CN112243952A - 一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用 - Google Patents

一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用。该双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼，为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸被甲硫氨酸取代的突变体斑马鱼。本发明中的双突变体斑马鱼具有与人类似的骨硬化症的症状，因此可将其作为骨硬化药物评价和大规模候选药物筛选的动物模型，另外，本发明中的双突变体斑马鱼的鳞片可以作为快速阅读和处理方式用于骨硬化症药物筛选，具有高通量、周期短、费用低和操作方便的特点，为骨硬化症药物筛选提供了一种有效途径。

Description

一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用。
背景技术
骨发育和骨重塑程序是通过精确平衡成骨细胞(osteoblast，Ob)的骨形成功能(形成新的骨)和破骨细胞(osteoclast，Oc)的骨吸收功能(吸收消化旧的骨)而完成的。而骨吸收和骨形成主要依赖于Oc和Ob的活性。Ob与Oc的形成和成熟又极大程度上依赖于转录因子和细胞因子。因此，这些因子的异常会打破骨形成和骨吸收之间的平衡，从而导致骨质疏松(骨吸收>骨形成)和骨硬化疾病的发生(骨形成>骨吸收)。
骨硬化症(又称石骨症)是一种骨疾病，以破骨细胞的骨吸收功能障碍导致骨密度增加为特征。它的发病率约为1/100,000-1/500,000。患者通常会出现矮小、畸形、病理性骨折等症状，部分患者还伴有严重的血液系统和神经系统异常。这种疾病目前尚无特效药物治疗，主要的治疗方式为造血干细胞移植。骨硬化症主要由有三种不同的破骨细胞障碍导致：1)单核破骨细胞形成障碍；2)融合障碍导致不能形成多核破骨细胞；3)破骨细胞功能障碍。前两个障碍表现为成熟破骨细胞数量下降，而最后一种障碍则表现为破骨细胞骨吸收功能异常。更深入的理解破骨细胞形成调控机制是揭示骨硬化症发病机理的关键。而破骨细胞是起源于血液髓系细胞，之后再迁移到骨表面经过进一步分化成为破骨细胞。通过对这个过程中的关键基因突变将为我们提供解析骨形成机制的机会。
Pu.1又叫SPI.1，是Ets转录因子家族中的一员，它对于早期巨噬细胞发育必不可少。过去的二十年，不同的科研组建立了数个Pu.1缺陷小鼠，大部分没有出现骨骼缺陷表型。其中有一个Pu.1完全缺失小鼠，在抗生素的处理下可以活到2周，并出现了巨噬细胞和破骨细胞数量减少性骨硬化症。最近，另一个Pu.1条件性缺失小鼠被报道，它是在巨噬细胞/破骨细胞中特异性敲除Pu.1，并导致破骨细胞功能异常性骨硬化症。这些报道显示了Pu.1在破骨细胞形成和成熟中的重要作用。巨噬细胞分化过程同时也受集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1，CSF-1)和其受体CSF-1R(又叫FMS)的严密调控。CSF-1R缺陷小鼠会出现巨噬细胞和破骨细胞数量的减少。更为重要的是，最近几个临床家系研究发现CSF-1R双等位基因突变会导致严重的脑畸形和骨硬化症。虽然PU.1和FMS已经被报道在小鼠破骨细胞减少型骨硬化症中有作用，但是具体影响破骨细胞发育的机制和相互作用关系仍然未知。并且由于小鼠模型的成本和饲养规模以及操作限制，目前仍缺乏可以用于骨硬化药物评价和大规模候选化合物筛选的骨硬化症动物模型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用，其中，所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为20dpf至1年半的突变体斑马鱼；优选为20dpf至1年的突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1双突变体斑马鱼的破骨细胞数量和功能显著下降，突变体中骨弯曲比例增加，突变体骨密度增加，和/或突变体脊髓腔缩窄。
所述的骨硬化症是由PU.1和FMS基因异常表达引起，即由pu.1G242D和fmsj4e1共同突变引起。
所述的骨硬化症的症状为骨发育异常，如骨密度(bone mineral density,BMD)增加、脊柱侧凸(约25％的Ⅱ型常染色体显性患者会出现该症状)、脊椎畸形等，部分患者伴有严重的血液系统和神经系统异常。
所述的骨硬化症在通过维甲酸(retinoic acid，RA)治疗后症状缓解。
所述的维甲酸的有效浓度为1.3μmol/L以下；优选为0.65μmol/L以下。
一种双突变斑马鱼在筛选对骨硬化症有效的药物中的应用，其中，所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为20dpf至1年半的突变体斑马鱼；优选为20dpf至1年的突变体斑马鱼。
所述的骨硬化症是由PU.1和FMS基因异常表达引起，即由pu.1G242D和fmsj4e1共同突变引起。
所述的骨硬化症在通过维甲酸(retinoic acid，RA)治疗后症状缓解。
一种利用双突变斑马鱼筛选对骨硬化症有效的药物的方法，其中，所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼。
所述的骨硬化症是由PU.1和FMS基因异常表达引起，即由pu.1G242D和fmsj4e1共同突变引起。
所述的利用双突变斑马鱼筛选对骨硬化症有效的药物的方法，具体包括以下步骤：
(a)以不同浓度(浓度梯度)的备选药物处理双突变体斑马鱼的鳞片组织，同时以二甲基亚砜(DMSO)处理野生斑马鱼的鳞片组织为对照；
(b)处理1～3天后，观察双突变体斑马鱼和野生斑马鱼鳞片上破骨细胞表型，以确定所述备选药物对骨硬化症的治疗或缓解效果；
(c)当双突变体斑马鱼鳞片上的破骨细胞数量经过备选药物处理后恢复至与对照组处理水平相同，视为备选药物对骨硬化症有效。
所述的利用双突变斑马鱼筛选对骨硬化症有效的药物的方法，在步骤(a)和(b)之间还包括确定安全范围内的最高药物浓度的步骤，具体为：处理1～3天后，根据双突变体斑马鱼和野生斑马鱼鳞片细胞的存活情况确定安全范围内的最高化合物浓度。
所述的鳞片细胞的存活情况根据鳞片细胞核状态和/或成骨细胞数量来确定，即经备选药物处理1～3天后，细胞核状态和/或成骨细胞数量与处理前相比无统计学差异，视为安全浓度。
所述的鳞片细胞核状态可由DAPI染色标记。
所述的鳞片的成骨细胞数量可由碱性磷酸酶染色标记。
步骤(a)中所述的双突变体斑马鱼和野生斑马鱼均为斑马鱼成鱼；优选为3个月以上的斑马鱼；更优选为4个月以上的斑马鱼。
步骤(a)中所述的备选药物包括化合物等。
步骤(b)中所述的处理的时间优选为2天。
步骤(b)中所述的破骨细胞表型包括破骨细胞数量和/或破骨细胞功能。
所述的破骨细胞数量可通过LCP(LCP标记所有类型的破骨细胞)染色来观察，LCP信号多少可以看出总的破骨细胞数量。
所述的破骨细胞功能可通过TRAP(TRAP标记有功能的破骨细胞)染色来观察，染色深浅可以看出其功能强弱。
一种离体突变体斑马鱼的鳞片在筛选对骨硬化症有效的药物中的应用，其中，所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼。
所述的骨硬化症是由PU.1和FMS基因异常表达引起，即由pu.1G242D和fmsj4e1共同突变引起。
所述的突变体斑马鱼为40dpf以上的突变体斑马鱼；优选为突变体斑马鱼的成鱼；进一步优选为3个月以上的突变体斑马鱼；再进一步优选为4个月以上的突变体斑马鱼。
所述的离体突变体斑马鱼的鳞片为离体7天内的突变体斑马鱼的鳞片(鳞片可在培养基中离体培养7天)。
一种筛选对骨硬化症有效的药物的方法，为利用突变体斑马鱼的鳞片进行筛选，其中，所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼；
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼。
所述的骨硬化症是由PU.1和FMS基因异常表达引起，即由pu.1G242D和fmsj4e1共同突变引起。
所述的双突变体斑马鱼和野生斑马鱼均为斑马鱼成鱼；优选为3个月以上的斑马鱼；更优选为4个月以上的斑马鱼。
所述的离体突变体斑马鱼的鳞片为离体7天内的突变体斑马鱼的鳞片。
所述的筛选对骨硬化症有效的药物的方法，具体包括如下步骤：
(i)以不同浓度(浓度梯度)的备选药物处理离体双突变体斑马鱼的鳞片组织，同时以二甲基亚砜(DMSO)处理野生斑马鱼的鳞片组织为对照；
(ii)处理1～3天后，观察双突变体斑马鱼和野生斑马鱼鳞片上破骨细胞表型，以确定所述备选药物对骨硬化症的治疗或缓解效果；
(iii)当双突变体斑马鱼鳞片上的破骨细胞数量经过备选药物处理后恢复至与对照组处理水平相同，视为备选药物对骨硬化症有效。
本发明总体构思为：
(1)我们对比检测了检测野生型(wild-type，wt)、pu.1G242D、fmsj4e1单突变体以及pu.1G242D；fmsj4e1双突变体中不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)破骨细胞发育的情况，包括利用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色观察其功能性破骨细胞数量变化；利用L-plastin(Lcp)和DAPI免疫荧光共染检测其总体破骨细胞数量和破骨细胞数量变化；利用L-plastin(Lcp)和TUNEL免疫荧光共染检测其破骨细胞凋亡的变化；
(2)我们对比检测了检测野生型(wild-type，wt)、pu.1G242D、fmsj4e1单突变体以及pu.1G242D；fmsj4e1双突变体骨硬化症发生概率及程度，包括统计骨骼弯曲发生比例；茜素红染色后计算单个脊柱腔体积变化；利用高分辨率micro-CT检测野生型和突变体中的BMD变化；
(3)根据模型的脊柱上破骨细胞功能和数量，以及骨发育表型，骨密度与脊髓腔变化，与临床进行骨硬化症细比对，确定是否具有人骨硬化症类似病症。
(4)利用RA处理不同时期的(wild-type，wt)、pu.1G242D、fmsj4e1单突变体以及pu.1G242D；fmsj4e1双突变体，观测其对突变体破骨细胞功能恢复和骨硬化症症状缓解的效果，包括RA处理后，利用TRAP染色、LCP与DAPI共染色检测功能性破骨细胞、总体破骨细胞以及多核破骨细胞恢复情况；观测骨骼弯曲发生概率的变化；
(5)利用斑马鱼成鱼鳞片作为快速作为RA处理后的快速阅读方式进行TRAP+细胞统计以观测其对鳞片上破骨细胞功能恢复的作用；确定是否可以利用斑马鱼成鱼鳞片进行骨硬化症有效化合物筛选。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明是首次发现斑马鱼上Pu.1和Fms在破骨细胞发育过程中有协同作用，且Pu.1主要作用于破骨细胞生成，而Fms则主要于影响破骨细胞的成熟。该pu.1G242D；fmsj4e1双突变体斑马鱼具有与人类似的骨硬化症的症状，可以应用于新化合物筛选，该斑马鱼模型可能成为研究骨硬化症及化合物筛选的新载体。
(2)本发明中的pu.1G242D；fmsj4e1双突变体斑马鱼模型，纯合突变体可以存活至成年并可繁殖下一代，而小鼠PU.1完全敲除纯合突变体出生后不久致死，条件性敲除的突变体需要体外诱导才可以出现骨密度增加表型，且无骨弯曲表型，是一个较弱程度骨硬化症模型；相似的，小鼠FMS纯合突变体也只有骨密度增加表型，且无骨弯曲表型，是一个较弱程度骨硬化症模型。目前尚无小鼠PU.1和FMS双纯合突变体报道。因此我们可以探索幼年至成年时期PU.1和FMS在该疾病的致病机理以及相互作用。另外，该斑马鱼可以实现：①新突破：尚未出现有效的人类骨硬化症斑马鱼模型；②高通量：斑马鱼产卵数量多，养殖方便容易，且可以同时进行多种药物筛选，可进行多批次同时进行药物筛选；③低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于老鼠，平均每天每只消费约为老鼠的1/100；④给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至成年斑马鱼吸收，所需化合物的量仅为老鼠的1/100～1/1000。
(3)本发明首次提出可以使用斑马鱼鳞片作为快速阅读和处理方法用于骨硬化症药物筛选，鳞片相比于斑马鱼整体可以实现：①更高通量：每条鱼有成百上千的鳞片可以使用，且拔取之后可以重新生长；②周期短：鳞片可在培养基中离体培养7天，且对化合物吸收更快；③低费用：体积小，所需化合物量少，成本低；④操作方便：无需喂食；相比整体斑马鱼需要切片后实施染色观测表型变化，鳞片可直接进行染色和观测。
(4)本发明中pu.1G242D；fmsj4e1双突变体斑马鱼具有以下表型：①破骨细胞数量和功能显著下降；②突变体中骨弯曲比例增加；③突变体骨密度增加；④突变体脊髓腔缩窄，确定该斑马鱼疾病模型与人类疾病的症状一致，因此，可将其作为骨硬化药物评价和大规模候选化合物筛选的骨硬化症动物模型。
附图说明
图1是不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)TRAP信号的变化情况图；其中，A为不同时期wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的矢状切面上功能性破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色图(蓝色箭头指示的是TRAP+细胞，比例尺为400μm)；B为A中的TRAP+细胞数量统计图(蓝色、紫色、绿色和红色线条分别代表wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的TRAP+细胞在20dpf到90dpf的数量变化)(样本量：20dpf组wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1 n＝24，27，21，27；30dpf组n＝27，23，20，24；40dpf组n＝27，15，9，18；60dpf组n＝27，27，9，27；90dpf组n＝25，19，19，28；One-way ANOVA；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图2是不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)的突变斑马鱼的LCP+总破骨细胞数变化图；其中，A为不同时期wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的横切面上总破骨细胞的LCP和DAPI免疫荧光染色图(箭头指示的是神经弓上的LCP+破骨细胞，比例尺为50μm；sc：脊髓)；B为A中的LCP+细胞数量统计图(蓝色、紫色、绿色和红色线条分别代表wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的LCP+细胞在20-90dpf的数量变化)(样本量：20dpf组wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1 n＝20，12，13，14；40dpf组n＝23，21，20，22；60dpf组n＝20，24，21，27；90dpf组n＝22，16，16，14；One-way ANOVA；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图3是不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)的突变斑马鱼的破骨细胞凋亡情况图；其中，A为不同时期wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的横切面上破骨细胞的LCP(绿色信号)和TUNEL(红色信号)免疫荧光双染色图(白色箭头指示的是LCP+TUNEL+的凋亡的破骨细胞，比例尺为50μm；sc：脊髓)；B为A中的LCP+TUNEL+占LCP+细胞比例(凋亡破骨细胞占总破骨细胞比例)的统计图(蓝色、紫色、绿色和红色线条分别代表wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的凋亡破骨细胞比例在20-90dpf的数量变化)；C为凋亡破骨细胞比例在40dpf的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的统计比较；(样本量：20dpf组wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1 n＝51，29，32，41；40dpf组n＝52，64，37，42；60dpf组n＝20，24，21，27；90dpf组n＝50，42，15，52；One-way ANOVA；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图4是不同发育阶段(从受精后20天到受精后60天)的突变斑马鱼的多核破骨细胞的比例的变化图；其中，A为不同时期wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的横切面上单核及多核破骨细胞的变化的LCP(绿色信号)和DAPI(蓝色信号)免疫荧光双染色图(单核破骨细胞：1个LCP+细胞与1个DAPI+核共染；多核破骨细胞：1个LCP+细胞与>1个DAPI+核共染；白色框内显示的是单核破骨细胞；黄色框显示的是具有2-3个核的多核破骨细胞；红色框显示的是具有3个以上核的多核破骨细胞(比例尺为50μm)；sc：脊髓)；B为A中的多核破骨细胞占总破骨细胞比例的统计图(蓝色、紫色、绿色和红色线条分别代表wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体的多核破骨细胞比例在20-60dpf的数量变化)(样本量：20dpf组wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1n＝10，11，11，27；40dpf组n＝28，35，38，39；60dpf组n＝14，31，37，60；One-way ANOVA；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图5是不同发育阶段的突变斑马鱼的身体弯曲的比例、脊髓腔面积统计以及BMD测定结果图；其中，A为1年期的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体身体弯曲的比例统计(红色箭头标示弯曲位置(比例尺为6000μm))；B为wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体分别在3个月，6个月，12个月的身体弯曲比例统计图；C和D为3个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体脊髓腔面积的统计(上排显示茜素红整体骨组织染色(比例尺为6000μm)，下排为放大的单个脊柱图(比例尺为100μm)；红色箭头标示弯曲位置)(样本量为n＝9，one-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；E和F为3个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体BMD的测定结果(比例尺为6000μm，样本量为n＝6，one-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图6是不同梯度剂量的RA处理不同时期斑马鱼后形态正常的斑马鱼比例变化图；其中，A为40dpf斑马鱼用不同RA浓度处理6天后形态正常的斑马鱼比例变化(样本量为n＝10)；B为4个月成鱼用不同RA浓度处理6天后形态正常的斑马鱼比例变化(样本量为n＝10)。
图7是RA处理后对PU.1和FMS缺陷导致的骨硬化症的影响图；其中，A和B为使用0.65μM RA处理40天的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体6天后的TRAP染色图(蓝色箭头指示的是神经弓上的TRAP+细胞，比例尺为50μm；样本量为n＝12，two-wayANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001))；C、D和E为使用0.65μM RA处理4个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体6天后的LCP/DAPI染色图以及总的LCP+破骨细胞统计和多核破骨细胞比例统计结果(比例尺为50μm，样本量为n＝9，two-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)(白色框和箭头显示的是单核破骨细胞；黄色框和箭头显示的是具有2-3个核的多核破骨细胞；红色框和箭头显示的是具有3个以上核的多核破骨细胞)；F为使用0.65μM RA处理2个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体一个月后的身体弯曲比例的变化(比例尺为2000μm，样本量为DMSO组wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1 n＝6，4，6，3；RA组n＝4，4，3，4；two-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图8是RA处理4个月的突变斑马鱼后对PU.1和FMS缺陷导致的脊柱骨和鳞片骨的破骨细胞功能的影响图；其中，A和B为使用1.3μM RA处理4个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体6天后的TRAP染色图(蓝色箭头指示的是神经弓上的TRAP+细胞，黄色星号指示的是单核破骨细胞信号；比例尺为50μm，样本量为n＝9，two-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；C和D为使用1.3μM RA处理4个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体鳞片6天后，进行TRAP染色(红色箭头指示的是鳞片上的TRAP+细胞，蓝色星号指示的是单核破骨细胞信号；比例尺为500μm，样本量为n＝10，two-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。
本发明中斑马鱼的养殖如文献(Westerfield M:The zebrafish:guide for thelaboratory use of zebrafish(Brachdanio rerio).Edition by Eugene,OR,M.Westerfield，1993)所述。
本发明中用到如下的品系的斑马鱼：AB野生型斑马鱼、pu.1G242D突变体斑马鱼、fmsj4e1突变体斑马鱼、pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼；其中，
pu.1G242D突变体斑马鱼是斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的突变体斑马鱼(具体见中国专利：CN201310050870.5，名称为“急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征动物模型及用途”)；
fmsj4e1突变体斑马鱼是斑马鱼fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼(具体见参考文献：D.M.Parichy,D.G.Ransom,B.Paw,等.Anorthologue of the kit-related gene fms is required for development of neuralcrest-derived xanthophores and a subpopulation of adult melanocytes in thezebrafish,Danio rerio[J].Development,2000,127(14):3031-3044.)；
pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼是斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代的突变体斑马鱼。我们通过将fmsj4e1杂合子突变体斑马鱼与pu.1G242D杂合子突变体斑马鱼杂交后，经基因型鉴定获得pu.1G242D；fmsj4e1双杂合子突变体斑马鱼，再将pu.1G242D；fmsj4e1双杂合子突变体斑马鱼进行自交，基因型鉴定后获得pu.1G242D；fmsj4e1双纯合子突变体斑马鱼。
本发明中所使用的术语“野生型”/或者“wt”都是指野生型斑马鱼。
本发明中所使用的术语“dpf”指受精后的天数。举例来说，“20dpf”指受精后20天，“40dpf”指受精后40天。
本发明中所使用的术语“month”指受精后的月数。举例来说，“4-month”指受精后4个月。
本发明中所使用的PBS是按照如下方法配置：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后将pH值用质量分数30％的浓盐酸调整至7.4，加水定容至1L。
本发明中所使用的PBST是在上述PBS中加入0.1％(v/v)的吐温20。
实施例1：Pu.1和FMS在斑马鱼再功能性破骨细胞发育中具有协同作用已知在哺乳动物中，破骨细胞来源于巨噬细胞。PU.1和FMS都表达于巨噬细胞中，任何一个基因的异常都会导致破骨细胞异常，提示它们在破骨细胞形成和成熟中具有重要作用。然而，PU.1和FMS在破骨细胞发育中是否有协同作用尚不可知。为了回答这个问题，我们进行了以下实验：
1)冰冻切片实验：斑马鱼标本先经过4％PFA(多聚甲醛)固定(固定时间视组织大小而定，如小鱼组织室温固定2h，成鱼组织室温固定2天)，之后利用30％(w/v)蔗糖进行脱水(4℃过夜脱水)。等组织完全脱水沉入管底部，即可进行OCT包埋，包埋后利用莱卡切片机切片；
2)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色：冰冻切片使用去离子水洗3×10mins(水洗3次，每次10min，其它以此类推)后，使用TRAP染色液37℃孵育1h。TRAP染色液现配现用，配方遵照试剂盒说明书(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA；NO387)进行配置：50ml TRAP染色液，包含0.5ml的GBC碱溶液，0.5ml亚硝酸钠溶液，0.5ml萘酚AS-BI磷酸溶液，1ml酒石酸盐，45ml去离子水。配置完后的溶液置于37℃预热1h后实施染色。在本发明中TRAP+表示TRAP染色阳性。
3)通过冰冻切片后的TRAP染色比较wt，pu.1G242D，fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1双突变体斑马鱼中功能性破骨细胞的数量。TRAP是一种由破骨细胞溶酶体分泌的酶，来标记具有骨吸收功能的破骨细胞。我们检测wt、单突变体(pu.1G242D,fmsj4e1)以及pu.1G242D；fmsj4e1双突变体中不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)TRAP信号的变化。
结果显示，在wt中，成熟的TRAP+破骨细胞在20dpf的头骨部分出现，30dpf开始出现在脊柱骨(主要为脊柱骨的神经弓和血管弓部分)，40dpf的TRAP+细胞大幅增加，60dpf达到峰值，90dpf急剧减少(图1A和1B)。该结果提示我们骨发育过程中破骨细胞经历了形成(20-60dpf)和凋亡(60-90dpf)两个过程。相比于wt，无论是pu.1G242D、fmsj4e1单突变体，还是pu.1G242D；fmsj4e1双突变体的不同阶段都出现了TRAP+功能性破骨细胞减少，但是在pu.1G242D；fmsj4e1双突变体中减少的更为严重。这些结果提示Pu.1和FMS缺陷都会导致功能性破骨细胞减少，特别是当同时缺陷时加剧了表型，表明Pu.1和FMS在斑马鱼功能性破骨细胞发育中具有协同作用。
实施例2：PU.1相比于FMS，主要作用于斑马鱼破骨细胞生成
功能性破骨细胞的减少有两个可能性的原因：一个是破骨细胞生成障碍，另一个是多核破骨细胞成熟障碍。为了确定PU.1和FMS缺陷导致的功能性破骨细胞减少的原因，我们进行了以下实验：
LCP与DAPI免疫荧光共染色方法如下：
①先将斑马鱼冰水处死，之后将样品在解剖显微镜下用手术刀取出胸鳍与腹鳍之间的躯段；
②将组织置于4％PFA中固定过夜；
③取出的躯段用PBST洗3×5mins，
④再利用20mg/mL的组织蛋白酶(名称：proteinase K；品牌：Fermentas，ThermoFisher Scientific)室温消化2h；
⑤之后用PBST洗3×5mins；
⑥将组织置于含10％(v/v)羔羊血清(Lamb Serum，LS)的PBST溶液室温封闭1h；
⑦加入L-plastin(LCP)的兔源性一抗(一抗按照1:400用封闭液稀释，品牌：abcam，货号：ab210099)4℃过夜；
⑧再用PBST洗6×20mins；
⑨加入anti-rabbit 488二抗(二抗按照1:400用封闭液稀释，Invitrogen；A21206)37度2h孵育；
⑩再用PBST洗6×20mins；
Figure BDA0002666350820000111
最后置于30％(w/v)蔗糖溶液中脱水过夜，OCT包埋，再利用切片机进行冰冻切片，切片封闭时用含DAPI的封片剂封片。
在本发明中LCP+表示LCP染色阳性。
我们实施了LCP和DAPI的共染，不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)的突变斑马鱼的LCP+总破骨细胞数变化如图2所示。结果发现：在wt中，LCP+细胞开始出现在20dpf的脊柱，然后不断增加，60dpf达到峰值，然后迅速减少，90dpf只剩下少量的LCP+细胞(图2A和2B)，显示了破骨细胞的生命周期。在pu.1G242D、fmsj4e1突变体中，LCP+细胞在20-40dpf与wt一样出现增长，但是在接下40-60dpf出现了减少(图2A和2B)。另外，其中pu.1G242D突变体的LCP+细胞变化与pu.1G242D；fmsj4e1双突变体更为相似，表现出比fmsj4e1突变体更为严重的破骨细胞生成障碍。提示PU.1和FMS对于破骨细胞生成都是必须的，但是PU.1作用更明显。
实施例3：破骨细胞减少部分是由凋亡导致的
为了鉴定pu.1和fms缺陷导致破骨细胞减少的细胞学机制，我们实施了LCP与末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记末端标记(TUNEL)的共染色，过程如下：
(1)TUNEL染色：
①先将斑马鱼冰水处死，之后将样品在解剖显微镜下用手术刀取出胸鳍与腹鳍之间的躯段；
②根据TUNEL试剂盒(名称：In-Situ Cell Death Detection Kit TMR red；品牌：Roche；地址：Basel,Switzerland；货号：12156792910)的说明书，先将取出的躯段用PBST洗3×5mins；
③利用20mg/mL的组织蛋白酶(名称：proteinase K；品牌：Fermentas，ThermoFisher Scientific)室温消化2h；
④之后用PBST洗3×5mins；
⑤使用丙酮：乙醇(1:2，v/v)溶液-20℃浸泡7min；
⑥用PBST洗3×5mins；
⑦将试剂盒中的酶与缓冲液按照体积比1:9对组织进行37℃过夜染色；
⑧染完后用PBST洗3×5mins。
(2)LCP抗体染色：
①上述TUNEL染色后的组织需要与LCP共染，继续将组织置于含10％(v/v)羔羊血清(LS)的PBST溶液室温封闭1h；
②加入LCP的兔源性一抗(一抗按照1:400用封闭液稀释，品牌：abcam，货号：ab210099)4℃过夜；
③用PBST洗6×20mins；
④加入anti-rabbit 488二抗(二抗按照1:400用封闭液稀释，Invitrogen；A21206)37℃孵育2h；
⑤用PBST洗6×20mins；
⑥最后置于30％(w/v)蔗糖溶液中脱水，OCT包埋，再利用切片机进行冰冻切片，切片封闭时用含DAPI的封片剂封片。
不同发育阶段(从受精后20天到受精后90天)的突变斑马鱼的破骨细胞凋亡情况如图3所示。结果发现，在wt中凋亡的破骨细胞在40dpf开始增加，60dpf达到峰值，90dpf急剧减少(图3A和3B)，与之前的破骨细胞生命周期一致。然而，在单突变体(pu.1G242D、fmsj4e1)以及pu.1G242D；fmsj4e1双突变体中，破骨细胞的凋亡高峰提前了，并且在20-40dpf中的凋亡数量也高于wt。提示Pu.1和Fms缺陷会导致破骨细胞的提前凋亡。这些凋亡可能是突变体中破骨细胞减少的部分原因。
实施例4：FMS相比于PU.1，主要作用于斑马鱼破骨细胞成熟
为了进一步解析破骨细胞成熟是否也在突变体中收到了影响，我们进行了LCP和DAPI共染色，鉴别多核破骨细胞，并计算多核破骨细胞在总破骨细胞中的占比。其中：
(1)LCP与DAPI免疫荧光共染色如实施例2中所述；
(2)单核与多核破骨细胞判定原则：
单核破骨细胞：1个LCP+细胞与1个DAPI+核共染；
多核破骨细胞：1个LCP+细胞与>1个DAPI+核共染。
不同发育阶段(从受精后20天到受精后60天)的突变斑马鱼的多核破骨细胞的比例的变化如图4所示。结果表明，在wt中，20dpf是没有多核破骨细胞，但是到了20-60dpf的时候开始逐渐增多。与wt相比，单突变体和双突变体中多核破骨细胞比例在每个时期都大量减少，并且在双突变体中减少的更多(图4A和4B)。另外，fmsj4e1突变体的多核破骨细胞比例的变化与pu.1G242D；fmsj4e1双突变体更为相似，表现出比pu.1G242D突变体更为严重的减少。提示PU.1和FMS对于破骨细胞成熟都是必须的，但是FMS作用更明显。
综上所述，这些数据提示PU.1和FMS在破骨细胞发育过程中有协同作用，PU.1主要作用于破骨细胞形成，而FMS主要作用于破骨细胞成熟。
实施例5：pu.1G242D；fmsj4e1双突变体出现严重的骨骼畸形和骨硬化症
在人体中，破骨细胞的缺失和异常会导致骨硬化症的发生。骨硬化症主要表现为骨发育异常表型，如骨密度(bone mineral density,BMD)增加、脊柱侧凸(约25％的Ⅱ型常染色体显性患者会出现该症状)、脊椎畸形等。为了进一步确定斑马鱼PU.1和FMS的异常会不会引起破骨细胞减少而导致骨硬化症，我们检测了不同突变体和野生型斑马鱼中的骨表型。具体实验过程如下：
(1)茜素红染色(对于斑马鱼成鱼整体茜素红染色)：
①先将冰水处死的斑马鱼置于4％(w/v)NaCl溶液中浸泡24h，之后剥去内脏和肌肉组织，剩余骨组织；
②将骨组织置于4％PFA中固定过夜；
③再将其浸入96％(w/w)的乙醇溶液中；
④放入-20℃冰箱脱水16h；
⑤再置入0.1％(w/v)茜素红染液染色2h；
⑥最后染完色的骨骼组织保存在100％甘油中拍照观察。
(2)单个脊髓腔面色测定：
①将上述染完茜素红的整体骨组织置于解剖显微镜下，解剖出单个脊柱；
②将单个脊柱使用体式显微镜拍照；
③利用imageJ软件对不同基因型的骨髓腔面积进行测量统计。
(3)micro-CT测定BMD：
①先用冰水处死斑马鱼；
②将组织置于4％PFA中固定过夜；
③将组织置于micro-CT样品槽上，进行3D扫描，并计算BMD。
(4)身体弯曲比例统计：
①将pu.1G242D；fmsj4e1双杂合子斑马鱼进行交配，获得的后代养至1年半，定期剪尾巴进行基因型鉴定，并观测身体弯曲比例；
②基因型鉴定：首先提取pu.1G242D和fmsj4e1斑马鱼尾部DNA，利用引物对PU.1和FMS突变片段进行PCR扩增，之后分别获得250bp的PU.1产物和500bp大小的FMS产物，并进行测序确认突变方式和类型。也可以通过对PCR的产物进行酶切来进行基因型鉴定。其中BsmF1内切酶可以将PU.1突变条带切断成两条接近125bp的片段，而PU.1野生型条带不能被BsmF1内切酶切开，只有一条250bp的条带。BssS1内切酶则可以将FMS野生型条带切开为两条约250bp的条带，而FMS野生型条带不能被BssS1内切酶切开，只有一条500bp的条带。
PU.1的前引物为：5’-CTGCTTGACCTTCTGCGAAA-3’；
PU.1的后引物为：5’-CCGAGAACCTCTCCACTGAA-3’；
Fms的前引物为：5’-GGCAGAGCTGTCCTAAAA-3’；
Fms的后引物为5’-CTAGCAAGAGATAAAAGGTGT-3’；
图5A是1年期的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体形态，图5B是wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体分别在3个月，6个月，12个月的身体弯曲比例(弯曲比例＝形态弯曲的鱼的数量/该基因型鱼的总数)统计图，结果表明，大部分pu.1G242D和fmsj4e1单突变体可以正常存活，只有少数单突变体会在3个月以后出现身体弯曲的表型(1年时期弯曲比例pu.1G242D：17.98％；fmsj4e1：3.90％)(图5A和5B)。然而这个比例在pu.1G242D；fmsj4e1双突变体中非常高，在3个月时达到87.34％，1年达到94.94％。相似的，当我们用茜素红(alizarin red,AR)染色标记骨形态，发现3个月的pu.1G242D；fmsj4e1双突变体的骨弯曲比例远远高于单突变体(图5C)。此外，相比于野生型(3个月)，脊髓腔面积在单突变体中也缩小了，并在双突变体中进一步加重(图5C和5D)。我们利用高分辨率micro-CT检测3个月的野生型和突变体中的BMD变化，结果表明单突变体的BMD明显增加，并且在双突变体中增加的更多(图5E和5F)。这些结果表明PU.1和FMS的异常会引起破骨细胞减少型骨硬化症，其中pu.1G242D、fmsj4e1单突变体和双突变体可以成为不同程度的骨硬化症模型。
实施例6：RA处理可以缓解由PU.1和FMS缺陷引起的破骨细胞减少型骨硬化症表型
斑马鱼模型已经被证明是一个非常适用于大规模药物筛选的模式动物。我们之前的结果显示pu.1G242D、fmsj4e1单突变体和双突变体可以成为模拟人类不同程度的骨硬化症疾病。因此，pu.1G242D、fmsj4e1、pu.1G242D；fmsj4e1可能可以作为人类骨硬化症模型应用于药物发现。维甲酸(retinoic acid，RA)是一个临床应用于早幼粒白血病治疗的药物。已有的文献表明，RA可能会促进破骨细胞活性。因此我们想知道RA处理是否能激活pu.1G242D、fmsj4e1、pu.1G242D；fmsj4e1突变体中的破骨细胞并缓解骨硬化症症状。pu.1G242D、fmsj4e1单突变体和双突变体是否可以作为不同程度的骨硬化症模型进行药物评价和筛选。我们进行了RA处理后破骨细胞功能、数量以及骨表型弯曲比例统计。具体过程如下：
(1)RA处理：
①先将全反式维甲酸(Sigma-Aldrich,R2625)粉末用二甲基亚砜(DMSO)配置成40mg/mL的储液；
②进行具体实验前，根据处理鱼的时期用养鱼水稀释成工作浓度；
③对于40dpf和4-month的斑马鱼，RA溶液的工作浓度分别为0.65μM和1.3μM。40dpf和4-month斑马鱼RA处理6天(每2天喂一次食，并更换RA溶液)。
(2)TRAP染色如实施例1所述。
(3)LCP与DAPI免疫荧光染色如实施例2所述。
(4)身体弯曲比例统计如实施例5所述。
结果如下，我们通过梯度剂量处理，找到不同时期斑马鱼RA的最大不至畸剂量(0.65～1.3μM，0.65μM是40dpf斑马鱼的最大不至畸剂量，1.3μM是4-month斑马鱼的最大不至畸剂量)(图6)。
为了评价RA对功能性破骨细胞的作用，我们统计了40dpf和4-month的野生型和突变体斑马鱼在RA处理6天后的TRAP+细胞数。结果表明，TRAP+细胞在各个基因型中，在RA处理后显著增加(图7A和7B，图8A和8B)。提示功能性破骨细胞可以被RA拯救。此外，我们还利用斑马鱼的鳞片作为RA处理后的快速阅读方式进行TRAP+细胞统计，结果与之前一致，RA处理可以显著增加各个基因型斑马鱼鳞片上的TRAP+细胞(图8C和8D)。为了进一步确认RA可以激活破骨细胞的发育和成熟，我们又利用LCP和DAPI计算了总破骨细胞数和多核破骨细胞比例。结果表明，RA处理不仅可以增加总的LCP+破骨细胞数，还可以提高多核破骨细胞的比例(图7C、7D、7E)。使用0.65μM RA处理2个月的wt,pu.1G242D,fmsj4e1和pu.1G242D；fmsj4e1突变体一个月后，观察其身体弯曲比例的变化，结果如图7F所示。
以上结果提示RA不仅可以增加破骨细胞生成，还可以促进破骨细胞成熟。最后我们观察了RA处理对于骨弯曲表型是否有缓解作用。我们对1-month大小的斑马鱼进行RA处理(0.65μM)，长时间处理后在3-month进行骨弯曲表型观察。结果表明，RA可以降低骨弯曲发生的比例。综上所述，RA可以有效的缓解PU.1和FMS缺陷引起的破骨细胞减少型骨硬化症表型。pu.1G242D、fmsj4e1、pu.1G242D；fmsj4e1突变体可以作为不同程度的骨硬化症模型进行药物评价和筛选。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PU.1的前引物
<400> 1
ctgcttgacc ttctgcgaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PU.1的后引物
<400> 2
ccgagaacct ctccactgaa 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fms的前引物
<400> 3
ggcagagctg tcctaaaa 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fms的后引物
<400> 4
ctagcaagag ataaaaggtg t 21

Claims (10)

1.一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用，其特征在于：所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
2.一种双突变斑马鱼在筛选对骨硬化症有效的药物中的应用，其特征在于：所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸被甲硫氨酸取代的突变体斑马鱼。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的骨硬化症是由PU.1和FMS基因异常表达引起。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的骨硬化症在通过维甲酸治疗后症状缓解。
6.一种利用双突变斑马鱼筛选对骨硬化症有效的药物的方法，其特征在于：所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼；
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸被甲硫氨酸取代的突变体斑马鱼。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(a)以不同浓度的备选药物处理双突变体斑马鱼的鳞片组织，同时以二甲基亚砜处理野生斑马鱼的鳞片组织为对照；
(b)处理1～3天后，观察双突变体斑马鱼和野生斑马鱼鳞片上破骨细胞表型；
(c)当双突变体斑马鱼鳞片上的破骨细胞数量经过备选药物处理后恢复至与对照组处理水平相同，视为备选药物对骨硬化症有效；
步骤(a)中所述的双突变体斑马鱼和野生斑马鱼均为3个月以上的斑马鱼；
步骤(b)中所述的破骨细胞表型包括破骨细胞数量和/或破骨细胞功能。
8.一种离体突变体斑马鱼的鳞片在筛选对骨硬化症有效的药物中的应用，其特征在于：所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼；
所述的pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼为斑马鱼pu.1基因DAB结构域中第242位氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代，以及fms基因激酶结构域第614位氨基酸缬氨酸被甲硫氨酸取代的突变体斑马鱼。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述的突变体斑马鱼为40dpf以上的突变体斑马鱼；
所述的离体突变体斑马鱼的鳞片为离体7天内的突变体斑马鱼的鳞片。
10.一种筛选对骨硬化症有效的药物的方法，其特征在于：为利用突变体斑马鱼的鳞片进行筛选；其中，所述的双突变体斑马鱼为pu.1G242D；fmsj4e1突变体斑马鱼。
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