中透析48～60h，得到水溶性黑色素纳米颗粒PEG-MNPs。

本发明上述方法中所制备得到的黑色素，包括黑色素粗提物、黑色素纯品、MNPs和PEG-MNPs，均在-40～-45℃、5～13Pa条件下真空冷冻干燥后，4℃保存。

采用本发明方法，制备得到了粒径范围在10～250nm的天然MNPs，很大程度的降低了天然黑色素颗粒的粒径，进而采用聚乙二醇修饰剂对天然黑色素纳米颗粒进行修饰，成功获得了水溶性、分散稳定性良好的PEG-MNPs。

本发明利用黑色素仅溶于碱性溶液，在超声降解过程中加入盐酸溶液，加速了共价键和氢键的断裂，加剧了降解的发生；在调节pH值的过程中逐渐改变黑色素的溶解度，促进黑色素以颗粒析出，不停搅拌震荡使其降解，再以超声波细胞破碎达到进一步降解的目的，最终获得了颗粒大小均一、更小尺寸的天然黑色素纳米颗粒。

天然黑色素来源广泛，生物安全性较高且具有治疗功效，开发安全无毒的天然黑色素纳米颗粒具有很高的应用价值。本发明利用超声降解法结合黑色素在不同pH条件下溶解度的不同，将黑色素这一功能性物质制备成纳米颗粒，获得了纳米颗粒应有的特性(表面效应、体积效应和尺寸效应)，拓展了黑色素的应用范围。

附图说明

图1是山杏核壳黑色素纯品的紫外-可见光光谱图。

图2是山杏核壳黑色素纯品的红外光谱图。

图3是山杏核壳黑色素纯品的¹H NMR谱图。

图4是山杏核壳黑色素纯品的SEM谱图。

图5是实施例3制备MNPs的粒径分布图。

图6是实施例3制备MNPs的TEM谱图。

图7是实施例3制备MNPs的紫外-可见光光谱图。

图8是实施例3制备MNPs的红外光谱图。

图9是实施例3制备MNPs的¹H NMR谱图。

图10是比较例1制备MNPs的粒径分布图。

图11是实施例4制备MNPs的粒径分布图。

图12是实施例5制备PEG-MNPs的红外光谱图。

图13是实施例5制备PEG-MNPs的TEM谱图。

图14是MNPs与PEG-MNPs的溶解性比较图。

具体实施方式

下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1。

将山杏核壳用蒸馏水洗净，置于70℃鼓风烘干箱中烘干2天。以搅碎机将山杏核壳搅碎，过20目筛，得到山杏核壳粉末，保存在室温干燥条件下。

称取1g干燥的山杏核壳粉末，加入20mL的2mol/L NaOH溶液中，以60Hz、200W的超声波辅助提取60min，使用循环水真空泵抽滤除去不溶物，收集滤液得到黑色素粗提液。

以7mol/L盐酸溶液调节黑色素粗提液的pH值至1.5～2.0，11000r/min离心除去上清液，收集沉淀物。

将沉淀物用蒸馏水稀释，调节pH值至4.5～5.0，按质量比0.2%加入纤维素酶，置于50～55℃水浴中酶解反应60min。酶解产物离心收集沉淀物。

再次将沉淀物用蒸馏水稀释，调节pH值至4.5～5.0，按质量比0.3%加入糖化酶，置于55～60℃水浴中酶解反应120min。酶解产物离心收集沉淀物。

将两种酶处理后的沉淀物加入2mol/L NaOH溶液中，超声辅助溶解10min，以HCl溶液调节pH值至1.5～2.0，11000r/min离心收集沉淀物。

将沉淀物用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13Pa条件下真空冷冻干燥，得到黑色素粗提物，4℃下保存。

取黑色素粗提物，按照质量体积比1∶30加入6mol/L HCl溶液中，加热至100℃酸解120min，11000r/min离心，收集沉淀物。以无水乙醇洗涤沉淀物，重复洗涤8次，每次使用无水乙醇体积为沉淀物质量的20倍，至上清液为清亮色，11000r/min离心去除上清液，收集沉淀物。

洗涤后的沉淀物溶于2mol/L NaOH溶液中，HCl溶液调节pH值至1.5～2.0，11000r/min离心除去上清液，收集沉淀物。重复上述碱溶和酸沉降步骤6次，至上清液为清亮色。最后将沉淀物用蒸馏水重复洗涤7次，11000r/min离心去除上清液，收集沉淀物，用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13Pa条件下真空冷冻干燥后，得到黑色素纯品，4℃下保存。

图1的紫外光谱图结果表明，山杏核壳黑色素在紫外区域没有明显的吸收峰，随着波长的增加，其光密度逐渐下降，这与其他研究结果一致。在260～280nm处观察到一个小肩峰的特征吸收峰，其类似于合成黑色素，并且表明存在苯酚基团。由吸光度对波长的对数图表显示出一条负斜率在-0.0015至-0.0030之间的线性曲线(-0.00186)，符合典型的黑色素特征。

图2给出了山杏核壳黑色素纯品的红外光谱图，图中3300～3500cm^-1处的平峰主要是由OH和NH₂基团震动引起的，结合黑色素的溶解性，此处可能更多是OH基团震动；在2900cm^-1处有一个小的尖峰，可能是因为脂肪族基团CH₂和CH₃的震动所导致；1600～1650cm^-1之间的尖峰可能是因为C=O(羧基上的)、C=C(芳环上的)基团震动导致的，1500～1550cm^-1之间的尖峰则可能是因为NH基团震动导致；在1450cm^-1处有一尖峰，可能是因为CH₂CH₃基团震动所导致。上述红外结果表明，所提取黑色素主要由酚羟基、羧基、甲基和胺基组成。

图3的¹H MNR结果进一步表明，黑色素是芳香族聚合物。6.5-7.6ppm范围内的宽峰可能归属为芳环氢或芳杂环氢的吸收峰(如吲哚或吡咯环)，说明各种芳氢所处的化学环境差别较大，并表明黑色素是大分子物质；4-5ppm区域内无吸收峰，表明分子中存在>C=CH₂结构；3.7ppm的峰可归因于吲哚或吡咯环上第一位点结合的甲基(N-CH₃)或在环上结合的-OCH₃；2.5ppm的信号属于亚甲基或酯基(-OCOCH₃)，表明有羧酸盐结构存在。在¹H MNR光谱的脂肪族区域中，0.8-1.0ppm范围内的微弱信号可能是由于烷基片段的CH₃基团，例如可能来自残留蛋白质的CH₂CH₃、CH(CH₃)₂。

通过图4的SEM结果可以看出，山杏核壳黑色素纯品是一种表面光滑且规则的高分子聚合物，粒径跨度较大，以微米级别存在，粒度范围1～5μm。

实施例2。

称取1g干燥的山杏核壳粉末，加入15mL的3mol/L NaOH溶液中，以60Hz、200W的超声波辅助提取90min，使用循环水真空泵抽滤除去不溶物，收集滤液得到黑色素粗提液。

以5mol/L盐酸溶液调节黑色素粗提液的pH值至1.0～1.5，9000r/min离心，除去上清液收集沉淀物。

将沉淀物用蒸馏水稀释，调节pH值至4.5～5.0，按质量比0.4%加入纤维素酶，置于50～55℃水浴中酶解反应90min。酶解产物离心收集沉淀物。

再次将沉淀物用蒸馏水稀释，调节pH值至4.5～5.0，按质量比0.4%加入糖化酶，置于55～60℃水浴中酶解反应150min。酶解产物离心收集沉淀物。

将两种酶处理后的沉淀物加入2mol/L NaOH溶液中，超声辅助溶解15min，以HCl溶液调节pH值至1.5～2.0，11000r/min离心收集沉淀物。

取黑色素粗提物，按照质量体积比1∶50加入4mol/L HCl溶液中，加热至98℃酸解90min，11000r/min离心，收集沉淀物。以无水乙醇洗涤沉淀物，重复洗涤10次，每次使用无水乙醇体积为沉淀物质量的30倍，至上清液为清亮色，11000r/min离心去除上清液，收集沉淀物。

洗涤后的沉淀物溶于2mol/L NaOH溶液中，HCl溶液调节pH值至1.5～2.0，11000r/min离心除去上清液，收集沉淀物。重复上述碱溶和酸沉降步骤8次，至上清液为清亮色。最后将沉淀物用蒸馏水重复洗涤6次，11000r/min离心去除上清液，收集沉淀物，用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13Pa条件下真空冷冻干燥后，得到黑色素纯品，4℃下保存。

实施例3。

取实施例1或2制备的黑色素纯品，溶于0.1mol/L NaOH溶液中，配制成25μg/mL的黑色素溶液。

以1mol/L HCl调节溶液的pH值至7.0，以200W、60Hz的超声波超声处理30min，期间不间断进行搅拌；随后，再用功率200W的超声波细胞破碎机破碎10min，破碎过程中超声1s、停2s。

用7mol/L HCl调节溶液的pH值至1.5～2.0，11000r/min离心除去上清液，收集固体物，用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13Pa条件下真空冷冻干燥后，得到天然黑色素纳米颗粒MNPs，4℃下保存。

图5、图6分别给出了所制备MNPs的粒径分布图以及TEM图。可以看出，MNPs的粒径范围为10±5nm，且具有良好的分散稳定性。

将MNPs的紫外-可见光光谱图(图7)与山杏核壳黑色素纯品进行比较，可以看出两个光谱大致相同。然而，MNPs的谱图中，270～280nm处较弱的肩峰出现位移，这可能是由于MNPs尺寸较小引起的。

而图8的MNPs红外光谱图表明， MNPs与山杏核壳黑色素纯品具有相似的特征吸收峰，两者的红外光谱图特征峰基本一致，在3400cm^-1附近存在由O-H、吲哚的N-H伸缩震动(3450cm^-1)产生的较强的共振吸收峰，1650～1600cm^-1处有芳香C=C伸展和COO伸展产生的较强吸收，1400～1380cm^-1处可见酚醛COH弯曲和吲哚与酚醛NH伸缩振动。总之，红外结果表明提取的黑色素主要由酚羟基、羧基、甲基和胺基组成，制备的MNPs并未改变山杏核壳黑色素的原有功能性官能团。

将MNPs的¹H MNR谱图(图9)与山杏核壳黑色素纯品进行比较，可以看出6.5-7.0ppm的宽峰消失，表明MNPs已被超声降解为小分子物质。

比较例1。

以1mol/L HCl调节溶液的pH值至7.0，以200W、60Hz的超声波超声处理90min，期间不间断进行搅拌。

图10给出了所制备MNPs的粒径分布图。可以看出，与实施例3比较，只采用一种方式处理，虽然超声波超声处理时间延长，但由于并未进一步进行细胞破碎处理，所以得到的MNPs粒径范围增加很多，在50～250nm之间，较多的集中在100～150nm之间。

实施例4。

取实施例1或2制备的黑色素纯品，溶于1mol/L NaOH溶液中，配制成100μg/mL的黑色素溶液。

以1mol/L HCl调节溶液的pH值至7.0，以200W、60Hz的超声波超声处理10min，期间不间断进行搅拌；随后，再用功率200W的超声波细胞破碎机破碎5min，破碎过程中超声1s、停2s。

图11给出了所制备MNPs的粒径分布图。本实施例MNPs的粒径范围在50～150nm之间，较多的集中在80～120nm之间。

实施例5。

将实施例3制备的MNPs溶于0.5mol/L NaOH溶液中，配制成250μg/mL的黑色素纳米颗粒溶液。以1mol/L HCl调节溶液的pH值至9，按照MNPs与修饰剂PEG的质量比为1∶2加入mPEG₂₀₀₀-NH₂，磁力搅拌12h后，将溶液移至MWCO 2000D的透析袋中，透析48h以去除未反应的mPEG₂₀₀₀-NH₂。用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13Pa条件下真空冷冻干燥后，制备得到水溶性黑色素纳米颗粒PEG-MNPs，4℃下保存。

图12的PEG-MNPs红外光谱图中，出现了属于mPEG-MNPs的特征峰2880cm^-1(烷基C-H伸缩)和1110cm^-1(C-O-C)，表明mPEG₂₀₀₀-NH₂已经成功修饰了天然MNPs。

从图13的TEM结果可以看出，修饰后的PEG-MNPs粒径约为15nm，且分散稳定性良好。

图14给出了MNPs和PEG-MNPs的溶解性对比实验，可以看出，修饰后的PEG-MNPs水溶性增加，具有良好的水溶性。

实施例6。

将实施例3制备的MNPs溶于1mol/L NaOH溶液中，配制成400μg/mL的黑色素纳米颗粒溶液。以1mol/L HCl调节溶液的pH值至9，按照MNPs与修饰剂PEG的质量比为1∶1加入mPEG₂₀₀₀-NH₂，磁力搅拌24h后，将溶液移至MWCO 2000D的透析袋中，透析60h以去除未反应的mPEG₂₀₀₀-NH₂。用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13Pa条件下真空冷冻干燥后，制备得到水溶性黑色素纳米颗粒PEG-MNPs，4℃下保存。

Claims

1.一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法，包括：

1）、以干燥的山杏核壳粉末为原料，置于NaOH溶液中进行超声提取，除去不溶物得到黑色素粗提液；

2）、调节黑色素粗提液的pH值至1.0～3.5，进行酸沉降并收集沉淀物；

3）、将沉淀物用水稀释，调节pH值至4.5～5.0，加入纤维素酶进行酶解后，再次收集沉淀物；

4）、再将沉淀物用水稀释，调节pH值至4.5～5.0，加入糖化酶进行酶解后，收集沉淀物；

5）、将两种酶处理后的沉淀物用NaOH溶液溶解后，再次调节pH值至1.5～2.0进行酸沉降，收集沉淀物，得到黑色素粗提物；

6）、将上述制备的黑色素粗提物加入HCl溶液中，加热至90～100℃进行酸解，收集沉淀物，以无水乙醇进行洗涤；

7）、将无水乙醇洗涤后的沉淀物以NaOH溶液溶解，调节pH值至1.5～2.0，酸沉降并收集沉淀物，重复进行碱溶和酸沉降，将得到的黑色素固形物以蒸馏水洗涤，得到黑色素纯品；

8）、取黑色素纯品溶于NaOH溶液中，配制成10～200μg/mL的黑色素溶液，在200W、60Hz超声波处理条件下调节溶液的pH值至5.0～7.0，并超声处理30～120min后，再以超声波细胞破碎机破碎2～10min，调节溶液的pH值至1.0～3.5，酸沉降并收集固体，制备得到黑色素纳米颗粒MNPs。

2.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是还包括：

将MNPs溶于NaOH溶液中，配制成100～600μg/mL的黑色素纳米颗粒溶液，调节pH值为9，以MNPs与修饰剂的质量比为1∶0.5～3加入mPEG₂₀₀₀-NH₂，搅拌均匀，于MWCO 2000D透析袋中透析48～60h，得到水溶性黑色素纳米颗粒PEG-MNPs。

3.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是使用超声波细胞破碎机破碎时，超声波探头工作1s、停2s。

4.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是所述山杏核壳粉末与NaOH的质量比为1∶0.4～2。

5.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是采用60Hz、50～200W的超声波清洗装置，将山杏核壳粉末在NaOH溶液中超声提取10～90min。

6.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是调节所述黑色素粗提液的pH值至1.5～2.0。

7.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是所述纤维素酶用量为沉淀物质量的0.05～0.4%，酶解反应在50～55℃水浴中进行，反应时间0.5～2.5h。

8.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是所述糖化酶用量为沉淀物质量的0.05～0.4%，酶解反应在55～60℃水浴中进行，反应时间0.5～2.5h。

9.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是使用2～8mol/L的HCl溶液对所述黑色素粗提物进行酸解，酸解时间0.5～2.5h。

10.根据权利要求1所述的天然黑色素纳米颗粒的制备方法，其特征是所述碱溶和酸沉降过程重复不少于6次。