CN112266400A - 抗肿瘤化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗肿瘤化合物。具体地说，本发明涉及一组具有抗肿瘤活性的氨基甲酸酯类化合物及其制备方法，以及在抗肿瘤方面的应用。本发明的化合物具有如下式(I)所示的化学结构，其中各取代基如说明书所述。本发明所制得的化合物对多种肿瘤具有优良的抑瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于医药化学领域，涉及提高吉西他滨抗肿瘤活性的方法，尤其是涉及一组具有抗肿瘤活性的吉西他滨氨基甲酸酯类化合物及其制备方法，以及在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
吉西他滨(gemcitabine)，中文化学名：4-氨基-1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2(1H)-酮，英文化学名：2′-deoxy-2′,2′-difluorocytidine，分子式：C9H11F2N3O4，是一种新型氟代核苷类似物，吉西他滨的化学结构如以下式(A)所示：
吉西他滨本身并无药理活性，进入人体内后经脱氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢为相应的单磷酸酯、双磷酸酯和三磷酸酯而发挥药效。吉西他滨可用于治疗多种实体瘤(例如，非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等)，临床用其盐酸盐，但目前仅限于静脉给药治疗胰腺癌和非小细胞肺癌。该疗法的患者依从性差并存在若干不良反应，典型的不良反应包括，①血液系统：有骨髓抑制作用，可出现贫血、白细胞降低和血小板减少。②胃肠道；约2/3的患者出现肝脏转氨酶异常，多为轻度、非进行性损害；约1/3的患者出现恶心和呕吐反应，20％的患者需要药物治疗。③肾脏：约1/2的患者出现轻度蛋白尿和血尿，有部分病例出现不明原因的肾衰。④过敏：约25％的患者出现皮诊，10％的患者出现瘙痒，少于1％患者可发生支气管痉挛。⑤其他：约20％的患者有类似于流感的表现；水肿/周围性水肿的发生率约30％；脱发、嗜睡、腹泻、口腔毒性及便秘发生率则分别为13％，10％，8％，7％和6％。这些不良反应将严重影响吉西他滨临床用药的效益/风险比。此外，本品在静注后可广泛分布于各组织，能被胞苷脱氨酶在肝脏、肾、血液和其他组织中快速代谢，故血浆半衰期短(t1/2：8-17min)，需多次给药(Gang Wang，等.J.Med.Chem.2017,60,2552；Tang Li，等.DRUG DEVELOPMENT AND INDUSTRIAL PHARMACY，2017，43：2016)。
现有技术仍然期待有新的、并且预期具有某种或某些更优异效果的方法来治疗肿瘤，例如期待有更加优良的抗肿瘤活性的药物例如吉西他滨衍生物应用于临床。
发明内容
本发明的目的是提供新的、并且预期具有某种或某些更优异效果的方法来治疗肿瘤，例如提供具有更加优良的抗肿瘤活性的药物应用于临床。本发明人出人意料地发现，具有本发明结构的化合物呈现优异的抗肿瘤活性。
为此，本发明第一方面提供了以下式(I)化合物(其在本发明中亦可称为吉西他滨氨基甲酸酯类化合物或吉西他滨氨基甲酸酯等)，
其中：R代表C10-22直链或支链的饱和烷基或不饱和烯基，其中碳链中的1个或2个CH2任选地被O替代。
根据本发明第一方面的化合物，其中所述R选自：正癸烷基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、正二十烷基、正二十二烷基、正十六烷氧丙基、正十八烷氧乙基、(9-烯)正十烷基、(11-烯)正十二烷基、(11-烯)正十二烷乙基。
根据本发明第一方面的化合物，其也可以溶剂化物(例如水合物)的形式存在，因此，这些溶剂化物(例如水合物)也包括在本发明的化合物之内。
根据本发明第一方面的化合物，其为选自下列的化合物1～化合物12：
化合物1：正癸烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物2：正十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物3：正十四烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物4：正十六烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物5：正十八烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物6：正二十烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物7：正二十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物8：正十六烷氧丙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物9：正十八烷氧乙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物10：(9-烯)正十烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物11：(11-烯)正十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物12：(11-烯)正十二烷乙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯。
进一步的，本发明第二方面提供了制备式(I)化合物的方法，该方法如以下反应路线1所示。
反应路线1：
在该反应路线1中，R如本文所定义的。
具体地说，本发明的方法包括如下步骤：
1)使式(II)化合物(国内市售途径获得)溶于非极性溶剂(例如，二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环)，在1.5-3倍当量有机碱(例如，三乙胺、N,N-二甲基吡啶、吡啶、4-二甲氨基吡啶)存在下，与1-2倍当量的式(III)化合物(国内市售途径获得)在0℃-40℃下搅拌反应3-10小时，得到式(IV)化合物；
2)使式(IV)化合物溶于质子性溶剂(例如，水、醇或醇-水混合溶剂，例如甲醇；例如10mmol化合物IV’溶于40～60mL例如50mL质子性溶剂中)，加入0.1-2当量的无机碱(例如0.1～0.5当量；例如，氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠)，在0℃-室温下搅拌反应0.5-3小时，得到式(I)化合物。
根据本发明第二方面任一项所述方法，其中步骤2)中，随甲醇还一起添加乙酸乙酯，并随NaOH还一起添加氯化钙。例如随50mL甲醇还添加10mL乙酸乙酯，并随NaOH固体0.1g一起还添加氯化钙0.25g。
进一步的，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一项所述化合物或者本发明第二方面任一项所述方法制备的化合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
根据本发明第三方面的用途，其中所述肿瘤为实体瘤。
根据本发明第三方面的用途，其中所述肿瘤为选自：非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中如未另外说明，涉及的％是重量/重量百分数。
吉西他滨，(+)2'-脱氧-2'2'-二氟胞嘧啶，临床上通常以其盐酸盐的形式使用，常见剂型有盐酸吉西他滨冷冻干燥粉针剂。临床上可用于治疗以下疾病：局部晚期或已转移的非小细胞肺癌、局部晚期或已转移的胰腺癌、吉西他滨与紫杉醇联合，适用于治疗经辅助/新辅助化疗后复发，不能切除的、局部复发或转移性乳腺癌。
吉西他滨的细胞代谢和作用机制：吉西他滨(dFdC)为嘧啶类抗代谢物，在细胞内经核苷激酶的作用被代谢为具有活性的二磷酸(dFdCDP)及三磷酸核苷(dFdCTP)。dFdCDP和dFdCTP通过两种作用机制抑制DNA合成，从而实现吉西他滨的细胞毒作用。首先，dFdCDP抑制核苷酸还原酶的活性，致使合成DNA所必需的三磷酸脱氧核苷(dCTP)的生成受到抑制。其次，dFdCTP与dCTP竞争掺入至DNA链中(自增强作用)。同样，少量的吉西他滨还可以掺入RNA分子中。因此，细胞内dCTP浓度降低更加有利于dFdCTP掺入到DNA链中。DNA聚合酶ε不能去除掺入的吉西他滨及修复已形成的DNA链。吉西他滨掺入DNA链后，延伸的DNA链中就增加了一个核苷酸。这个增加的核苷酸可以完全抑制DNA链的进一步合成(隐蔽链终止)。吉西他滨掺入DNA链后引起细胞凋亡。
吉西他滨对培养细胞的细胞毒活性：吉西他滨对各种培养的人及鼠肿瘤细胞有明显的细胞毒活性。其作用具有细胞周期特异性，即吉西他滨主要作用于DNA合成期(S-期)的细胞，在一定的条件下，可以阻止G1期/S期交接点的细胞进展。在体外，吉西他滨的细胞毒作用取决于浓度和时间。
吉西他滨在动物模型中抗瘤活性的研究：在肿瘤动物模型的研究中发现吉西他滨的抗肿瘤活性与给药的方式有关。每天给药的方法会导致动物死亡率很高，而抗肿瘤活性很低。当用每3-4天给药一次的方法，吉西他滨在非致死剂量时对小鼠的多种肿瘤均有很好的抗肿瘤活性。
吉西他滨的药代动力学特点：在7项研究，共计353例患者中评价了吉西他滨的药代动力学特点。其中女性患者121例和男性患者232例，年龄29-79之间。在这些患者中，约45％为非小细胞肺癌患者，35％为胰腺癌患者。得到以下药代动力学参数的给药剂量范围是500-2,592mg/m2，输液时间变化范围0.4-1.2小时。血浆峰浓度(输液结束后5分钟内得到)为3.2-45.5μg/ml。按照1000mg/m2/30min剂量给药，输液结束30min内母体化合物血浆浓度可持续高于5μg/ml，输液结束后1小时内，其血浆浓度亦高于0.4μg/ml。
分布：中央室的分布容积为女性12.4L/m2和男性17.5L/m2(个体间差异为91.9％)。周边隔室的分布容积为47.4L/m2。周边隔室的容积与性别不相关。血浆蛋白结合可忽略不计。半衰期：半衰期为42-94分钟，与年龄和性别相关。对于推荐的给药方案，吉西他滨在输液开始后的5-11小时内被完全清除。每周给药一次时，吉西他滨不会产生蓄积。
吉西他滨在肝脏、肾脏、血液和其他组织中被胞苷脱氨酶快速代谢。在细胞内，吉西他滨在细胞内代谢产生吉西他滨单磷酸、二磷酸和三磷酸核苷(dFdCMP、dFdCDP和dFdCTP)，其中dFdCDP和dFdCTP具有活性。这些细胞内形成的代谢物，在血浆或尿液中都未曾检出。主要代谢物2'-脱氧-2',2'-二氟脲苷(dFdU)没有活性，在血浆和尿中均可检出。
吉西他滨的全身清除率为29.2L/hr/m2-92.2L/hr/m2，与性别和年龄相关(个体差异为52.2％)。清除率女性比男性低大约25％。虽然清除速度很快，男性和女性的清除率都随年龄增加而下降。吉西他滨推荐给药剂量为1000mg/m2，静脉滴注30分钟，不必因男性和女性降低的清除率而减少吉西他滨的给药剂量。经尿排泄：少于10％以原药形式排泄。肾清除：2-7L/hr/m2。给药后一周内，吉西他滨给药剂量的92％-98％被检出，其中99％主要以dFdU形式经尿排泄，1％经粪便排泄。
本发明出人意料地发现一类独特的吉西他滨化学结构改造物具有优良的性能。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
实施例1、正癸烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
示意性反应路线如下：
将市售的2’,2’-二氟-2’-脱氧胞嘧啶核苷-3’,5’-二苯甲酸酯(式II化合物，9.4g，0.02mol)溶于75mL二氯甲烷中，先加入三乙胺(3.0g，0.03mol)，然后分批加入氯甲酸癸氧酯(III’，5.3g，0.024mol)，室温搅拌1.5小时，TLC检测反应结束；接着使反应液依次用饱和食盐水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相浓缩，沉淀，得化合物IV’，用于下一步反应。
上述所得0.01mol化合物IV’溶于50mL甲醇中，然后加入催化量的NaOH固体(0.1g)，室温搅拌反应0.5小时，TLC检测反应结束；接着使反应物用硅胶过滤，滤液浓缩，再用硅胶柱层析纯化(洗脱液CH2Cl2：CH3OH＝20:1，v/v)，分离纯化得到标题化合物I’为白色固体，其在本发明中可称为化合物1。
经测定，本文实施例1～12中，式II化合物到式I化合物两步反应的收率为50.6～53.7％，式IV化合物到式I化合物的脱Bz基团反应收率为67.1～70.3％；例如实施例1之式II化合物到式I’化合物两步反应的收率为52％，式IV’化合物到式I’化合物的脱Bz基团反应收率为68.3％。
1HNMR(500M,CD3OD):δ8.25(d,J＝6.8Hz,1H),7.28(d,J＝6.8Hz,1H),6.20(brs,1H),4.31-4.27(m,1H),4.22-4.19(m,2H),3.98-3.96(m,1H),3.91(t,J＝7.5Hz,2H),1.72-1.70(m,2H),1.40-1.31(m,14H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H).
MS-ESI(m/z):448.2(M+H)
【HPLC-A法】：测定物料中杂质含量的方法
取制备工艺过程中的待测物(例如本发明实施例所得化合物IV或化合物I)适量，精密称定，加稀释剂(0.02％磷酸-乙腈70:30溶液)溶解并稀释制成1ml含500μg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取上述溶液适量，加稀释剂稀释成每1ml约含5μg的溶液，作为对照溶液；
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱规格250mm×4.6mm，5μm，以0.02％磷酸-乙腈70:30溶液为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为30℃；
精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的3倍；
按对照溶液主峰面积对照法计算特定杂质的含量。
已经发现，在本发明涉及在碱性条件下从化合物IV水解得到化合物I的脱Bz基团过程中，可能有少量酰胺键断开生成吉西他滨(其在本发明以式I化合物作为产物的制备过程中称为特定杂质)，以该特定杂质在上述HPLC条件下的保留时间为基础，计算其它物质例如式IV化合物或者式I化合物的相对保留时间，这些式IV化合物或者式I化合物的相对保留时间大约在1.4～1.7范围内。使用【HPLC-A法】测定本发明各实施例制得的式I化合物中特定杂质(相对于式I化合物的)百分含量；或者，亦可使用【HPLC-A法】测定本发明各实施例制得的式IV化合物中特定杂质(相对于式IV化合物的)百分含量。此外，通过供试品色谱图以面积归一化法亦可计算出供试品的色谱纯度。
经测定，本发明实施例1～12所制得的式IV化合物中特定杂质百分含量均小于0.02％，例如实施例1所得式IV’化合物中特定杂质百分含量均小于0.01％，表明在制得式IV化合物之前原材料引入或者副反应引入的特定杂质相当少。
经测定，本发明实施例1～12所制得的式I化合物中特定杂质百分含量均在0.62～0.96％范围内，例如实施例1所得式I’化合物中特定杂质百分含量为0.783％，表明在从式IV化合物制备式I化合物过程中会明显引入特定杂质。
此外，经测定，本发明实施例1～12所制得的式I化合物的色谱纯度均在96.4～97.7％范围内，例如实施例1所得式I’化合物的色谱纯度为97.13％，显示相对较高的纯度，但不满足通常对于药物原料药纯度大于98％以上的要求。
实施例2、正十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正十二烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物2。
1HNMR(500M,CD3OD):δ8.29(d,J＝6.5Hz,1H),7.25(brs,1H),6.22(brs,1H),4.33-4.21(m,3H),3.98-3.92(m,1H),3.84(t,J＝7.1Hz,2H),1.68-1.65(m,2H),1.40-1.31(m,16H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).
MS-ESI(m/z):476.2(M+H)
实施例3、正十四烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正十四烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物3。
1HNMR(500M,CD3OD):δ8.30(d,J＝7.2Hz,1H),7.34(d,J＝6.8Hz,1H),6.25(brs,1H),4.32-4.26(m,1H),4.20-4.17(m,2H),3.98-3.96(m,2H),3.81(d,J＝12.5Hz,1H),1.69(q,J＝7.2Hz,2H),1.41-1.28(m,22H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H).
MS-ESI(m/z):504.2(M+H)+.
实施例4、正十六烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正十六烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物4。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.16(d,J＝7.2Hz,1H),7.36(d,J＝7.2Hz,1H),6.25(brs,1H),4.54-4.52(m,1H),4.22-4.20(m,2H),4.08-3.89(m,3H),1.77-1.54(m,3H),1.31-1.22(m,25H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).
MS-ESI(m/z):532.2(M+H)
实施例5、正十八烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正十八烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物5。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.19(d,J＝7.0Hz,1H),7.35(d,J＝6.8Hz,1H),6.24(s,1H),4.55-4.50(m,1H),4.22-4.10(m,5H),1.72-1.64(m,2H),1.31-1.25(m,30H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H).
MS-ESI(m/z):560.2(M+H)
实施例6、正二十烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正二十烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物6。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.17(d,J＝7.2Hz,1H),7.37(d,J＝7.2Hz,1H),6.26(s,1H),4.53-4.49(m,1H),4.22-4.19(m,3H),4.10-3.98(m,2H)1.73-1.65(m,2H),1.33-1.25(m,34H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H).
MS-ESI(m/z):588.2(M+H)
实施例7、正二十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正二十二烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物7。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.19(d,J＝7.0Hz,1H),7.38-7.36(m,1H),6.24(brs,1H),4.52-4.48(m,1H),4.20-3.99(m,5H),1.72-1.67(m,2H),1.31-1.24(m,38H),0.89(t,J＝7.0Hz,3H).
MS-ESI(m/z):616.2(M+H)
实施例8、正十六烷氧丙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
使十六烷氧丙醇溶于二氯甲烷中，加入3当量三乙胺和2当量双光气，室温反应1小时后，直接旋干溶剂，制得氯甲酸正十六烷氧丙酯；接着，
参照实施例1的方法进行，使化合物II与氯甲酸正十六烷氧酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物8。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.23(d,J＝7.2Hz,1H),7.37(d,J＝7.2Hz,1H),6.25(brs,1H),4.51-4.49(m,1H),4.20-4.17(m,3H),4.08-3.89(m,2H),3.76-3.71(m,4H),1.73-1.62(m,4H),1.31-1.24(m,26H),0.87(t,J＝7.0Hz,3H).
MS-ESI(m/z):590.2(M+H)
实施例9、正十八烷氧乙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例8的方法进行，化合物II与氯甲酸正十八烷氧乙酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物9。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.21(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(d,J＝7.0Hz,1H),6.25(brs,1H),4.53-4.50(m,1H),4.20-4.10(m,5H),3.99-3.89(m,6H),1.72-1.65(m,2H),1.33-1.25(m,30H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).
MS-ESI(m/z):604.2(M+H)
实施例10、(9-烯)正十烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，化合物II与氯甲酸(9-烯)正十烷酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物10。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.22(d,J＝7.0Hz,1H),7.33-7.31(m,1H),6.25(brs,1H),5.22-5.17(m,1H),4.92-5.01(m,2H),4.56-4.51(m,1H),4.20-4.07(m,5H),1.92-1.66(m,4H),1.39-1.20(m,10H).
MS-ESI(m/z):446.2(M+H)
实施例11、(11-烯)正十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，化合物II与氯甲酸(11-烯)正十二烷酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物11。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.24(d,J＝6.8Hz,1H),7.30(d,J＝6.8Hz,1H),6.25(brs,1H),5.26-5.23(m,1H),5.11-5.07(m,2H),4.55-4.52(m,1H),4.23-4.16(m,5H),2.11-2.02(m,2H),1.72-1.62(m,2H),1.38-1.23(m,14H).
MS-ESI(m/z):474.2(M+H)
实施例12、(11-烯)正十二烷乙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯
参照实施例1的方法进行，化合物II与氯甲酸(11-烯)正十二烷乙酯反应；然后经脱Bz保护基，制得标题化合物为白色固体，其在本发明中可称为化合物12。
1HNMR(500M,CDCl3):δ8.26(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(d,J＝7.2Hz,1H),6.31(brs,1H),5.28-5.25(m,1H),5.14-5.11(m,2H),4.54-4.50(m,1H),4.33-4.11(m,9H),2.09-2.02(m,2H),1.62-1.59(m,2H),1.35-1.27(m,14H).
MS-ESI(m/z):518.2(M+H)
实施例21、制备吉西他滨氨基甲酸酯类化合物
分别参照实施例1～12的方法，从式IV化合物为起始物制备各题述式I化合物，在本实施例的各脱Bz基团反应中，随50mL甲醇还添加10mL乙酸乙酯，并随NaOH固体0.1g一起还添加氯化钙0.25g，其余操作照实施例1～12进行，分别得到各式I化合物。
经测定，式IV化合物到式I化合物的脱Bz基团反应收率为82.4～85.7％，例如本实施例21参照实施例1方法中该脱Bz基团反应收率为84.8％，表明本实施例方法脱Bz基团反应收率显著提高；
所制得的式I化合物中特定杂质百分含量均在0.106～0.141％范围内，例如本实施例21参照实施例1方法所得式I’化合物中特定杂质百分含量为0.117％，表明本实施例方法可以使产物式I化合物中的特定杂质含量显著降低；
所制得的式I化合物的色谱纯度均在98.3～99.6％范围内，例如本实施例21参照实施例1方法所得式I’化合物的色谱纯度为99.27％，呈现显著更高的纯度，完全药用原料药的纯度要求。
实施例22、制备吉西他滨氨基甲酸酯类化合物
分别参照实施例1～12的方法，从式IV化合物为起始物制备各题述式I化合物，在本实施例的各脱Bz基团反应中，随50mL甲醇还添加10mL乙酸乙酯，其余操作照实施例1～12进行，分别得到各式I化合物。经测定，式IV化合物到式I化合物的脱Bz基团反应收率为69.2～71.1％，例如本实施例22参照实施例1方法中该脱Bz基团反应收率为69.8％；所制得的式I化合物中特定杂质百分含量均在0.68～0.94％范围内，例如本实施例22参照实施例1方法所得式I’化合物中特定杂质百分含量为0.842％；所制得的式I化合物的色谱纯度均在96.7～98.1％范围内，例如本实施例22参照实施例1方法所得式I’化合物的色谱纯度为97.41％。
实施例23、制备吉西他滨氨基甲酸酯类化合物
分别参照实施例1～12的方法，从式IV化合物为起始物制备各题述式I化合物，在本实施例的各脱Bz基团反应中，随NaOH固体0.1g一起还添加氯化钙0.25g，其余操作照实施例1～12进行，分别得到各式I化合物。经测定，式IV化合物到式I化合物的脱Bz基团反应收率为67.6～69.8％，例如本实施例23参照实施例1方法中该脱Bz基团反应收率为68.2％；所制得的式I化合物中特定杂质百分含量均在0.65～0.97％范围内，例如本实施例23参照实施例1方法所得式I’化合物中特定杂质百分含量为0.776％；所制得的式I化合物的色谱纯度均在96.4～97.8％范围内，例如本实施例23参照实施例1方法所得式I’化合物的色谱纯度为97.13％。出人意料的发现，制备吉西他滨氨基甲酸酯类化合物的脱Bz基团反应中，随甲醇还添加适量乙酸乙酯同时随NaOH还添加氯化钙不但可以提高此反应的收率，而且能够减少特定杂质引入到终产物中，终产物纯度高。
实施例31、药物的抗肿瘤活性
1、试验用细胞
人胰腺癌(AsPC-1)细胞、人胰腺导管癌(SU.86.86)。
2、测试物
吉西他滨、实施例21制备的12种吉西他滨酯化物。
3、实验方法
体外培养AsPC-1、SU.86.86等肿瘤细胞，在37℃、5％CO2条件下于细胞培养箱中培养至对数期。将上述细胞接种于96孔板中，接种密度为5000个/孔，每孔100μL，之后继续在细胞培养箱中培养24h。
采用MTT法测定各种测试物对上述肿瘤细胞的毒性，试验中包括设置用吉西他滨酯化合物和吉西他滨作为阳性对照药。用细胞培养液倍比稀释测试物，得到吉西他滨浓度为1～100μM的细胞培养基。细胞铺板24h后，分别用200μL含药培养基取代对应孔中的原培养基，每个浓度设4个复孔，同时设置空白对照孔和调零孔。继续孵育24、48、72h后，加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，同条件下继续培养4h后弃去培养液，向每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒，平板震荡仪震荡10min，在酶标仪中测定490nm波长处的吸光度值，计算细胞生长抑制率％和IC50(μM)值。部分化合物的IC50(μM)值如下：
针对AsPC-1，吉西他滨的IC50(μM)为1198.0，化合物1的IC50(μM)为86.2，化合物2～12的IC50(μM)在75.1～132.7范围内；针对SU.86.86，吉西他滨的IC50(μM)为124.1，化合物1的IC50(μM)为5.8，化合物2～12的IC50(μM)在4.3～7.5范围内。
从上述可见，化合物1～12这些酯对AsPC-1和SU.86.86的抑制效果显著优于吉西他滨。
实施例32：抑制小鼠移植性肿瘤的药效学试验
1、试验材料
药物：吉西他滨以及实施例21所得化合物2、化合物6、化合物9、化合物11五种化合物，剂量为相当于10mg吉西他滨/kg体重/次的剂量。清洁级C57BL/6N小鼠。瘤种：小鼠移植性肿瘤Lewis肺癌、S180肉瘤和H22肝癌。
2、试验方法
(1)小鼠Lewis肺癌：
体重18～22g的雄性C57BL/6N小鼠，随机均分为6组，每组10只，分别设为生理盐水对照组、分别为上述五种化合物的五个组。
颈部脱臼处死Lewis肺癌皮下接种生长12d的C57BL/6N荷瘤小鼠，无菌取新鲜肿瘤组织，以组织研磨器制成细胞匀浆，用生理盐水调整活细胞含量至2～3×107/mL，接种于C57BL/6N小鼠右侧腋部皮下，每只接种0.1mL。
给药剂量和方法：生理盐水，灌胃，每日0.1mL/10g体重/天，每日1次，共11次；各种试药腹腔注射，间日1次，共4次。
接种第2天开始给药，末次给药后24h，处死动物，称体重及瘤块重量，按下式计算瘤重抑制率：
瘤重抑制率(％)＝(1-试验组瘤重/生理盐水对照组瘤重)×100％。
三批试验合并统计，以SPSS10.0软件进行统计分析，体重和肿瘤重量的实验数据以x±s表示，以单因素方差分析比较各给药组与生理盐水对照组的差异。
(2)小鼠S180肉瘤
无菌取S180肉瘤腹腔接种生长8d的小鼠腹水，以生理盐水稀释瘤细胞含量至3～4×107/mL，接种于实验小鼠右侧腋部皮下，每只接种0.1mL。给药周期11d，分组及给药情况、统计方法与小鼠Lewis肺癌试验相同。
(3)小鼠H22肝癌
取H22肝癌腹腔接种生长9d的小鼠腹水，以生理盐水稀释至瘤细胞含量为5～6×107/mL接种NIH小鼠。给药周期11d，分组及给药情况、统计方法与小鼠Lewis肺癌试验相同。
3、对小鼠移植性肿瘤的抑制结果
吉西他滨对Lewis肺癌的瘤重抑制率为65.3％，化合物2、化合物6、化合物9、化合物11对Lewis肺癌的瘤重抑制率在83～92％范围内(例如化合物2为88.6％)；吉西他滨对S180肉瘤的瘤重抑制率为54.7％，化合物2、化合物6、化合物9、化合物11对S180肉瘤的瘤重抑制率在74～79％范围内(例如化合物2为75.8％)；吉西他滨对H22肝癌的瘤重抑制率为59.2％，化合物2、化合物6、化合物9、化合物11对H22肝癌的瘤重抑制率在85～91％范围内(例如化合物2为90.6％)。
出人意料的发现，本发明所制得的化合物比之于吉西他滨对多种肿瘤具有明显更好的抑瘤作用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (10)
1.式(I)所示化合物，
其中，R代表C10-22直链或支链的饱和烷基或不饱和烯基，其中碳链中的1个或2个CH2任选地被O替代。
2.根据权利要求1的化合物，其中碳链中的1个CH2任选地被O替代。
3.根据权利要求1的化合物，其中所述R选自：正癸烷基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、正二十烷基、正二十二烷基、正十六烷氧丙基、正十八烷氧乙基、(9-烯)正十烷基、(11-烯)正十二烷基、(11-烯)正十二烷乙基。
4.根据权利要求1的化合物，其是以溶剂化物(例如水合物)的形式存在。
5.根据权利要求1的化合物，其为选自下列的化合物1～化合物12：
化合物1：正癸烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物2：正十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物3：正十四烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物4：正十六烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物5：正十八烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物6：正二十烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物7：正二十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物8：正十六烷氧丙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物9：正十八烷氧乙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物10：(9-烯)正十烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物11：(11-烯)正十二烷基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯，
化合物12：(11-烯)正十二烷乙基(1-(3,3-二氟-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃-2-基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)氨基甲酸酯。
6.制备权利要求1～5任一项所述式(I)化合物的方法，该方法以如下反应路线进行：
7.根据权利要求6的方法，其包括如下步骤：1)使式(II)化合物溶于非极性溶剂(例如，二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环)，在1.5-3倍当量有机碱(例如，三乙胺、N,N-二甲基吡啶、吡啶、4-二甲氨基吡啶)存在下，与1-2倍当量的式(III)化合物在0℃-40℃下搅拌反应3-10小时，得到式(IV)化合物；2)使式(IV)化合物溶于质子性溶剂(例如，水、醇或醇-水混合溶剂，例如甲醇；例如10mmol化合物IV’溶于40～60mL例如50mL质子性溶剂中)，加入0.1-2当量的无机碱(例如0.1～0.5当量；例如，氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠)，在0℃-室温下搅拌反应0.5-3小时，得到式(I)化合物；进一步的，例如，在本步骤2)中，随甲醇还一起添加乙酸乙酯，并随NaOH还一起添加氯化钙；例如随50mL甲醇还添加10mL乙酸乙酯，并随NaOH固体0.1g一起还添加氯化钙0.25g。
8.权利要求1～5任一项所述式(I)化合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述肿瘤为实体瘤。
10.根据权利要求8的用途，其中所述肿瘤为选自：非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌。
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