CN112246221A - 聚离子液共价有机骨架材料、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚离子液共价有机骨架材料、其制备方法和应用，本发明利用中性节点单元和醛基化离子液体合成的亚胺类聚离子液共价有机骨架材料具备良好的结晶性和多孔性。该聚离子液共价有机骨架材料为实心纳米球，球形大小均匀，分散性良好，直径约为650nm。将其填充SPE柱对血清样品进行预处理，并结合LC‑MS/MS联用的分析方法对人血清中的3,5‑T2AM、3,5‑T2、3',5'‑T2和T4进行富集分析，与直接萃取浓缩或沉淀蛋白浓缩等现有技术相比，检测信号有明显的提高，信号检测强度调高3‑7倍，检测灵敏度高、特异性强且简便省时。
Description
技术领域
本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及一种聚离子液共价有机骨架材料、其制备方法和应用。
背景技术
多孔材料因其结构的显著优势，其在气体吸附、催化反应、能量存储、光电材料以及生物医药等领域广泛应用而成为研究的热点，但此前多为无机材料，因其结构无定形，难以进行修饰，所以一定程度上限制了其应用，这使得结构可调的有机多孔聚合物(POPs)得到研究发展，有机多孔聚合物按类型大致可分为以下几种：高度交联聚合物(HCPs)、有机微孔聚合物(PIMs)、多孔芳香骨架聚合物(PAFs)、共轭微孔聚合物(CMPs)和共价有机骨架(COFs)等，其中共价有机骨架自2005年问世以来，以独特的理化性质，引起了广大科研工作者的关注和研究。
甲状腺激素是调节生长发育的重要激素，在能量稳态中起重要作用，可以通过准确监测血清中这些低含量激素，来评估人体健康水平。通过对代谢通路的研究，T2族甲状腺激素代谢产物引起了许多学者的关注。由于甲状腺激素的亲脂特性，所以释放到血液中的甲状腺激素主要通过与载体蛋白结合进行转运，只有小部分未结合游离的激素，从而发挥生理作用。血液中甲状腺激素(TH)的主要代谢反应是脱碘化、硫酸化、葡萄糖醛酸化和醚键裂解。其中脱碘化是调节哺乳动物体内甲状腺激素生物利用度的最主要途径。脱碘化代谢主要是通过D1、D2、D3型脱碘酶的作用，对T4进行内环或外环脱碘形成T3或rT3。3,5-二碘甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3,3'-二碘甲状腺原氨酸(3,3'-T2)和3',5'-二碘甲状腺原氨酸(3',5'-T2)等二碘甲状腺原氨酸可能是T3或rT3的内外环脱碘形成的产物。早期被认为没有活性，但近几年随着对其研究的深入，已有研究发现3,5-T2可能是不同于T3的一种活性生物分子，也能够调节机体生长等生理需求。3,5-T2通过介导碳水化合物、脂类和蛋白质中间代谢途径起到调节机体作用。根据基因组研究结果，3,5-T2与活性T3分别与TR受体结合的亚型不同。
随着高效液相色谱(HPLC)技术的进步及与串联质谱结合成液相色谱-质谱(LC-MS/MS)联用技术的发展，可能成为激素检测更为有力的手段。这种分析技术通过保留时间以及母离子和碎片离子的离子对来识别复杂样品中的目标分子。通过使用选择性反应监测模式，测量人血清或血浆中部分TH谱图的经典代谢物，提供了比免疫测定法更好的精度，准确性和可重复性。样品的前处理环节是样品分析中至关重要的步骤，前处理的结果直接影响着检测结果的灵敏度和准确性，由于生物样本基质中成分复杂且组分含量都比较低，对其进行直接检测定量较为困难，有必要在分析前对待测组分进行分离、纯化乃至富集，从而达到检测要求，合适的前处理有助于真实、准确对待测组分进行定量。固相萃取(Solidphase extraction，SPE)由于其操作简单、预富集因子高、可重复使用等优点，在前处理过程中得到了广泛的应用。固相萃取作为一种高效的样品前处理手段，可与多种分析检测手段联用对生物样品中小分子化合物和蛋白质多肽等大分子、金属离子污染物、农药残留物等物质进行准确检测。选择合适的吸附剂，能够提高SPE选择性、吸附能力和效率，进行更加高效的样本处理，而COFs作为一种新型的微孔有机材料，在吸附领域广泛的应用，使其有望作为一种新的SPE吸附剂。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，利用中性节点单元(TAPB)和醛基化离子液体(FFBMIM)合成的亚胺类聚离子液共价有机骨架材料，具备良好的结晶性和多孔性，以及聚合物中的共轭结构、亚胺氮原子的孤对电子等相互作用使其对目标碘化物具有良好的捕捉效果。
本发明的另一目的是提供上述聚离子液共价有机骨架材料的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述聚离子液共价有机骨架材料在色谱分析中作为固相萃取填料的应用，特别是作为固相萃取填料用于富集T2族甲状腺激素。
本发明的技术方案如下：
一种聚离子液共价有机骨架材料，命名为FFBMIM-TAPB-COF，其结构式中包含式I所示的结构单元，
本发明提及的聚离子液共价有机骨架材料包括5000～20000个式I所示的结构单元。
本发明利用中性节点单元(TAPB)和醛基化离子液体(FFBMIM)合成的亚胺类聚离子液共价有机骨架材料为实心纳米球，球形大小均匀，分散性良好，直径约为650nm。其中咪唑阳离子有序分布在孔道结构的壁面上，在通过单层结构的反向堆积形成的相邻两层咪唑阳离子交替排列在孔道两侧，这种排列方式削弱了层间的电荷排斥作用，保证了层与层之间能够进行有效堆积，使该聚离子液共价骨架材料具备良好的结晶性和多孔性。
本发明提及的聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)的制备方法，它包括如下步骤：在催化剂三氟甲基磺酸钪和溶剂存在的条件下，化合物TAPB和离子液体单体FFBMIM在0～150℃进行化学反应，制备目标产物FFBMIM-TAPB-COF，其中，化合物TAPB和离子液体单体FFBMIM的结构式如下所示：
在一种优选方案中，离子液体单体FFBMIM和化合物TAPB的摩尔比为1:0.4～1:1.4，离子液体单体FFBMIM和化合物TAPB的摩尔比可以但不局限于，1:0.4、1:0.6、1:0.65、1:0.68、1:0.7、1:0.72、1:74、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.2或1:1.4。
本发明在制备聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)时，以三氟甲基磺酸钪(Sc(OTf)3)作为催化剂，在一种优选方案中，催化剂三氟甲基磺酸钪与化合物TAPB的摩尔比为1:15～1:20，具体而言，催化剂三氟甲基磺酸钪与化合物TAPB的摩尔比可以为1:15、1:16、1:16.3、1:16.5、1:16.7、1:17、1:18、1:19或1:20。
进一步地，反应温度为100～150℃，优选为120℃。
更进一步地，反应时间为10～32h，优选为12～24h。
本发明在制备聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)时，溶剂可以选自均三甲苯、二氧六烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、邻二氯苯或1-丁醇中的一种或几种。
在一种优选方案中，溶剂为邻二氯苯和1-丁醇。更优选地，邻二氯苯和1-丁醇的体积比为1:1。
在一种优选方案中，离子液体单体FFBMIM与溶剂的摩尔体积比为0.005～0.1:1mmol/ml；例如，0.005:1mmol/ml、0.01:1mmol/ml、0.012:1mmol/ml、0.013:1mmol/ml、0.015:1mmol/ml、0.02:1mmol/ml、0.04:1mmol/ml、0.06:1mmol/ml、0.08:1mmol/ml或0.1:1mmol/ml。
本发明还提供了上述离子液体单体FFBMIM的制备方法，它包括如下步骤：
在一种优选方案中，化合物II和化合物III的摩尔比为1:0.5～1:1.5，例如，1:0.5、1:0.8、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.5。
进一步地，反应温度为60～90℃，优选为80℃。
更进一步地，反应时间为10～24h，优选为2～12h。
在制备离子液体单体FFBMIM时，反应溶剂选自乙腈、四氢呋喃或甲苯中的的一种或几种，优选为乙腈。
在一种优选方案中，化合物II与反应溶剂的摩尔体积比为1:2～12mmol/ml；例如，1:2mmol/ml、1:4mmol/ml、1:6mmol/ml、1:8mmol/ml、1:10mmol/ml或1:12mmol/ml。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供一种聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)具备良好的结晶性和多孔性，将其填充SPE柱对血清样品进行预处理，并结合LC-MS/MS联用的分析方法对人血清中的3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4进行富集分析，与直接萃取浓缩或沉淀蛋白浓缩等现有技术相比，检测信号有明显的提高，信号检测强度调高3-7倍，检测灵敏度高、特异性强且简便省时。
附图说明
图1是离子液体单体FFBMIM质谱图；
图2是离子液体单体FFBMIM核磁1H NMR图；
图3是本发明的聚离子液共价有机骨架材料作为固相萃取填料用于富集T2族甲状腺激素的流程图；
图4是聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)的SEM和TEM表征分析图，其中，A为SEM图；B为TEM图；
图5是聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)粒径分布图；
图6是离子液体单体FFBMIM与聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)红外光谱图；
图7是聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)的活化体积结果图；
图8是聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)对于13种化合物吸附特异性的结果比较；
图9是聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)吸附线性结果图；
图10是聚离子液共价有机骨架材料(FFBMIM-TAPB-COF)洗脱剂种类优化图；
图11是血清经FFBMIM-TAPB-COF材料SPE柱富集处理进样分析色谱图，其中，血清空白基质(A)、BSA空白基质+5种混合对照(B)和血清富集处理后的MRM色谱图(C)；
图12是四种提取富集处理方式色谱图对比图；在6.9min，由上而下对应的曲线为经商业HLB柱分离富集、本发明制备的SPE富集柱分离富集、乙酸乙酯萃取富集和C18E柱分离富集；在7.5min，由上而下对应的曲线为经本发明制备的SPE富集柱分离富集、商业HLB柱分离富集、C18E柱分离富集和乙酸乙酯萃取富集；在8.7min，由上而下对应的曲线为经本发明制备的SPE富集柱分离富集、商业HLB柱分离富集和C18E柱分离富集；在8.9min，由上而下对应的曲线为经由上而下对应的曲线为经本发明制备的SPE富集柱分离富集、商业HLB柱分离富集、C18E柱分离富集和乙酸乙酯萃取富集；在10.6min，最上方的曲线为经本发明制备的SPE富集柱分离富集、中间的为商业HLB柱分离富集和C18E柱分离富集，两个曲线重叠在一起、最下方的曲线为乙酸乙酯萃取富集。
具体实施方式
通过以下实施例和附图对本发明的作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、材料
1.实验试剂
表1实验试剂
2.实验仪器
表2实验仪器
1.3表征方法
利用SEM、TEM、FT-IR、DLS对离子型共价有机骨架进行表征，确证FFBMIM-TAPB-COF骨架成功合成，同时观察三种合成材料的形貌及粒径大小。
1.4标准储备液的制备
分别精密称取3,5-T2、3',5'-T2、3,5-T2AM、T3、T4、酪氨酸、苯丙氨酸、肾上腺素、胞苷、5-mc、腺苷、肌苷、m6A这13种对照品5mg于棕色容量瓶中，加入适量氨水并用甲醇使其溶解定容至刻度，充分摇匀，配制成0.5mg/mL的对照品储备液，4℃避光保存。临用前用水或空白基质将其稀释成系列浓度的标准溶液。
利用上述标准品储备液准确配制50μg/mL的3,5-T2、3',5'-T2、T3、T4、酪氨酸、苯丙氨酸、胞苷、5-mc、腺苷、肌苷、m6A11种混合标准品储备液，4℃避光保存。临用前用水将其稀释成系列浓度的标准液。
1.5 SPE富集柱的制备
使用常规的1mL固相萃取聚丙烯空柱，自行填充本发明制备的FFBMIM-TAPB-COF材料。首先在SPE空管底部塞入配套聚四氟乙烯材质的筛板，准确称取一定量的FFBMIM-TAPB-COF材料，加入甲醇制成混悬液，湿法填充于SPE空管内，控制底部阀门流出液体，直至剩下固体粉末，再次塞入一片聚四氟乙烯筛板以堵住柱口，轻轻挤压筛板使得填料均匀平整紧实，活化后即可使用。
1.6性能考察
1.6.1吸附性能考察
1.6.1.1 SPE柱吸附性能
qe＝C0*V0–C1*V1–Cx*Vx
其中，qe表示吸附量(μg)，C0为上样溶液的浓度(μg/mL)，V0为上样液的体积(mL)，C1为淋洗液淋洗后的浓度(μg/mL)，V1为淋洗液的体积(mL)，Cx为上样液过柱后的浓度(μg/mL)，Vx为上样液过柱后的体积(mL)。
1.6.1.2活化体积
称取2mg的FFBMIM-TAPB-COF材料按照“1.5”项制备SPE柱后，分别用0.5mL、1mL、1.5mL、3mL的甲醇活化，之后取500μg/mL的T3对照品溶液分别加入已经活化的材料中，再加入去离子水淋洗，分别收集滤液并离心处理进样，比较不同活化体积下的材料对T3的吸附效果，得到最佳活化体积。
1.6.1.3吸附特异性
(1)特异性吸附
对13种内源性物质和结构类似的对照品进行富集分析，称取2mg的FFBMIM-TAPB-COF材料按照“1.5”项制备SPE柱，加甲醇1.5mL活化材料并弃去活化后的收集液，各加入800μL的500μg/mL的对照品溶液后，加水淋洗后加入洗脱液进行洗脱，收集所得洗脱液，以同种方式处理另外12种对照品。将收集到的洗脱液4℃下12000rpm离心10min，进HPLC检测比较，考察对13种化合物的吸附能力的比较，从中筛选出能特异性吸附的化合物。
(2)竞争性吸附
称取2mg的FFBMIM-TAPB-COF材料按照“1.5”项制备SPE柱，加甲醇1.5mL活化材料并弃去活化后的收集液，再加入11种物质(除肾上腺素和3,5-T2AM)配制成的50μg/mL的混合标准品溶液800μL，其余处理同(1)，进HPLC检测，以吸附量对材料用量作图考察竞争吸附性。
1.6.1.4最大吸附量
分别称取5份2mg的FFBMIM-TAPB-COF材料按照“1.5”项制备SPE柱，加甲醇1.5mL活化材料，弃去活化收集的废液，分别加入500μg/mL的3,5-T2AM、3',5'-T2、3,5-T2、3,5,3'-T3、T4对照品标准溶液800μL，用去离子水淋洗，分别收集滤液，离心处理收集的滤液，再通过HPLC检测，计算最大吸附量。
1.6.1.5吸附线性
分别称取1、2、5、10、15mg的FFBMIM-TAPB-COF材料按照“1.5”项制备SPE柱，分别用0.75mL、1.5mL、7.5mL、15mL、22.5mL的甲醇活化，弃去活化收集的废液，分别加入500μg/mL的T3对照品标准溶液0.4mL、0.8mL、2mL、4mL、6mL后用去离子水淋洗，分别收集滤液，滤液处理后通过HPLC检测，以洗脱量对材料量作图得到吸附线性图。
1.6.2解吸附洗脱剂
1.6.2.1 SPE柱解吸附性能
Q＝(Cy*Vy)/(C0*V0–C1*V1)*100％
其中，Q表示洗脱率，C0为上样溶液的浓度(μg/mL)，V0为上样液的体积(mL)，C1为淋洗液淋洗后的浓度(μg/mL)，V1为淋洗液的体积(mL)，Cy为洗脱后的浓度(μg/mL)，Vy为洗脱液的体积(mL)。
1.6.2.2洗脱剂优化
(1)称取7份2mg FFBMIM-TAPB-COF材料按照“1.5”项制备SPE柱，编号1-7，并加1.5mL甲醇活化。再逐个加入800μL 500μg/mL的T3溶液后，用水淋洗后，分别用水、乙腈、甲醇、20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水、80％甲醇-水7种不同的洗脱剂溶液300μL分别洗脱5次，收集每次的洗脱液，处理后进样。以洗脱率分别对洗脱剂种类和洗脱体积作图，比较7种洗脱剂的洗脱效果并计算洗脱体积。
(2)考察洗脱剂添加剂的影响，按照上述步骤操作分别在洗脱液80％甲醇-水溶液里加入0.1％甲酸、0.2％甲酸、0.3％甲酸、0.4％甲酸、0.5％甲酸进一步优化，300μL分别洗脱5次，收集每次的洗脱液，处理后进样。以洗脱率对添加剂比例作图，比较5种添加剂比例的富集效果，得到最优的添加剂比例。
1.7应用
1.7.1实际样本检测开发
通过Waters Xevo TQD三重四级杆液质联用定性分析检测到甲状腺癌症患者血清样本中含有3,5-T2AM、3',5'-T2、3,5-T2、T4。样本处理选用FFBMIM-TAPB-COF材料特异性吸附4种甲状腺激素，其中T4作为基准消除个体差异。
1.7.2分析方法
1.7.2.1色谱条件
色谱柱为Unity C18柱(150mm×2.1mm，3μm,ACCHROM)，流动相为含有0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸甲醇(B)，流速为0.2mL/min，梯度洗脱：0min，30％B；5min，60％B；12min，80％B；15min，30％B。柱温为40℃，自动进样器温度为4℃，进样量10μL。
1.7.2.2质谱条件
电离模式：ESI正离子模式；电喷雾的参数分别是：毛细管电压，1.2kV；脱溶剂气流，600L/h；离子源温度150℃；脱溶剂温度为600℃，各个化合物的MRM参数见表3。
表3各个化合物的MRM参数
1.8样品前处理
收集健康人和甲状腺癌症患者血清样本1mL，并加入120μL含有25g/L抗坏血酸、柠檬酸和二硫苏糖醇的抗氧化剂以防止甲状腺激素的潜在转化，于-80℃保存备用。分析时将血清样本从-80℃冷冻冰箱取出，使用前于室温解冻，取500μL血清置于10kDa超滤装置(Centrifree YM-30，Millipore)中，以13000rpm、37℃离心30分钟。取出350μL超滤液，并用去离子水稀释至1mL，并调节pH至11.0作为上样液。
1.9方法学验证
精密称量BSA 500mg于棕色容量瓶中加去离子溶解并定容至刻度，配置5％BSA溶液10mL作为空白基质，4℃避光保存用于方法学验证。为了评估开发方法的准确性和可行性，从特异性、线性和范围、定量下限、检测下限、批内与批间精密度、准确度、加样回收率、基质效应等方面。对建立的FFBMIM-TAPB-COF材料结合LC-MS/MS分析方法富集并测定人体血清中3,5-T2AM、3',5'-T2、3,5-T2、T4这4种甲状腺激素的含量的方法进行验证
1.10实际样本测定
为了评价所建立方法的实用性，利用所合成的FFBMIM-TAPB-COF材料富集血样中的3,5-T2AM、3',5'-T2、3,5-T2、3,5,3'-T3、T4，富集前按照“1.8”项对血清进行预处理，按照“1.5”项填充SPE，富集处理后结合LC-MS/MS分析中MRM模式检测富集后血样中分析物的含量，具体操作流程如图3所示。
1.11数据处理和统计分析
含量测定数据：采用Skylline Mass定量软件分析LC-MS/MS数据。用SPSS16.0统计软件处理，以均数±标准差(Mean±SD)表示，采用t检验，假设检验水准α＝0.05或α＝0.01判定，P<0.05或P<0.01表示有统计学差异。
二、实验
实施例1离子液体FFBMIM的制备
在单颈烧瓶中，加入1-甲基-2醛基咪唑(化合物II，440mg)、4-(氯甲基)苯甲醛(化合物III，739mg)和乙腈24ml，在80℃加热回流10h反应结束，冷却至室温后，将溶剂旋转蒸发后，用丙酮洗涤3-4次后真空干燥，得产物200mg，产率为16.7％。
质谱结果如图1所示，与采用LC-MS/MS高分辨质谱，采用正离子检测模式测定的精确理论分子量一致。将目标产物离子液体单体FFBMIM溶于氘代DMSO，核磁1H NMR如图2所示。位移值10.01(s,1H，-CHO),9.84(s,1H,-CHO),8.80(s,1H,＝CH),7.94(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.89(dt,J＝10.3,6.8Hz,1H，-CH＝N),7.69(s,1H,Ar-H),7.67(s,1H,Ar-H),5.69(s,2H,-CH2),4.02(s,3H,-CH3)，与软件理论位移值一致。
实施例2 FFBMIM-TAPB-COF的制备
在平底烧瓶中，加入化合物TAPB 98mg、实施例1制备的离子液体单体FFBMIM100mg和催化剂三氟甲基磺酸钪8.3mg，脱气后通氮气保护，再加入邻二氯苯和1-丁醇的混合溶液(v/v＝1:1)30ml，在120℃反应12h，反应完成后过滤取沉淀，并用甲醇和THF分别洗涤4次后，真空干燥烘干，制得目标产物FFBMIM-TAPB-COF 165mg。
三、材料表征和性能考察
1、材料表征
1.1电镜图(SEM、TEM)
为了较为直观的了解FFBMIM-TAPB-COF的外部形态，分别对材料进行SEM和TEM表征分析，结果如图4所示。在图4中，图A的SEM结果显示合成的粒子基本上呈规则的球形，球形大小均匀，分散性良好，直径约为650nm。图B的TEM结果显示材料晶型结构规整，材料骨架为实心纳米球，说明结构是由内而外的致密结构，直径也约为650nm，与SEM结果吻合。所以，本发明制备的聚离子液共价骨架材料粒径在650nm左右。
1.2粒径分析(DLS)
为了考察FFBMIM-TAPB-COF材料的粒径以及分散情况，测定了其粒径分布。结果如图5所示，该球体的粒径主要分布在650nm左右，与SEM和TEM结果一致。
1.3红外光谱分析(FT-IR)
分别对合成的离子液体单体(FFBMIM)和共价有机骨架(FFBMIM-TAPB-COF)进行FT-IR分析，测量范围在4500cm-1-800cm-1，光谱图结果如图6所示，两条吸收带中大于3000cm-1的区域吸收峰均明显较宽，对应为材料中不饱和碳C-H的伸缩振动峰，说明材料结构中可能含有双键或苯环；1730cm-1是由醛基的-C＝O伸缩振动引起的，FFBMIM-TAPB-COF较FFBMIM基本无吸收带，表明材料表面的醛基基本反应完全；1628cm-1的区域吸收峰为-C＝N的伸缩振动，对应材料结构中的咪唑基团或亚胺键，FFBMIM-TAPB-COF中吸收峰强度较FFBMIM吸收带中该处的吸收强，说明形成的更多-C＝N官能团，故推测两种反应物缩合形成-C＝N；1350cm-1处有较强的吸收峰，对应材料中咪唑基团上-C-N的伸缩振动峰；775cm-1处是由亚胺基团上的C-H伸缩振动引起的，并且FFBMIM-TAPB-COF中吸收峰强度较FFBMIM吸收带中该处的吸收强，同样说明反应生成了亚胺基团；FFBMIM-TAPB-COF和FFBMIM吸收带中3000cm-1是由苯环上的C-H的伸缩振动引起的；1600cm-1处的吸收峰对应苯环的骨架振动νc＝c，820cm-1处是由苯环上的C-H面外振动引起的。
2、性能考察
2.1吸附性能
以甲醇作为活化溶剂得到FFBMIM-TAPB-COF材料的活化体积结果图(如图7)。以T3为例，取500μg/mL的T3对照品溶液800μL分别加入四份活化体积不同的SPE柱中，收集滤液并处理进样用仪器检测，比较不同活化体积下的材料对同等量的T3的吸附效果，发现基本活化至1.5mL/2mg时其吸附量可达到最大。
2.2特异性
分别比较FFBMIM-TAPB-COF材料对于13种化合物的吸附特异性和竞争特异性，每份平行操作三份，从中筛选出能特异性吸附的化合物，结果如表4和5及图8所示。
表4 FFBMIM-TAPB-COF材料对于13种化合物特异性吸附结果
表5 FFBMIM-TAPB-COF材料对于13种化合物竞争性吸附结果
通过比较对几种内源性物质的富集前后的差异，考查材料的富集特异性。结果如表4所示；进一步研究这几种化合物的竞争性吸附特性，结果如表5所示。综合对比发现，材料对甲状腺激素的富集效果，特异性吸附和竞争性吸附结果是一致的，对于3,5T2、3',5'T2、T3、T4的富集效果最佳。
2.3特异性
以T3为例，加入500μg/mL的T3对照品标准溶液800μL，得到1mg FFBMIM-TAPB-COF材料的最大吸附量为82μg/mg。同样的操作下，分别考察得3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的最大吸附量分别为14.48μg/mg、30.73μg/mg、66.35μg/mg和50.45μg/mg。
2.4吸附线性
FFBMIM-TAPB-COF材料的吸附线性结果如图9。向已经活化的SPE柱(1mg、2mg、5mg、10mg、15mg)中分别加入500μg/mL的混合溶液体积不同(0.4mL、0.8mL、2mL、4mL、6mL)，将所得的洗脱液进仪器检测，由图9可以看出，FFBMIM-TAPB-COF材料对3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2、T3和T4均呈现出良好的线性。
2.5洗脱剂种类
以T3为例，分别加入800μL 500μg/mL的T3溶液，弃去收集液和淋洗液，之后在分别用水、乙腈、甲醇、20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水、80％甲醇-水7种不同的洗脱剂溶液300μL分别洗脱5次，收集洗脱液后处理进仪器检测，以解吸附的洗脱率对洗脱剂的分类和洗脱体积作图(10-A、10-C)。从图10中可以看出，80％甲醇-水作为洗脱剂洗脱效果最好；继续往80％甲醇-水中加入不同溶度的甲酸(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)进一步优化洗脱剂，由图10-B可知，0.2％甲酸80％甲醇-水为最佳洗脱剂，洗脱至1.2mL之后基本洗脱完全。
四、对3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的富集分析
1、样本前处理条件优化
FFBMIM-TAPB-COF材料对3,5-T2、3',5'-T2、T3和T4均能有较好的富集能力。但在处理实际样本前先用对照品溶液对富集参数进行优化，包括材料的用量、样本基质pH、洗脱剂，实验中使用的3,5T2、3',5'T2、T3和T4混合对照品溶液的溶度为25μg/mL，溶液基质为BSA空白基质。
1.1材料用量
由最大吸附量和竞争性吸附结果来看，使用25μg/mL的3,5-T2、3',5'-T2、T3和T4混合对照品溶液，分别选用1mg、2mg、5mg、7mg、9mg对材料用量进行优化，结果显示，材料量为7mg时，四种化合物吸附量达到最优。
1.2样品基质pH
考察了pH值在12-13范围内，FFBMIM-TAPB-COF材料对3,5-T2、3',5'-T2、T3和T4的吸附，结果显示，pH＝11时，四种化合物的吸附量达到最优。
1.3洗脱剂
由图10可知，0.2％甲酸80％甲醇-水(v/v)为最佳洗脱剂，因此，将0.2％甲酸80％甲醇-水(v/v)作为最后的洗脱剂。将25μg/mL的3,5-T2、3',5'-T2、T3和T4混合对照品溶液上样，用0.2％甲酸80％甲醇-水洗脱，结果显示，四种物质的最佳洗脱体积为0.6mL。
2、方法学验证
2.1特异性
通过考察6个不同个体血清空白基质色谱图、BSA空白基质+5种混合对照的色谱图以及血清经FFBMIM-TAPB-COF材料SPE柱富集处理进样分析色谱图，对血清中存在的其他内源性物质是否影响测定结果进行分析判断确认本分析方法的特异性。结果显示，由于特异性吸附材料富集的存在，血清样品中的内源性杂质不影响5种化合物的分离测定，且目标待测物峰形良好，如图11所示。
2.2线性范围
精密量取空白基质500μL，加入不同浓度的4种混合对照溶液各10μL，制成相应系列浓度的标准样本。对样本进行样本前处理后，每个浓度平行制备5个样品，记录待测物的峰面积(A)，以待测物的峰面积(A)对浓度(C)作回归计算。结果见表6，相关系数R2＝0.9985、0.9991、0.9984、0.9999；各个化合物峰面积与浓度之间均呈现良好的线性关系，线性范围均超过三个数量级，且检测下限依次为26.4、20.0、23.1、15.5pg/mL。
表6 3,5T2AM、3,5T2、3',5'T2和T4的线性回归方程、相关系数、线性范围、和检测下限(n＝5)
2.3精密度与准确度
用BSA空白基质制备低、中、高三个浓度的质控(Quality control samples,QC)样本，样本前处理后，进行处理后进行LC-MS/MS分析，考察分析方法的批内精密度与准确度；通过不同天、连续制备并测定3个合格的分析批次，考察方法的批间精密度与准确度。精密度用QC样品的批内和批间相对变异系数(RSD)表示，准确度用相对回收率表示。结果见表7，4种化合物在BSA空白基质中的精密度RSD<14％，满足精密度要求RSD<15％，准确度在90％～110％范围内，均符合生物样品检测要求。
表7 3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的精密度和准确度测定结果(Mean±SD，浓度单位：ng/mL)
2.4回收率
在测定回收率时，精密量取BSA空白基质500μL，样品前处理后，加入到含有不同浓度水平的3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的混合对照品干燥的离心管中，溶解制备成未经提取的低、中、高三个浓度的质控样本。每种浓度各做3份样品，进样分析。记录色谱图，测定各色谱峰面积(A)。
量取BSA空白基质500μL，精密加入不同浓度的3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的混合对照，每种浓度各做3份样品，样品前处理后，制备成经提取处理的低、中、高三个浓度的质控样本，进行LC-MS/MS分析。记录色谱图，测定各色谱峰面积(B)，按B/A×100％计算加样回收率。结果见表8，各个化合物的高中低浓度回收率均>80％。
表8 3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的回收率测定结果(Mean±SD，n＝3,浓度单位：ng/mL)
2.5基质效应
量取BSA空白基质500μL，精密加入不同浓度的3,5T2AM、3,5T2、3',5'T2和T4的混合对照，每种浓度各做3份样品，样品前处理后，制备成经提取处理的低、中、高三个浓度的质控样本，进样分析。记录色谱图，测定各色谱峰面积(A)。另用流动相制备成4种化合物相应系列浓度的标准溶液，每种浓度3份样品，进样分析，记录峰面积(B)。按照“ME(％)＝A/B×100％”计算基质效应。结果见表9，4种化合物在空白基质溶液中的基质效应为80～110％，RSD<15％，均符合生物样本测定要求。
表9 3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的基质效应测定结果(Mean±SD，n＝3,浓度单位:：ng/mL)
3、富集分析
为了评价所建立方法的实用性，利用本发明所合成的FFBMIM-TAPB-COF材料结合LC-MS/MS中的MRM模式富集并检测血清样中3,5-T2AM、3,5-T2、3',5'-T2和T4的含量，结果如图12所示。在图12中分别是血清样品经FFBMIM-TAPB-COF材料富集、经商业HLB柱分离富集、C18E柱分离富集以及经乙酸乙酯萃取富集处理直接进样对比图，血清基质比较复杂，且激素3,5-T2AM、3,5-T2和3',5'-T2体内含量很低，若样本预处理完直接使用LC-MS/MS仪器进行检测，可能对其不能准确的定量，利用所合成的FFBMIM-TAPB-COF材料对样本进行富集后，提高信号响应后，可以有效的检测到3,5-T2AM、3,5-T2和3',5'-T2，经过比较发现，本发明合成的材料富集处理后比直接萃取处理后的信号提高了3-7倍。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种聚离子液共价有机骨架材料，命名为FFBMIM-TAPB-COF，其结构式中包含式I所示的结构单元，
2.一种权利要求1所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：在催化剂三氟甲基磺酸钪和溶剂存在的条件下，化合物TAPB和离子液体单体FFBMIM在0～150℃进行化学反应，制备目标产物FFBMIM-TAPB-COF，其中，化合物TAPB和离子液体单体FFBMIM的结构式如下所示：
3.根据权利要求2所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，离子液体单体FFBMIM和化合物TAPB的摩尔比为1:0.4～1:1.4，优选为1:0.7；催化剂三氟甲基磺酸钪与化合物TAPB的摩尔比为1:15～1:20，优选为1:16.5。
4.根据权利要求2所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，反应温度为100～150℃，优选为120℃；反应时间为10～32h，优选为12～24h。
5.根据权利要求2所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，离子液体单体FFBMIM与溶剂的摩尔体积比为0.005～0.1:1mmol/ml；优选为0.013:1mmol/ml。
6.根据权利要求5所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，所述溶剂为均三甲苯、二氧六烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、邻二氯苯或1-丁醇中的一种或几种，优选为邻二氯苯和1-丁醇，更优选地，邻二氯苯和1-丁醇的体积比为1:1。
7.根据权利要求2所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，离子液体单体FFBMIM按照如下步骤制备：
8.根据权利要求7所述的聚离子液共价有机骨架材料的制备方法，其特征在于，化合物II和化合物III的摩尔比为1:0.5～1:1.5，优选为1:1.2；反应温度为60～90℃，优选为80℃；反应时间为10～24h，优选为2～12h；反应溶剂为乙腈、四氢呋喃或甲苯中的的一种或几种，优选为乙腈；化合物II与反应溶剂的摩尔体积比为1:2～12mmol/ml；优选为1:6mmol/ml。
9.权利要求1所述的聚离子液共价有机骨架材料在色谱分析中作为固相萃取填料的应用。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述的聚离子液共价有机骨架材料在色谱分析中作为用于富集T2族甲状腺激素的固相萃取填料的应用。
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